CARACTERIZAÇÃO DAS BOMBAS DE PRÓTONS VACUOLARES

E SEU PAPEL NAS RESPOSTAS ADAPTATIVAS DE PLANTAS

AO ESTRESSE HÍDRICO.

MICHELLE GUEDES CATUNDA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINESE

DARCY RIBEIRO

CAMPOS DOS GOYTACAZES

JANEIRO DE 2008

CARACTERIZAÇÃO DAS BOMBAS DE PRÓTONS VACUOLARES

E SEU PAPEL NAS RESPOSTAS ADAPTATIVAS DE PLANTAS

AO ESTRESSE HÍDRICO.

MICHELLE GUEDES CATUNDA

“Tese apresentada ao Centro de

Biociências e Biotecnologia da Universidade

Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,

como parte das exigências para obtenção do

título de Doutor em Biociências”.

Orientador: Arnoldo Rocha Façanha

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

JANEIRO DE 2008

ii

Dedico esta tese aos meus pais, meu irmão, meu esposo,

mas principalmente ao meu filho Daniel a quem ensino e

com quem aprendo a viver e a ser feliz a cada dia que

amanhece.

iii

AGRADECIMENTOS

Costumo dizer que minha vida é preenchida por seis grandes amores, aos quais

gostaria muito de agradecer...

• Deus, que me deu a vida e essa oportunidade maravilhosa de ser feliz;

• Meu filho, Daniel, que desde que chegou a esse mundão me ensinou o

real significado de duas nobres palavras: vida e felicidade!

• Meu esposo, grande amor e companheiro de todos os momentos;

• Minha mãe, exemplo de mulher, meu pai, o melhor pai do mundo, e

meu irmão, sempre o meu caçulinha.

Aos meus amores, o meu muito obrigada por cada minuto de amor,

atenção, dedicação e confiança... Sem vocês por perto, nada disso estaria

sendo concretizado agora!

Agradeço também ao meu orientador, Arnoldo Rocha Façanha pela

imensa paciência e por cada discurso apaixonado pela ciência... Prometo

que vou levar um pouquinho dessa paixão para sempre comigo!

À professora Anna Okorocova, ao professor Lev Okorocov e ao

professor Fábio Olivares pelos ensinamentos oportunos.

Ao pessoal do LQFPP, LMGV e LFBM, que sempre estiveram de

portas abertas para a utilização dos equipamentos necessários para o

desenvolvimento desse trabalho.

À UENF e à FAPERJ pelo suporte financeiro.

Aos meus amigos, que riram de mim e que riram comigo... Que graça

tem a vida sem amigos???

Inga, Rosivany e Rosane... Para sempre no meu coração!!

Ana Paula (cunhadona!!), Tati Felice, Nathália, Fabiana, Alena, Juares,

Daniel, Jorge André, Geórgia, Josimara, Flávia Emenegilda, ... Obrigada!!!

Ao pessoal do campo que me ajudou a cultivar e a colher tiririca, por

mais esquisito que isso lhes parecesse!!

iv

Ao pessoal do LBCT, Giovana, Bia e Márcia Adriana (ex-LBCT) pelo

carinho e pela força no preparo das amostras para microscopia!!

Ao amigo Noil pelo suporte no microscópio... Jamais teria alinhado

aquele “trem” sem a sua ajuda!!!

À Dona Maria pelo bolo de banana espetacular quando eu estava

grávida do Daniel!!!!!

Os meus alunos do CEDERJ por terem me permitido vivenciar a

experiência didática, e ao pessoal do CEDERJ, pólo Macaé, Aninha,

Giselli, Ada, Claudinha, Sílvio, Maurício, ..., obrigada pela força sempre!!

Enfim... A todos os que estiveram por perto, me acompanhando,

torcendo por mim ou mesmo rindo comigo, o meu super-hiper-mega muito

obrigada!!! Vocês fizeram dessa fase da minha vida uma passagem muito

mais agradável!

v

SUMÁRIO página

RESUMO........................................................................ vii

ABSTRACT.................................................................... viii

1. INTRODUÇÃO........................................................... 01

2. REVISÃO DE LITERATURA...................................... 03

2.1. H+-ATPase vacuolar........................................... 03

2.2. H+-PPase vacuolar............................................. 05

2.3. Estresse nas plantas.......................................... 09

2.3.1. O estresse hídrico...................................... 11

2.4. Tiririca (Cyperus rotundus)................................ 12

2.5. Cana-de-açúcar (Híbrido interespecífico de

Saccharum L.)................................................................

16

2.6. Milho (Zea mays).............................................. 17

3. OBJETIVO GERAL..................................................... 19

3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................. 19

4. MATERIAL E MÉTODOS........................................... 20

4.1 Plantas................................................................. 20

4.2 Preparação da fração microssomal..................... 21

4.3 Purificação das vesículas de tonoplasto e

membrana plasmática....................................................

22

4.4 Determinação das atividades PPásicas e

ATPásicas......................................................................

23

4.5 Monitoramento do gradiente de prótons ............. 23

4.6 Determinação da condutância estomática e da

transpiração....................................................................

23

4.7 Determinação da fluorescência da clorofila a...... 24

4.8 Determinação do teor de clorofila........................ 24

4.9 Microscopia eletrônica de transmissão e

imunocitoquímica............................................................

24

4.10 Microscopia eletrônica de varredura................. 25

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................. 26

5.1 Atividade hidrolítica e de transporte de H+ da P- 26

vi

ATPase, da V-ATPase e da PPase em plantas de C.

rotundus..........................................................................

5.2 Condutância estomática e da transpiração......... 41

5.3 Fluorescência da clorofila a................................ 42

5.4 Teores de clorofila............................................... 45

5.5 Microscopia eletrônica de varredura................... 46

5.6 Microscopia eletrônica de transmissão............... 48

5.7 Atividade hidrolítica e de transporte de H+ da P-

ATPase, da V-ATPase e da PPase em colmos de

Saccharum spp...............................................................

50

6. CONCLUSÕES.......................................................... 53

7. BIBLIOGRAFIA........................................................... 55

vii

RESUMO A Cyperus rotundus é uma espécie que possui alto vigor reprodutivo e

rusticidade, que expressam sua alta capacidade de sobreviver a

situações de estresse abiótico. O turgor celular é parcialmente

controlado pelas bombas de prótons vacuolares, que geram gradiente

de H+ e facilitam o transporte secundário de íons e água para dentro do

vacúolo. A análise das bombas de prótons de C. rotundus retiradas de

seu ambiente natural exibiram uma hidrólise de PPi de cerca de 30%

em relação a hidrólise do ATP, enquanto que o gradiente de prótons

gerado por ambas as bombas foram muito similares. Esses dados

sugerem que, em condição natural de campo, as bombas de prótons

vacuolares funcionam como em outras espécies vegetais e que a V-

ATPase é a principal bomba. Analizando o desenvolvimento dessa

planta daninha sob condição de estresse hídrico, observou-se que as

atividadedes hidrolíticas de ambas as bombas foram progressivamente

inibida com o estresse hídrico. Após o restabelecimento da irrigação, a

atividade tanto de hidrólise, quanto de transporte de H+ pela PPase é

estimulada, estímulo esse que diminui para níveis próximos ao controle

48h após o restabelecimento da irrigação. A atividade da V-ATPase foi

pouco alterada, sugerindo que a capacidade de manter o turgor da

célula vem do trabalho em conjunto das duas bombas vacuolares. A

PPase funciona como um sistema back-up para a ATPase, suprindo o

meio citossólico de Pi para síntese de ATP pela ATPase. Em cana-de-

açúcar, análise de data mining no banco de dados SUCEST sugere que

os genes que codificam para as bombas de prótons vacuolares são

expressos em altos níveis em tecido de casca e os dados apresentados

no presente trabalho confirmam a atividade alta das bombas de prótons

nesse tecido. Esses dados são discutidos em relação ao possível papel

dessas bombas no metabolismo da cana-de-açúcar.

viii

ABSTRACT Cyperus rotundus is a weed that has high reproductive vigor and

rusticity that express high capacity to cope with abiotic stress. The cell

turgor is partially controlled by vacuolar H+-pumps, which generate a H+-

gradient that energize the uptake of ions and water into the vacuole.

The analysis of the vacuolar H+-pumps of plants of Cyperus rotundus

harvested from their natural environment exhibited a PPi hydrolysis

about 30% of their ATP hydrolysis, while the H+-gradients coupled to

either PPi and ATP hydrolytic activities were quite similar. These data

suggest that, on field conditions, the vacuolar proton pumps function just

like other plants and the V-ATPase is the main proton pump. Analyzing

this weed development under drought stress the activity of both

tonoplast H+-pumps were progressively inhibited. After rewatering, the

H+-PPase activity exhibited a striking stimulation, but this activation

declines to the level of control plants 48h after rehydration. In contrast,

the V-ATPase activity was only barely changed, suggesting that the

vacuolar turgor capacity of C. rotundus could be regulated by both

proton pumps working together during drought stress. It is likely that H+-

PPase function as backup system on ATP synthesis. On sugar cane

study, analyses of data mining in SUCEST bank (sugarcane EST

Project) suggest that the genes encoding this vacuolar H+-pumps are

expressed in higher levels in stem bark and our results confirm and

extend the data mining analysis of SUCEST bank suggesting that the

proton pumps are induced in the active form in stem bark of sugarcane.

These data are discussed in relation to a possible role of these pumps

in the yet underestimated metabolism of the stem bark of sugarcane.

1

1 - INTRODUÇÃO

A população mundial está aumentando em uma taxa alarmante e

espera-se que alcance aproximadamente seis bilhões de pessoas até o

final do ano de 2050. Por outro lado, a produção de alimentos está

diminuindo devido ao efeito de vários estresses bióticos e abióticos.

Assim, minimizar estas perdas é uma grande área de interesse para

todas as nações que precisam lidar com as exigências crescentes do

alimento. A herbivoria, a competição por plantas invasoras, o frio, a

salinidade e a seca são, entre os estresses principais, aqueles que

prejudicam o crescimento e a produtividade de plantas (Mahajan e

Tuteja, 2005).

Dados divulgados pela Empresa Brasileira de Pesquisa

Agropecuária (EMBRAPA) relatam que dos 3,3 bilhões de hectares

considerados aptos para a agricultura no mundo, cerca de 28% estão

sujeitos a estresse hídrico por déficit de água, 22% a estresses

minerais e 12% a estresse por excesso de água. Com isso, pode-se

dizer que o desenvolvimento de uma agricultura sustentável em áreas

tropicais deve estar apoiado em estratégias de desenvolvimento de

plantas mais adaptadas às condições de estresse ambiental,

associadas a práticas de manejo de água e nutrientes que conduzam a

ganhos de eficiência e desempenho das culturas.

O estresse hídrico é, sem dúvida, o maior limitador da

produtividade de plantas cultivadas em todo o mundo (Bohnert et al.,

1995). A identificação e compreensão dos mecanismos de tolerância ao

estresse hídrico são de grande importância para o desenvolvimento de

novas cultivares (van Rensburg, 1994; Ingram e Bartels, 1996).

Vários estudos têm sido feitos com o objetivo de identificar

padrões fisiológicos que possam ser usados como critérios para a

seleção de resistência ao estresse hídrico (Blum et al., 1996; Dure et

al., 1989).

Diferente do que ocorre nos laboratórios, as plantas no campo

estão sujeitas a incidência de vários estresses simultâneos. De fato,

2

dados recentes de varredura de expressão gênica mostram que os

mecanismos de tolerância a esses estresses apresentam vários

componentes que se sobrepõem (Bohnert et al.., 2001). Nesse projeto

será estudada a ação da ATPase e da H+-PPase vacuolar nos

mecanismos de adaptação ao estresse hídrico. Embora cada enzima

seja específica na utilização de seus respectivos substratos (Rea, et al.,

1992), ambas catalisam a translocação eletrogênica de prótons do

citossol para o lúmem do vacúolo para gerar um gradiente

eletroquímico de prótons. Esta força próton motriz promove a energia

para o transporte secundário de vários íons e metabólitos através da

membrana (Rea et al., 1992; Sze et al., 1992). No tonoplasto, a V-

ATPase é a mais abundante bomba de prótons, sendo

extraordinariamente importante para manter a homeostase iônica e o

metabolismo celular (Lüttge e Ratajczak, 1997). A H+-PPase vacuolar é

uma bomba transportadora de prótons que têm suas atividade e/ou

expressão modulados durante os mais diversos estresses ambientais.

Rea e Poole (1993) citados por Maeshima (2000) indicaram a

importância desta enzima em células vegetais sob condições de

estresse energético, com isso, exerce função importante nas

estratégias de sobrevivência de plantas expostas a condições limitantes

de suprimento de ATP.

Plantas resistentes ao estresse hídrico são capazes de manter

seu turgor mesmo com potencial hídrico baixo, aumentando o número

de moléculas de solutos dentro da célula (Bray et al., 2000).

Para que as plantas sejam capazes de sobreviver as constantes

alterações do ambiente e ao mesmo tempo manter suas condições

metabólicas em um nível ótimo, a expressão e a atividade das bombas

de próntos deve ser muito bem reguladas (Gaxiola et al., 2007).

A planta daninha tiririca (Cyperus rotundus L.) e a cultivada

cana-de-açúcar (Saccharum sp) foram selecionadas para objeto de

estudo devido sua rusticidade e alta capacidade de proliferação.

3

2 - REVISÃO DE LITERATURA

Bombas de prótons são proteínas integrais da membrana que

funcionam a partir da hidrólise de moléculas de ATP, no caso das

ATPases, e PPi, no caso das PPases. Efetuam o transporte ativo dos

prótons através da membrana da célula e possuem como objetivos a

manutenção da composição iônica intracelular, a importação de solutos

contra o gradiente de concentração, o balanço da pressão osmótica dos

dois lados da membrana celular e também, a manutenção do potencial

da membrana celular.

As bombas podem funcionar contra o gradiente de concentração,

bombeando os prótons e, neste caso, consumindo energia. No entanto,

as ATPases podem também funcionar de forma reversa, sintetizando

ATP a partir de ADP e Pi, quando permitem a passagem dos prótons a

favor do gradiente de concentração.

Pedersen e Carafoli (1987) baseados em considerações de

estrutura e mecanismo de ação, agruparam as ATPases em 3 classes

principais: P, V e F. Essas ATPases estão distribuídas nas diversas

membranas celulares e sua função básica é a hidrólise ou síntese de

ATP e o transporte de íons. Além desses sistemas existe um quarto tipo

de bomba de prótons que foi posteriormente identificado, as H+-

pirofostatases (PPase).

Células vegetais são as únicas que contém vacúolos, que

ocupam grande parte de seu volume celular, e as principais enzimas,

presentes no tonoplasto, responsáveis pela acidificação do vacúolo

central são a V-ATPase e a PPase (Sze 1985, Taiz, 1992; Rea e Poole,

1993,). Essas 2 bombas de prótons fornecem o gradiente eletroquímico

de H+ que energiza o transporte de outros metabólitos (Rea e Sanders,

1987).

2.1 – H+-ATPase Vacuolar

A H+-ATPase vacuolar (V-ATPase) é a enzima responsável pela

acidificação do vacúolo central. Também está presente no Golgi e em

vários outros sistemas de endomembranas das células vegetais

4

(Ratajczak et al., 1999). A maior parte dos processos de transporte

secundário são impulsionados por um gradiente eletroquímico de

prótons gerado pela V-ATPase, incluindo reações de osmoregulação,

homeostase, armazenamento, defesa vegetal e muitas outras funções.

Ela exerce um importante papel no controle do pH extra e intra cellular

nas células eucarióticas, que é essencial para o bom funcionamento

dos processos celulares (Yao et al., 2007).

A V-ATPase de vegetais é estruturalmente muito semelhante a

de outros seres eucariotos e suas subunidades são codificadas por

uma família de múltiplos genes, que desempenha um importante papel

na regulação da expressão gênica e na separação das isoformas das

V-ATPase para as diferentes organelas (Taiz, 1992). É uma enzima

multimérica que exibe uma estrutura molecular complexa. Mais de 10

diferentes subunidades da V-ATPase já foram descritas para algumas

plantas (DuPont e Morrissey, 1992; Ward e Sze, 1992). Três dessas

subunidades, que foram encontradas em todas as V-ATPases

estudadas até o momento parecem ser mais importantes para o seu

funcionamento, são elas a subunidade calalítica A (~ 70kDa) e a

subunidade regulatória B (~ 60kDa), ambas localizadas na periferia da

membrana no domínio V1 e o canal de prótons hidrofóbico, formado

pela subunidade C (~ 16kDa) que formam o domínio V0, integral da

membrana (Rockel et al., 1998). No tonoplasto, a V-ATPase é a mais

abundante, atingindo 6,5 – 35% da proteína total do vacúolo de

diferentes espécies (Xiao et al., 2007). Sua estrutura pode ser

visualizada na figura 1.

5

Figura 1 - Modelo esquemático de uma V-ATPase de planta (Drory e

Nelson, 2006; Gaxiola et al., 2007)

Devido a sua função como uma bomba de H+ no tonoplasto, a V-

ATPase está envolvida no transporte de metabólitos para dentro do

vacúolo. Por outro lado, em condições de estresse ambiental, a V-

ATPase funciona como uma enzima de resposta a estresses sofrendo

modificações moderadas na expressão de suas subunidades e

modulação de estrutura (Dietz et al., 2001). Visto que está envolvida em

adaptações ecofisiológicas em níveis moleculares, a V-ATPase foi,

também denominada como uma “eco-enzima” (Lüttge et al., 1995, ).

Pouca atenção tem sido dada para a função da V-ATPase em

situação de estresse hídrico. Dietz et al.(2001) alertavam para a

necessidade de estudos da atividade e expressão da V-ATPase em

plantas submetidas ao déficit hídrico.

2.2 - H+-PPase Vacuolar

Uma característica própria de plantas é a existência de vias

metabólicas paralelas que usam tanto nucleotídeos quanto pirofosfato

como fontes alternativas de energia. Uma delas é a H+-ATPase, a qual

está presente em todos os eucarióticos e a outra é a Pirofosfatase

(PPase) que tem sido encontrada em todas as plantas e em algumas

bactérias fototróficas (Rea e Poole, 1993) e protozoários. Já está bem

6

estabelecido que a membrana vacuolar (tonoplasto) de células vegetais

possui 2 bombas de prótons, a H+-ATPase e a PPase. São sugeridas

duas hipóteses para a existência de duas bombas numa mesma

membrana: que a PPase agiria como um sistema back-up para a H+-

ATPase nas condições em que o fornecimento de ATP fosse limitado

ou que a PPase é reversível e pode usar o gradiente de H+ do trans-

tonoplasto para sintetizar PPi (Leigh et al., 1992).

A localização da PPase é ainda controvertida. Quando ela foi

primeiramente isolada em tonoplasto, acreditava-se que ela fosse uma

enzima marcadora de vacúolo (Maeshima, 1990), porém estudos

recentes têm mostrado que a PPase é encontrada em membrana

plasmática (Long et al. 1995; Robinson et al.. 1996), complexo de Golgi

e retículo endoplasmático.

Por algum tempo já se suspeitava da existência de PPase

associada à membrana. Foi em meados dos anos 70, que Karlsson

(1975) demonstrou uma atividade PPase estimulada por K+ e Walker e

Leigh (1981) caracterizaram uma PPase dependente de Mg2+. Somente

em 1985 é que finalmente identificaram que o transporte de H+

dependente de PPi era mediado por uma PPase e não uma V-ATPase

capaz de usar PPi em algumas circunstâncias. Seguidas

caracterizações mostraram que essa PPase diferia da V-ATPase em

vários aspectos: A PPase era estimulada pelo K+ enquanto que a V-

ATPase era seletivamente ativada por halógenos; nem a hidrolise nem

o transporte de prótons pela PPase são inibidos por nitrato; finalmente

foi mostrado que a PPase é específica para MgPPi (ou Mg2PPi) como

substrato enquanto que a V-ATPase não mostra nenhuma atividade

em relação a esse composto.

As atividades tanto de transporte de prótons dependente de PPi

quanto a de hidrólise estimulada por K+ e /ou insensível a molibidato

tem sido demonstrada em membranas vacuolares da maioria dos

principais tipos de plantas vasculares (plantas monocotiledôneas,

dicotiledôneas, C3, C4 e CAM) como também em seus prováveis

ancestrais, a algas clarófitas. Mais ainda, a PPase é o componente

principal das membranas vacuolares e é capaz de gerar um gradiente

7

de prótons de magnitude similar ou superior do que a V-ATPase

(Maeshima e Yoshida, 1989). A estimativa de abundância sugere que

essas enzimas constituem de 1% (em Beta vulgaris) e 5-10% (em Mung

bean) da proteína total da membrana vacuolar (Maeshima e Yoshida,

1989).

A membrana vacuolar preparada a partir de várias espécies de

plantas, incluindo musgos, samambáias, e algas, apresenta atividades

PPásicas em adição a V-ATPase (Nakanishi e Maeshima, 1998).

Notáveis exemplos de PPases transportadoras ou conservadoras de

energia são as PPases reversíveis transportadoras de prótons

encontradas em cromatóforos de bactérias não sulfurosas,

Rhodospirillum rubrum, as PPases transportadoras de Prótons

vacuolares de células vegetais e PPase associada a membrana de

animal e mitocondria de levedura.

Essa última, porém, apresenta padrões de sensibilidade a

inibidores bem diferentes das duas primeiras (Baykov et al., 1993).

Baseado nestes resultados considera-se que as PPases associadas a

mitocôndria pertencem a um grupo distinto de PPases (Baykov et al.,

1993).

A PPase está amplamente distribuída entre as plantas

superiores, algas e bactérias fotossintéticas, Rhodospirillum rubrum.

Embora Lichko e Okorokov (1984) tenham demonstrado uma atividade

de transporte de prótons dependente de PPi em frações enriquecidas

de tonoplasto de Saccharomyces carlsbergenesis, a H+-PPase é ainda

considerada restrita a plantas (Rea et al., 1992) e certos procariotos.

A PPase consiste de um único peptídeo com uma massa

molecular de aproximadamente 73KDa (Nakanishi e Maeshima, 1998),

embora tenham sido encontrados valores de pesos moleculares

diferentes em várias espécies, 67,000 (Beta vulgaris) e 73,000 (Vigna

radiata) para a mesma subunidade. Essa subunidade mostra-se não

somente necessária, mas também suficiente para o transporte de H+

dependente de PPi. A subunidade que se liga ao substrato funciona

como um monômero durante a hidrólise de PPi (Rea e Poole, 1993),

embora tenha sido proposto uma estrutura dimérica para a PPase

8

funcional nativa (Sato et al., 1991). A estrutura primária da PPase foi

deduzida a partir do cDNA de Arabdopsis thaliana, cevada, beterraba,

tabaco e arroz, no entanto, poucos resíduos característicos foram

determinados (Takasu et al.., 1997). A estrutura da PPase pode ser

visualizada na figura 2.

A abundância e a ubiqüidade da PPase em plantas necessita um

fornecimento regular de PPi citossólico e uma taxa de ação de massa

PPi:Pi em favor da translocação de prótons. O nível de PPi em tecidos

vegetais varia na faixa de 5-39 nmol/g de peso fresco (Smyth et al..,

1984) e esse PPi parece está quase que limitado ao citossol. Já foi

calculado em folhas de espinafre e protoplasto de mesófilo de trigo o

PPi citossólico de 200 a 300 µM (Weiner et al. , 1987), enquanto que

em outras organelas como vacúolo e cloroplasto de alga, Chara, foi

encontra <1 e 2-3µM respectivamente, contra 193µM para o citossol

(Takeshige e Takawa, 1989). Considerando uma estequiometria de H+:

PPi igual a 1, considera-se que a energia livre liberada pela hidrólise do

PPi citossólico exceda o mínimo teórico requerido para energização

vacuolar.

Figura 2 – Modelo de H+-PPase de Streptomyces coelicolor (Gaxiola et al.., 2007)

9

Gaxiola (2001) mostrou que a PPase é codificada por um único

gene e, provavelmente por esse motivo, é mais fácil de ser sintetizada

que a V-ATPase em condições de estresse metabólico.

2.3 - Estresse nas Plantas

O termo estresse é definido como qualquer fator físicoquímico ou

ambiental capaz de produzir uma tensão prejudicial ao organismo vivo

(Levitt, 1980) e a definição mais aceita para estresse ambiental é, uma

força adversa ou uma condição que inibe o funcionamento normal de

um sistema biológico como as plantas (Jones e Jones, 1989). Na

natureza o estresse, normalmente, não acontece isoladamente, mas

sim em conjunto com outros, assim, existem diversas vias para que as

plantas sejam capazes de sobreviver a uma situação de estresse

(Mahajan e Narendra, 2005).

As plantas são constantemente expostas a uma série de fatores

de estresses como, baixas temperaturas, salinidade, seca, alagamento,

calor, estresses oxidativos e toxidade por metais pesados, sendo que

os estresses abióticos são a principal causa da queda na produtividade

mundial, causando perdas de centenas de milhões de dólares por ano

(Bray et al.., 2000).

As plantas respondem ao estresse ambiental de maneira

complexa e dinâmica. Um número crescente de evidências mostra que

as membranas possuem um papel central na percepção do estresse,

respondendo ao estímulo ambiental (e hormonal) através da alteração

do bombeamento de íons e da conformação das proteínas ligadas a

membrana e suas atividades. As membranas participam diretamente ou

indiretamente, determinando a compartimentalização de precursores,

intermediários, produtos, e efetores de sistemas enzimáticos não

ligados à membrana, influenciando o pH. Em resposta a situações de

estresses, vários genes são regulados de modo a minimizar os efeitos

do estresse em questão (Shinozaki et al., 2003).

Amzallag e Lerner (1994) dividem a resposta ao estresse em 2

grupos principais: os de resposta rápida, que está relacionada a um

programa de defesa preexistente na planta e ou outro denominado

10

adaptação, onde o tempo influencia de maneira crucial na elaboração

dessa resposta. A adaptação é uma resposta prolongada durante a

qual as plantas ajustam sua fisiologia as condições ambientais numa

maneira orientada pelo meio.

Quando uma planta responde ao estresse através de sua

resistência (resposta pré-adaptativa) ela expressa um programa

preexistente que lhe permite sobreviver ao estresse mantendo (mais ou

menos) seu programa original de desenvolvimento, onde o estresse é

considerado como o gatilho da expressão genética.

A resistência reflete a capacidade da planta de expressar, sob

estresse, seu programa de desenvolvimento original. Em geral, a

expressão deste programa preexistente ocorre relativamente rápido, em

48h de exposição ao estresse. A reação não é específica ao estresse

particular e rapidamente estabiliza ao nível atual. A diminuição do

crescimento é proporcional a intensidade do estresse e inversamente

proporcional a tolerância (capacidade pré-adaptativa) da planta.

Durante a adaptação a planta estabelece um novo programa de

desenvolvimento como função das condições precisas de estresse. No

início do processo de adaptação existe uma considerável diminuição no

crescimento, que é comumente mais importante do que a

preadaptação. Uma vez a planta esteja adaptada, a velocidade de

crescimento aumenta, e pode atingir níveis similares a média de

velocidade de crescimento relativo (RGR – relative growth rate)

comparada as plantas controle de mesma idade. Um aumento da RGR

no final do processo de adaptação indica que o fim do estresse à

planta. A resposta adaptativa inclui modifições do balanço hormonal,

processos metabólicos e expressão de genoma. Em contraste a

resposta pré-adaptativa não é completamente pré-programada no

genoma.

Enquanto a resposta adaptativa não é programada, a

capacidade de responder ao estresse por adaptação é geneticamente

controlada. Nem toda espécie possui essa capacidade de adaptação.

Dentro de uma espécie capaz de se adaptar, nem todo o cultivar é

11

capaz . E mais ainda, dentro de uma espécie, nem todo o cultivar que

se adapta o faz com a mesma extensão (Amzallag e Lerner, 1994).

Quando ocorrem severas mudanças nas condições ambientais,

a célula pode responder de uma maneira específica e rápida

selecionando o aumento ou diminuição da expressão de genes

específicos. Os genes cuja expressão é aumentada durante o tempo de

estresse, são, presumivelmente críticos para a adaptação do organismo

à condição adversa; um exame dos genes ativados em resposta ao

estresse podem mostrar-se útil no entendimento da resposta biológica

de plantas em condições de estresse. Os sistemas genéticos que

respondem ao estresse são de interesse não somente devido ao seu

papel de apoiar a planta sob estresse, mas também por sua utilidade no

estudo dos eventos moleculares que controlam o nível quantitativo da

expressão gênica (Matters e Scandallos, 1986).

Nem toda resposta metabólica é considerada deletéria ou

prejudicial, e o maior desafio para os bioquímicos é distinguir as

respostas que representam um sintoma prejudicial e aquelas que são

verdadeiramente adaptativas, ou seja, que favorecem o crescimento

continuado durante a recuperação ao estresse. Na verdade para

qualquer variável no metabolismo deve existir uma faixa ótima, onde

abaixo dela a planta pode sofrer privação, e exceder essa faixa pode

levar a toxicidade (DeRocher e Bohnert, 1993).

2.3.1 - O estresse hídrico

O estresse hídrico pode ser causado por excesso ou por falta de

água. O estresse hídrico mais comum é o causado por falta de

disponibilidade de água para as plantas. A remoção de água das

membranas rompe a estrutura normal da bicamada lipídica e a

membrana plasmática fica extremamente porosa, podendo levar a um

desarranjo das proteínas presentes na membrana, o que contribui para

a perda de sua integridade e seletividade e também, na perda da

capacidade enzimática (Crowe et al., 1992; Hoekstra et al.., 2001;

Mahajan e Narendra, 2005). Além dos danos à membrana, o estresse

hídrico pode causar redução na atividade de proteínas citossólicas ou

12

de organelas. A alta concentração de eletrólitos durante a desidratação

pode causar rompimento no metabolismo celular (Liu e Zhu, 1998;

Yanqiong et al.., 2007).

Um outro efeito fisiológico causado pelo estresse hídrico é a

redução do crescimento vegetativo das plantas. A parte aérea é,

normalmente, mais sensível que as raízes e a redução da expansão da

parte aérea em situação de estresse hídrico é benéfica para a planta,

tendo em vista a redução na transpiração. Já o crescimento radicular

recebe um estímulo de crescimento, com o objetivo de explorar novas

áreas do solo a procura de água (Liu e Zhu, 1998).

O aumento da temperatura ou a rápida queda na umidade

resultam em uma condição de déficit hídrico para as plantas. A primeira

resposta de todas as plantas ao déficit hídrico é, em geral, o

fechamento dos estômatos, para evitar a perda de água por

transpiração (Mansfeld e Atkinson, 1990). O fechamento estomático

pode ser resultado da evaporação direta da água das células guarda

sem envolvimento metabólico, sendo conhecido como fechamento

hidropassivo, ou pode ser dependente do metabolismo, envolvendo

fluxo de íons que causam o fechamento estomático.

2.4 - Tiririca (Cyperus rotundus L.)

As plantas daninhas verdadeiras são, segundo Fisher (1973), as

que apresentam rusticidade e grande vigor vegetativo e reprodutivo,

tendo capacidade de sobreviver, crescer e reproduzir em condições

extremas de ambiente, como seca, encharcamento, altas e baixas

temperaturas, solos com problemas de salinidade, alcalinidade e

acidez. Além disso, são resistentes a pragas e doenças. De acordo com

Cardenas et al.. (1972), as principais características das plantas

daninhas são: ciclo de vida semelhante ao da cultura, plasticidade

populacional, germinação desuniforme (mecanismo de sobrevivência

em função da dormência), produção de inibidores (efeitos alelopáticos

ou teletóxidos) e produção de grande número de sementes (reprodução

sexuada) e/ou estruturas reprodutivas (reprodução assexuada).

13

Os danos causados pelas invasoras tendem a ser medido,

através do número de culturas que afetam, pela dificuldade de controle,

e pelo número de países em que ocorrem. A Cyperus rotundus, que

pode ser visualizada na figura 3, é considerada uma das espécie mais

nociva entre as plantas daninhas (Holm et al., 1977), sendo inclusive

citada no Guinnes Book (1994), como infestante de 52 importantes

culturas em 92 países. É uma planta altamente competitiva e de difícil

controle químico e/ou mecânico, ocorrendo com freqüência nas regiões

compreendidas entre as latitudes 30º Norte a 35º Sul (Junqueira Neto

et al.., 1982). No Brasil a Cyperus rotundus ocorre em toda extensão

territorial. É a invasora mais conhecida no país, possui ampla

distribuição, rápida disseminação, crescimento e desenvolvimento, alta

capacidade de competição e rusticidade. Pode ser ainda hospedeira

alternativa para fungos como e Fusarium spp, insetos, ácaros e para

diversas espécies de nematóides, além de causar efeitos alelopáticos,

produzindo substâncias que afetam a germinação, a brotação e o

desenvolvimento de outras espécies (Kissmann, 1991; Lorenzi, 1994).

A Cyperus rotundus é altamente beneficiada pelos cultivos

intensivos do solo, o que favorece a sua multiplicação e dispersão e,

além disso, é resistente a grande maioria dos herbicidas registrados

(Forster e Cerdeira, 1993; Sharma e Gupta, 2007). Em conseqüência

destas características e de sua rápida propagação vegetativa, esta

ciperácea passa a dominar áreas agrícolas com quase total

exclusividade.

A Cyperus rotundus é uma planta de metabolismo C4 (Mercado,

1979), e por este motivo é beneficiada por alta intensidade luminosa e

temperatura elevada (Holm et al., 1977) mantendo uma alta atividade

fotossintética nestas condições, com ausência aparente de

fotorespiração (Taiz e Zeiger, 1995; Guimarães, 1993). Essas

características fazem com que essa planta daninha se torne muito mais

competitiva nas regiões tropicais. Muitas culturas de importância

econômica são afetadas pela Cyperus rotundus, como a cana-de-

açúcar, o milho, o feijão, o arroz, a soja e hortaliças.

14

Na cana-de-açúcar, cerca de 1 milhão de hectares plantados

com esta cultura apresentam infestação de Cyperus rotundus, no Brasil

(Kissmann, 1991). Os prejuízos decorrem de competição, durante todo

o ciclo, mas especialmente é na fase inicial da cultura e nas reformas

que a invasora ocasiona maiores problemas. Pela exudação de

substâncias químicas de efeito alelopático a Cyperus rotundus inibe a

brotação de gemas e o perfilhamento da cana, o que resulta em

estandes muito baixos (Lorenzi, 1983; Durigan, 1991). Na Colômbia

Cruz et al. (1971), demonstraram que uma competição inicial por 10

dias reduziu em 10% a produtividade da cana-de-açúcar, enquanto a

competição por 30 dias reduziu em 30%. Experimentos conduzidos na

Argentina, em 1965, citados por Kissmann (1991), mostraram que em

casos extremos de infestação há uma queda de até 75% na colheita de

cana e uma redução de 65% na produção de açúcar.

15

Figura 3 – A Cyperus rotundus L.

Rede de tubérculos

16

2.5 - Cana-de-açúcar (híbrido interespecífico de Saccharum L.)

Originária do sudeste da Ásia, onde é cultivada desde épocas

remotas, a exploração canavieira assentou-se, no início, sobre a

espécie S. officinarum. O surgimento de várias doenças e de uma

tecnologia mais avançada exigiram a criação de novas variedades, as

quais foram obtidas pelo cruzamento da S. officinarum com as outras

quatro espécies do gênero Saccharum e, posteriormente, através de

recruzamentos com as ascendentes (Doorembos e Kassam, 1979)).

Os trabalhos de melhoramento persistem até os dias atuais e

conferem a todas as variedades em cultivo uma mistura das cinco

espécies originais e a existência de cultivares ou variedades híbridas.

A importância da cana-de-açúcar pode ser atribuída à sua

múltipla utilização, podendo ser empregada in natura, sob a forma de

forragem, para alimentação animal, ou como matéria prima para a

fabricação de rapadura, melado, aguardente, açúcar e álcool (Orlando

Filho, 1983) .

O Brasil encontra-se em primeiro lugar no ranking mundial da

produção de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), atualmente com uma

área total cultuvada de aproximadamente 5.400.000 há e uma

produção anual da ordem de 400.000.000 de toneladas (cana colhida).

O estado de Alagoas com aproximadamente 7,7% da área colhida do

Brasil (Agrianual, 2007). Com essa produção a cultura da cana-de-

açúcar demonstra ser de grande importância para a economia do

Brasil.

As características dos cultivares influenciam a eficiência

fotossintética da cana, além das variações climáticas que prevalecem

durante o desenvolvimento da cultura. A fotossíntese é correlacionada

negativamente com a largura das folhas e positivamente com a sua

espessura. A temperatura e a disponibilidade de água no solo, dos

fatores climáticos, são os mais importantes para a produção de cana-

de-açúcar (Vitória Filho e Christoffoleti, 2004). Sendo a cana-de-açúcar

uma planta de metabolismo fotossintético C4, é considerada altamente

eficiente na conversão de energia radiante em energia química.

17

Para o aprimoramento do cultivo da cana-de-açúcar, existe a

necessidade de melhor entendimento sobre o metabolismo do processo

fotossintético. É necessário conhecer-se mais e melhor o sistema de

transporte e de acúmulo dos metabólicos, principalmente sacarose, o

mais valioso produto da cana-de-açúcar .

2.6 – Milho (Zea mays L.)

O milho é uma das mais importantes plantas comerciais com

origem nas Américas. Há indicações de que sua origem tenha sido no

México, América Central ou Sudoeste dos Estados Unidos. É uma das

culturas mais antigas do mundo, havendo provas, através de

escavações arqueológicas e geológicas, e através de medições por

desintegração radioativa, de que é cultivado há pelo menos 5.000 anos.

Logo depois do descobrimento da América, foi levado para a Europa,

onde era cultivado em jardins, até que seu valor alimentício tornou-se

conhecido.

A importância econômica do milho é caracterizada pelas

diversas formas de sua utilização, que vai desde a alimentação animal

até a indústria de alta tecnologia. Na realidade, o uso do milho em grão

como alimentação animal representa a maior parte do consumo desse

cereal, isto é, cerca de 70% no mundo. Nos Estados Unidos, cerca de

50% é destinado a esse fim, enquanto que no Brasil varia de 60 a 80%,

dependendo da fonte da estimativa e de ano para ano (Fanceli e

Dourado Neto, 2000)

O milho é uma planta característica de clima tropical, ou seja,

exige calor e umidade para produzir satisfatoriamente e proporcionar

rendimentos compensadores (Resende et al., 2000).

Em plantas de milho, o déficit hídrico afeta praticamente todos os

aspectos relacionados ao desenvolvimento das plantas, reduzindo a

área foliar, diminuindo a fotossíntese e afetando vários outros

processos, além de alterar o ambiente físico das culturas, por modificar

o balanço de energia do sistema (Bergamaschi, 1992).

18

As restrições causadas pela baixa disponibilidade de água do

solo ou pela alta demanda evaporativa ativam certos mecanismos

fisiológicos que permitem aos vegetais escapar ou tolerar essas

limitações climáticas, modificando seu crescimento e desenvolvimento,

e até mesmo atenuando as reduções na produção final.

O milho é cultivado em regiões cuja precipitação varia de 300 a

5.000 mm anuais, sendo que a quantidade de água consumida por uma

lavoura de milho durante o seu ciclo está em torno de 600 mm. Dois

dias de estresse hídrico no florescimento diminuem o rendimento em

mais de 20%, quatro a oito dias diminuem em mais de 50% (Magalhães

e Durães, 2006).

Segundo Kramer (1969), os efeitos causados pelo déficit hídrico

são devidos às modificações na anatomia, morfologia, fisiologia e

bioquímica das plantas.

19

3 - OBJETIVO GERAL

Caracterizar a nível celular, bioquímico e molecular as enzimas

transdutoras de energia em espécies vegetais que expressem

diferentes suscetibilidades ao estresse hídrico. A abordagem visa

atender a grande demanda de conhecimento básico da área e

desenvolver ferramentas de suporte a programas de geração de

variedades mais adaptadas e tolerantes a condições de estresses

abióticos (extremos de seca).

3.1 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Gerar conhecimento científico básico sobre o funcionamento e

distribuição dos sistemas de transdução de energia da planta

daninha Cyperus rotundus, e da planta cultivada Saccharum spp.,

as quais apresentam impressionante tolerância a estresses

ambientais e das quais pouco se conhece sobre sua energética

celular, além de estabelecer comparação entre a planta daninha e a

cultivada Zea mays ;

2. Identificar padrões de distribuição, abundância e atividade das

bombas de prótons V-ATPase e PPase que possam ser usados

como indicadores para fenotipagem de plantas tolerantes ao

estresse hídrico.

3. Elucidar mecanismos envolvidos na ativação de vias alternativas do

metabolismo energético que utilizam pirofosfato ao invés de ATP,

durante a adaptação ao estresse hídrico em plantas visando o futuro

desenvolvimento de variedades adaptadas de culturas importantes.

20

4 - MATERIAL E MÉTODOS

O presente trabalho foi realizado em duas fases, a primeira com plantas

retiradas de uma área experimental do campo e a segunda com plantas

cultivadas em casa de vegetação e submetidas ao estresse hídrico.

As médias dos dados climatológicos obtidos pelo Setor de Irrigação e

Agrometeorologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense na

estação evapotranspirométrica em Campos dos Goytacazes, RJ, entre

março de 2002 e dezembro de 2003 e março de 2004 e dezembro de

2005 , foram: precipitação, 620 mm; umidade relativa, 79,8 %;

temperatura máxima, 28,3ºC; temperatura mínima, 18,9 ºC e

temperatura média, 24,5 ºC.

A segunda fase foi realizada em casa de vegetação, também na

Unidade de Apoio à Pesquisa, no campus da Universidade Estadual do

Norte Fluminense Darcy Ribeiro – UENF, no município de Campos dos

Goytacazes, RJ.

4.1 – Plantas

Na primeira fase foram utilizadas plantas adultas de Cyperus

rotundus coletadas em campo aberto, na Unidade de Apoio à Pesquisa,

no campus da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro – UENF, no município de Campos dos Goytacazes, RJ, região,

segundo Andreazzi (1997), localizada ao Norte do Estado do Rio de

Janeiro a uma altitude de 13 m do nível médio do mar, tendo como

coordenadas geográficas 21º 45´15” de latitude Sul e 41º 19´28” de

longitude Oeste. O clima da região, conforme W. Koppen é classificado

como Awi, com temperatura média em torno de 24 ºC e precipitação

pluvial de 932 mm por ano.

Na segunda fase foram utilizados tubérculos de C. rotundus,

colmos de cana-de-açúcar e sementes de milho, que foram plantados

em vasos com capacidade para 8 litros, contendo uma mistura de

substrato e areia na proporção de 2 :1.

As características químicas da mistura de areia e substrato

utilizada são apresentadas no Quadro 1.

21

Quadro 1 - – Resultado da análise química do solo utilizado

Características Químicas

pH Ca2+ Mg2+ Al3+ Na+ K P

H2O cmolc.dm3 mg.dm3

7,2 2,2 2,3 0,0 0,26 1,518 18,70

Análise realizada no Laboratório de Solos da UFRRJ em

Campos dos Goytacazes, RJ.

As plantas cultivadas foram irrigadas diariamente e após 15 a 20

dias da germinação, foram selecionadas para os procedimentos

experimentais.

O monitorando do estresse hídrico foi feito por quantidade (%) de

água no solo através do peso fresco comparado ao peso seco de três

amostras de 25 cm3 de solo, e após o estresse atingir o nível de 70% de

ressecamento do solo, a irrigação foi re-estabelecida e mantida

constante por 5 dias (120h).

A parte vegetal utilizada das plantas de C. rotundus e de milho foi

o pseudocaule (como indicado na figura 3). Também foram utilizados

colmos de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), de onde foram separadas

casca (parte mais externa) e miolo para fracionamento celular.

No local do experimento, as temperaturas máxima, mínima e

média do ar e a umidade relativa (UR) foram monitoradas, entre as 8h e

às 17h, por meio de um termohigrômetro modelo 450, Spectrum

Technologies. A umidade do solo foi monitorada por um sensor Spectrum

Technologies.

4.2 - Preparacão da fração microssomal

A metodologia aplicada permite que de uma só vez, partindo-se

de uma mesma amostra, as frações de vesículas de membrana

plasmática e tonoplasto sejam isoladas. A fração microssomal contendo

vesículas de membrana plasmática e de tonoplasto foram isoladas de

pseudocaule das plantas de C. rotundus e do colmo de Saccharum spp,

através de centrifugação diferencial, essencialmente como descrito por

Giannini e Briskin (1987), com algumas modificações. Foram cortadas e

pesadas cerca de 15 a 20g de tecido e estes foram então

22

homogeneizadas em meio tamponado, usando grau e pistilo. O tampão

de extração é composto de sacarose 250 mM, glicerol a 10 %, 5 mM

DTT, 5 mM EDTA, 0,4 % de PVP-40, 100 mM KCl, 0,3 % BSA, PMSF 1

mM, Benzamidina 1mM, Tris-HCl (pH 8,0) 100 mM, na relação peso de

tecido/volume de tampão de 1:2. As soluções usadas na preparação

foram mantidas no gelo e toda a manipulação foi realizada a 4°C. O

homogenato resultante foi filtrado através de quatro camadas de gaze e

submetido a centrifugação a 3.000 x g durante dez minutos para a

remoção de células não rompidas, e núcleos. O sobrenadante foi

submetido a nova centrifugação a 100.000 x g por 30 minutos. O

precipitado dessa centrifugação é solubilizado em solução tampão

contendo: glicerol a 10 %, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, Benzamidina 1mM,

Tris-HCl 100 mM pH 7,6 e EDTA 5 mM.

4.3 - Purificação das vesículas de tonoplasto e membrana

plasmática

A purificação das vesículas de membrana plasmática, foi

realizada essencialmente como descrito por Serrano (1990). 1,5 mL da

fração microssomal foi aplicada sobre um gradiente descontínuo

bifásico de sacarose nas concentrações de 25/46 % p/p, contendo

ainda: Tris-HCl 100 mM pH 7,6, EDTA 5 mM, DTT 5mM, PMSF 1mM e

Benzamidina 1mM. O gradiente com a fração microssomal foi

submetido a uma centrifugação de 100.000 x g em um rotor SW40

(Beckman), durante 2 horas. Após a centrifugação a banda contendo as

vesículas de membrana plasmática purificadas localizava-se na

interface entre 30 e 46 %, enquanto as vesículas de tonoplasto situava-

se na interface de 10 e 25 % ou 10 e 30 %. As bandas foram coletadas

e congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a –70ºC até

utilização. A proteína total contida na preparação foi dosada pelo

método clássico descrito por Lowry et al.. (1951) e Bradford (1976).

23

4.4 - Determinação das atividades PPásicas e ATPásicas

As atividades PPásicas e ATPásica foram determinadas

colorimetricamente, segundo o método clássico descrito por Fiske e

Subbarrow (1925). A reação foi iniciada com a adição da proteína e

parada através da adição de ácido tricloroacético em baixas

temperaturas, para uma concentração final de 10 % (v/v). A

composição do meio de reação foi de Tris , 50 mM em pH 6,5 para

frações de membrana plasmática e 7,0 para frações de tonoplasto;

MgSO4, 3 mM, KCl 100 mM, ATP 1 mM para as ATPases e PPi 1 mM

para as PPases e 0,03mg.ml-1 de proteína. Como inibidores da

atividade ATPásica foram utilizados 0,2 mM de vanadato no caso de

vesículas de membrana plasmática (Bowman et. al., 1988) A hidrólise

de PPi foi aferida através de sua dependência por K+.

4.5 - Monitoramento do gradiente de prótons

O gradiente de próton foi monitorado pelo decréscimo da

fluorescência da sonda fluorescente metacromática, 9-amino-6-cloro-2-

metoxiacridina (ACMA), excitada com um feixe de λ 415 nm e a

emissão captada a 485 nm. O meio de reação era composto de 250mM

sacarose, 10 mM de Tris pH 6.5 ou 7,0, KCl 100 mM, ACMA 1,3 µM,

MgSO4 1 ou 3 mM e ATP 3 mM ou PPi 0,4mM e 50 µg de proteína. O

gradiente foi dissipado com NH4Cl 1,5 mM.

4.6 - Determinação da condutância estomática e da

transpiração

A taxa fotossintética líquida (A, µmol m-2 s-1), a condutância

estomática (gs, mol m-2 s-1) e a transpiração foram determinadas nas

plantas de C. rotundus mantidas sob tratamento, por meio do sistema

portátil de medição das trocas gasosas, modelo LI-6200 (LI-COR). Para

tanto, foi utilizada uma câmara de 0,25L com área de medição de

aproximadamente 7,5 cm2. Todas as medidas foram efetuadas entre 7h

e 14h com intervalos de 1h nos dias estabelecidos de estresse por

déficit hídrico, utilizando sempre a luz ambiente.

24

4.7 - Determinação da fluorescência da clorofila a

A variável da fluorescência emitida pela clorofila a foi

determinada, nas mesmas folhas que as trocas gasosas, por meio de

um fluorímetro de luz modulada modelo Mini-PAM (WALZ).

As folhas das plantas foram adaptadas ao escuro, com o uso de

pinças, por 30 minutos, para que os centros de reação, do PSII,

adquiram a condição de “abertos” (todos os aceitadores primários

oxidados) e a perda de calor seja mínima. A fluorescência inicial (F0) foi

obtida com luz modulada de baixa intensidade (< 0,1 µmol m-2 s-1) para

não induzir efeito na fluorescência variável. A fluorescência máxima

(Fm) foi determinada por um pulso de luz saturante de 0,3 s de duração,

com freqüência de 20000 Hz. A fluorescência variável (FV) foi

determinada pela diferença entre F0 e Fm. Esse pulso permite o

fechamento dos centros de reação do PSII. Com os valores de FV e Fm

foi obtida a relação FV/Fm.

4.8 - Determinação do teores de clorofila

Os teores de clorofila foram determinados a partir do início do

tratamento pelo estresse por déficit hídrico, por meio do medidor portátil

de clorofila modelo SPAD-502, Minolta, Japão.

4.9 - Microscopia Eletrônica de Transmissão e

Imunocitoquímica

As amostras de plantas submetidas ao estresse hídrico e após

restabelecimento da irrigação foram fixadas em solução de

glutaraldeído 2,5 % em tampão fosfato por 24 horas a temperatura

ambiente. Após a fixação primária, as amostras foram lavadas por três

vezes em tampão fosfato para remoção do glutaraldeído residual e

desidratadas em série etanólica crescente. Amostras destinadas a

microscopia eletrônica de transmissão (MET) foram pós-fixadas por 1

hora em solução de tetróxido de ósmio 1% em água, lavadas por três

vezes em tampão fosfato e só então sofreram desidratação em séria

etanólica crescente. Após a desidratação as amostras foram embebidas

25

em resina UNICRIL durante um período de 72h, sendo mantidas em

estufa para polimerização da resina. Para visualização do material

antes de ser levado ao MET foram obtidas seções semi-finas (0,7 - 1

µm) utilizando um ultramicrótomo Reichert-Jung Ultracut S (Leica) e

facas de vidro preparadas em um Knife maker II Reichert-Junga partir

dos blocos obtidos. Seções semi-finas coradas com azul de toluidina

solução 0,1% foram examinadas em um microscópio ótico Axioplan

(Zeiss). Seções ultra-finas para observação da imunocitoquímica ao

MET foram recolhidas em grades de níquel e incubadas com anticorpo

anti-PPase, subsequentemente contrastadas em acetato de uranila

solução 5% em água por 20 minutos e citrato de chumbo por 5 a 7

minutos e então examinados em um microscópio eletrônico de

transmissão Zeiss modelo EM 900 (Carls Zeiss).

4.10 - Microscopia Eletrônica de Varredura

Amostras de raízes e mesocótilos fixadas em glutaraldeído e

tetróxido de ósmio da mesma forma como descrito para amostras

preparadas para MET, foram lavadas por três vezes em tampão fosfato

e desidratadas em série etanólica crescente. Em seguida, amostras

selecionadas foram transferidas para o equipamento Critical Point

Drying Apparatus (Mod CPD 030, Bal-tec), e após secagem, foram

metalizadas utilizando o Automatic Sputter Coater SCD 050, Bal-tec.

Finalizado este processo, as amostras estavam prontas para

observação no microscópio eletrônico de varredura DSEM 962 (Zeiss).

26

5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 - Atividade hidrolítica e de transporte de H+ da P-ATPase,

da V-ATPase e da H+-PPase em plantas de C. rotundus

O trabalho teve início com a caracterização das atividades das

bombas de prótons de membrana plasmática e de vacúolo da planta

daninha C. rotundus, crescidas em condições de campo.

A Figura 4 mostra os resultados de atividade hidrolítica e a

Figura 5 de transporte de H+ pelas bombas P-ATPase, V-ATPase e

PPase isoladas de plantas crescidas no campo, ou seja, os resultados

encontrados relatam a atividade dessas bombas em condições de

campo para tal espécie vegetal.

Figura 4 - Atividade hidrolítica das bombas de prótons em vesículas

enriquecidas de membrana plasmática e de vacúolo de

plantas de C. rotundus crescidas em condições de campo

(média representativa de cinco experimentos).

P-ATPase V-ATPase V-PPase0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Ati

vid

ade

µµ µµm

ol.m

g-1

.min

-1

27

Figura 5 – Transporte de prótons pelas bombas ATP/PPi dependente

de vesículas de membrana plasmática e tonoplasto de

plantas em condições de campo. P-ATPase (a), V-ATPase

(b) e PPase (c). Fluorescência do ACMA na presença de 50

µg de proteína de membrana.

Os experimentos mostraram que a atividade da V-ATPase de

membranas enriquecidas de tonoplasto na C. rotundus, foi, em média

de 1,6 µmol.mg ptn-1.min-1 e a atividade da PPase, de 0,5 µmol.mg ptn-

1.min-1 (Figura 4), apresentando, portanto valores superiores aos

encontrados na literatura para Vigna unguiculata (Otoch et al., 2000) e

para Suaeda salsa (Han et al., 2005), porém, o balanço na atividade

entre as duas bombas de prótons vacuolares está coerente com o

padrão estabelecido para a maioria das preparações de tecido vegetal,

em que a V-ATPase, que é a principal bomba vacuolar, podendo gerar

um gradiente de H+ através da membrana vacuolar de magnitude

parecida ou maior que PPase (Perotti et al.,1994; Giannini e Briskin,

1987; Rea e Sanders, 1987), como é possível observar na figura 5.

Em condições ótimas para a planta, a atividade da V-ATPase

supera a da PPase (Nakanishi e Maeshima, 1998). Segundo Maeshima

(2000), uma maior quantidade da enzima PPase está presente em

0 200 400 600 8000

20

40

60

80

100

120

a

bc

Tempo (segundos)

Flu

ore

scên

cia

(%)

28

tecidos jovens, ou em condições de estresse energético. Esta fase do

experimento foi realizada com plantas adultas não estressadas. Tendo

o conhecimento de que a C. rotundus possui característica de

tolerância a condições adversas do ambiente, esperava-se encontrar

um padrão diferenciado do descrito para outras plantas mais sensíveis

a alterações ambientais, com uma atividade hidrolítica e de transporte

pela PPase mais alto que a da V-ATPase, mostrando um padrão

diferenciado da C. rotundus, porém, os valores encontrados para as

atividades das bombas de prótons PPase e V-ATPase da C. rotundus

seguem o padrão descrito na literatura para outras plantas.

Quando o assunto é estresse abiótico, muitos grupos, com

muitos resultados contraditórios, têm estudado os efeitos do estresse

salino nas bombas de prótons vacuolares (V-ATPase e PPase). Otoch

et al. (2001) mostraram que a atividade de transporte dependente de

PPi sofre uma redução na germinação de sementes de Vigna

unguiculata crescidas sob condição de estresse salino. Qiu et al. (2007)

mostraram que em vesículas enriquecidas de tonoplasto de S. salsa a

atividade hidrolítica e de transporte de prótons da V-ATPase

aumentaram quando as plantas foram submetidas ao tratamento com

estresse salino em comparação com plantas controle. Russak e Klobus

(2007) mostraram que plantas submetidas ao estresse salino

apresentaram aumento na atividade da V-ATPase. Porém, estudos de

energética associados ao estresse hídrico estão limitados a poucos

grupos.

Com o objetivo de buscar características diferenciadas na

bioenergética da C. rotundus quando submetidas à situação de

estresse por déficit de água, realizamos experimentos em casa de

vegetação.

Os resultados apresentados a seguir mostram o comportamento

das bombas de prótons de membrana plasmática e vacuolares da C.

rotundus sob condição de déficit hídrico.

A figura 6 mostra a atividade de hidrólise da bomba de prótons

de membrana plasmática P-ATPase. Uma importante característica da

29

P-ATPase é que ela funciona como um indicador do funcionamento

celular e sua atividade é afetada por diversos fatores ambientais

(Serrano, 1990; Palmgren, 1998). Sendo assim, é possível detectar a

presença de estresse em nível celular através do funcionamento da P-

ATPase.

Observou-se que durante o estresse hídrico a atividade

hidrolítica dessa bomba cai, chegando a aproximadamente 60% de

inibição em relação ao controle, indicado no eixo 0 (zero) da figura 7, e

após 24h do restabelecimento da irrigação a atividade retorna a níveis

próximos ao do controle, indicando o final do período de estresse.

controle dh.30% dh.50% dh.70% ri.10min ri.24h ri.48h ri.120h0

1

2

3

hidr

ólis

e A

TP

µµ µµm

ol.m

g-1

.min

-1

Figura 6 – Atividade hidrolítica da bomba de próton P-ATPase em

vesículas enriquecidas de membrana plasmática de plantas

de C. rotundus submetidas a déficit de água (dh) e após o

restabelecimento da irrigação (ri) (média representativa de

três experimentos).

30

dh.30% dh.50% dh.70% ri.10min ri.24h ri.48h ri.120h

-60

-40

-20

0

20

40

60

inib

ição

/est

ímu

lo (

%)

Figura 7 - Porcentagem de inibição ou estímulo da atividade hidrolítica

(µmol.mg-1.min-1) da bomba de prótons P-ATPase dos

tratamentos em relação ao controle.

Os resultados que seguem (figuras 8, 9, 10, 11 e 12) mostram a

atividade hidrolítica das bombas V-ATPase e PPase, principal foco do

trabalho apresentado. Observou-se que ambas bombas sofreram

inibição da atividade de hidrólise conforme o aumento do estresse

hídrico, indicado pelo aumento na porcentagem de ressecamento do

solo.

O resultado apresentado na figura 12 indica claramente que a V-

ATPase é a bomba de prótons mais inibida quando comparada a

PPase. Esse resultado sugere um déficit no suprimento de ATP,

levando a uma redução na quantidade de substrato para ser hidrolisado

pela V-ATPase. Corbineau et al. (2004), mostraram que o estresse

hídrico leva a um déficit energético avaliado pelos baixos níveis de

ATP, ADP e NTP, nucleotídeos responsáveis pelo armazenamento de

energia em suas ligações químicas para utilização nos diversos

processos celulares.

O suprimento de PPi, que é subproduto de muitos processos

metabólicos, parece ter sido menos afetado, já que a atividade da

PPase sofreu uma inibição cerca de 40% menor que a V-ATPase

quando comparadas ao controle (figura 12).

31

controle dh.30% dh.50% dh.70% ri.10min ri.24h ri.48h ri.120h0

1

2

hidr

ólis

e A

TP

µµ µµm

ol.m

g-1

.min

-1

Figura 8 – Atividade hidrolítica da bomba de próton V-ATPase em

vesículas enriquecidas de tonoplasto de plantas de C.

rotundus submetidas a déficit de água (dh) e após o

restabelecimento da irrigação (ri) (média representativa de

três experimentos).

dh.30% dh.50% dh.70% ri.10min ri.24h ri.48h ri.120h

-100

-60

-20

20

60

100

inib

ição

/est

imu

laçã

o (

%)

Figura 9 - Porcentagem de inibição ou estímulo da atividade

hidrolítica (µmol.mg-1.min-1) da bomba de prótons V-

ATPase dos tratamentos em relação ao controle.

32

controle dh.30% dh.50% dh.70% ri.10min ri.24h ri.48h ri.120h0

1

2

hid

rólis

e P

Pi

mm

ol.m

g-1

.min

-1

Figura 10 – Atividade hidrolítica das bomba de próton PPase em

vesículas enriquecidas de tonoplasto de plantas de C.

rotundus submetidas a déficit de água (dh) e após o

restabelecimento da irrigação (ri) (média representativa de

três experimentos).

dh.30% dh.50% dh.70% ri.10min ri.24h ri.48h ri.120h

-120

-80

-40

0

40

80

120

inib

ição

/est

imu

laçã

o(%

)

Figura 11 - Porcentagem de inibição ou estímulo da atividade hidrolítica

(µmol.mg-1.min-1) da bomba de prótons PPase dos

tratamentos em relação ao controle.

33

dh. 30% dh. 70% ri. 24h ri. 120h

-100

-50

0

50

100V-ATPasePPase

inib

ição

/est

imu

laçã

o (

%)

Figura 12 – Comparação entre a porcentagem de inibição ou estímulo

da atividade hidrolítica (µmol.mg-1.min-1) das bomba de

prótons V-ATPase e PPase dos tratamentos em relação ao

controle.

24h após o restabelecimento da irrigação, é possível observar

um incremento de aproximadamente 20% da atividade da V-ATPase e

de 100% da PPase, quando comparadas ao controle (figura 12), o que

sugere que a capacidade de recuperação da PPase é muito superior

que a da V-ATPase.

A explicação para os resultados apresentados pode ter como

base o fato da enzima PPase ser um polipeptídeo único, codificada por

um único gene (Sarafian et al.., 1992), sendo assim, sua resposta de

expressão após o término do estresse com a finalidade de restabelecer

o metabolismo celular, torna-se mais rápida. Além disso, também é

possível discutir a partir do fato de que após o término do estresse

hídrico, que provocou um estresse energético com conseqüente

depleção nos níveis de ATP, o substrato mais abundante presente no

citossol é o PPi, então, 24h após o restabelecimento da irrigação, a

atividade PPásica superou a ATPásica.

A maior atividade PPásica acarreta na hidrólise do pirofosfato

(PPi) e aumenta a produção de fosfato inorgânico, que, juntamente com

o ADP, é substrato para formação de ATP. Na figura 12 é possível

34

observar que aos 5 dias após o restabelecimento da irrigação (120h) a

atividade da V-ATPase encontra-se em níveis semelhantes ao controle

e a da PPase é reduzida a um nível pouco maior que o controle. Nesta

situação, a planta, provavelmente, está retomando sua atividade

energética normal, onde o suprimento de ATP aos poucos está sendo

normalizado. É possível que após mais alguns dias a atividade da V-

ATPase seja recuperada e volte a ser prioritária em relação a PPase.

Na figura 13, é possível observar o comportamento das plantas

de C. rotundus no período do estresse hídrico e após o

restabelecimento da irrigação. É possível observar que mesmo após

cinco dias sem irrigação, as folhas da planta se mantêm túrgidas e os

sintomas de déficit hídrico aparecem apenas aos 11 dias sem irrigação,

onde é possível observar sintomas de clorose e murcha. Após o

restabelecimento da irrigação, a recuperação da planta é bastante

rápida, onde após 24h do restabelecimento da irrigação as folhas

retomam seu aspecto de turgescência e os sintomas da desidratação

sofrida podem ser observados apenas em algumas folhas.

Em 1971 e 1977, Gaff descreveu um grupo de plantas que

chamou de ressurection plants, que são um grupo de plantas que

possuem a habilidade de tolerar longos períodos de dessecação e

“ressuscitar” após o restabelecimento da irrigação. Plantas com tais

características podem utilizar diferentes mecanismos fisiológicos e

bioquímicos de adaptação à dessecação e de retorno ao padrão

metabólico normal após a re-hidratação (Bewley e Krochko, 1982;

Navari-Izzo e Rascio, 1999).

No decorrer do experimento foi possível observar que cerca de 3

dias após o restabelecimento da irrigação, novas brotações foram

observadas, provavelmente como uma estratégia da espécie em se

reproduzir enquanto as condições do ambiente permitem (dados não

apresentados).

A C. rotundus não foi descrita como uma ressurection plant,

porém, suas características de recuperação de seu estado metabólico

35

após a re-hidratação, como pode ser visualizado na figura 13, sugerem

características próximas a essas plantas.

Figura 13 – Plantas de C. rotundus. Controle (A), 5º dia de estresse

hídrico (B), 11º dia de estresse hídrico (C) e 24h após o

restabelecimento da irrigação (D).

36

Para facilitar a comparação com uma planta cultivada de

metabolismo C4, experimentos com milho (Zea mays) foram conduzidos

nas mesmas condições do experimento com a planta daninha C.

rotundus. Os dados comparativos para a atividade hidrolítica das

bombas de prótons vacuolares (V-ATPase e PPase) podem ser

observados na tabela 1.

Tabela 1 – Comparação entre a atividade hidrolítica das bombas de

prótons vacuolares de C. rotundus e Z. mays em situação de déficit hídrico (dh) e após o restabelecimento da irrigação (re-irri). Valores representativos (± SD) de três experimentos.

controle dh 30% dh 70% re-irri 24h

V-ATPase Hidrólise ATP (µµµµmol.mg-1.min-1)

C. rotundus 1,77 ±0,15 1,16 ±0,18 0,54 ±0,03 1,93 ±0,08

Zea mays 0,14 ±0,04 0,09 ±0,04 0,05 ±0,03 0,13 ±0,05

V-PPase Hidrólise PPi (µµµµmol.mg-1.min-1)

C. rotundus 0,92 ±0,07 0,93 ±0,07 0,63 ±0,03 1,95 ±0,05

Zea mays 0,1 ±,050 0,05 ±0,02 0,03 ±0,02 0,09 ±0,03

Os dados apresentados na tabela 1 mostram a diferença

metabólica existente entre a planta daninha e a cultivada, onde os

valores de atividade hidrolítica obtidos em preparações de plantas

controle, plantas sob déficit hídrico e plantas re-irrigadas de C. rotundus

superam os de Z. mays, sugerindo uma energética diferenciada, o que

sustentaria a condição de rusticidade da C. rotundus.

Nas figuras 14 e 15 é possível observar a atividade de transporte

de prótons pelas bombas vacuolares.

Normalmente o funcionamento de uma bomba de prótons é

avaliado por sua capacidade de hidrolisar substrato acoplado a

capacidade de transportar prótons e com isso favorecer o transporte

secundário.

37

Figura 14 – Bomba de próton ATP dependente de vesículas de

tonoplasto de plantas irrigadas diariamente (a), 30% dh (b),

70% dh (c) e 24h após restabelecimento da irrigação (d).

Fluorescência do ACMA na presença de vesículas de

tonoplasto (50 µg de proteína de membrana).

Figura 15 – Bomba de próton PPi dependente e permeabilidade da

membrana de vesículas de tonoplasto de plantas irrigadas

diariamente (a), 30% dh (b), 70% dh (c) e após

restabelecimento da irrigação (d). Fluorescência do ACMA

na presença de vesículas de tonoplasto (50 µg de proteína

de membrana).

38

Figura 16 – Porcentagem de inibição ou estímulo da velocidade inicial

do transporte de prótons pelas bombas de próton V-ATPase

e PPase da membrana de vesículas de tonoplasto dos

tratamentos em relação ao controle.

Com os resultados apresentados nas figuras 14, 15 e 16, é

possível observar que a atividade de transporte de prótons da V-

ATPase parece estar em uma situação desacoplada de sua atividade

hidrolítica, pois sua atividade de transporte, mesmo com plantas sob

déficit hídrico de 70% apresentou-se maior que a da PPase, enquanto

que sua atividade hidrolítica foi 40% menor que a da PPase.

Matsuura-Endo et al. (1992) apresentaram dados em que o

tratamento com estresse por baixas temperaturas afetou a atividade

hidrolítica e de transporte da V-ATPase; Darley et al. (1995) mostraram

que sob condição de estresse por baixas temperaturas a V-ATPase

não foi afetada em plântulas de Mung bean e que no caso apresentado

a principal bomba de prótons foi a PPase; Colombo e Cerana (1993)

mostraram um incremento na atividade PPásica em suspensão de

células de cenoura sob tratamento com NaCl e Rea e Poole (1993)

mostraram a importância dessa bomba em células de plantas sob

condição de anoxia e estresse por baixas temperaturas. As diferenças

encontradas nos resultados dos trabalhos supracitados são atribuídas

5º dia 11º dia re-irrigada

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100V-ATPasePPase

% e

stím

ulo

/in

ibiç

ãoV

0

39

ao fato de que as condições de crescimento para as diversas plantas

submetidas aos estresses variados são diferentes, favorecendo, a

variabilidade dos fenômenos celulares.

Os resultados seguintes mostram que a bomba de prótons V-

ATPase apresentou-se pouco menos inibida, em relação a PPase

(figuras 17 e 18) quando comparada aos resultados citados

anteriomente, o que pode ser atribuído ao fato dos experimentos terem

sido conduzidos em diferentes épocas do ano, porém, este fato não

comprometeu as conclusões do trabalho.

Como a H+-PPase vacuolar é a principal enzima capaz de

hidrolisar PPi presente nas membranas do vacúolo, o estímulo

observado deve estar relacionado com a ativação desta enzima

induzida pelo re-estabelecimento da irrigação, sustentando a hipótese

de que existe um possível acoplamento entre as duas bombas de

prótons vacuolares, onde o gradiente eletroquímico gerado pela H+-

PPase energizaria a reversão do ciclo catalítico da H+-ATPase,

favorecendo a síntese de ATP (Façanha & de Meis, 1998). Assim, a

indução deste sistema regenerador de ATP durante o re-

estabelecimento da irrigação pode ser parte da resposta adaptativa da

planta ao estresse hídrico a que foi submetida.

Importante ressaltar que os dados apresentados mostram que as

duas bombas de prótons vacuolares trabalham em conjunto para

manter os processos fisiológicos da planta e superar o estresse a que

foi submetida.

40

Figura 17 - Atividade hidrolítica das bombas de prótons em vesículas

enriquecidas de membrana plasmática e de vacúolo de

plantas de C. rotundus submetidas a estresse hídrico (média

representativa de três experimentos).

5º dia 11º dia re-irrigada

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100V-ATPasePPase

inib

ição

/est

imu

laçã

o (

%)

Figura 18 - Porcentagem de inibição ou estímulo da atividade hidrolítica

(µmol.mg-1.min-1) das bombas de prótons V-ATPase e PPase

dos tratamentos em relação ao controle.

P-ATPase V-ATPase PPase0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5controle5º dia11º diare-irrigada

Ati

vid

ade

µµ µµm

ol.m

g-1

.min

-1

41

No presente trabalho, os resultados encontrados sugerem que

as plantas de C. rotundus possuem um metabolismo adaptado para

resistência ao estresse por déficit de água, pois mesmo após 11 dias

sem irrigação, e apesar das plantas apresentarem sintomas de clorose

severa e murcha, suas bombas de prótons vacuolares ainda possuíam

a capacidade de hidrolisar os substratos ATP e PPi, possivelmente com

a finalidade de manter as atividades celulares das plantas. Porém,

pode-se observar que houve um decréscimo na atividade de ambas as

bombas com o passar dos dias, sendo que a PPase foi a enzima que

sofreu maior inibição, quando comparada a V-ATPase. Esses

resultados corroboram com dados de literatura que apresentam a V-

ATPase como uma enzima extraordinariamente importante para manter

a homeostase iônica e o metabolismo celular. Lüttge et al. (1995)

demonstraram que em condições de estresse ambiental a V-ATPase

funciona como uma enzima de resposta de estresse, sofrendo

pequenas modificações na expressão de subunidades. Observamos

também que após o restabelecimento da irrigação a porcentagem de

estímulo em relação ao controle da atividade hidrolítica da PPase

superou em aproximadamente 80% a da V-ATPase, o que nos sugere a

rápida recuperação dessa enzima objetivando a recuperação do

metabolismo da planta.

5.2 - Determinação da condutância estomática e da

transpiração

Nas figuras 19, 20 e 21 é possível observar os resultados da

taxa fotossintética líquida, transpiração e condutância estomática das

plantas submetidas ao estresse hídrico quando comparado às plantas

controle. É possível observar que as plantas sob estresse hídrico

possuem taxa de transpiração e condutância estomática mais baixas

que as plantas controle. Esse resultado vai de encontro aos dados

encontrados na literatura, onde em situação de déficit hídrico as plantas

fecham os estômatos. Esse fechamento estomático evita a transpiração

excessiva, prevenindo a perda de água pela planta, porém,

compromete a fotossíntese, uma vez que com os estômatos fechados,

42

as plantas não absorvem o CO2 da atmosfera, substrato para

ocorrência da fotossíntese. Aparentemente, a C. rotundus segue o

mesmo padrão das mais diversas espécies vegetais citadas na

literatura, onde sob déficit hídrico a condutância estomática decresce,

assim como a assimilação de carbono e conseqüentemente, a

fotossíntese. A visualização desse fechamento estomático foi possível

utilizando a técnica de microscopia de varredura, que será apresentada

no seguimento do trabalho.

5.3 - Determinação da fluorescência da clorofila a

A fluorescência da clorofila a indica a quantidade de energia que

não é aproveitada pela planta para a realização dos processos

fotoquímicos. Nos dados apresentados na figura 22, pode-se observar

que as diferenças entre as plantas controle e as submetidas ao

estresse somente apareceram no 11º dia, e os valores apresentados

são pouco menores que a faixa considerada normal para plantas não

submetidas ao estresse. Segundo Jakl e Bolhàr-Nordenkampf (1991),

a eficiência quântica (Fv/Fm) pode variar em uma faixa de 0,75 a 0,85

em plantas não submetidas a estresses. A diminuição da relação Fv/Fm

pode ser usada para estudar o efeito de estresse causado pela

aplicação de herbicidas (Eullaffroy, 2003).

Esses resultados sugerem a resistência fisiológica dessa planta

daninha ao estresse ambiental a que foi submetida.

43

Figura 19- Resultado da taxa fotossintética líquida (A) em plantas de C.

rotundus irrigadas todos os dias (contr.), submetidas ao

tratamento de déficit hídrico (dh) e após o restabelecimento

da irrigação (ri).

Figura 20 – Resultados da transpiração (gs) em plantas de C. rotundus

irrigadas todos os dias (contr.), submetidas ao tratamento

de déficit hídrico (dh) e após o restabelecimento da

irrigação (ri).

44

Figura 21- Resultado da condutância estomática (gs) em plantas de C.

rotundus irrigadas todos os dias (contr.), submetidas ao

tratamento de déficit hídrico (dh) e após o restabelecimento

da irrigação (ri).

0,5

0,6

0,7

0,8

1º dia 5º dia 11º dia re-irrigada

Efi

ciên

cia

qu

ânti

ca (

Fv/

Fm

)

controle

tratamento

Figura 22 – Determinação da eficiência quântica (Fv/Fm) em plantas de

C. rotundus irrigadas todos os dias (controle) e submetidas

ao tratamento de estresse hídrico por 11 dias (tratamento).

45

5.4 - Determinação do teor de clorofila

Os dados apresentados para teor de clorofila na figura 23,

mostram a redução nas plantas estressadas em relação às plantas

controle ao longo dos dias de estresse. Quando comparados aos dados

de eficiência quântica apresentados na figura 22 esse decréscimo no

teor de pigmentos pode sugerir uma capacidade de adaptação da C.

rotundus às condições adversas de modo que a quantidade de fótons

captada pelas clorofilas do complexo antena que se mantiveram

inalteradas é o suficiente para manter os valores de fluorescência da

clorofila a nas plantas estressadas em relação ao controle até o 7º dia

após a suspensão da irrigação. No 11º dia, o estresse hídrico severo

contribuiu para redução do teor de pigmentos, o que também afetou o

rendimento quântico, porém, após o re-estabelecimento da irrigação,

com o ajuste do metabolismo da planta, o teor de pigmentos voltou a

aumentar, acompanhado do rendimento quântico da fotossíntese.

15

20

25

30

35

40

1º dia 5º dia 11º dia re-irrigada

Teo

r d

e p

igm

ento

s

controle

tratamento

Figura 23 – Determinação do teor de pigmentos fotossintéticos em

plantas de C. otundus irrigadas todos os dias (controle) e

submetidas ao tratamento de estresse hídrico por 11 dias

(tratamento).

46

5.5 – Microscopia Eletrônica de Varredura

O déficit hídrico tem efeito em diversos processos fisiológicos

das plantas, visto que o estresse geralmente aumenta a resistência

difusiva ao vapor de água, mediante fechamento dos estômatos,

reduzindo a transpiração e, conseqüentemente, o suprimento de CO2

para a fotossíntese. Muitos desses efeitos refletem mecanismos de

adaptação das plantas ao ambiente (Nogueira, 1997).

Mendonça (2000) estudando os estômatos de plantas daninhas

monocotiledôneas observou em Cyperus rotundus L. a presença de

apenas uma fileira de estômatos nos bordos foliares da superfície

adaxial, e densidade estomática de 135 estômatos/mm2 na superfície

abaxial.

Procurou-se observar o comportamento estomático das plantas

de C. rotundus conforme os tratamentos de estresse hídrico a que

estavam sendo submetidas.

Observou-se após o preparo das amostras que nas plantas

controle, que recebiam irrigação diária, os estômatos apresentavam-se

abertos (figura 24 A e B), facilitando as trocas hídricas e gasosas,

porém, nas plantas submetidas ao estresse hídrico, os estômatos

estavam fechados (figura 24 C e D), o que faz com que a planta não

realize as trocas gasosas necessárias para o processo fotossintético,

com conseqüente perda de biomassa no decorrer do tempo. Pudemos

observar também que 24h após o restabelecimento da irrigação (figura

24 E e F), os estômatos ainda não estavam abertos como no controle,

porém, espera-se que após o ajustamento da planta a nova situação

(final do estresse hídrico), os estômatos voltem a abrir normalmente.

47

Figura 24 – Superfície abaxial de Cyperus roitundus. A) Visão geral da superfície

foliar de planta controle (500x); B) Detalhe do estômato (3000x); C) Visão

geral da superfície foliar de planta sob déficit de 50% de água (500x); D)

Detalhe de estômato (1000x); E) Visão geral da superfície foliar de planta

24h após restabelecimento da irrigação (500x); F) Detalhe de estômato

(3000x).

A B

C D

E F

48

5.6 – Microscopia Eletrônica de Transmissão

Plantas tolerantes ao estresse hídrico são capazes de manter

sua pressão de turgor em situação de baixo potencial hídrico

aumentando o número de moléculas de soluto dentro das células

(Radin, 1983; Bray et al..,2000). Esse transporte de solutos acontece

por intermédio das bombas de prótons. Uma vez que a avaliação visual

do experimento mostrou que os sintomas do estresse, como a murcha

e a clorose das folhas, apareceram somente após um período de 11

dias sem irrigação e que após o restabelecimento da irrigação, a

recuperação da planta foi bastante rápida (figura 13), sugerindo uma

maior ativação das bombas vacuolares, ou mesmo um incremento na

expressão das mesmas, como mostrado por Gaxiola et al.. (2001).

Esperava-se encontrar a marcação ao redor da membrana

vacuolar das células das plantas, uma vez que a bomba de prótons

PPase encontra-se distibuída por tal membrana. Esperava-se, também,

encontrar uma maior marcação nas amostras coletadas de plantas re-

irrigadas, um vez que os dados bioquímicos apresentados apontavam

essa etapa como a de maior atividade da bomba PPase. No entanto, as

preparações obtidas não permitiram observar com clareza as estruturas

celulares. A imunomarcação para PPase permitiu observar que a

presença da bomba de prótons PPase é maior nas plantas controle

(figura 25), sofrendo uma redução durante o estresse (figura 26) e

apresentando uma quantidade ainda menor que o controle nas plantas

re-irrigadas (figura 27), sugerindo que a regulação dessas bombas de

prótons acontecem de maneira pós transcripcional.

49

Figura 25 – Micrografia eletrônica de transmissão com imunomarcação anti PPase em plantas controle (20000x).

Figura 26 – Micrografia eletrônica de transmissão com imunomarcação

anti PPase em plantas sob estresse hídrico (20000x).

50

Figura 27 – Micrografia eletrônica de transmissão com imunomarcação

anti PPase em plantas re-irrigadas (20000x).

5.7 - Atividade hidrolítica e de transporte de H+ da P-ATPase,

da V-ATPase e da H+-PPase em colmos de Saccharum spp.

Os resultados apresentados a seguir mostram uma

caracterização inicial e preliminar das atividades das bombas de

prótons de membrana plasmática e de vacúolo em colmos da planta

Saccharum spp., cultivadas em condições de campo. Tal espécie foi

escolhida para o experimento por ser uma das plantas mais importantes

economicamente para o Brasil.

A figura 28 mostra os resultados de atividade hidrolítica e a

figura 29 de transporte de H+ pelas bombas P-ATPase, V-ATPase e

PPase isoladas de casca de colmo plantas crescidas em condições de

campo, ou seja, os resultados encontrados relatam a atividade dessas

bombas em tal tecido.

51

Figura 28 - Atividade hidrolítica das bombas de prótons em vesículas

enriquecidas de membrana plasmática e de vacúolo de

casca de colmo de plantas cultivadas em condições de

campo (média representativa de três experimentos).

Figura 29 – Bomba de próton ATP/PPi dependente de vesículas de

membrana plasmática e tonoplasto de casca de colmo de

plantas cultivadas em condições de campo. P-ATPase (a),

V-ATPase (b) e PPase (c). Fluorescência do ACMA na

presença de 50 µg de proteína de membrana.

P-ATPase V-ATPase PPase0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Ati

vid

ade

µµ µµm

ol.m

g-1

.ptn

-1

52

Os resultados apresentados na figura 28 sugerem o padrão de

atividade hidrolítica para casca de colmo de cana-de-açúcar, onde a

bomba de prótons PPase apresentou atividade mais alta que as

demais, resultado esse que se confirmou no transporte de prótons

(figura 29).

É possível que esse resultado esteja relacionado com o

transporte de solutos, pois esta espécie vegetal é conhecida por sua

alta atividade de transporte de solutos e síntese de açúcares. O tecido

externo do colmo (que denominamos de casca), possui atividade

fotossintética e, possivelmente alta atividade de biossíntese de

açúcares, o que justificaria a alta atividade da PPase, que estaria

funcionando utilizando-se do PPi liberado pelas reações de biossíntese.

53

6 – CONCLUSÕES

• Em condições de campo a planta daninha Cyperus rotundus

apresentou um padrão de atividade hidrolítica e de transporte

de prótons semelhante ao apresentado na literatura para as

demais plantas, onde a atividade hidrolítica é maior para a V-

ATPase e o gradiente de H+ apresenta magnitude

semelhante ao da PPase;

• Durante o estresse hídrico, observou-se que as plantas de C.

rotundus apresentaram sintomas de déficit hídrico somente

aos 11 dias sem irrigação e que após 24h do seu

restabelecimento, as folhas retomam seu aspecto de

turgescência, semelhante ao que acontece com as

ressurection plants;

• Após restabelecimento da irrigação a bomba de prótons

PPase mostrou-se superior a V-ATPase tanto em hidrólise de

substrato quanto em transporte de prótons, sugerindo que o

gradiente de prótons gerado através da membrana vacuolar

pela hidrólise do PPi poderia estar sendo usado para síntese

de ATP, para que os processos celulares da planta fossem

mantidos;

• Os parâmetros fisiológicos avaliados demonstram que a

planta daninha C. rotundus segue os mesmos padrões das

mais diversas espécies vegetais de metabolismo C4, onde

sob déficit hídrico, a condutância estomática, a eficiência

quântica e o teor de pigmentos decrescem;

• As avaliações morfológicas utilizando a técnica de

microscopia de varredura comprovam o fechamento

estomático durante o estresse hídrico;

• As avaliações da quantificação e localização da bomba de

prótons PPase, utilizando a técnica de imunomarcação e

visualização em microscópio eletrônico de transmissão

mostraram que a presença das bombas de prótons PPase é

54

maior nas plantas controle, sofrendo redução durante o

estresse e não superando a quantidade encontrada no

controle mesmo após o restabelecimento da irrigação,

sugerindo que a regulação seja pós transcripcional;

• As avaliações efetuadas em tecido de cana-de-açúcar

mostraram ser maior a atividade de hidrólise e transporte de

prótons pelas bombas vacuolares em casca e que, neste

caso, a PPase foi a que apresentou maior atividade,

sugerindo que seu funcionamento pode estar relacionado

com a síntese de ATP, utilizando o gradiente gerado pela

hidrólise do PPi, para ser utilizado durante os processos de

biossíntese de açúcares

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