CARACTERIZACION DE

LAS PROTEINAS:

PESO MOLECULAR.

DETERMINACION DE LA

ESTRUCTURA PRIMARIA.

ELECTROFORESIS.

V = E z / f v: velocidad de migración de la molécula en un

campo eléctrico. E: intensidad de campo eléctrico, z: carga neta

de la proteína. f = 6phr es el coeficiente friccional. h (eta) es la

viscosidad del medio y r es el radio de la partícula.

Electroforesis en gel de poliacrilamida: en condiciones nativas

(PAGE) o en presencia de SDS (SDS-PAGE).

Isoelectroenfocado (IEF): Separación por punto isoeléctrico (pI).

Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D -PAGE):

IEF en una primera dimensión, SDS-PAGE en la segunda.

ISOELECTROENFOCADO: Separación por pI.

Las proteínas se corren en un gradiente de pH preformado, que se obtiene

sometiendo a electroforesis previa una mezcla de polianfolitos (polímeros

pequeños con múltiple carga) con diferentes valores de pI. En A se carga

la muestra y se aplica el voltaje, con lo cual las proteínas migrarán hasta

llegar al valor de su pI, donde, al no tener carga neta, quedarán

enfocadas, lo que se observa en B.

DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE LAS PROTEINAS.

Mr = masa molecular relativa (por ejemplo, 50,000)

Masa molecular: Por ejemplo 50,000 daltons (50 kDa).

A) Proteína nativa:

1) Ultracentrifugación.

2) Filtración por gel.

3) Espectrometría de masa.

B) Subunidad:

1) Electroforesis en gel de poliacrilamida en

presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE).

ULTRACENTRIFUGACION.

Fc= fuerza centrífuga. r = radio del rotor.

w= velocidad angular. w2r = campo centrífugo. = volumen específico parcial

(inversa de la densidad de la proteína).

m’ (masa efectiva) es menor que m (masa real) porque el flúido desplazado

ejerce una fuerza opuesta (1 – r) .

f= coeficiente friccional de la partícula = 6phr , donde h es la viscosidad del

medio y r el radio de la partícula.

v = Fc / f = m(1 – r) w2r / f

s = coeficiente de sedimentación (unidades 10-13 seg = 1 Svedberg).

s = v / w2r = m (1 – r) / f

La velocidad de sedimentación (v) depende en parte de la masa de la

partícula; tambien depende de su forma (una partícula compacta tiene un

valor de f menor que el de una alargada); una partícula densa se mueve

mas rápido que una menos densa porque su valor de (1 – r) es menor; y

depende tambien de la densidad de la solución (r): si r es < 1, se hunde; si es

> 1, flota y si es = 1 no se desplaza.

Ultracentrifugación zonal (en gradiente)

La solución de proteína se corre en un gradiente de densidad (por ejemplo,

sacarosa), con proteínas de s conocido como marcadoras.

Peso molecular

de subunidad:

Determinacion

por SDS-PAGE

ESPECTROMETRIA DE

MASA: SUS APLICACIONES

EN LA DETERMINACION DE

PESOS MOLECULARES DE

PROTEINAS Y EN LA

SECUENCIACION DE

PEPTIDOS.

Espectrometría de Masa

• La Espectrometría de Masa es una tecnica quepermite determinar la masa de moléculas pormedio de la medida de la relacion masa/carga (m/z).

• La medida de masas moleculares involucra laproduccion, separación y detección de ionesmoleculares en fase gaseosa.

•Cada molécula puede originar iones moleculares

con distinto número de cargas ( y distintas m/z).

Un espectrómetro de masa consiste de tres módulos:

1) Fuente de iones.

2) Analizador de masas.

3) Sistema de detección y adquisición de datos.

Técnicas actuales para trabajo biológico:

1) MALDI-ToF MS (desorción/ionización por laser asistida por

matriz, combinada con análisis de masas por tiempo de vuelo)

2) ES/MS (ionización por electrospray combinada con análisis de

masas por cuadrupolo)

La solución a analizar se pasa a través de una

aguja hipodérmica mantenida a un alto

potencial. Se forma un cono de gotitas muy

finas, altamente cargadas, que irradian de la

punta de la aguja. Se evaporan rápidamente,

pasando las moléculas a analizar a la fase

gaseosa. Si son moléculas grandes se

producen iones con cargas múltiples.

ES/MSGENERACION DE IONES MOLECULARESIONIZACION POR ELECTROSPRAY

(ESI MS)

Aqueous

solution

This ionization method arises in the attempt to couple the LC to MS

The effect of vacuum, temperature and curtain gas causes the formation of

increasingly smaller drops until the molecule is fully desolvated in vacuum.

Sir Geoffrey Taylor (1964). "Disintegration of Water Droplets in an Electric Field". Proc. Roy. Soc. London. Ser. A 280 (1382): 383.

dripping,

burst,

pulsating,

cone-jet

1914, John Zeleny

What is the ionization mechanism in ESI?

No tolerant to the presence of salts, surfactants, inorganic acids, TFA no so

good for sensitivity, (regularly desalting steps are required, acetic and formic

acids are used in the mobile phase).

Lord Rayleigh, 1882

ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES

MOLECULARES.

ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES

MOLECULARES

Los iones se dirigen al vacío del espectrómetro de

masa de cuadrupolo a través de un orificio o capilar

calentado. El cuadrupolo consta de cuatro barras

metálicas paralelas que generan un campo eléctrico

oscilatorio. Los iones se separan en este campo:

sólo los de una determinada m/z se dejan pasar a

una determinada amplitud y frecuencia de

oscilación de los potenciales eléctricos aplicados a

las barras, y llegan al detector.

Quadrupole Mass Analyzer

From: http://www.chem.vt.edu/chem-ed/ms/quadrupo.html

Ion transmitted along the quadrupole in

an stable trajectory

Ions do not have an stable trajectory

and is ejected from the quadrupole

•Limited mass range (4 000 Da).

•Were the first mass analyzer to

be coupled to ESI.

•Excellent mass filters.

•Acquisition every 0.2-1 Da.

radiofrequency

DC: Direct current

RF: Radio frequency

GENERACION DE IONES MOLECULARESPseudocristales mixtos de una matriz (p.ej.: ácido 3,5-

dimetoxi-4-hidroxicinámico). Se los irradia con un pulso

de laser. La sublimación rápida de los cristales lleva a la

formación de iones moleculares protonados en fase gaseosa.

MALDI-ToF MS

ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES MOLECULARES.Se aceleran a una energía cinética de aprox. 25 KeV y se los

deja volar a través de una distancia fija sin campo eléctrico.

Teniendo energía cinética idéntica, los iones chicos se

mueven más rápido que los grandes y llegan antes al

detector. M/z se determina a partir del tiempo de vuelo,

comparando con standards.

Camera

Laser

Sample

plate

Pumping Pumping

Beam guide

Timed ion selector Reflector

Linear

detectorExtraction

gridsReflector

detector

ESQUEMA GENERAL DE UN ESPECTROMETRO DE MASA

MALDI-TOF

Detector

Iones de igual m/z con velocidades diferentes

Reflectron (espejo iónico): compensa la variación de energía cinética de los

iones al abandonar la fuente (100 eV a 1 keV) reflejando los iones hacia atrás

a lo largo del mismo camino de vuelo antes de detectarlos.

La trayectoria de vuelo de un ion puede ser incrementada incorporando un

“espejo iónico” o reflectron al final del tubo de vuelo. Tal dispositivo retarda y

luego revierte las velocidades iónicas para corregir diferencias menores en energía

cinética entre iones de la misma relación m/z, y así minimiza variaciones en los

tiempos de vuelo y mejora la resolución y la precisión de los valores de masa.

Espectrometro

de masa,

MALDI-ToF

MALDI es una fuente de ionización pulsada

• La muestra se mezcla con un matriz

que absorbe fuertemente en el UV.

• La matriz absorbe energía del laser

llevando a que se volatilicen tanto la

matriz como la muestra.

• Las moléculas ionizadas de la matriz

transfieren un protón a la muestra.

• Los iones de la muestra son entonces

acelerados recorriendo el tubo de vuelo

para analizar su masa (TOF MS).

MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization.

Matrix : Analyte

1000:1 – 10000:1

Excess of

MatrixEasy Sample

prep:

•Dried droplet

•Layered method

Nd:YAG (355nm)

N2 laser (337 nm)

Ionization by

laser (pulses

1-5nsec

but….high

potency: kW

MW).

Compatible

with TOF

analyzers

Highly efficient

ionization

method

Matrices absorb strongly l of the laser irradiation

cold matrix

hot matrix

La relación masa a carga de un ion es proporcional al cuadrado

de su tiempo de vuelo.

t = Tiempo de vuelo

L = Longitud recorrida por los iones

dentro del analizador

m = Masa

K = Energía cinética del ion

z = Número de cargas en el ion

2

22

L

Kt

z

m

MALDI-MS

1. Los espectros de MALDI-MS son muy simples, en general sólo

se observan iones con una sola carga: (M+H)+ o (M-H)-.

2. Es un método de ionización muy eficiente, y tiene alta

sensibilidad para el análisis de biomoléculas y biopolímeros.

3. Es ideal para el análisis de mezclas de péptidos trípticos para la

identificación de proteínas por PMF, peptide mass fingerprinting.

4. Es un análisis de high throughput (permite el análisis de un

número grande de muestras en corto tiempo).

5. Es compatible con el analizador de masa de tiempo de vuelo.

6. La intensided del laser puede inducir fragmentaciones que

permiten obtener información estructural (secuencia).

SECUENCIACION

DE PEPTIDOS Y

PROTEINAS

¿Cuales son lo objetivos de la secuenciación de péptidos?

• Comparar estructuras primarias de diferentes proteínas paraestablecer relaciones evolutivas (actualmente, se hace mayormenteusando secuencias traducidas de secuencias de nucleótidos).

• Obtener una secuencia de péptido de una proteína desconocidaproveniente de un organismo cuyo genoma no está secuenciado; estopermitirá la síntesis de oligonuclótidos degenerados para identificary clonar el gen que la codifica.

•Confirmar la identidad de una proteína sospechada a partir de unexperimento de PMF.

•Identificar modificaciones post-traduccionales.

.

SECUENCIACION DE PROTEINAS Y PEPTIDOS.

Para secuenciar una proteína siempre se debe partir de la proteína

purificada. La purificación puede consistir en obtener la proteína

pura en un tubo, a través de los métodos de purificación ya

mencionados, o, aún si no está completamente homogénea, como

una banda discreta en un gel de SDS-PAGE.

Para secuenciar una proteína siempre se la debe fragmentar para

obtener péptidos de menor tamaño, secuenciables por distintos

procedimientos.

Tanto para secuenciar por el método de Edman como por

espectrometría de masa, debe comenzarse con estos tres pasos:

1) Desnaturalizar, con urea por ejemplo, y reducir los puentes

disulfuro.

2) Bloquear los grupos –SH, con iodoacetamida por ejemplo.

3) Fragmentar la proteína en péptidos mas pequeños, usando dos

métodos diferentes (por ejemplo, digestiones con tripsina y BrCN)

SECUENCIACION DE PROTEINAS Y

PEPTIDOS.

1) Método de Edman:

Previa separación de los péptidos por

HPLC en fase reversa, secuenciarlos

químicamente por reacción con el reactivo

de Edman (isotiocianato de fenilo), en un

secuenciador automático.

Pasos a seguir para secuenciar una proteína pura

por el método de Edman.

1) Desnaturalizar, con urea por ejemplo, y reducir los puentes disulfuro.

2) Bloquear los grupos –SH, con iodoacetamida por ejemplo.

3) Fragmentar la proteína en péptidos mas pequeños, usando dos

métodos diferentes (por ejemplo, digestiones con tripsina y BrCN)

4) Separar los péptidos obtenidos por el primer método por HPLC en fase

reversa (RP-HPLC).

5) Tratar cada péptido purificado con el reactivo de Edman, isotiocianato

de fenilo, en un secuenciador automático.

6) Identificar los residuos de aminoácidos por RP-HPLC de los derivados

de feniltiohidantoína (PTH-aminoácido) on line en el secuenciador.

7) Hacer lo mismo con los péptidos obtenidos por el segundo método de

ruptura de la proteína.

8) Armar la secuencia por superposición de los péptidos obtenidos por

ambos métodos.

MDH-1

MDH-2

LAS MALATO DEHIDROGENASAS DE

TRYPANOSOMA CRUZI

El Procise Protein Sequencing System de Applied Biosystems

Está compuesto por 4 módulos integrados: el Secuenciador propiamente dicho, el Microgradient Delivery

System, el detector de UV de longitud de onda variable, y la computadora equipada con Procise control

software y SequencePro software. El sistema controla la entrega precisa de hasta 12 solventes y reactivos

diferentes. Incluye el cartucho de reacción, donde se obtiene el primer derivado, el frasco de conversión

donde se lo transforma en el PTH-derivado, que luego se transfiere a la columna de HPLC en fase reversa,

donde se separan por el gradiente de solvente, se lo detecta en el detector UV/VIS por su absorbancia y se lo

identifica por el tiempo de retención en la columna. La calibración se hace en base a una corrida con los

PTH derivados de los 20 aminoácidos proteicos, además en algún caso de un derivado correspondiente a una

modificación post-traduccional que se quiere detectar.

1er.Ciclo

2

3er.

DEGRADACI

ON DE

EDMANREACCION DEL

RESIDUO N-

TERMINAL CON

ISOTIOCIANATO

DE FENILO

1er. Ciclo

2o. Ciclo

3er. Ciclo

Secuenciación

automática por

el Método de

Edman

(N-terminal de

la cruzipaína)

2) Espectrometría de masa:

Puede utilizarse para secuenciar péptidos o para identificar

proteínas.

2a) Secuenciación: Seleccionar un péptido determinado por

MS y fragmentarlo, obteniendo su secuencia a partir de las

masas de los fragmentos resultantes (CID, fragmentación en

cámara de colisión, o PSD, decaimiento después de la fuente de

iones)

2b) Identificación: Sin separar los péptidos, determinar la

masa de cierto número de los mismos por MS e identificar a la

proteína en los bancos de datos, por comparación con las masas

de digeridos virtuales de todas las proteínas ya secuenciadas. Se

conoce como peptide mass fingerprinting (PMF). Es óptimo

cuando el genoma del organismo de origen está completamente

secuenciado.

FRAGMENTACION DE LOS PEPTIDOS

C

O

N

H

COOHNH2

y¨n z´nxnC-terminal ions

bnan c”n

N-terminal

ions

Roepstorff, P., and Fohlmann J. Biomed. Mass Spectrom. 11, 601 (1984)

Jhonson R. S., Martin S. A., Biemann K., Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes. 86, 137 (1988).

N C

N C

FRAGMENTACION DE LOS PEPTIDOS

Un péptido cargado puede ser fragmentado en dos trozos de tres maneras, que

pueden producir un par de iones a y x, un par de iones b e y, o un par de iones c

y z.

Teóricamente una fragmentación puede tener lugar en cualquier lugar de un

péptido, y se espera un espectro que contenga todos los posibles picos de iones.

En la práctica, debido a la fortaleza irregular de las ligaduras en las diferentes

posiciones, los diferentes iones aparecen con distintas frecuencias.

Los mas abundantes son los iones y, los cuales a menudo forman la serie

completa en un espectro. Los siguientes en frecuencia son los iones a y b, de

los cuales muchos no se observan. Los iones c, x y z se presentan mucho menos

frecuentemente. Adicionalmente, estos iones pueden formar nuevos iones por

pérdida de agua o de amonio.

La introducción de un grupo sulfónico en el N-terminal de un péptido tríptico

favorece la fragmentación que da lugar a los iones y, y suprime a los de la serie

b, dando un espectro simplificado, que facilita la determinación de la secuencia.

SECUENCIACION POR ESPECTROMETRIA DE MASA

La ES/MS puede aplicarse directamente a la secuenciación de péptidos,

utilizando un ES MS/MS, es decir un espectrómetro de masa de electrospray en

tandem, que tiene dos analizadores de masa separados por una celda de

colisión, donde el péptido seleccionado se fragmenta y da iones “hijos” que se

separan en el segundo analizador y permiten determinar la secuencia.

Collision-induced dissociation (CID)

Es una técnica de fragmentación usada para obtener información

estructural. Se utiliza la colisión con las moléculas de un gas para obtener

la fragmentación de un ión seleccionado por su masa.

Es una técnica de fragmentación usada con

MALDI-ToF MS para obtener información

estructural, típicamente a partir de péptidos

menores que 2 kDa. El decaimiento de un ion

precursor seleccionado por su masa tiene

lugar después que el ión deja la fuente de

iones, en el tubo de vuelo, y los fragmentos

iónicos son separados por el reflectrón.

Post-source decay (PSD)

1. PSD se refiere a un método de detección y medida

de las masas de fragmentos de iones que se forman

a partir de un ión precursor seleccionado.

2. Los fragmentos de iones se forman principalmente

por descomposición unimolecular después que los

iones precursores están completamente acelerados

(después que dejan la fuente de iones, de ahí el

nombre de post-source decay)

3. Los fragmentos de iones son separados y

detectados en el reflectrón.

Fundamento de Post Source Decay

(PSD)

Laser

ReflectronFuente

Detector

lineal

Detector

reflector

La descomposión

tiene lugar en

cualquier punto del

tubo de vuelo

La descomposición tiene lugar en el tubo

de vuelo.

No.

de

iones

Energía interna

Los fragmentos se obtienen por descomposición de los iones originales, que ocurre en el tubo de vuelo, es

decir, después de que los iones salieron de la fuente.

La descomposición se debe a la energía interna del ión precursor. Sólo una pequeña fracción de los iones

precursores tiene suficiente energía para fragmentarse. Esta energía puede aumentarse usando una

intensidad del laser mas elevada, o usando una celda de colisión.

EL FUNDAMENTO DE PSD

Cuando los iones precursores se fragmentan, la

velocidad de los fragmentos es igual a la del precursor,

por lo cual viajarán todos juntos en el tubo de vuelo.

Esto se debe a que la velocidad es determinada por la

aceleración inicial; si la energía inicial es 20 keV, las

energías de la unión química están alrededor de 10 eV,

de modo que la ruptura de una unión tendrá un efecto

mínimo sobre la velocidad.

Los aparatos usados tienen un selector de velocidad

(Bradbury-Neilson gate), que permite seleccionar al ión

precursor y a sus fragmentos para que pasen a su

través y lleguen al reflectrón.

El ión molecular precursor intacto tiene una energía cinética traslacional KEM = ½ Mv2, siendo M su

masa y v su velocidad. Un fragmento del ión precursor tiene una energía cinética traslacional KEm =

KEM (m/M), siendo M la masa del precursor y m la del fragmento.

Estas diferencias hacen que los iones precursor e hijos sigan diferentes caminos en el reflectrón. ¿Cómo

se hace para que los fragmentos que están viajando a la misma velocidad que el precursor pero tienen

una energía cinética reducida lleguen enfocados al detector? Variando la pendiente del gradiente de

voltaje del reflectrón a través del rango de masas de los fragmentos.

La secuenciación de péptidos usando Post Source Decay MALDI ha sido posible en principio

desde hace mucho tiempo, pero se la usaba poco por su difícil interpretación.

Hubo un avance dramático con el desarrollo de la derivatización del péptido antes de la PSD:

La acidificación por sulfonación dirige la fragmentación a la unión b-y , y neutraliza los

fragmentos b, con lo cual se obtiene una serie única de iones y. La distancia entre dos picos

adyacentes del espectro representa un aminoácido.

Dos reactivos comunes son ”CAF” y ”SPITC”:

N O

O

O

O

H2N

H

Pep

R2

+H

R2

Pep

O

NHS

O

OHO

S OH

O

O RT, pH>9

NHS-ester of 3-Sulfo-

propionic acid anhydrideMass addition, +136 Da

Agrega 215 Da al N-terminal y a cadenas laterales de Lys.

•El digerido tríptico se analiza por PMF.

•Para evitar la sulfonación de los e-aminos de Lys se pueden bloquear las Lys por

reacción con imidazol, que agrega 68 Da/Lys. Esto es específico, y no afecta al N-

terminal. Si no se lo hace, se observarán después de la sulfonación sólo los péptidos

con Arg. Luego se hace la sulfonación con el reactivo.

•La mezcla de péptidos modificados se analiza de nuevo por MALDI.

•Se buscan las masas que representan péptidos con Arg o Lys terminal, o sea los que

aumentaron su masa en 136 o 204 Da.

•Se pasa el aparato de MALDI a PSD y se selecciona esa masa de péptido.

•Se hace el análisis de PSD, que lleva aproximadamente 2 minutos en un TOF/TOF

MALDI.

Procedimiento experimental

Peptide mass fingerprinting de la aconitasa de Trypanosoma cruzi (- / + sulfonación)

Secuenciación por Post Source Decay (PSD) de péptidos trípticos de la aconitasa

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR PEPTIDE

MASS FINGERPRINTING (PMF)

• La muestra reducida y alquilada (en un fragmento de gel o mancha) se digiere

con una proteasa (tripsina?).

•La mezcla de péptidos resultante se analiza por MALDI-ToF-MS.

•La lista de masas de péptidos se utiliza para escanear un digerido in-silica de

una base de datos de secuencias por Internet.

•El resultado de la búsqueda se presenta como probability scores y otras

medidas de confianza.

•La homogeneidad de la muestra y la precisión de la medida son factores muy

importantes para una interpretación segura de los resultados.

1326.8

05

1173.6

52

1394.8

46

1715.9

84

873.4

71

1786.8

88

835.4

27

1751.7

97

1587.9

00

1430.8

71

914.5

55

1135.6

51

2270.0

86

1927.9

41

2071.0

08

742.4

10

1366.6

84

1522.9

32

1106.5

92

1258.7

29

940.5

05

971.5

49

1055.6

14

2306.0

46

2497.3

09

1870.9

13

2110.0

59

1993.9

65

663.8

19

1557.7

46

1657.8

11

2211.1

07

2669.2

96

2319.1

40

2375.1

23

2991.5

41

3070.5

87

2872.3

56

0

1

2

3

4

5

4x10In

tens. [a

.u.]

750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000m/z

PMF of band # 3

MDH-1

MDH-2

LAS MALATO DEHIDROGENASAS DE

TRYPANOSOMA CRUZI

MDH-1

MDH-2

EDMAN

SINTESIS QUIMICA DE PEPTIDOS

La sintesis quimica de peptidos es muy importante actualmente, pues

permite a) estudiar el plegamiento de regiones individuales de una

proteína; b) aislar, usandolos como ligandos para cromatografía de

afinidad, a receptores y otras proteínas, c) usarlos como drogas,

p.ej.: la 1-desamino-8-D-Arg-vasopresina, hormona antidiurética sin

efectos sobre la presión sanguinea; d) para generar anticuerpos

específicos.

La sintesis se realiza en fase sólida, aplicando el método

desarrollado por Merrifield, que le permitió sintetizar interferon (155

residuos) y ribonucleasa (124 residuos), ambos activos

Los aminoácidos que se introducen deben estar bloqueados en los

sitios en que no debe producirse reacción, y luego desbloquearlos

para continuar la etapa siguiente. Se efectúa con el residuo C-

terminal ligado a una resina, lo que permite eliminar facilmente

subproductos.

INTRODUCCION

A LA

PROTEOMICA

GENOMA Y PROTEOMA

GENOME: “GENes and ChromosOMEs” (Winkler,

1920): Conjunto completo de los cromosomas y sus

genes.

PROTEOME: Conjunto completo de las proteínas de

un organismo (el conjunto de proteínas codificadas

por un genoma, Wilkins y Williams, 1994; Wasinger et

al., 1995).

La secuenciación de los genomas se hizo posible con la

introducción de los métodos de secuenciación del ADN, a partir

del establecimiento del método utilizando dideoxynucleótidos

por Frederick Sanger, en 1975, que le permitió secuenciar el

genoma completo del bacteriófago X174, con 5,375 pares de

bases, en 1977. La primera secuenciación completa del genoma

de un organismo de vida libre fué la de Haemophilus influenzae

(1.8 Mb), en 1995. El Human Genome Project comenzó en

1990 y se completó en 2003; la estimación del número total de

genes en el genoma humano se estima entre 20,000 y 25,000. Al

2 de Enero de 2018 la Kyoto Encyclopedia of Genes and

Genomes (KEGG) registraba ya 429 genomas eucarióticos

completos, además de 4521 genomas de bacterias y 263 de

Archaea.

DETERMINACIÓN DE LA FUNCIÓN DE LOS GENES

Determinación de las características químicas, bioquímicas y

biológicas de las proteínas.

1) Estructura molecular.

2) Modificaciones post-traduccionales.

3) Capacidad de unir ligandos.

4) Velocidad de síntesis y degradación. Concentracion

intracelular.

5) Especificidad de tejido, célula y organela.

6) Especificidad de sexo.

7) Especificidad de estadío de desarrollo embrionario, post natal

y de envejecimiento.

Se estima en 252 el número de tipos celulares diferentes que se encuentran

en el hombre. Todas esas células tienen el mismo DNA, pero todas

ellas presentan diferencias cuali y cuantitativas en sus proteínas. El

DNA almacena información; las proteínas hacen todo lo demás.

ADN

Transcripción

Pre-mARN

“Splicing” alternativo

mARN 1 mARN 2 mARN 3

Traducción

Proteína 1 Proteína 2 Proteína 3

Modificación

Post-traduccional

y/o Proteólisis

Prot. 1’ Prot. 1’’ Prot. 2’ Prot. 2’’ Prot. 3’ Prot. 3’’

¿HAY IGUAL NUMERO DE PROTEINAS QUE DE GENES?

Para la funcionalidad adecuada de una proteína se

requiere mucho mas que la integridad del gen

estructural que la codifica. Si este está mutado, y el

producto es inactivo, naturalmente la proteína no será

funcional. Pero puede suceder algo parecido si el gen

estructural está intacto, pero hay mutaciones en otros

genes que participan en lo que realmente le interesa a la

célula, que es la proteína perfectamente plegada, con las

modificaciones post-traduccionales requeridas y

localizada en el compartimento subcelular correcto.

LA NATURALEZA POLIGENICA DE LAS PROTEINAS.

Gen estructural

Genes que codifican factores de transcripción. Genes que codifican chaperonas necesarias

para el plegamiento correcto.

Genes que codifican proteínas regulatorias. Genes que codifican enzimas que modifican

post-traduccionalmente a la proteína.

Genes que codifican proteínas que modifican Genes que codifican proteasas de

la estructura de la cromatina. procesamiento.

Genes que codifican proteínas de

transporte e integración a organelas.

Secuencias regulatorias en el ADN Genes que codifican proteasas

(“enhancers”) que degradan a la proteína

Proteína madura,

correctamente localizada,

en la concentración necesaria

DESAFIOS TECNICOS DE LA PROTEOMICA.

1) Si suponemos alrededor de 22,000 genes en el genoma humano, y

que cada gen da origen a entre 3 y 6 o más proteínas, el número total

de proteínas en un organismo superior puede variar entre 50,000 y

500,000.

2) Las proteínas tienen una heterogeneidad mucho mayor que los

ácidos nucleicos. La composición y secuencia de aminoácidos de una

proteína determina: a) su masa molecular; b) su carga total a

diferentes valores de pH; c) su hidrofobicidad; d) su forma, es decir

el plegamiento de la proteína nativa. Esto a su vez determina la

solubilidad de las proteínas en diferentes solventes, su

comportamiento en los métodos de separación y purificación, y su vida

media in vitro. La diversidad de propiedades fisicoquímicas es

muchísimo mayor que la de los ácidos nucleicos.

3) Los valores de pI de las proteínas varían entre menos de 3 y más de

12, con dos grandes agrupamientos, uno alrededor de 5.5 y el otro

alrededor de 8.5. Los ácidos nucleicos tienen un rango estrecho de pI,

en la zona ácida.

4) Los ácidos nucleicos son muy solubles en soluciones acuosas, en

tanto que muchas proteínas son muy hidrofóbicas, y por ello insolubles

en agua. Se estima que más del 15 % de las proteínas totales nunca

entrarán en un gel de 2D-PAGE por su extrema hidrofobicidad.

5) La masa molecular de las proteínas varía entre unos pocos miles y

varios millones de Daltons, y su tamaño no puede predecirse con

certeza a partir de la secuencia de aminoácidos derivada de la

secuencia de DNA, por las modificaciones post-traduccionales.

6) La concentración de las proteínas varía dentro de un rango muy

amplio, probablemente mayor que el rango de los mRNAs. La

diferencia en concentración de proteínas abundantes y raras en los

flúidos corporales es mayor que 12 órdenes de magnitud.

LAS HERRAMIENTAS PARA EL ESTUDIO DEL

PROTEOMA

La técnica clásica, y hasta hace unos pocos años, la

principal utilizada, es la separación de las proteínas por

electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida, seguida de

identificación de dichas proteínas por secuenciación o, en general

actualmente, por espectrometría de masa, después de hidrólisis

enzimatica parcial.

Actualmente lo mas utilizado para estudios amplios de

proteómica son otras combinaciones de técnicas, por ejemplo

cromatografía de alta resolución (HPLC) combinada con

espectrometría de masa, o electroforesis capilar tambien combinada

con espectrometría de masa. Este tipo de técnicas permite la

identificación de proteínas en mezclas complejas, previa hidrólisis

enzimática parcial.

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

Electrophoresis 2000, 21, 2610-16

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

EN EL ESTUDIO DEL PROTEOMA.

Ventajas:

Excelente resolución: pueden identificarse a veces hasta 10,000 proteínas

en un solo gel. Es una técnica capaz de analizar simultáneamente miles

de proteínas.

Desventajas:

1)Pueden ser necesarios varios geles, corridos en diferentes condiciones

de rango de pH y de concentración de acrilamida, para resolver las

mezclas muy complejas.

2) Es difícil detectar proteínas muy grandes o muy chicas, muy ácidas o

muy básicas, o proteínas de membrana (muy hidrofóbicas).

3) Se detectan sólo las proteínas de alta y mediana abundancia en el

material en estudio. En cualquier célula, sus proteínas pueden variar en

concentración en seis órdenes de magnitud. Para ver proteínas

minoritarias, es necesario en general purificar la organela en que se

encuentran y trabajar con ese material. Tambien se puede trabajar previa

marcación radioactiva, para aumentar la sensibilidad de detección.

EDMAN MALDI-ToF-MS

SensibilidadBajo pmole (6x1011

moléculas; 67 ng albúmina)

Bajo fmole (6x108

moléculas; 67 pg albúmin

Costo US$ 150/peptido < 1 ¢/analisis

Tiempo de análisis Overnight Pocos minutos

Número de frascos de cultivo necesarios

100-150 1

Identificación de proteínas por EDMAN vs MALDI-ToF-MS

Electroforesis diferencial en gel (DIGE).

Se marcan las dos muestras de proteína que se quieren comparar

con dos colorantes diferentes, reactivos con el amino, y diseñados

para mantener la misma movilidad relativa.

Se mezclan las dos muestras de proteínas marcadas y se las corre

en un mismo gel bidimensional.

Después de la corrida se crean dos imágenes de fluorescencia del

gel que se superponen para identificar diferencias en el patrón.

Esta técnica hace innecesario comparar geles diferentes.

Está disponible comercialmente.

El método ICAT permite medir la

expresión diferencial de proteínas.

Estructura del reactivo ICAT: ICAT

consiste de un grupo biotina para

afinidad, una región intermedia que

puede incorporar átomos de deuterio o

de hidrógeno, y un grupo terminal

reactivo de tioles para unirlo a cisteínas.

Estrategia de ICAT: Las proteínas se

cosechan en dos estados celulares

diferentes y se marcan en los residuos

de cisteína con la forma liviana o la

pesada del reactivo ICAT. Después del

marcado, las dos muestras de proteína

se mezclan y se digieren con una

proteasa, como la tripsina. Los péptidos

marcados con el ICAT pueden ser

purificados usando cromatografía de

afinidad con avidina. Siguiendo la

purificación, los péptidos marcados con

ICAT son analizados por MS para

cuantificar las relaciones entre los picos

y las proteínas se identifican por

secuenciación con MS/MS.

Isotope-coded affinity tags (ICAT)

Si bien la idea última detrás de los estudios de

proteómica es llegar algún día al conocimiento completo

de las proteínas de un organismo, lo mas frecuente

actualmente es hacer proteómicas parciales: la

proteómica de un tipo celular determinado; la proteómica

de una organela aislada; la proteómica de las proteínas

blanco de una determinada modificación post-

traduccional; las diferencias en la expresión de proteínas

antes y después de la diferenciación de un estadío a otro

en un organismo que tiene un ciclo de vida complejo; las

diferencias en la expresión de proteínas de una misma

célula antes y después de un determinado tratamiento.

Cromatografía líquida en 2 dimensiones acoplada a espectrometría de masa (2D LC MS/MS)

Identificación de proteínas potencialmente SUMOiladas en

Trypanosoma cruzi

Resuspensión en UreaReducción con DTT+ Alquilación con IAADigestión con TripsinaDesalado en Columna fase reversa C18

(DSC-18, Supelco, Sigma-Aldrich)Lleva muestra a sequedadResuspende en 2% ACN/0.1%FA 20 μg proteínaColumna intercambio ionico

(SCX 5 uL opti-pak)Eluidos 0,25,50,100,200 y 500 mM NaClSistema de nano-HPLCTrap loading C18-columnTrap separation C18-column

Elución en gradiente 5–40% ACN/0.1% FA en 100 min

Análisis de péptidos en línea con un espectrómetro de masa(LTQ XL/ETD, Thermo Fisher Scientific).

Proteínas potencialmente SUMOiladas

Distribución por categoria funcional

Se identificaron 7178 péptidos en ambas muestras. Corresponden a 2686 proteínas.

236 resultaron enriquecidas en la Muestra vs. Control

Proteínas potencialmente sumoiladas

Metacaspasa 3 in vivo

Validación de proteínas SUMOiladas