CARACTERIZAÇÃO DE TcKAP7: UMA PROTEÍNA ASSOCIADA AO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANAacute

CARACTERIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 UMA PROTEIacuteNA ASSOCIADA AO

CINETOPLASTO DO PROTOZOAacuteRIO Trypanosoma cruzi

CURITIBA

2015

FLAacuteVIA SOUZA MORINI



Tese apresentada ao Curso de Poacutes Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular Departamento de Biologia Celular Setor de Ciecircncias Bioloacutegicas Universidade Federal do Paranaacute como requisito parcial agrave obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutora em Biologia Celular e Molecular Orientador Dr Stenio Perdigatildeo Fragoso

CURITIBA

2015

Agrave vocecirc minha pequena

Ah como era a vida antes de vocecirc chegar mesmo

Era muito mais sem graccedila com certeza

Vocecirc chegou e junto com vocecirc um turbilhatildeo de novidades e no meio

disso tudo uma tese para ser defendida Mas com a sua inocecircncia

entendeu minhas ausecircncias me fez tirar forccedilas da onde eu natildeo sabia para

tocar meu trabalho a diante e terminar a tese A Mama ama vocecirc mais que

tudo Anjinha Esse trabalho eacute dedicado agrave vocecirc minha princesa

Obrigada por fazer parte desta etapa da minha vida gatinha

Ao meu Mozatildeo Meu marido Meu melhor amigo Meu companheiro para o

que der e vier E agora papaizote da nossa Anjinha

Obrigada por me apoiar sempre Me dar forccedilas broncas conselhos de tudo

um pouco Obrigada por fazer a nossa bebezotinha entender a ausecircncia da

mama quando vaacuterias noites vocecirc tinha que fazer ela dormir para eu poder ir no

lab ou ficar escrevendo Sem vocecirc eu natildeo conseguiria vitinha Obrigada

por estar aqui Sempre Tannnnnntoooooo

Agrave vocecircs pentelhos

O que seria de mim sem vocecircs

Vocecircs satildeo minha fortaleza meu porto seguro sempre posso contar com vocecircs

pra tudo tudo mesmo Obrigada pelos conselhos pelas broncas por

nunca me deixar desistir mesmo nos momentos mais difiacuteceis vocecircs sempre

tinham uma palavra que me confortava me encorajava e me fazia seguir em

frente Sem a ajuda de vocecircs esse trabalho natildeo ficaria pronto nunca

Amo vocecircs

AGRADECIMENTOS

Agrave Deus em primeiro lugar por me dar sauacutede vitalidade e acircnimo sempre

E por sempre estar comigo

Ao Dr Stenio Perdigatildeo Fragoso pela orientaccedilatildeo confianccedila dedicaccedilatildeo e

amizade Afinal satildeo 12 anos hein chefe Como vocecirc ainda me aguenta Obrigada

por tudo aprendi e continuo aprendendo muito com vocecirc

Agrave Dra Tatiana Arruda Campos Brasil que me ajudou desde o primeiro

momento em que eu entrei no Laboratoacuterio de Proteiacutenas com seu jeito meigo e

atencioso e com sua experiecircncia me mostrou um mundo novo por qual eu me

apaixonei Sempre com muita paciecircncia me explicava tudo tim tim por tim tim e me

ajudou muuuito na escrita da tese Obrigada Tati

Agrave Dra Lia Medeiros que me ajudou muito com as microscopias Fizemos ateacute

o sacrifiacutecio de ir visualizar uma MET na UFSC em Floripa que chato neacute Brigadatildeo

Lia pela paciecircncia e boa vontade

Ao Dr Paulo Carvalho e a Dra Juliane Fischer que me ajudaram em

experimentos e anaacutelises que nem entraram na tese Sempre muito atenciosos

Obrigada

Aos meus queridos amigos do LAB2 Aqueles que jaacute se foram (Andreacute

Aleatoacuterio Lari Mauriacutecio Baacuterbara Odineacuteia Paacute ) e aqueles que estatildeo laacute ateacute hoje

(Didi Gi Vanessa Felipe Aline Claudinha) Obrigada por fazerem o trabalho ficar

mais divertido Aos meus companheiros de doc Mocircnica e Fernando o trio parada

dura passou por muita coisa junto e tem muita histoacuteria pra contar Obrigada gente

adoro vocecircs

Agraves minhas queridas amigas mais ldquoexperientesrdquo que moram no meu coraccedilatildeo

Aldinha e Dani obrigada por todos os momentos que passamos juntas no lab e fora

do lab obrigada pela a ajuda que sempre me deram sem esperar nada em troca

vocecircs sabem que seus conselhos sempre foram muito valiosos pra mim Obrigada

amigas vocecircs satildeo iacutempares

Agrave minha querida irmatildezinha Rocirc que nasceu no mesmo dia soacute que eacute mais

velha hahahahaha Obrigada amiga por tudo por todo esse tempo pelos

experimentos pelas confissotildees pelas gargalhadas Vocecirc eacute uacutenica

Agrave Pri Hira Mari Serpeloni Haruo Daisy Vanessa que sempre me ajudavam

quando eu precisava ou fazer um experimento ou jogar conversa fora

Aos meus amigos doutores atleticanos Michel e Henrique que me ajudaram

em vaacuterios experimentos e anaacutelises Obrigada por estarem sempre dispostos em

ajudar Vocecircs satildeo atleticanos mas satildeo gente boa Obrigada

Ao Giovany pela imensa ajuda com os camundongos sempre disposto em

ajudar e ensinar

Ao Nilson Silvio Tacircnia Sibelli por toda a ajuda pela amizade e pela

paciecircncia e competecircncia Ah e pelas histoacuterias de terror

Agrave Maria Cristina por toda a ajuda natildeo soacute na parte administrativa e pela

amizade

Ao Dr Marco Krieger pela confianccedila e por me proporcionar suporte

financeiro quando entrei no periacuteodo de prorrogaccedilatildeo

A todos os amigos e pesquisadores do Instituto Carlos Chagas dos demais

laboratoacuterios Lab REG Lab Genocircmica Laboratoacuterio de Biologia Celular por terem de

um jeito ou de outro participado do processo Eacute difiacutecil agradecer todo mundo

Valeu galera

ldquoTenho a impressatildeo de ter sido uma crianccedila brincando agrave

beira-mar divertindo-me em descobrir uma pedrinha

mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras

enquanto o imenso oceano da verdade continua

misterioso diante de meus olhosrdquo

(Isaac Newton)

RESUMO

O DNA do cinetoplasto (kDNA) dos tripanosomatiacutedeos consiste numa rede de

moleacuteculas circulares catenadas entre si os miniciacuterculos e os maxiciacuterculos Os

miniciacuterculos codificam RNAs guias (gRNAs) e os maxiciacuterculos codificam para

algumas subunidades de enzimas mitocondriais e rRNA em um padratildeo

criptografado (ediccedilatildeo de RNA) Estudos com o tripanosomatiacutedeo Crithidia fasciculata

mostraram que proteiacutenas do tipo histona H1 associadas ao cinetoplasto (KAPs) satildeo

capazes de condensar a rede de kDNA Poreacutem pouco eacute conhecido sobre estas

proteiacutenas de Trypanosoma cruzi um protozoaacuterio parasita que sofre alteraccedilotildees na

estrutura do DNA do cinetoplasto ao longo de seu ciclo de vida Neste trabalho foi

caracterizada uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T cruzi denominada de

TcKAP7 que possui baixo peso molecular e natureza baacutesica condizente com um

papel na neutralizaccedilatildeo de carga e na condensaccedilatildeo do DNA Atraveacutes de ensaios

usando a teacutecnica de espalhamento de raios-X a baixo acircngulo (SAXS) foi possiacutevel

perceber que a proteiacutena TcKAP7 sofre mudanccedilas estruturais na presenccedila do kDNA

sugerindo uma interaccedilatildeo com essa estrutura seja atraveacutes de ligaccedilotildees eletrostaacuteticas

ou atraveacutes de ligaccedilotildees especiacuteficas com moleacuteculas presentes na rede A anaacutelise pela

teacutecnica de imunofluorescecircncia mostrou que proteiacutena TcKAP7 estaacute localizada na

regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto o que sugere que pode estar envolvida na

finalizaccedilatildeo da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos Mutante nulo para TcKAP7 foi gerado por

teacutecnicas de substituiccedilatildeo gecircnica a fim de verificar se na ausecircncia de TcKAP7

ocorriam alteraccedilotildees na estrutura do kDNA Contudo os parasitas mutantes para

TcKAP7 natildeo apresentavam alteraccedilotildees na estrutura e morfologia do cinetoplasto

quando analisados por microscopia eletrocircnica e foram capazes de se diferenciar

sem perder a capacidade infectiva Entretanto ensaios de RNA de interferecircncia

visando analisar a funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei levou agrave reduccedilatildeo

da proliferaccedilatildeo celular das formas prociacuteclicas desse parasita mostrando que este

gene eacute essencial para o metabolismo desse tripanosomatiacutedeo sugerindo que KAP7

possa ter papeis distintos em T cruzi e T brucei

Palavras-chaves Trypanosoma cruzi cinetoplasto nocaute KAPs

ABSTRACT

The kinetoplast DNA (kDNA) of trypanosomatids consists in a network of circular

molecules catenated each other the minicircles and maxicircles The minicircles

code RNAs guides (gRNAs) and the maxicircles code for some subunits of

mitochondrial enzymes and rRNA in a cryptic pattern (RNA editing) Studies in the

trypanosomatid protozoan Crithidia fasciculata showed that the kDNA is associated

with histone H1-like proteins known as kinetoplast-associated proteins (KAPs) wich

are capable of condensing the kDNA network However little is known about these

proteins of Trypanosoma cruzi a protozoan parasite which undergoes changes in

kinetoplast DNA structure over its life cycle Here we characterize a protein

associated with T cruzi kinetoplast named TcKAP7 TcKAP7 is a low molecular

weight protein with basic nature which is consistent with a role in DNA charge

neutralization and condensation Analysis by small angle X-Ray scattering technique

(SAXS) revealed that the TcKAP7 protein undergoes structural changes in the

presence kDNA suggesting an interaction with this DNA network either through

electrostatic bonds or through specific binding to molecules present on the network

The immunofluoresce analysis showed that TcKAP7 is located in the kinetoplast

poles suggesting that TcKAP7 might be involved in the late stages of the minicircle

replication A null mutant for TcKAP7 was obtained by gene replacement techniques

to study possible alterations in the kDNA structure However no modification in the

structure and morphology of the kinetoplast was observed by electron microscopy In

addition Tckap7 null mutant was able to differentiate without losing its infective

capacity Interference RNA assays was performed to analyze the function of

TbKAP7 the ortholog gene in T brucei The ablation of TbKAP7 expression leaded

to reduction in the procyclic proliferation suggesting that this gene is essential for the

metabolism of the parasite and might play distinct roles in T cruzi and T brucei

Key-words Trypanosoma cruzi kinetoplast gene knockout KAPs

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA

DE CHAGAS19 FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO

Trypanosoma cruzi20 FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS

CELULARES DE T cruzi 22 FIGURA 4 REDE DE kDNA27 FIGURA 5 DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO

DE T cruzi29 FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA

NOS TRYPANOSOMAS29 FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO

AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTEO CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO30

FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA32 FIGURA 9 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO

MICROFLUIDIFICADOR45 FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI

P3XFLAG 50 FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES

UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP755

FIGURA 12 MAPA DO VETOR P2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi62

FIGURA 13 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER65

FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS66

FIGURA 15 SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS67

FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP769

FIGURA17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI70

FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI71

FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS73

FIGURA 20 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener75

FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT75

FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT76

FIGURA 23 COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS77

FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO78

FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT) 79

FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO80

FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T brucei82

FIGURA 28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE83

FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA84

FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP785 FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS86 FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE

TcKAP787 FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE

TcKAP787 FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI88 FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP790 FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE

TcKAP791 FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD

3TTM 4NNU E TCKAP793 FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR

DE TcKAP794 FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP795 FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 VISTO EM

DIFERENTES AcircNGULOS96

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153

TABELA 2 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153

TABELA 3 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO GENE TbKAP763

TABELA 4ndash PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO67

TABELA 5 COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP772

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO18 11 O Trypanosoma cruzi18 12 Ciclo de vida do T cruzi20 13 Aspectos celulares de T cruzi21 14 O genoma de T cruzi24 15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi25 16 O cinetoplasto26 17 A rede de kDNA26 171 Replicaccedilatildeo do kDNA31 18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)32 2 OBJETIVOS35 21 OBJETIVO GERAL35 211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS35 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS36 31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados36 311 Reagentes36 312 Tampotildees e Soluccedilotildees36 313 Meios de cultura38 32 Cultivo do Trypanosoma cruzi38 321 Epimastigotas38 322 Tripomastigotas metaciacuteclicos39 33 Curva de crescimento de T cruzi39 34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi40 35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi40 36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi40 37 Clonagem do gene TcKAP741 38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR41 39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes42 391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)42 392 Teacutecnica de PCR de colocircnia43 310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)43 311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli43 312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP744 3121 Processamento da amostra44 3122 Cromatografia de afinidade45 3123 Cromatografia de troca iocircnica46 3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo46 313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS46 314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)46 315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo47 316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo47 317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)48 318 Modelagem de TcKAP748 319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP749 320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo western blot49 321 Superexpressatildeo de TcKAP750

3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para superexpressatildeo da proteiacutena50 3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo52 3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes52 322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico53 3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene TcKAP753 3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para transfecccedilatildeo de T cruzi55 3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN56 3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes57 3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-NEO-DOWN57 3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN57 3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-HIGRO-DOWN58 3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot58 323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia59 324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo60 325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados60 326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP761 327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia61 3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita64 4 RESULTADOS65 41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP765 42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi69 43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia70 44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico71 441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN72 442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do tipo Southern blot74 45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot76 46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP776 47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para TcKAP779 48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia80 49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP782 491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP782 410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP784 411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante86 412 Anaacutelise estrutural de TcKAP787

413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de TcKAP791 4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP791 4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA93 5 DISCUSSAtildeO97 6 CONCLUSOtildeES102 7 REFEREcircNCIAS103

18

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 O Trypanosoma cruzi

Trypanosoma cruzi eacute um protozoaacuterio flagelado unicelular pertencente ao

reino Protista subreino Protozoa filo Sarcomastigophora subfilo Mastigophora

classe Zoomastigophora ordem Kinetoplastida e famiacutelia Trypanosomatidae (LEVINE

et al 1980) A principal caracteriacutestica dessa ordem eacute a presenccedila de uma estrutura

singular o cinetoplasto que abriga em uma massa de DNA extranuclear

concentrado na mitococircndria uacutenica deste protista (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) A

famiacutelia Trypanosomatidae inclui os seguintes gecircneros importantes Blastocrithidia

Crithidia Endotrypanum Herpetomonas Leishmania Leptomonas Phytomonas e

Trypanosoma O gecircnero Trypanosoma eacute um dos mais importantes dentro da famiacutelia

Trypanosomatidae por incluir uma seacuterie de espeacutecies causadoras de doenccedilas

humanas importantes como o Trypanosoma cruzi agente da doenccedila de Chagas

Trypanosoma rhodesiense e Trypanosoma gambiense agentes da doenccedila do sono

e de animais o Trypanosoma brucei Trypanosoma equiperdum e Trypanosoma

equinum (DE SOUZA 2015)

Este protozoaacuterio eacute um microrganismo heteroxecircnico com ciclo bioloacutegico

alternado entre hospedeiros vertebrados (mamiacuteferos) e invertebrados (triatomiacuteneos)

Existem diferentes formas de transmissatildeo da doenccedila dentre as quais se destaca a

via vetorial que consiste na transmissatildeo do parasita atraveacutes de excretas do inseto

vetor hematoacutefago pertencente agrave ordem Hemiacuteptera famiacutelia Reduvidae subfamiacutelia

Triatominae (DIAS et al 1956) A principal caracteriacutestica bioloacutegica dos triatomiacuteneos

eacute que satildeo obrigatoriamente hematoacutefagos e necessitam do repasto sanguiacuteneo para

completar o desenvolvimento (DIAS 2000) O parasita pode ainda ser transmitido

aos mamiacuteferos por transfusatildeo sanguiacutenea ou via oral e com menos frequecircncia por

via congecircnita acidentes de laboratoacuterio e transplantes de oacutergatildeos (BELTRAO HDE et

al 2009 STEINDEL et al 2008 TANOWITZ et al 1992) Praticamente todo tipo

de ceacutelula nucleada do hospedeiro mamiacutefero pode ser parasitada considerando o

tropismo das diferentes cepas (LENZI et al 1996) Outra caracteriacutestica deste

parasita eacute apresentar diferentes morfologias durante o ciclo bioloacutegico A classificaccedilatildeo

19

de suas formas baseia-se tambeacutem na posiccedilatildeo do cinetoplasto em relaccedilatildeo ao nuacutecleo

e do local de onde emerge o flagelo (HOARE 1971)

Foi no ano de 1909 no estado de Minas Gerais que Carlos Chagas meacutedico

sanitarista identificou pela primeira vez o protozoaacuterio parasita Trypanosoma cruzi

agente causador da Doenccedila de Chagas A doenccedila de Chagas eacute endecircmica na

Ameacuterica Latina sendo conhecida a existecircncia de vetores da doenccedila desde o sul dos

Estados Unidos agrave Argentina (FIGURA 1)

FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA DE CHAGAS FONTE Modificado de httpwwwwhointen

Em 2008 o nuacutemero de indiviacuteduos infectados era estimado entre 16 e 18

milhotildees sendo que aproximadamente 90 milhotildees de pessoas estariam sob risco

de contaminaccedilatildeo na Ameacuterica Latina (WHO 2010)

Apesar de existirem drogas (Nifurtimox e Benzonidazol) para o tratamento

da doenccedila sua ineficaacutecia no estaacutegio crocircnico e sua accedilatildeo toacutexica acabam prejudicando

o paciente sem conseguir eliminar o parasita (BRENER et al 2000) Sem vacinas

ou tratamento quimioteraacutepico eficiente a principal estrateacutegia de controle limita-se agrave

prevenccedilatildeo da transmissatildeo por transfusatildeo sanguiacutenea e ao controle populacional dos

vetores triatomiacuteneos Aleacutem da sua importacircncia como patoacutegeno humano este micro-

organismo apresenta caracteriacutesticas peculiares que o tornam um excelente modelo

para o estudo de questotildees bioloacutegicas baacutesicas

Regiotildees endecircmicas

20

12 Ciclo de vida do T cruzi

O T cruzi apresenta um ciclo complexo na natureza sofrendo mudanccedilas

estruturais bioquiacutemicas e morfoloacutegicas de acordo com o ambiente em que se

encontra Formas replicativas epimastigotas e amastigotas dos hospedeiros

invertebrado e mamiacutefero respectivamente alternam-se com as formas infectivas e

natildeo proliferativas tripomastigotas metaciacuteclicas (proveniente do inseto vetor) e

tripomastigota sanguiacutenea (originaacuteria do mamiacutefero infectado) (FIGURA 2) (DE

SOUZA 1984)

FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO Trypanosoma cruzi FONTE Infograacutefico Veniacutecio Ribeiro ICICTFIOCRUZ

Durante o repasto sanguiacuteneo do inseto vetor formas tripomastigotas

metaciacuteclicas atingem a corrente sanguiacutenea do hospedeiro pela lesatildeo da picada Esta

forma infectiva eacute capaz de invadir todos os tipos de ceacutelulas com exceccedilatildeo das

21

hemaacutecias Apoacutes a entrada do parasita na ceacutelula os tripomastigotas diferenciam-se

em uma forma replicativa denominada amastigota que apoacutes diversas divisotildees sofre

uma diferenciaccedilatildeo para um estaacutegio intermediaacuterio o epimastigota intracelular e

posteriormente para tripomastigota Quando ocorre a lise celular os tripomastigotas

satildeo liberados ao meio extracelular podendo entatildeo invadir ceacutelulas vizinhas atingir

novos tecidos atraveacutes da corrente sanguiacutenea ou ainda infectar um inseto vetor

durante o processo de hematofagia recomeccedilando o ciclo no hospedeiro

invertebrado No inseto as formas tripomastigotas diferenciam-se em epimastigotas

no tubo digestivo e migram para o intestino onde ocorrem as divisotildees binaacuterias Ao

atingirem a porccedilatildeo terminal do tubo digestivo ocorre a diferenciaccedilatildeo em

tripomastigotas metaciacuteclicos que satildeo eliminados juntamente com as fezes e urina do

triatomiacutedeo

A transformaccedilatildeo da forma epimastigota do T cruzi em tripomastigota

metaciacuteclica denominada metaciclogecircnese eacute de grande interesse de estudo pois

neste processo ocorrem diversas alteraccedilotildees morfoloacutegicas metaboacutelicas e de

expressatildeo gecircnica (GOLDENBERG et al 1985) A metaciclogecircnese que ocorre

naturalmente no intestino do inseto vetor pode ser mimetizada in vitro utilizando-se

meio quimicamente definido que simula as condiccedilotildees da urina do inseto vetor

(CONTRERAS et al 1985)

13 Aspectos celulares de T cruzi

O Trypanosoma cruzi apresenta aleacutem das organelas tiacutepicas da maioria das

ceacutelulas eucarioacuteticas como nuacutecleo retiacuteculo endoplasmaacutetico aparato de Golgi e

mitococircndria algumas estruturas peculiares (FIGURA 3) como os microtuacutebulos

subpeliculares a estrutura paraflagelar os reservossomos o cinetoplasto os

glicossomos e os acidocalcisomos exclusivos dos tripanosomatiacutedeos (revisto por

DE SOUZA 1984 1999 2002)

22

FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS CELULARES DE T cruzi FONTE DOCAMPO et al 1975

A superfiacutecie celular dos tripanossomatiacutedeos eacute composta principalmente

pela membrana plasmaacutetica e pelos microtuacutebulos subpeliculares Pequenos

filamentos conectam fortemente os microtuacutebulos subpeliculares os quais se

apresentam espaccedilados de forma regular entre si e com a membrana plasmaacutetica (DE

23

SOUZA SANTANNA CUNHA-E-SILVA 2009) conferindo rigidez agrave ceacutelula e

resistecircncia ao rompimento mecacircnico

Todos os membros da famiacutelia Trypanosomatidae apresentam um flagelo

que emerge de uma aacuterea de invaginaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica conhecida como

bolsa flagelar Devido agrave localizaccedilatildeo especiacutefica de vaacuterios receptores nesta aacuterea

acredita-se que a maior parte do traacutefego vesicular e entrada de nutrientes ocorram

nesta regiatildeo Outra invaginaccedilatildeo menor localizada proacutexima agrave bolsa flagelar o

citoacutestomo tambeacutem estaacute envolvida com a absorccedilatildeo de nutrientes (PORTO-

CARREIRO et al 2000)

O flagelo do T cruzi apresenta uma estrutura baacutesica semelhante a outros

flagelos sendo envolvido por uma membrana flagelar e contendo um axonema

tiacutepico que apresenta um padratildeo de nove pares de microtuacutebulos perifeacutericos e um par

central Associado ao flagelo deste parasita eacute encontrado um complexo arranjo de

filamentos proteacuteicos denominado de estrutura paraflagelar (revisto por GULL 1999)

Na parte posterior da ceacutelula existem organelas usualmente esfeacutericas

denominadas reservossomos Os reservossomos satildeo organelas aacutecidas que

possuem em seu interior proteinases principalmente a cruzipaiacutena (uma

cisteiacutenoproteinase) e proteiacutenas ingeridas que chegam dentro de vesiacuteculas

endociacuteticas oriundas da bolsa flagelar e do citoacutestomo Com base nisso foi proposto

que os reservossomos seriam compartimentos preacute-lisossomais (SOARES et al

1992) Tambeacutem tem sido proposta a participaccedilatildeo dos reservossomos no processo

de metaciclogecircnese como principal fonte de energia para esta atividade (SOARES

1999)

O T cruzi assim como todos os membros da famiacutelia Tripanosomatidae

apresenta uma mitococircndria uacutenica e ramificada que se estende por todo o corpo do

protozoaacuterio Como em todas as ceacutelulas eucarioacuteticas a mitococircndria dos

tripanosomatiacutedeos tambeacutem apresenta DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como

kDNA ou DNA do cinetoplasto que se concentra em uma determinada regiatildeo da

mitococircndria localizada logo abaixo do corpuacutesculo basal dando origem a uma

estrutura intramitocondrial chamada de cinetoplasto O cinetoplasto abriga o kDNA

o qual eacute constituiacutedo por moleacuteculas circulares que se encontram interligadas

formando uma extensa rede entre si (SHLOMAI 1994)

Distribuiacutedos pelo citoplasma estatildeo os glicossomos um tipo especializado de

peroxissomo Estes acumulam enzimas da via glicoliacutetica envolvidas na conversatildeo

24

da glicose a 3-fosfoglicerato que em outros organismos localizam-se no citoplasma

(HANNAERT et al 2003)

Outra particularidade dos tripanossomatiacutedeos estaacute na estocagem intracelular

de caacutelcio Este iacuteon importante nos processos de sinalizaccedilatildeo celular eacute estocado em

organelas denominadas acidocalcissomos Os acidocalcissomos provavelmente

estatildeo envolvidos em diversos processos bioloacutegicos tais como o armazenamento de

caacutelcio e polifosfatos adaptaccedilatildeo dos tripanosomatiacutedeos a condiccedilotildees de estresse

ambiental manutenccedilatildeo do pH intracelular e osmorregulaccedilatildeo (revisto por DOCAMPO

et al 2005)

14 O genoma de T cruzi

No ano de 2005 foi concluiacuteda a montagem do genoma do T cruzi (EL-

SAYED et al 2005) A cepa CL Brener foi a escolhida para o sequenciamento por

ser bem caracterizada bioquiacutemica e parasitologicamente (ZINGALES et al 1997) e

por ser considerada representativa para o universo de cepas circulantes de T cruzi

Com base na montagem do sequenciamento o genoma diploacuteide do parasita foi

calculado como sendo de 1064 1107 Mb com cada haploacutetipo contendo cerca de

12000 genes sendo que mais de 50 do genoma constituiu-se de sequecircncias

repetitivas compostas por famiacutelias de proteiacutenas de superfiacutecie retrotransposons e

elementos subtelomeacutericos (EL-SAYED et al 2005)

A comparaccedilatildeo das estruturas genocircmicas e proteiacutenas preditas obtidas a

partir do sequenciamento de Trypanosoma cruzi com as de Leishmania major e

Trypanosoma brucei indica mais similaridade entre T cruzi e T brucei uma grande

conservaccedilatildeo entre os respectivos proteomas (exceto para antiacutegenos de superfiacutecie) e

uma sintenia bastante conservada entre os trecircs tripanosomatiacutedeos apesar da

divergecircncia haacute 200-500 milhotildees de anos atraacutes (BERRIMAN et al 2005 EL SAYED

et al 2005 IVENS et al 2005)

Os tripanosomatiacutedeos possuem aleacutem do genoma nuclear um grande

genoma mitocondrial (kDNA) que tem sido extensivamente estudado sendo uacutenico

em estrutura funccedilatildeo e mecanismo de replicaccedilatildeo O kDNA eacute formado por milhares de

moleacuteculas circulares topologicamente relaxadas e interligadas umas as outras Este

arranjo conteacutem aproximadamente 20 - 30 do DNA total dos tripanosomatiacutedeos e eacute

composto por 2 tipos de moleacuteculas circulares os maxiciacuterculos e os miniciacuterculos Os

25

maxiciacuterculos apresentam um tamanho entre 22-37 kb e conteacutem basicamente os

genes codificadores de proteiacutenas envolvidas na fosforilaccedilatildeo oxidativa e RNA

ribossocircmico Os miniciacuterculos com um tamanho que varia de espeacutecie para espeacutecie

(05 a 25 kb) conteacutem os genes que codificam os RNAs guia envolvidos na

editoraccedilatildeo do RNA (STUART et al 1989 SHAPIRO amp ENGLUND 1995 MADISON-

ANTENUCCI et al 2002 SIMPSON et al 2003 ONN et al 2006 GLUENZ et al

2007)

15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi

T cruzi estaacute sujeito agraves frequentes mudanccedilas de ambientes decorrentes da

passagem por diferentes hospedeiros durante seu ciclo de vida (temperatura pH

quantidade de nutrientes evasatildeo do sistema imune) por esse motivo a expressatildeo

gecircnica deste parasita eacute regulada por diversos fatores A adaptaccedilatildeo raacutepida e eficiente

a estas diferentes condiccedilotildees torna-se uma importante tarefa para o parasita

Como os demais eucariotos o T cruzi apresenta trecircs RNAs polimerases a

RNA polimerase I transcreve os genes para RNAs ribossocircmicos a RNA polimerase

II os genes que codificam proteiacutenas e a RNA polimerase III pequenos RNAs como

o tRNA (RNA de transferecircncia) Nos tripanosomatiacutedeos promotores para as RNA

polimerase I e III jaacute foram identificados poreacutem ainda natildeo foram identificados

promotores para os genes transcritos pela RNA polimerase II com exceccedilatildeo de um

promotor associado ao gene do mini-exon (GILLINGER amp BELLOFATTO 2001

revisto por CAMPBELL et al 2003)

Os genes dos tripanosomatiacutedeos estatildeo organizados em unidades

policistrocircnicas e natildeo apresentam interrupccedilotildees por iacutentrons com exceccedilatildeo do gene da

poli-A polimerase (MAIR et al 2000)

Uma vez que em T cruzi como nos demais eucariotos somente mRNAs

monocistrocircnicos satildeo traduzidos os precursores de mRNA policistrocircnicos devem ser

processados ateacute mRNAs individuais Como caracteriacutestica desta famiacutelia os

transcritos de mRNA satildeo processados por mecanismos de trans-splicing (AGABIAN

1990) e poliadenilaccedilatildeo (LEBOWITZ et al 1993 MATTHEWS et al 1994

VANHAMME amp PAYS 1995)

No processo de trans-splicing as unidades codificadoras satildeo separadas e eacute

adicionada na extremidade 5rsquo uma sequecircncia extremamente conservada espeacutecie-

26

especiacutefica de 39 nucleotiacutedeos denominada sequumlecircncia liacuteder (SL) ou minieacutexon

(McCARTHY-BURKE et al 1989 NILSEN 1992 VANHAMME amp PAYS 1995)

Nesta reaccedilatildeo participam duas moleacuteculas de RNA uma doadora e outra aceptora A

doadora eacute um precursor do mini-exon e em T cruzi possui cerca de 110

nucleotiacutedeos (ZWIERZYNSKI amp BUCK 1991) A aceptora eacute o transcrito derivado da

unidade policistrocircnica ao qual o mini-exon eacute transferido O complexo enzimaacutetico

envolvido nesta reaccedilatildeo eacute semelhante ao descrito para a de cis-splicing (LAIRD

1989)

Os transcritos processados satildeo estabilizados pela estrutura cap 4 do mini-

exon (ULLU amp TSCHUDI 1991) e pela adiccedilatildeo de uma cauda poli-A agrave extremidade

3rsquo sendo que a adiccedilatildeo de ambos os elementos ocorrem em conjunto (LEBOWITZ et

al 1993) Regiotildees ricas em resiacuteduos de pirimidinas aleacutem da sequumlecircncia consenso

(AG) para o trans-splicing regulam a adiccedilatildeo do mini-exon e da cauda poli-A

Deleccedilotildees nestas regiotildees impedem o correto processamento destes transcritos

(MATTHEWS et al 1994)

A ocorrecircncia de transcriccedilatildeo policistrocircnica associada agrave ausecircncia de

promotores para RNA polimerase II e agrave presenccedila de niacuteveis distintos de mRNA

originados de uma mesma unidade policistrocircnica sugerem que a regulaccedilatildeo da

expressatildeo gecircnica nesses protozoaacuterios ocorra a niacutevel poacutes-transcricional baseada

principalmente em mecanismos que controlam a estabilidade e a traduccedilatildeo dos

mRNAs (CLAYTON 2002 BOUCHER et al 2002)

16 O cinetoplasto

O cinetoplasto eacute uma estrutura peculiar presente nos tripanosomatiacutedeos e

encontra-se inserida no interior da mitococircndria uacutenica abrigando fibrilas de DNA

conhecidas como kDNA O nome cinetoplasto (cineto=movimento e plasto=organela)

foi dado pois se acreditava que o mesmo fosse responsaacutevel pelo movimento do

flagelo

17 A rede de kDNA

O DNA do cinetoplasto eacute formado por dois tipos de moleacuteculas circulares os

miniciacuterculos de tamanho entre 05 e 25 kb e os maxiciacuterculos que apresentam

entre 20 e 40 kb Cerca de 10000 miniciacuterculos e 50 maxiciacuterculos se encontram

27

catenados formando uma extensa rede (SHAPIRO amp ENGLUND 1995 DE SOUZA amp

CAVALCANTI 2008) (FIGURA 4)

FIGURA 4 REDE DE kDNA

FONTE ROY CHOWDHURY et al 2010

As primeiras questotildees relacionadas ao arranjo das moleacuteculas na rede do

kDNA dos tripanosomatiacutedeos surgiram na deacutecada de 80 sugerindo que tal

organizaccedilatildeo poderia ter evoluiacutedo como um maneira mais eficaz de armazenar uma

grande quantidade de material em um pequeno espaccedilo (HAJDUK et al 1986)

Os maxiciacuterculos apresentam um tamanho de 22 a 37 kb e assim como o

DNA mitocondrial de outros eucariotos codificam RNAs ribossomais e diversas

proteiacutenas da cadeia respiratoacuteria incluindo subunidades da citocromo oxidase e

NADH desidrogenase (revisto por SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Os transcritos dos

maxiciacuterculos satildeo processados poacutes-transcricionalmente para formar mRNAs

funcionais atraveacutes de um processo conhecido como ediccedilatildeo ou editoraccedilatildeo do RNA

A editoraccedilatildeo do RNA consiste na inserccedilatildeo ou retirada de resiacuteduos de uridina em

28

siacutetios especiacuteficos dos RNAs transcritos pelos maxiciacuterculos a fim de criar coacutedons de

iniciaccedilatildeo ou terminaccedilatildeo mudanccedilas na fase de leitura ou quadros abertos de leitura a

partir de sequumlecircncias sem sentido O processo de ediccedilatildeo eacute especificado por

pequenos RNAs guias produzidos pelos miniciacuterculos e maxiciacuterculos e catalisado

por um complexo muiltiproteacuteico o editosomo (revisto por Esteacutevez amp Simpson 1999

Stuart et al 2005) Esse processo constitui uma forma de regular poacutes-

transcricionalmente a expressatildeo de genes mitocondriais nas diferentes formas

evolutivas do parasita

Os miniciacuterculos caracterizam-se por apresentar um tamanho de 05 a 25 kb

e por transcrever os RNAs guia (gRNA) responsaacuteveis pela especificidade da ediccedilatildeo

dos mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos por meio de uma sequumlecircncia presente na

porccedilatildeo central desses gRNAs (BENNE 1994 STUART et al 2005) A significacircncia

da variaccedilatildeo em tamanho e organizaccedilatildeo entre as espeacutecies ainda natildeo eacute aparente

contudo a diversidade das sequecircncias dos miniciacuterculos estaacute correlacionada com a

necessidade de mais ou menos ediccedilatildeo de mRNA de cada organismo (STUART

1991) Apesar desta diversidade os miniciacuterculos apresentam pelo menos duas

regiotildees conservadas o dodecacircmero GGGGTTGGTGTA conhecido como sequecircncia

universal dos miniciacuterculos (UMS) e o hexacircmero ACGCCC que correspondem agrave

origem de replicaccedilatildeo da fita L (light) e da fita H (heavy) respectivamente

(BIRKENMEYER amp RAY 1986 BIRKENMEYER et al 1987 RAY 1989 SHLOMAI

1994 HINES amp RAY 2008)

Embora o cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos seja formado por

moleacuteculas circulares relaxadas e catenadas diferentes arranjos da rede de kDNA

podem ser observados entre diferentes estaacutegios do ciclo de vida desses

protozoaacuterios como em T cruzi (FIGURA 5) assim como mudanccedilas na posiccedilatildeo do

kDNA satildeo utilizadas para identificar as diferentes formas evolutivas do parasita

(FIGURA 6)

29

FIGURA 5 ndash DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO DE T cruzi

LEGENDA As fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de bastatildeo nas formas amastigotas (A) e epimastigotas (B) enquanto nas formas tripomastigotas a rede de kDNA torna-se menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma arredondada (C) FONTE DE SOUZA amp SOUTO-PADRON 1980 e DE SOUZA 1984

Nas formas amastigota (FIGURA 5A) e epimastigota (FIGURA 5B) de T

cruzi as fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de

bastatildeo Em tripomastigotas (FIGURA 5C) de T cruzi a rede de kDNA torna-se

menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma

arredondada (DE SOUZA 1984) Os vaacuterios graus de compactaccedilatildeo do kDNA em

tripanosomatiacutedeos podem estar relacionados com a accedilatildeo de proteiacutenas que

condensam o DNA como seraacute visto mais adiante

FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA NOS TRYPANOSOMAS FONTE Modificado de DO CAMPO et al 2005

30

O cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos encontra-se localizado

proacuteximo ao corpo basal perpendicularmente ao eixo do flagelo Em alguns

tripanosomatiacutedeos que sofrem diferenciaccedilatildeo ao longo de seu ciclo de vida como o

T cruzi o cinetoplasto muda de posiccedilatildeo dentro da ceacutelula passando da regiatildeo

anterior (nos epimastigotas) para a regiatildeo posterior (nos tripomastigotas) poreacutem

permanecendo proacuteximo e perpendicular ao corpo basal (FIGURA 7) O cinetoplasto

eacute fisicamente conectado ao corpo basal atraveacutes de um grupo de filamentos

citoplasmaacuteticos chamado de complexo de ligaccedilatildeo tripartite (TAC) (OGBADOYI et al

2003) Este complexo eacute responsaacutevel pelo posicionamento espacial do cinetoplasto e

por sua segregaccedilatildeo

FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTE O CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO LEGENDA A morfologia eacute definida pelas posiccedilotildees do ponto onde emerge o flagelo e a bolsa flagelar (BF) (mostrada em laranja) nuacutecleo (mostrado em azul) e kDNA (mostrado em roxo) FONTE Modificado de FIELD amp CARRINGTON 2009

31

171 Replicaccedilatildeo do kDNA

Nos tripanosomatiacutedeos a replicaccedilatildeo do kDNA eacute restrita a fase S nuclear

(COSGROVE amp SKEEN 1970 WOODWARD amp GULL 1990) diferente do que

acontece na maioria dos eucariotos onde a replicaccedilatildeo do DNA mitocondrial ocorre

ao longo do ciclo celular (LIU et al 2005)

A replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos se inicia quando estes satildeo individualmente

decatenados da rede de kDNA pela accedilatildeo de DNA topoisomerases do tipo II pois

estes natildeo se replicam enquanto estatildeo ligados agrave rede e termina quando os

miniciacuterculos retornam para a rede com a ajuda da mesma enzima (SHAPIRO amp

ENGLUND 1995)

Os miniciacuterculos satildeo liberados da rede em direccedilatildeo a zona cinetoflagelar

(KFZ) uma regiatildeo especializada da matriz mitocondrial entre o kDNA e o corpo

basal (FIGURA 8) que abriga proteiacutenas envolvidas com o iniacutecio da replicaccedilatildeo Em

seguida os ciacuterculos migram (ou satildeo transportados) para os poacutelos opostos da rede

de kDNA para completar sua replicaccedilatildeo O iniacutecio da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos na

regiatildeo cinetoflagelar envolve a montagem de um complexo proteacuteico na origem de

replicaccedilatildeo dos ciacuterculos com a participaccedilatildeo da primase polimerase e proteiacutenas que

se ligam agrave sequumlecircncia universal de miniciacuterculos (UMSBP) Estas juntamente com

outras proteiacutenas geram uma forquilha de replicaccedilatildeo que se propaga

unidirecionalmente ao redor do miniciacuterculo formando uma estrutura tipo

intermediaacuteria (LIU et al 2005 GLUENZ et al 2007)

Os miniciacuterculos receacutem-replicados migram da zona KFZ para dois complexos

proteacuteicos situados nos poacutelos diametralmente opostos do cinetoplasto onde os

proacuteximos passos de replicaccedilatildeo iratildeo ocorrer Estes passos incluem remoccedilatildeo dos

primers pela accedilatildeo de endonucleases preenchimento de alguns intervalos entre os

fragmentos de Okazaki pela DNA polimerase e uniatildeo dos cortes (nicks) por uma

DNA ligase Apoacutes estas etapas os novos ciacuterculos sintetizados que ainda possuem

pelo menos uma interrupccedilatildeo em sua sequumlecircncia satildeo reunidos agrave periferia da rede

pela accedilatildeo de topoisomerases II Apoacutes todos miniciacuterculos terem sido replicados os

intervalos satildeo reparados (Revisto por LIU et al 2005 POVELONES 2014)

Pouco se sabe sobre o processo de replicaccedilatildeo dos maxiciacuterculos Assim

como os miniciacuterculos os maxiciacuterculos tambeacutem sofrem replicaccedilatildeo unidirecional que

32

se inicia em uma origem contida na regiatildeo variaacutevel da moleacutecula formando estruturas

tipo- Entretanto ao contraacuterio dos miniciacuterculos eles permanecem ligados agrave rede de

kDNA durante o processo replicativo (revisto por KLINGBEIL et al 2001 Liu et al

2005)

FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA FONTE Modificado de LIU et al 2005

18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)

Proteiacutenas que se ligam ao DNA tambeacutem foram identificadas na mitococircndria

de uma variedade de organismos eucarioacuteticos variando de levedura ateacute humanos

(MAIER et al 2001) Estas proteiacutenas satildeo codificadas no nuacutecleo da ceacutelula e satildeo poacutes-

traducionalmente importadas para a mitococircndria

Conceitualmente qualquer proteiacutena que se associe ao kDNA quer atuando

na replicaccedilatildeo e transcriccedilatildeo quer atuando na organizaccedilatildeo compactaccedilatildeo e

segregaccedilatildeo da rede pode ser chamada de KAP (KAP do inglecircs Kinetoplast-

33

Associated Protein) Observou-se que algumas dessas KAPs apresentam

caracteriacutesticas de proteiacutenas histonas H1 (H1 histone-like proteins) por serem

proteiacutenas pequenas (17 a 25 kDa) fortemente baacutesicas (pI de 11 a 125) interagindo

com a carga negativa das moleacuteculas de DNA e com grande conteuacutedo dos

aminoaacutecidos lisina e arginina elevado (aprox 30 a 50)

Proteiacutenas associadas com genoma mitochondrial (KAPs) dos

tripanosomatiacutedeos e que compartilham caracteriacutesticas com histonas H1 foram

inicialmente identificadas no cinetoplasto do tripanosomatiacutedeo de inseto Crithidia

fasciculata e denominadas de KAP1 a 5 As H1-KAPs de C fasciculata interagem

com miniciacuterculos (XU et al 1996) e desse modo podem facilitar a associaccedilatildeo

orientaccedilatildeo e organizaccedilatildeo dessas moleacuteculas na rede pela neutralizaccedilatildeo das cargas

negativas das moleacuteculas de DNA contribuindo para a condensaccedilatildeo organizaccedilatildeo e

segregaccedilatildeo da rede de kDNA Ateacute o momento foram caracterizadas quatro H1-KAPs

de C fasciculata (CfKAP1 2 3 and 4) Aleacutem das caracteriacutesticas de histona H1

possuem uma preacute-sequecircncia clivaacutevel de nove aminoaacutecidos em sua porccedilatildeo N-

terminal e que provavelmente estaacute envolvida no transporte da proteiacutena para o

cinetoplasto jaacute que natildeo aparece na proteiacutena madura (XU amp RAY 1993 XU et al

1996 HINES amp RAY 1998) Atraveacutes de ensaios de imunofluorescecircncia foi possiacutevel

confirmar que estas proteiacutenas estatildeo presentes em toda a rede de kDNA Pela

facilidade encontrada nas KAPs purificadas de condensar redes de kDNA in vitro

(XU et al 1996) sugere-se que estas estejam envolvidas na organizaccedilatildeo e

condensaccedilatildeo do kDNA in vivo (LUKES et al 2001)

As teacutecnicas de deleccedilatildeo de genes satildeo uma oacutetima ferramenta para elucidar as

possiacuteveis funccedilotildees que um gene pode apresentar Em C fasciculata foi utilizada a

teacutecnica de nocaute gecircnico para o gene Cfkap1 onde mutantes viaacuteveis foram

obtidos mostrando que a forma e a dimensatildeo do cinetoplasto natildeo foram alterados

ao contraacuterio da organizaccedilatildeo da rede de kDNA que passou a apresentar fibrilas de

DNA espessas e uma camada eleacutetron-densa no centro do disco Quando foi

realizada a reintroduccedilatildeo do gene na forma episomal o fenoacutetipo normal da rede de

kDNA foi restaurado (LUKES et al 2001) Tambeacutem foi realizado o duplo nocaute

dos genes Cfkap2 e Cfkap3 o qual da mesma maneira produziu mutantes viaacuteveis

poreacutem com o crescimento bastante reduzido uma reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo e um

aumento nos niacuteveis de mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos Apesar de todas

estas alteraccedilotildees o kDNA permaneceu inalterado mostrando que as proteiacutenas

34

CfKAP2 e CfKAP3 desempenham um papel diferente ao da CfKAP1 pois estatildeo

envolvidas com o metabolismo mitocondrial e proliferaccedilatildeo celular ao inveacutes de

estarem envolvidas na organizaccedilatildeo estrutural do kDNA (AVLIYAKULOV et al

2004)

Com base nesses estudos surgiu o interesse de nosso grupo no estudo de

KAPs em T cruzi visando verificar qual o papel dessas proteiacutenas na organizaccedilatildeo da

rede de kDNA e sua importacircncia nos diferentes estaacutegios do ciclo de vida do parasita

Atraveacutes de anaacutelises bioinformaacuteticas foram identificadas 6 diferentes H1-KAPs

codificadas no genoma do T cruzi levando em consideraccedilatildeo a similaridade com

KAPs de C fasciculata (CAVALCANTI et al 2009) Essas H1-KAPs foram

denominadas de KAP3 KAP4a KAP4b KAP4c KAP6 e KAP7 Nosso grupo iniciou

a caracterizaccedilatildeo das proteiacutenas TcKAP4 e TcKAP6 mostrando que elas se localizam

no cinetoplasto mas com padrotildees distintos de distribuiccedilatildeo dependendo da forma do

ciclo de vida do parasita (CAVALCANTI et al 2009) Mais recentemente mostramos

que o nocaute da TcKAP3 natildeo afeta a proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do

parasita (DE SOUZA et al 2010)

A complexidade da rede de kDNA sugere portanto que as diferentes KAPs

atuem em conjunto algumas vezes de modo redundante para desempenhar

funccedilotildees na condensaccedilatildeo replicaccedilatildeo segregaccedilatildeo dessa estrutura

35

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL

O objetivo principal deste trabalho eacute caracterizar a funccedilatildeo da TcKAP7 avaliando seu

papel na biologia do parasita

211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

a) Analisar a localizaccedilatildeo subcelular da TcKAP7 atraveacutes de ensaios de

imunofluorescecircncia

b) Produzir TcKAP7 recombinante em larga escala para ensaios de biologia

estrutural

c) Estudar a viabilidade do parasita na ausecircncia do gene TcKAP7 para os parasitas

viaacuteveis analisar morfologia e ultraestrutura do cinetoplasto multiplicaccedilatildeo

diferenciaccedilatildeo e infectividade

36

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados

311 Reagentes

AmershamBioscience dNTPs Hybond C Hybond N kit ECL de western blotting

filmes de raio-X Hyperfilmreg anticorpo monoclonal anti-Histidina

Bio-Rad Acrilamida Agarose (UltraPure DNA grade) Azul de Bromofenol Bis-

Acrilamida Persulfato de Amocircnia

Cult-lab RPMI 1640

Difco Baacutecto-Aacutegar Bactotriptona Extrato de levedura Infuso de fiacutegado Triptose

Invitrogen Inc EDTA Fenol TRIS Nick Translation kit Taq DNA polymerase

IPTG Agarose X-Gal DNA de λHindIII Marcador de massa molecular Benchmark

Alexa Fluacuteor 458 1 kb Plus DNA Ladder Soro Fetal Bovino T4 DNA ligase

Merck Acetato de Soacutedio Aacutecido Aceacutetico Glacial Cloreto de CaacutelcioCloreto de

Potaacutessio Cloreto de Soacutedio Etanol Absoluto Glicina Glicose Hidroacutexido de soacutedio

Isopropanol HCl Na2HPO4

New England Biolabs Endonucleases de restriccedilatildeo

Qiagen Qiaquick PCR Purification kit

Serva Electrophoresis Alu-Gel S

Sigma Acetato de amocircnia Ampicilina Brometo de Etiacutedeo BSA Kanamicina

Glicerol Hepes Cloreto de Magneacutesio Tetraciclina β-mercaptoetanol DEAE-

celulose Tween 20 adjuvante completo de Freund monoclonal M2 anti-FLAG

312 Tampotildees e Soluccedilotildees

PBS NaCl 137 mM KCl 27 mM Na2HPO4 43 mM e KH2PO4 15 mM

PSG Na2HPO4 (anidro) 4747 mM NaH2PO4 H2O 25 mM NaCl 3676 mM e

glicose 555 mM

Soluccedilatildeo de tripsinazaccedilatildeo tripsina 005 (mv) e EDTA 002 (mv) em PBS pH

80

37

Soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia PBS e BSA 1 (albumina seacuterica

bovina)

Soluccedilatildeo de bloqueio para western blot TBST e leite em poacute desnatado 5

Soluccedilatildeo de lise para Toothpick NaOH 50 mM Glicerol 5 SDS 05 EDTA 5

mM e azul de bromofenol 0025

Soluccedilatildeo Ponceau S Ponceau S 05 em aacutecido aceacutetico 1

Soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo para geacuteis de proteiacutena Coomassie blue R-250 01 em

metanolaacutecido aceacutetico (4510)

Soluccedilatildeo para descoloraccedilatildeo de geacuteis de proteiacutena Metanol 4 aacutecido aceacutetico 75

Tampatildeo de lise hipotocircnico Tris-HCl 10mM pH 75 NaCl 10mM MgCl2 5 mM β-

mercaptoetanol 5 mM

Tampatildeo A para cromatografia de afinidade Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM

Tampatildeo B para cromatografia de afinidade Tampatildeo A contendo imidazol 1M

Tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica Tris-HCl 50 mM pH 80 NaCl 1M

Soluccedilatildeo de depurinaccedilatildeo para Southern blot HCl 025 M

Soluccedilatildeo desnaturante para Southern blot NaOH 05 M e NaCl 15 M

Soluccedilatildeo neutralizante para Southern blot Tris-HCl 05 M pH 75 e NaCl 15 M

Soluccedilatildeo Denhardt (50X) ficoll 05 polivinilpirrolidona 06 e albumina de soro

bovino 02

Soluccedilatildeo de hibridaccedilatildeo para Southern blot DNA de esperma de salmatildeo do tipo III

01 mgml fragmentado por ultra-som e desnaturado SSC 6X soluccedilatildeo de denhardt

6X e SDS 1

SSC 20X NaCl 3 M pH 70 e citrato de soacutedio 03 M

Soluccedilatildeo de baixa estringecircncia SSC 2X e SDS 01

Soluccedilatildeo de meacutedia estringecircncia SSC 1X e SDS 01

Soluccedilatildeo de alta estringecircncia SSC 01X e SDS 01

Tampatildeo de eletroporaccedilatildeo para T cruzi NaCl 140 mM HEPES (aacutecido) 25 mM e

Na2HPO4 074 mM pH 75

Tampatildeo ZPFM de eletroporaccedilatildeo de T brucei NaCl 129 mM KH2PO4 15mM KCl

8mM NaH2PO4 8mM MgCl2 15mM CaCl2 90 mM e CH3COONa 24 mM pH 70

Tampatildeo TELT Tris-HCl 50 mM pH 80 EDTA 625 mM pH 90 LiCl 25 M e Triton

X-100 4

Tampatildeo de amostra para DNA 10X Ficoll 400 25 azul de bromofenol 025 e

xileno cianol FF 025

38

Tampatildeo de amostra para proteiacutena 4X Tris-HCl 40 mM pH 68 SDS 1 β-

mercaptoetanol 25 glicerol 6 e azul de bromofenol 0005

Tampatildeo de eletroforese para SDS-PAGE 1X Tris-base 25 mM glicina 192 mM e

SDS 01

Tampatildeo de lise de bacteacuterias Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM PMSF1 mM

Tampatildeo para transferecircncia (western blotting) 1X Tris-base 25 mM glicina 192

mM e metanol 20

Tampatildeo TBE Tris base 89 mM aacutecido boacuterico 89 mM e EDTA 2 mM

TBS Tris-HCl 20 mM pH 80 e NaCl 150 mM

TBST TBS e Tween 20 01

TE Tris-HCl 10 mM pH 80 e EDTA 1 mM

313 Meios de cultura

LB Triptona 1 extrato de levedura 5 e NaCl 1

Meio LIT (liver infusion tryptose) infuso de fiacutegado 05 NaCl 753 mM KCl 54

mM glicose 10 mM bacto-triptose 05 Na2HPO4 564 mM hemina 00025 soro

fetal bovino 10 e extrato de levedura 15 gl

Meio TAU NaCl 190 mM KCl 17 mM MgCl2 2 mM CaCl2 2 mM e tampatildeo fosfato 8

mM pH 60

Meio TAU3AAG meio TAU suplementado com L-prolina 10 mM glutamato soacutedico

50 mM aspartato soacutedico 2 mM e glicose 10 mM

32 Cultivo do Trypanosoma cruzi

Neste trabalho foi utilizado o clone Dm28c de T cruzi (CONTRERAS et al

1985 CONTRERAS et al 1988) nas formas epimastigota e tripomastigota

metaciacuteclico

321 Epimastigotas

Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT (CAMARGO

1964) a 28 oC com passagens a cada trecircs dias e inoacuteculo de 1 x 106 ceacutelulasml As

formas epimastigotas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo no terceiro dia de cultivo

39

(correspondente a fase logariacutetmica de crescimento baseada em curva de

crescimento realizada nas mesmas condiccedilotildees) quando a densidade celular

apresentava-se entre de 1 - 3 x 107 ceacutelulasml

322 Tripomastigotas metaciacuteclicos

As formas metaciacuteclicas foram obtidas atraveacutes do processo de diferenciaccedilatildeo

in vitro (BONALDO et al 1988) Formas epimastigotas em final de fase logariacutetmica

de crescimento (densidade celular entre 5 - 7 x 107 ceacutelulasml) foram coletadas por

centrifugaccedilatildeo a 7000 x g por 5 minutos a 10 oC e ressuspendidas em meio TAU

na concentraccedilatildeo de 5 x 108 ceacutelulasml e mantidas a 28 oC por 2 horas Apoacutes este

periacuteodo correspondente ao estresse nutricional as ceacutelulas foram transferidas para

garrafas de 300 cm2 contendo 200 ml de meio TAU3AAG (concentraccedilatildeo final de 5 x

106 ceacutelulasml) Uma proporccedilatildeo dos parasitas que se aderiram agrave superfiacutecie da

garrafa de cultivo se diferenciou em metaciacuteclicos os quais foram liberados no

sobrenadante (BONALDO et al 1988) Estas formas foram purificadas pela

passagem atraveacutes de uma coluna de afinidade contendo a resina DEAE celulose

equilibrada em PSG (SOUSA 1983) Este procedimento foi realizado com o tipo

selvagem para obtenccedilatildeo de extrato proteacuteico e tambeacutem com o mutante de T cruzi

para TcKAP7 para verificaccedilatildeo da capacidade de diferenciaccedilatildeo e infectividade onde

o nuacutemero de metaciacuteclicos no sobrenadante foi contado apoacutes 24 48 72 e 96 horas

da incubaccedilatildeo em meio TAU3AAG

33 Curva de crescimento de T cruzi

Formas epimastigotas de T cruzi clone Dm28c e do mutante de T cruzi para

TcKAP7 foram cultivadas como descrito no item 321 ateacute atingirem a fase

estacionaacuteria para a comparaccedilatildeo da taxa de crescimento de ambas Foram

inoculadas 1 x 106 epimastigotas por ml de meio LIT em garrafas de 25 cm2 e

incubadas em seguida a 28 degC Diariamente foi realizada a contagem das culturas

em cacircmaras de Neubauer em diluiccedilotildees apropriadas ateacute o deacutecimo dia O graacutefico da

curva de crescimento comparativa entre a cultura selvagem e a nocaute foi feito

utilizando o programa Microsoft Excel

40

34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada conforme descrito por Medina-Acosta amp

Cross (1993) Epimastigotas (1 x 107 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a

7000 x g por 5 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 350 microl de tampatildeo TELT

Apoacutes 5 min de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente foi adicionado agrave amostra 1

volume de fenolclorofoacutermio e o material foi centrifugado a 13000 x g por 5 min A

fase aquosa foi recolhida e o DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol absoluto

e coletado por centrifugaccedilatildeo a 13000 x g por 10 min O DNA presente no sedimento

foi lavado com etanol 70 seco e em seguida ressuspendido em tampatildeo TE

contendo RNAse a 20 microgml

35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi

A extraccedilatildeo do kDNA de T cruzi foi realizada de acordo com Morel e

colaboradores (1980) com modificaccedilotildees

Formas epimastigotas (1 x109 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a

4000 x g por 10 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 20 ml de Tampatildeo de

Lise Hipotocircnico Posteriormente adicionou-se Sacarose 025 M e o material foi

centrifugado 6000 x g por 10 min O pellet foi ressuspendido em 20 ml de Tris-HCl

10 mM pH 75 NaCl 10 Mm EDTA 5 mM SDS 05 A esta soluccedilatildeo foi adicionado

100 ug de proteinase K e a mesma permaneceu a 37 ordmC durante a noite No dia

seguinte as ceacutelulas foram transferidas para uma seringa de 50 ml aonde ocorreu a

quebra mecacircnica do DNA nuclear Este material foi ultracentrifugado a 27000 rpm a

4ordm C durante 1 hora utilizando o rotor SW28 Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi

desprezado e o pellet ressuspendido em 25 ml de TE e novamente ultracentrifugado

nas mesmas condiccedilotildees Apoacutes centrifugaccedilatildeo o pellet foi ressuspendido em 1ml de TE

e foi realizada a purificaccedilatildeo por fenolclorofoacutermio Apoacutes purificaccedilatildeo o material foi

ressuspendido em 300 ul de TE e utilizado para ensaios de SAXS

36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi

41

As ceacutelulas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 x g 5 min a 10 degC) e

lavadas duas vezes em PBS pH 75 Apoacutes as lavagens os parasitas foram

ressuspendidos em PBS e tampatildeo de amostra 4x foi adicionado de tal maneira que

a concentraccedilatildeo final fosse de 1 x 106 ceacutelulas equivalentesmicrol Os extratos foram

fervidos por 5 min e armazenados a - 70 degC

37 Clonagem do gene TcKAP7

A sequecircncia do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi obtida a

partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da internet

wwwgenedborg e a sua regiatildeo codificante foi amplificada por PCR com os primers

KAP7F (5rsquo ndash AAAGGATCCATGCTAAGAACTGTTCTGCCACTG 3rsquo) e KAP7R (5rsquo ndash

TCAGCGTCGACTTATGACGGTGGTGCAGGATCAGCAGCTGCAGTATTTT3rsquo) a

partir do DNA genocircmico de T cruzi Dm28c As sequecircncias de reconhecimento das

enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI (marcadas em negrito) foram adicionadas na

extremidade 5rsquo dos primers KAP7F e KAP7R respectivamente As condiccedilotildees da

reaccedilatildeo de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA total T cruzi 10 pmol de cada

primer 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25

U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no

termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a desnaturaccedilatildeo do

material por 4 min a 94 degC seguida de 30 ciclos constando de desnaturaccedilatildeo a 94 degC

por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O

material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e

digerido com as enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI com uso de 20 U de cada

enzima e seus respectivos tampotildees em volume final de 20 μl por 4 h a 37 oC O

material foi novamente purificado e utilizado para ligaccedilatildeo com o vetor pET28a

previamente digerido com as respectivas enzimas Bacteacuterias E coli cepa DH5α

foram transformadas com a ligaccedilatildeo A seleccedilatildeo dos clones contendo plasmiacutedeo com

o inserto desejado foi realizada atraveacutes da teacutecnica de palitagem ou de PCR de

colocircnia

38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR

42

Com o intuito de verificar a posiccedilatildeo do mini-exon no transcrito de TcKAP7

realizamos o ensaio de RT-PCR para a obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7

O protocolo utilizado foi baseado no manual teacutecnico da Promega (ΙmProm-ΙΙ

Reverse Transcription System) assim como os reagentes utilizados para essa

reaccedilatildeo Aproximadamente 10 μg de RNA foram incubados com o oligonucleotiacutedeo

KAP7R por 10 min a 70 degC e imediatamente transferidos para o gelo Agrave mistura foi

adicionada uma soluccedilatildeo de dNTPs (concentraccedilatildeo final de 05 mM para cada dNTP)

MgCl2 (120 μM) RNAse OUT (2 unidades) (Invitrogen) Transcriptase reversa

ImProm-II e respectivo tampatildeo A reaccedilatildeo foi incubada por 2 h a 42 degC As amostras

de cDNA foram purificadas por Microcon YM-30 (Millipore) conforme descriccedilatildeo do

fabricante e armazenadas a -20 degC Posteriormente foi realizada uma reaccedilatildeo de

PCR utilizando as seguintes condiccedilotildees 10 ng do cDNA de TcKAP7 de T cruzi 10

pmol do primer ME (5rsquo-AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG -3rsquo) e 10

pmol do primer KAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA

polimerase 1x 25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi

processada no termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a

desnaturaccedilatildeo do material por 3 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando de

desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 55 degC por 30 s e extensatildeo

a 72 degC por 1 min O material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR

Purification (Qiagen) e clonado diretamente no vetor pGEMreg-T Easy (Promega)

Bacteacuterias E coli cepa TOP10Frsquo foram transformadas com a ligaccedilatildeo e os plasmiacutedeos

recombinantes foram selecionados pela teacutecnica da palitagem ou de PCR de colocircnia

(itens 391 e 392) Apoacutes a minipreparaccedilatildeo (item 310) o material foi submetido ao

sequenciamento de DNA usando o serviccedilo de sequenciamento da empresa

Macrogen (Coreacuteia do Sul)

39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes

391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)

As colocircnias foram coletadas com o auxiacutelio de palitos de dente (toothpick)

esteacutereis e transferidas para o fundo de tubos de micro-centriacutefuga e para a superfiacutecie

do meio LB solidificado (com o antibioacutetico de seleccedilatildeo do plasmiacutedeo) para a obtenccedilatildeo

de uma reacuteplica das colocircnias que foram analisadas (placa-matildee) A cada um dos

43

tubos foram acrescentados 15 μl do tampatildeo de lise Os tubos foram incubados em

banho-maria a 65 degC por 10 min As amostras entatildeo foram analisadas por

eletroforese em gel de agarose 1 usando o plasmiacutedeo sem inserto como controle

Posteriormente o gel foi corado com brometo de etiacutedeo (05 μgml) por

aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob luz ultravioleta para em

seguida ser fotografado no sistema de fotodocumentaccedilatildeo L-Pix (Locus

Biotecnologia Brasil)

392 Teacutecnica de PCR de colocircnia

Depois de selecionadas as colocircnias foram transferidas para tubos de PCR

contendo os reagentes da PCR e os primers que hibridizam com regiotildees que

flanqueiam o fragmento de DNA clonado em um volume total de 10 microl As amostras

foram incubadas a 94 degC por 3 min e submetidas a 35 ciclos de PCR com as

seguintes etapas 94 degC por 30 s 55 degC por 30 s e 72 degC por 1 min finalizando com

uma etapa de extensatildeo a 72 degC por 10 min Os produtos amplificados foram

analisados em gel de agarose 1 Posteriormente o gel foi corado com brometo de

etiacutedeo (05 microgml) por aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob

luz ultravioleta O gel foi fotografado no sistema de foto-documentaccedilatildeo L-Pix (Locus


310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)

Os clones recombinantes foram cultivados em 3 ml de meio LB contendo o

antibioacutetico apropriado durante 18 h As culturas foram entatildeo centrifugadas a 12000

x g por 1min a temperatura ambiente e os plasmiacutedeos recombinantes purificados

com o sistema de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeo (Miniprep Qiagen Kit) (QIAGEN) de

acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante

311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli

Para expressar a proteiacutena recombinante TcKAP7 E coli cepa

BL21(DE3)STAR transformada com o plasmiacutedeo pET28a contendo o gene TcKPA7

(pET28a-TcKAP7) foi cultivada em meio LB contendo 25 μgml do antibioacutetico

44

kanamicina a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo (preacute-inoacuteculo) Apoacutes 18 horas de crescimento uma

diluiccedilatildeo (110) foi realizada em novos tubos contendo meio LB-kanamicina e a

cultura foi incubada por 1 h a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo constante Apoacutes este periacuteodo 05

mM IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosideo) foi adicionado agraves culturas A

incubaccedilatildeo prosseguiu por mais 3 h nas mesmas condiccedilotildees Como controle negativo

as ceacutelulas tambeacutem foram cultivadas nas mesmas condiccedilotildees poreacutem sem a adiccedilatildeo de

IPTG (cultura natildeo induzida) Aliacutequotas das culturas induzidas e natildeo induzidas com

IPTG foram processadas para anaacutelise em SDS-PAGE

312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP7

3121 Processamento da amostra

As bacteacuterias apoacutes a expressatildeo de TcKAP7 foram sedimentadas por

centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em tampatildeo de lise e lisadas utilizando o

microfluidificador modelo M-110L (Microfluidics EUA) Este meacutetodo divide a amostra

em dois fluxos e os conduz sob alta pressatildeo gerada por uma vaacutelvula pneumaacutetica

para uma cacircmara de interaccedilatildeo tambeacutem chamada de aacuterea de choque Esta cacircmara

eacute formada por um sistema de micro-canais dentro de um bloco de ceracircmica Dentro

da cacircmara ocorre cavitaccedilatildeo sonicaccedilatildeo e impacto dos dois fluxos em que a amostra

foi dividida levando a lise das ceacutelulas bacterianas (FIGURA 9) Este processo

provoca o aumento da temperatura e todo o sistema de tubos que conduz a amostra

necessita ser refrigerado com gelo e aacutegua a 4degC para prevenir a precipitaccedilatildeo de

proteiacutenas soluacuteveis

45

FIGURA 9 - REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO MICROFLUIDIFICADOR LEGENDA A suspensatildeo de bacteacuterias eacute dividida em dois fluxos que se chocam sob alta pressatildeo dentro de micro-canais presentes na cacircmara de interaccedilatildeo da vaacutelvula homogeneizadora Melhores resultados satildeo obtidos aumentando o nuacutemero de ciclos de passagens Seta preenchida direccedilatildeo da amostra Seta pontilhada repetindo o ciclo de passagem FONTE Modificado de MAA amp HSU 1999

Apoacutes a lise o extrato soluacutevel foi obtido apoacutes centrifugaccedilatildeo a 30000 x g por

30 min a 4 degC

3122 Cromatografia de afinidade

Por ser expressa fusionada a uma cauda de seis histidinas a proteiacutena

TcKAP7 pode ser separada dos extratos celulares a partir da utilizaccedilatildeo de resina de

niacutequel da qual posteriormente a proteiacutena seraacute eluiacuteda

A purificaccedilatildeo da proteiacutena TcKPA7 presente no sobrenadante foi realizada

em sistema FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography ndash GE Healthcare) com

coluna HiTrap Chelating de 1 mL (GE Healthcare) A coluna foi carregada com

soluccedilatildeo NiSO4 100 mM e equilibrada com tampatildeo A para cromatografia de afinidade

Durante a purificaccedilatildeo foi utilizado um gradiente de 0-100 de tampatildeo B para

cromatografia de afinidade As fraccedilotildees provenientes da cromatografia foram

analisadas atraveacutes de SDS-PAGE

Suspensatildeo de bacteacuterias

Ceacutelulas lisadasBomba de

alta pressatildeo

Micro-canais

Vaacutelvula homogeneizadora

46

3123 Cromatografia de troca iocircnica

Para eliminar contaminantes remanescentes da cromatografia de afinidade

a amostra contendo a proteiacutena de interesse foi submetida a uma segunda etapa

cromatograacutefica cromatografia de troca iocircnica utilizando-se a coluna HiTraptrade SP (GE

Healthcare) no sistema de FPLC (GE Healthcare)

Primeiramente a amostra foi diluiacuteda para reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo salina e

a coluna foi lavada com 2 volumes de tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica e

depois com 2 volumes de tampatildeo A utilizado na cromatografia de afinidade O

gradiente de passagem do tampatildeo B foi de 0 a 100 e a proteiacutena TcKAP7 foi

obtida na fraccedilatildeo de material natildeo ligado agrave resina (Flow-through) (FT)

3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo

Amostras da cromatografia de troca iocircnica que continham a proteiacutena de

interesse foram concentradas atraveacutes de filtraccedilatildeo A soluccedilatildeo foi colocada em filtro

Amicon Ultra MWCO 10000 (Milipore) e centrifugada a 4000 rpm a 4 ordmC O

experimento foi realizado em sistema FPLC (GE Healthcare) com a coluna

Superdex 200 HR 1030 (GE Healthcare) em tampatildeo HEPES 20 mM pH 74 e de

cloreto de soacutedio100 mM

313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS

O experimento foi realizado em equipamento DynaPro Molecular instrument

a 4 ordmC As amostras foram previamente centrifugadas por 5 minutos a 15000 rpm a

4 ordmC A coleta de dados foi realizada com intervalos de 2 segundos com 100

aquisiccedilotildees Para cada leitura utilizou-se 5 microl de amostra proteica

314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)

O espectro de CD foi coletado usando espectropolariacutemetro Jasco J-715

(Jasco Corporation Toacutekio Japatildeo) sendo a temperatura mantida a 20 degC atraveacutes de

um Peltie rType Control System PFD425S (JASCO) Todos os dados foram

coletados usando cubeta de quartzo de 1 mm de caminho oacuteptico

47

Mediu-se a elipticidade em graus na regiatildeo do UV distante no intervalo de

comprimento de onda de 260 nm a 200 nm com uma velocidade de 100 nmmin

sendo feitas no total 30 leituras com resposta de 1 segundo em varredura contiacutenua

Os valores obtidos em miligraus foram convertidos para elipticidade molar

por resiacuteduo ([θ]MRW) em miligrauscm2dmol-1 que eacute definida pela equaccedilatildeo (Adler et

al 1973)

Onde θobs eacute a elipsidade observada em graus MRW eacute o peso molecular

meacutedio dos resiacuteduos da proteiacutena d eacute o caminho oacuteptico da cubeta em centiacutemetros e c

eacute a concentraccedilatildeo da proteiacutena em mgmL O MRW eacute calculado dividindo-se o peso

molecular da proteiacutena pelo nuacutemero de resiacuteduos

315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo

As amostras obtidas a partir da purificaccedilatildeo tiveram a concentraccedilatildeo calculada

utillizando a absorbacircncia mensurada pelo aparelho NanoDrop (Thermo Fisher

Scientific) levando-se em consideraccedilatildeo o coeficiente de extinccedilatildeo e teoacuterico da

proteiacutena obtido a partir do ProtParam (httpusexpasyorgtoolsprotparamhtml) e o

peso molecular da proteiacutena que eacute de cerca de 28 kDa

Obtidas as concentraccedilotildees a amostra foi concentrada pelo meacutetodo de

filtraccedilatildeo utilizando o filtro Amiconreg Ultra Centrifugal Filter (Millipore) com poro de

10000 Da A amostra foi centrifugada ateacute a obtenccedilatildeo de uma concentraccedilatildeo final de

5 mgml para os ensaios de cristalizaccedilatildeo Uma aliacutequota da proteiacutena concentrada foi

utilizada para anaacutelise por SDS-PAGE

316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo

Os ensaios de cristalizaccedilatildeo foram realizados empregando-se a teacutecnica de

difusatildeo de vapor em gota sentada utilizando-se os equipamentos disponiacuteveis no

Laboratoacuterio Robotizado de Cristalizaccedilatildeo de Proteiacutenas LNBio Os ensaios foram

feitos em placas de 96 poccedilos e as gotas preparadas pelo robocirc Honeybee

utilizando-se os kits disponiacuteveis no laboratoacuterio Crystal Screen HT (Hampton

Research) JCSG+ Suite (Molecular Dimensions) PACT Suite (Molecular

cd

MRWobs

10][

48

Dimensions) Precipitant Synergy (Rigaku Reagents) SaltRx HT (Hampton

Research) Wizard IampII (Rigaku Reagents)

317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)

Atraveacutes da teacutecnica de SAXS informaccedilotildees sobre a massa molecular das

partiacuteculas espalhadoras e do raio de giro (Rg) da proteiacutena de estudo satildeo obtidos a

partir dos dados coletados Por meio de programas computacionais como DAMMIN

(SVERGUN1999) e GASBOR (SVERGUN et al 2001) um modelo de baixa

resoluccedilatildeo da forma da proteiacutena pode ser obtido

Os dados de SAXS foram obtidos na linha de luz D02A ndash SAXS2 no

Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron (LNLS) Campinas-SP Brasil usando

comprimento de onda de 148 A e um detector bidimensional com arranjo CCD

(MARCCD USA) de 165 mm A distacircncia do detector para a amostra foi de 106804

mm e os dados na faixa de 002 nm-1 para 021 nm-1 foram coletados usando

proteiacutena pura nas concentraccedilotildees de 5 mgml em tampatildeo em 20 mM HEPES pH 74

e 100 mM de cloreto de soacutedioExposiccedilotildees de 300 e 600 s foram realizadas e os

dados do tampatildeo foram coletados antes e depois dos dados da amostra para fazer a

correccedilatildeo do solvente e normalizaccedilatildeo do espalhamento

Ajuste dos dados experimentais e avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo p(R) foram realizados

utilizando o programa GNOM (SVERGUN 1992) O envelope a baixa resoluccedilatildeo de

TcKAP7 foi determinado usando modelagem abnitio implementada no programa

DAMMIN O modelo a baixa resoluccedilatildeo e o modelo da estrutura tridimensional foram

superpostas usando o programa SUPCOMB (KOZIN amp SVERGUN 2001)

318 Modelagem de TcKAP7

Um modelo da estrutura tridimensional de TcKAP7 foi construiacutedo Para a

construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp BLUNDELL

1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a estruturas

tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um modelo

baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para a qual

se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura

tridimensional jaacute foi resolvida A qualidade do modelo pode ser avaliada por

49

exemplo atraveacutes de graacuteficos e tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de

cada aacutetomo constituinte do modelo

319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP7

A proteiacutena TcKPA7 recombinante purificada foi inoculada em camundongos

da linhagem BALBc por via intraperitonial com 4 aplicaccedilotildees de aproximadamente

20-50 μg de antiacutegeno em intervalos de 15 dias seguida de obtenccedilatildeo do soro apoacutes 1

semana da uacuteltima inoculaccedilatildeo O antiacutegeno foi emulsificado em adjuvante completo de

Freund na primeira inoculaccedilatildeo e com adjuvante a base de hidroacutexido de alumiacutenio

(Alu-Gel Serva) nas inoculaccedilotildees posteriores

320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo

western blot

Este procedimento foi executado segundo o meacutetodo de Towbin e

colaboradores (1979) Aliacutequotas de extratos de T cruzi equivalentes a 1 x 107

ceacutelulas foram submetidos agrave SDS-PAGE Apoacutes a separaccedilatildeo eletroforeacutetica as

proteiacutenas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond C Amersham

Biosciences) em tampatildeo de western por 2 h a 60 V ou 20 V por 16 h Apoacutes a

transferecircncia a membrana foi corada com Ponceau S e descorada suavemente com

aacutegua bidestilada para a identificaccedilatildeo das bandas do marcador de massa molecular

A membrana foi entatildeo incubada em soluccedilatildeo de bloqueio por 30 min sob agitaccedilatildeo

suave

Apoacutes o bloqueio a membrana foi incubada com os soros policlonais ou

anticorpos monoclonais em TBST-leite por aproximadamente 1 h a 37degC A

membrana foi lavada 5 vezes com TBST Em seguida a membrana foi incubada

com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado com a enzima

peroxidase (Pierce ndash Thermo Scientific) por 1h na diluiccedilatildeo de 16000 em TBST-leite

a temperatura ambiente A membrana foi submetida a mais cinco lavagens com

TBST e a reaccedilatildeo era evidenciada utilizando substrato quimioluminescente (West

Pico Pierce ndash ThermoScientific) sobre a membrana a qual era exposta a um filme

para raios-X (Hyperfilm ECL GE)

50

321 Superexpressatildeo de TcKAP7

3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para

superexpressatildeo da proteiacutena

O gene TcKAP7 foi clonado no vetor pNEO3xFLAG construiacutedo no nosso

laboratoacuterio a partir do vetor pTcGW-ProtCcarboxi (BATISTA et al 2010) que utiliza

o sistema Gateway de clonagem (Invitrogen) Os vetores foram construiacutedos

utilizando-se como base o pBluescript II (Stratagene San Diego USA) onde foram

inseridas trecircs sequencias que codificam para regiotildees intergecircnicas (IR) de T cruzi A

primeira TcUIR eacute a regiatildeo intergecircnica do locus de ubiquitinacalmodulina de T

cruzi (BATISTA et al 2010) As outras duas regiotildees intergecircnicas ITR1 e ITR2 foram

selecionadas a partir de genes de copia uacutenica no genoma e que possuem um niacutevel

de expressatildeo constitutivo nos estaacutegios epimastigota e tripomastigota metaciclicos

avaliados por dados de proteocircmica e RNAseq (Comunicaccedilatildeo pessoal Michel

Batista) Aleacutem disso esse vetor confere agrave regiatildeo C-terminal da proteiacutena

recombinante resultante da clonagem neste vetor trecircs etiquetas FLAG (sequecircncia

DYKDDDDK) em tandem (FIGURA 10)

FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI P3XFLAG

LEGENDA PR ndash PROMOTOR RIBOSOMAL TCUIR ITR1 E ITR2 - REGIOtildeES INTERGENICAS ATTR1 E ATTR2 ndash REGIOtildeES PARA RECOMBINACcedilAtildeO CMreg - RESISTEcircNCIA A CLORANFENICOL CCDB ndash GENE PARA SELECcedilAtildeO NEGATIVA DURANTE A CLONAGEM 3XFLAG ndash TREcircS ETIQUETAS DE FLAG (DYKDDDDK) NEOMICINA ndash GENE DE RESISTEcircNCIA A NEOMICINA

O gene TcKAP7 foi amplificado utilizando os primers especiacuteficos

KAP7GtwFor (5rsquo-

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCCGCGAAGTATTCAGCAGCCC)

e KAP7GtwRev (5rsquo-

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTGGTACATGGCGTACGGGTTG)

PR TcUIR Att R1 Cmreg ccdB Att R2 3x Flag ITR1 Neomicina ITR2

51

os quais possuem os siacutetios attB indicados em negrito As condiccedilotildees desta reaccedilatildeo

de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA genocircmico de T cruzi 10 pmol de cada

primer 200 μM de cada dNTP MgSO4 2 mM tampatildeo Taq DNA polimerase High

Fidelity 1x 1U de Platinum Taq DNA polimerase high fidelity (Invitrogen) A reaccedilatildeo

de PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA)

com a desnaturaccedilatildeo do material por 5 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando

de desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e

extensatildeo a 72 degC por 15 min

O gene amplificado foi clonado no vetor de entrada pDONRtrade221

(Invitrogen) A reaccedilatildeo foi feita com 150 ng dos produtos de PCR contendo os siacutetios

attB 150 ng do plasmiacutedeo pDONRtrade221 1 μL de BP ClonaseTM enzyme mix e TE

para um volume final de 10 μL e com incubaccedilatildeo a 25 degC por 16 h Foi entatildeo

adicionado 1 microL de proteinase K (2 mgmL) com incubaccedilatildeo por 10 min a 37 degC Os

clones em pDONRtrade221 foram transformados em ceacutelulas caacutelcio-competentes E coli

DH5α conforme protocolo de transformaccedilatildeo de ceacutelulas caacutelcio-competentes Apoacutes

transformaccedilatildeo a cultura foi semeada em placa de LBKan (kanamicina 25 microgmL) e

incubada a 37 degC durante 16 h

Para verificar a presenccedila de clones com os insertos de interesse foi feita a

teacutecnica da palitagem As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio

LBKan e incubadas por 16 h a 37 degC com agitaccedilatildeo (190 rpm) A purificaccedilatildeo dos

plasmiacutedeos foi realizada com o kit QIAprepreg Spin Miniprep (Qiagen) conforme

orientaccedilotildees do fabricante

Apoacutes esta etapa foi necessaacuterio transferir os insertos para o vetor de destino

pNEO3xFlag A troca de insertos entre os vetores de entrada e destino denominada

de reaccedilatildeo LR foi realizada conforme orientaccedilotildees do fabricante (Gateway LR clonase

enzyme mix) e ceacutelulas caacutelcio-competentes foram transformadas com os produtos

das recombinaccedilotildees conforme descrito anteriormente semeadas em placas de

LBAmp e incubadas a 37 degC durante 16 h

A verificaccedilatildeo de clones positivos foi realizada atraveacutes de PCR de colocircnias

As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio LB contendo ampicilina

(100 μgmL) e incubada a 37deg C por 16 h sob agitaccedilatildeo (200 rpm)O plasmiacutedeo

contendo o gene TcKAP7 foi denominado de pNEO_KAP7_3xFLAG

52

3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo

A transfecccedilatildeo das formas epimastigotas de T cruzi foi feita pela teacutecnica de

eletroporaccedilatildeo utilizando o equipamento genepulserreg apparatus (Bio-Rad) e cubetas

esteacutereis de eletroporaccedilatildeo gene pulsermicro pulserreg 02 cm (Bio-Rad) Formas

epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute uma densidade celular

de 3 x 107 ceacutelulasml Um volume de cultura correspondendo a 1 x 109 parasitas foi

centrifugado (4000 x g 4 degC) O sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram

ressuspendidas em tampatildeo de eletroporaccedilatildeo esteacuteril e submetidas a centrifugaccedilatildeo

nas condiccedilotildees acima O sedimento celular foi ressuspendido em 2 ml de tampatildeo de

eletroporaccedilatildeo Em cubetas de eletroporaccedilatildeo previamente resfriadas a 4 degC foram

misturados 400 μL (2 x 108 ceacutelulas) da suspensatildeo dos parasitas e 50 μL (20 microg) do

plasmiacutedeo para superexpressatildeo (pNEO_KAP7_3XFLAG) Em paralelo parasitas

foram submetidos agraves mesmas condiccedilotildees mas na ausecircncia de DNA (controle

negativo da transfecccedilatildeo)

As cubetas foram entatildeo mantidas em gelo por 10 min Em seguida os

parasitas foram transfectados com dois pulsos sequenciais de 500 μF e 450 volts

Apoacutes o esse procedimento as cubetas foram mantidas em gelo por mais 5 min A

suspensatildeo de parasitas transfectados foi entatildeo inoculada em 10 mL de meio LIT

suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 μgmL

3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes

O gene para a enzima neomicina fosfotransferase foi utilizado como

marcador de seleccedilatildeo dos parasitas carregando o plasmiacutedeo para a superexpressatildeo

pNEO_KAP7_3XFLAG Para tanto o antibioacutetico G418 foi adicionado agraves culturas

apoacutes 24 h da transfecccedilatildeo na concentraccedilatildeo final de 500 μgmL Entre 3 e 4 dias apoacutes

a transfecccedilatildeo foi realizada a primeira passagem (14) A partir desse ponto foram

feitas passagens semanais na proporccedilatildeo de 110 ateacute que natildeo fosse observado

crescimento nas duas uacuteltimas passagens da cultura do controle negativo da

transfecccedilatildeo

A expressatildeo da proteiacutena KAP7-FLAG foi analisada atraveacutes de ensaios de

western blot e imunofluorescecircncia

53

322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico

3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene

TcKAP7

As regiotildees a montante (upstream) e a jusante (downstream) do gene TcKAP7

respectivamente denominadas de UPSKAP7 (521 pb) e DOWNKAP7 (500 pb)

foram amplificadas por PCR usando os primers descritos nas TABELAS 1 E 2 A

regiatildeo denominada DOWNKAP7 conteacutem ainda 139 pb do final da regiatildeo codante de

TcKAP7

QUADRO 1 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA

REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1

UPSKAP7F GGGGTCGACCGTTGCTGGTTTTTCTTTTGGTGT

UPSKAP7R GGGAAGCTTGCTTCAAAACGTCTATGCGGGC

Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo SalI (GTCGAC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito


REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1

DOWNKAP7F GGGGAATTCGCCTCATATGACGCATCTCCCA

DOWNKAP7R GGGGGATCCTGTTGGCGCTGTCAAGGAAGTAAG

Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo EcoRI (GAATTC) e BamHI (GGATCC) adicionados aos primers estatildeo em negrito

As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng de

DNA total de T cruzi Dm28c 10 pmol dos oligonucleotiacutedeos F e R 200 μM de cada

dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA

polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador

modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do

54

material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s

hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O

material amplificado foi purificado usando o Qiaquick PCR Purification (Qiagen) O

DNA purificado foi digerido com enzimas de restriccedilatildeo apropriadas para a clonagem

dos fragmentos nos vetores pNEO1 O plasmiacutedeo resultante da clonagem das

regiotildees UPSKAP7 e DOWNKAP7 foi denominado de pNEO1kap7 (Figura 11A)

Uma vez que o genoma do T cruzi eacute diploide construiacutemos um segundo

plasmiacutedeo para o nocaute do segundo alelo do gene TcKAP7 tendo como marca de

seleccedilatildeo o gene que codifica resistecircncia a higromicina B Esse plasmiacutedeo foi

construiacutedo usando como molde o plasmiacutedeo pNEO1kap7 O plasmiacutedeo pNEO1kap7

foi digerido com HindIII para remoccedilatildeo do gene neo e uma pequena porccedilatildeo da regiatildeo

DOWNSTREAM (220 pb) O plasmiacutedeo linearizado foi purificado do gel de agarose

usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e ligado com o gene higro O gene

higro foi amplificado usando os primers HIGROF

(GGGGGAAGCTTATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC) e HIGROR

(GGGAAGCTTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG) ambos contendo na

extremidade 5rsquo o siacutetio para a enzima de restriccedilatildeo HindIII (em negrito) O plasmiacutedeo

resultante da ligaccedilatildeo foi denominado de pHIGRO1kap7 (FIGURA 11B)

55

FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP7 LEGENDA Nesta figura eacute observada a inserccedilatildeo das sequecircncias flanqueadoras do gene TcKAP7 juntamente com os respectivos siacutetios para cada enzima de restriccedilatildeo nos vetores de clonagem pNEO1 e pHIGRO1

3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para

transfecccedilatildeo de T cruzi

Os dois plasmiacutedeos recombinantes foram purificados pelo meacutetodo da lise

alcalina utilizando o kit de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeos (Qiagen) As minipreps

foram utilizadas para a amplificaccedilatildeo da regiatildeo UPS-NEO-DOWN (cassete NEO) e da

regiatildeo UPS-HIGRO-DOWN (cassete HYG) por PCR usando os primers UPSKAP7F

e DOWNKAP7R As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 20

ng do plasmiacutedeo pNEO1kap7 ou pHIGRO1kap7 10 pmol dos primers UPSKAP7F e

DOWNKAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase

1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi

processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas seguintes

condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de

desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e

56

extensatildeo a 68 degC por 2 min O material amplificado foi submetido agrave eletroforese em

gel preparativo de agarose 1 O gel foi corado com brometo de etiacutedeo (1 μgml) e a

banda correspondente a cada cassete foi removida do gel com auxiacutelio de uma

lacircmina de bisturi O DNA foi purificado por eletroeluiccedilatildeo dentro de saco de diaacutelise

nas condiccedilotildees de 100 V por 1 hora em tampatildeo TBE Para obter massa de DNA

suficiente para a transfecccedilatildeo (20 μg) foram feitas 10 reaccedilotildees de PCR com 100 μl

cada uma

3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN

Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute 2 x 107

ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a 6000

x g por 10 min a 4 degC O sedimento celular foi lavado com PBS esteacuteril e

ressuspendido em 1 ml de soluccedilatildeo de eletroporaccedilatildeo Volumes correspondentes a

04 ml da suspensatildeo de ceacutelulas foram transferidos para cubetas de eletroporaccedilatildeo

esteacutereis (02 cm de gap) (BioRad) e preacute-resfriadas Em uma delas foram adicionados

de 20 μg do fragmento representando o cassete NEO A outra cubeta contendo

apenas a suspensatildeo de parasitas foi usada como controle Apoacutes 10 minutos no gelo

as amostras contidas nas cubetas foram submetidas a 2 pulsos de 450 volts 500

microF utilizando o eletroporadorGenePulserreg IIApparatus (Bio-Rad) As amostras

foram incubadas novamente por 5 a 10 minutos no gelo em seguida foram

transferidas para garrafas de cultura de 25 cm2 contendo 10 ml de meio LIT

(suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 mgml) As culturas

foram entatildeo incubadas a 28 degC Apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo adicionou-se o

antibioacutetico G418 na concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por

sucessivas passagens (diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 a

cada 8-10 dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Os

parasitas nos quais TcKAP7 foi substituiacutedo pelo gene neo foram denominados deT

cruzi(kap7kap7neo) e foram testados para a correta inserccedilatildeo do gene neo no locus

genocircmico de TcKAP7

57

3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes

T cruzi transfectado com o cassete NEO (T cruzi(kap7kap7neo) foi cultivado

em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute uma densidade de 3 x 107

ceacutelulasml Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo por 1 min a 6000 x g e

lavados com PBS Em seguida os parasitas foram lisados gentilmente em 350 μl de

tampatildeo TELT conforme descrito no item 34

3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete

UPS-NEO-DOWN

As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF

(CCCGCTACGACTGCCCTCCACGCGGAAGGGAA) e EXTR

(AAGTAAACGGGAGAAGCAACACGATGGGAGGCTC) que natildeo estatildeo presentes na

construccedilatildeo do cassete UPS-NEO-DOWN combinados com os primers NEOF

(GGGGAAGCTTATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAG) e NEOR

(GGGGGAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAA)

As condiccedilotildees das reaccedilotildees foram as seguintes 100 ng do DNA total de T

cruzi Dm28c tipo selvagem (T cruzi(kap7kap7) ou tipo selvagem) ou do DNA da

populaccedilatildeo T cruzi(kap7kap7neo) (mutante simples nocaute) 10 pmol dos primers EXTF

+ NEOR e NEOF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA

polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de

PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas

seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35

ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC

por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min

3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN

Formas epimastigotas da populaccedilatildeo mutante de T cruzi (kap7kap7neo) foram

cultivadas em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute a densidade de 2 x

107 ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a

6000 x g por 10 min a 4 degC e submetidos ao processo de eletroporaccedilatildeo como

descrito no item 3202 Para a transfecccedilatildeo foram usados 20 μg do fragmento

58

representando o cassete UPS-HIGRO-DOWN As culturas (transfectada e controle)

foram entatildeo incubadas a 28 degC em LIT suplementado de G418 Apoacutes 24 horas de

incubaccedilatildeo foi adicionado o antibioacutetico higromicina ao meio de cultura na

concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por sucessivas passagens

(diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 e higromicina a cada 8-10

dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Mutantes nos quais

os dois alelos de TcKAP7 foram removidos e substituiacutedos pelos genes NEO e

HIGRO foram denominados com genoacutetipo T cruzi (kap7neokap7higro)


UPS-HIGRO-DOWN

As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF e

EXTR (item 3225) combinados com os primers HIGROF e HIGROR (item 3221)

As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng do

DNA total de T cruzi(kap7kap7) ou do DNA do T cruzi(kap7neokap7higro) 10 pmol dos

primers EXTF + HIGROR e HIGROF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15

mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase

(Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador modelo 9700

(Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por

4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo

dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min

3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute

atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot

O DNA genocircmico (5 μg) de T cruzikap7kap7 e T cruzikap7neokap7higro foi

submetido a digestatildeo com a enzima de restriccedilatildeo HindIII de acordo com as

especificaccedilotildees do fornecedor Apoacutes 3 horas o DNA digerido foi submetido agrave

eletroforese em gel de agarose 08 em tampatildeo TBE a 100 V O gel foi corado por

brometo de etiacutedio (05 μgmL) e fotografado sob a luz ultravioleta (310 nm)

Posteriormente o gel foi tratado com soluccedilotildees de depurinaccedilatildeo por 15 minutos de

desnaturaccedilatildeo por 30 minutos (2 vezes) e soluccedilatildeo de neutralizaccedilatildeo por 30 minutos (2

vezes) O DNA foi transferido para uma membrana de nylon (Hybond N

59

AmershamBiosciences) por capilaridade (SAMBROOK et al 1989) utilizando-se de

uma ldquoponterdquo de papel 3 MM embebido em SSC 20X Apoacutes a transferecircncia o DNA foi

fixado agrave membrana por exposiccedilatildeo agrave luz ultravioleta com uma dose de 120 mJcm2

usando o aparelho Spectrolinker (Spectronicscorp USA) A membrana contendo o

DNA de T cruzi foi preacute-hibridizada em soluccedilatildeo de hibridizaccedilatildeo de DNA por 1 hora a

65 ordmC seguido da adiccedilatildeo da sonda marcada radioativamente com α-[P32

]-dCTP (10

μCiμl 3000 Cimmol) (Amersham Biosciences) preparada segundo meacutetodo de nick

translation descrito por Rigbyet al (1977) utilizando-se o meacutetodo de iniciaccedilatildeo por

random primers (Megaprimer DNA labeling kit ndash GE) conforme recomendaccedilotildees do

fabricante

Foram utilizadas 3 sondas satildeo elas fragmento do gene TcKAP7

correspondendo a regiatildeo compreendida entre os nucleotiacutedeos 1 e 560 o gene neo e

o gene higro Apoacutes a marcaccedilatildeo as sondas foram purificadas em colunas de

Sephadex G-50 (ProbeQuant ndash Amersham Biosciences) e adicionadas ao tampatildeo de

hibridizaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 5 x 106

cpmml As membranas foram incubadas

por 16 horas a 65 C e em seguida lavadas nesta temperatura duas vezes por 30

minutos com soluccedilotildees de alta meacutedia e baixa estringecircncia As membranas foram

expostas a filme de raio-X (Hyperfilmreg Amersham Biosciences) na presenccedila de tela

intensificadora (Dupont Cronex Lightining Plus) por tempo que varia entre 1 a 3 dias

a ndash70 C

323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de


Formas epimastigotas de T cruzi foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 times

g 3 a 10 ordmC) lavadas duas vezes em PBS e depositadas sobre lacircminas de vidro

previamente tratadas com poli-L-lisina 001 diluiacuteda em PBS Os parasitas foram

entatildeo fixados com paraformaldeiacutedo 4 em PBS permeabilizados com Triton X-100

01 em PBS por 2 min agrave temperatura ambiente e incubados a 4ordmC durante 16 h

em soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia (PBS 1X + BSA 1 ) Apoacutes o

bloqueio os parasitas foram incubados agrave temperatura ambiente por 1 h com o

anticorpo monoclonal anti-FLAG em uma diluiccedilatildeo de 11000 em soluccedilatildeo de bloqueio

para imunofluorescecircncia Depois disso as lacircminas foram submetidas a 5 lavagens

60

de 5 min cada em PBS Em seguida os parasitas foram incubados agrave temperatura

ambiente por 1 hora com o anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado

ao fluoroacuteforo Alexa Fluacuteor 488 (Invitrogen) diluiacutedo 1600 em soluccedilatildeo de bloqueio As

lacircminas foram lavadas 5 vezes com PBS e posteriormente incubadas com o corante

Hoechst 33342 (Invitrogen) a 2 μgμL em PBS por 5 min Apoacutes cinco lavagens com

PBS as lacircminas foram montadas com ProLong Gold Antifade (Invitrogen) sobre uma

lacircmina de microscopia oacutetica O material foi observado nos microscoacutepios Leica SP5 e

DMI6000

324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para

TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo

Os parasitas foram coletados lavados com PBS e fixados em soluccedilatildeo

contendo 25 de glutaraldeiacutedo 4 de paraformaldeiacutedo e tampatildeo cacodilato 01 M

Em seguida os parasitas foram fixados por 1 h em soluccedilatildeo de 1 de tetroacutexido de

Oacutesmio e 08 de ferricianeto de potaacutessio diluiacutedos em tampatildeo cacodilato 01 M As

ceacutelulas foram entatildeo desidratadas em soluccedilatildeo contendo concentraccedilotildees crescentes

de acetona e incluiacutedas em Epon Apoacutes a obtenccedilatildeo de cortes ultrafinos dos parasitas

os mesmos foram contrastados em acetato de uranila e citrato de Chumbo antes de

serem observados e fotografados no microscoacutepio eletrocircnico de transmissatildeo Zeiss

900

325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados

A coloraccedilatildeo dos parasitas foi realizada pelo meacutetodo panoacutetico raacutepido

(Laborclin Pinhais Paranaacute Brasil) modificado

Formas epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 foram cultivadas

como descrito no item 321 Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo de 1

min a 4000 x g e ressuspensos em PBS Desta suspensatildeo uma gota foi retirada e

depositada sobre lacircminas previamente limpas Quando secas as lacircminas foram

imersas individualmente na Soluccedilatildeo 1 (Fixador) Soluccedilatildeo 2 (Revelador) e Soluccedilatildeo 3

(Corante) em cada uma por 30 s Apoacutes este processo as lacircminas foram lavadas em

aacutegua corrente secas agrave temperatura ambiente e cobertas com Permount e lamiacutenula

Os parasitas foram visualizados em microscoacutepio Nikon E600

61

326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP7

Ceacutelulas Vero (ATCCreg Nuacutemero CRL-2783trade) foram cultivadas em garrafas

de 150 cm2 contendo meio RPMI suplementado com 5 de soro fetal bovino

(GIBCO) penicilina 100 UIml streptomicina 10 microgml e glutamina 2 mM a 37 o C

com 5 de CO2 Ao atingirem a confluecircncia (80 a 100) realizou-se a passagem

atraveacutes de tripsinizaccedilatildeo e foi feito um inoacuteculo de 1 x 107 ceacutelulas para cada nova

garrafa de 150 cm2 Apoacutes 24 horas estas ceacutelulas (50 ndash 70 de confluecircncia) foram

infectadas com formas metaciacuteclicas obtidas da diferenciaccedilatildeo do mutante de T cruzi

para TcKAP7 em microplacas de 24 poccedilos contendo lamiacutenulas de vidro com

diacircmetro de 13 mm A cada poccedilo foram adicionadas 2 x 104 ceacutelulas Vero Apoacutes 24

horas de cultivo as ceacutelulas foram infectadas com tripomastigotas metaciacuteclicos

(obtidos do sobrenadante das culturas de T cruzi diferenciados em meio TAU3AAG

sem purificaccedilatildeo na coluna de DEAE celulose) A infecccedilatildeo das ceacutelulas Vero foi

acompanhada diariamente por microscopia de contraste de fase

327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de

ensaios de RNA de interferecircncia

Com o intuito de complementar os estudos da funccedilatildeo do gene TcKAP7 foi

utilizada a teacutecnica de RNA de interferecircncia O uso dessa metodologia compreende

uma abordagem alternativa agrave anaacutelise da funccedilatildeo gecircnica para genes ortoacutelogos deT

brucei por anaacutelises de RNAi uma vez que a maquinaria de RNAi em T cruzi eacute

inexistente (DA ROCHA et al 2003) Os resultados podem gerar evidecircncias que

estejam relacionadas agrave funcionalidade dos genes em T cruzi Esta abordagem foi

utilizada neste trabalho para auxiliar no estudo da funccedilatildeo do gene TcKAP7 a partir

do ortoacutelogo em T brucei ainda natildeo caracterizadoTbKAP7 Os ensaios de RNAi

foram realizados em T brucei cepa 29-13 (WIRTZ et al 1999) com sistema induzido

por tetraciclina utilizando o vetor p2T7-177 ilustrado na figura 12 Este vetor quando

transfectado no parasita integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de

repeticcedilotildees 177 (FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005)

62

FIGURA 12 MAPA DO VETOR p2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi LEGENDA T7 prom Promotor de T7 RNA Polimerase induzido por tetraciclina T7 term Terminador de transcriccedilatildeo 177 Sequumlecircncia repetitiva de 177 pares de bases para alvo de inserccedilatildeo em minicromossomos BLEO gene de resistecircncia agrave fleomicina GFP Proteiacutena Green FluorescentProtein os siacutetios para as enzimas de restriccedilatildeo estatildeo indicados AmpR gene de resistecircncia agrave ampicilina (FONTE WICKSTEAD et al 2002)

As regiotildees do mRNA para alvos nos ensaios de RNAi foram escolhidas com

o auxiacutelio da ferramenta RNAit da base de dados do Trypanofan - Genocircmica

funcional de Tbrucei (httptrypanofanpathcamacuktrypanofanmain)

(REDMOND et al 2003) Essas regiotildees foram amplificadas por PCR usando como

molde o DNA total de T brucei (100 ngreaccedilatildeo) 10 pmol dos primers listados na

tabela 3 200 mM de cada dNTP 15 mM de MgCl2 tampatildeo Taq DNA polimerase 1x

63

(Invitrogen) e 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo foi

aquecida por 4 min a 94 degC e entatildeo submetida a 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 94 degC

por 30 s anelamento a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min Os primers

utilizados apresentam siacutetio para as enzimas de restriccedilatildeo BamHI (F) ou HindIII (R)

Os produtos de PCR foram purificados por extraccedilatildeo com fenol-clorofoacutermio e

digeridos com as referentes enzimas

QUADRO 3 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO

GENE TbKAP7

KAP7RNAiF

AAAGGATCCCTAACCTAACCTGCAGGGTCTCTCG

KAP7RNAiR

GCGAAGCTTTTGTTCCTTTACAAACGCCC

Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo BamHI (GGATCC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito

As clonagens foram confirmadas por PCR de colocircnia e os plasmiacutedeos foram

purificados pelo kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) Apoacutes purificaccedilatildeo 10 μg dos

plasmiacutedeos foram linearizados com a enzima NotI conforme descrito pelo fabricante

O DNA foi precipitado e ressuspenso em 50 μl de meio de eletroporaccedilatildeo ZPFM para

transfecccedilatildeo do T brucei

Para cada transfecccedilatildeo foi utilizado um total de 4 x 107parasitas em fase logariacutetmica

de crescimento Os parasitas foram obtidos por centrifugaccedilatildeo (5000 x g por 10 min

a 4 degC) lavados em meio ZPFM e ressuspensos em 500 μl do mesmo meio A

transfecccedilatildeo foi feita em cubetas de eletroporaccedilatildeo (4 mm) usando o eletroporador da

BioRad (GenePulser II Electroporator) As condiccedilotildees utilizadas foram dois pulsos de

1600 V e 25 microF Os parasitas foram entatildeo transferidos para garrafas contendo meio

SDM-79 SFB 10 higromicina 50 μgml e G418 15 μgml A seleccedilatildeo dos parasitas

transfectados foi atraveacutes da adiccedilatildeo de 5μgmL de fleomicina resistecircncia conferida

pelo vetor p2T7-177 apoacutes 24 horas de cultivo O tempo para seleccedilatildeo foi entre duas

e trecircs semanas

64

3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita

A induccedilatildeo da expressatildeo de RNA dupla fita referente agrave porccedilatildeo do gene

TbKAP7 clonado no plasmiacutedeo p2T7-177 deu-se pela adiccedilatildeo de tetraciclina 2 μgml

a uma cultura transfectada de T brucei em fase de crescimento exponencial (~2 x

106 parasitasml) Nos dias que se seguiram 1μgml de tetraciclina foi adicionada

diariamente agraves culturas A observaccedilatildeo dos efeitos na curva de crescimento causada

por RNAi em T brucei foi realizada ao longo de uma semana com a contagem de

ceacutelulas e adiccedilatildeo diaacuteria de tetraciclina 1 μgml

65

4 RESULTADOS

41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP7

A regiatildeo codificante do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi

obtida a partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da

internet wwwgenedborg e amplificada por PCR com os primers descritos no item

37

No genoma do T cruzi cepa CL Brener (EL-SAYED et al 2005) foram

identificados dois haploacutetipos do gene TcKAP7 que foram denominados neste

trabalho de haploacutetipo A (Tc00104705350871950) e haploacutetipo B

(Tc00104705350979320) Neste trabalho foi utilizado o gene TcKAP7 proveniente

da cepa Dm28c de T cruzi Este gene apresenta uma regiatildeo codante de 747 pb e

codifica uma proteiacutena de 276 kDa assumindo que o primeiro ATG apoacutes a sequecircncia

do mini-eacutexon seja usada na iniciaccedilatildeo da traduccedilatildeo

A figura 13 abaixo mostra o alinhamento de TcKAP7 das cepas CL Brener e

Dm28c

FIGURA 13 - COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER

LEGENDA As posiccedilotildees com aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias estatildeo coloridas em preto

66

Embora o gene TcKAP7 natildeo possua grande identidade com os com genes

ortoacutelogos em Trypanosoma brucei TbKAP7 (714 pb) (Tb106k151470) Leishmania

major LmKAP7 (1044 pb) (LMJF_36_5840) Leishmania infantum LiKAP7 (1044 pb)

(LINJ_36_6090) e Leishmania braziliensis LbKAP7 (1038 pb) (LBRM_35_0010)

cujos genomas tambeacutem foram sequumlenciados (BERRIMAN et al 2005 IVENS et al

2005 PEACOCK et al 2007) as sequecircncias de aminoaacutecidos das respectivas

proteiacutenas deduzidas a partir desses genes ainda compartilham certo grau de

similaridade entre si (FIGURA 14) Na tabela 4 pode-se visualizar o percentual de

identidade entre as proteiacutenas KAP7 dos tripanossomatiacutedeos que possuem o genoma

sequenciado

FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Em preto encontram-se os resiacuteduos de aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias e em cinza os resiacuteduos conservados na maioria delas

67

QUADRO 4 - PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS

TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO

Os valores foram obtidos pelo alinhamento utilizando a ferramenta Clustal21

Mesmo apresentando pouca identidade e variaccedilatildeo de tamanho alguns

dados do genoma sugerem que esses genes satildeo ortoacutelogos entre si Pode-se

perceber uma sintenia entre seus loci nas vaacuterias espeacutecies de tripanosomatiacutedeos

(Cavalcanti et al 2009) (FIGURA 15)

FIGURA 15- SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Os dois contigs de TcKAP7 (TcA e TcB) estatildeo representados nesta figura juntamente com os contigs de outros tripanosomatiacutedeos (Tb= T brucei Lm= L major Li= L infantum e Lb= L brasiliensis) mostrando que KAP7 representado pela cor amarela apresenta uma sintenia entre seus loci em todas as espeacutecies mostradas sendo flanqueado pelo gene KAP4 em T cruzi e T brucei representado em azul Portanto em L majorL infantum eL brasiliensis ao lado direito de KAP7 estaacute o gene de uma proteiacutena hipoteacutetica representado pela cor vermelha e ao lado esquerdo encontra-se o gene da KAP4 representado em azul como mencionado anteriormente FONTE CAVALCANTI et al 2009

68

A expressatildeo de vaacuterios genes mitocondriais de C fasciculata e L major eacute

regulada durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia consenso

[(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos mRNAs

(BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998 PASION

et al 1996 ZICK et al 2005)

Assim resolvemos caracterizar a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7 na

tentativa de identificar sinais com identidade com aqueles encontrados em C

fasciculata Na figura 16 estaacute representada a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7

com a sequumlecircncia parcial do mini-exon proveniente do primer usado na teacutecnica de

RT-PCR bem como parte da regiatildeo codificante do gene O mini-exon estaacute situado a

129 bases a jusante do iniacutecio da regiatildeo codificante do transcrito TcKAP7 e define

portanto uma regiatildeo 5rsquo-UTR de 168 bases considerando que o tamanho do mini-

exon eacute de 39 bases A anaacutelise da regiatildeo 5rsquo-UTR mostrou um elemento com

caracteriacutesticas muito semelhantes aquele envolvido na regulaccedilatildeo de genes em C

fasciculata (sequencia (G)ATAGAA(G) mostrada no retacircngulo preto na FIGURA

16B) sugerindo que TcKAP7 seja regulada durante o ciclo celular

69

A

B

FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP7 LEGENDA A Esquema geral da localizaccedilatildeo do mini-exon de TcKAP7 e B Localizaccedilatildeo especiacutefica do mini-exon de TcKAP7 O mini-exon de TcKAP7 (sequecircncia parcial em verde) estaacute localizado a 129 pb da regiatildeo codante (representada em parte pela cor azul) A regiatildeo 5rsquoUTR do transcrito Tckap7 estaacute representada na cor rosa A possiacutevel sequencia consenso de regulaccedilatildeo durante o ciclo celular estaacute indicada no retacircngulo preto

42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi

Formas epimastigotas foram transfectadas com o plasmiacutedeo pNEO3XFLAG

contendo o gene TcKAP7 (pNEO_KAP7_3xFLAG) A expressatildeo da proteiacutena

TcKAP7-FLAG foi analisada por ensaio de western blot Os resultados mostraram

que a expressatildeo da proteiacutena TcKAP7-FLAG foi satisfatoacuteria correspondendo ao

tamanho esperado (FIGURA 17 ) a qual foi confirmada pela reatividade do anticorpo

monoclonal especiacutefico para as etiquetas FLAG (anti-FLAG)

70

FIGURA 17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI

43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia

Para verificar a localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 foi realizado o ensaio de

imunofluorescecircncia Como natildeo foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do anticorpo com alto tiacutetulo

contra a proteiacutena recombinante TcKAP7 neste ensaio foi utilizado o anticorpo

monoclonal anti-FLAG que reconhece a etiqueta FLAG a qual estaacute fusionada a

proteiacutena TcKAP7

Nessa figura pode-se observar que a proteiacutena de fusatildeo acumula-se na regiatildeo

dos poacutelos do cinetoplasto das formas epimastigotas do T cruzi (FIGURA 18)

indicando que TcKAP7 uma proteiacutena tipo histona H1 estaacute realmente associada com

o kDNA do parasita

71

FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI LEGENDAA contraste interferencial diferencial (DIC) B Hoechst marcando o nuacutecleo e o

cinetoplasto C fluorescecircncia mostrando a localizaccedilatildeo de TcKAP7 mais intensa na regiatildeo dos poacutelos

docinetoplasto dos protozoaacuterios D Aumento de C


As teacutecnicas que permitem a remoccedilatildeo de um gene e sua substituiccedilatildeo por

genes repoacuterteres atraveacutes do processo de recombinaccedilatildeo tecircm sido usadas com

sucesso para verificaccedilatildeo da funccedilatildeo gecircnica em tripanosomatiacutedeos (MACRAE et al

2006) O nocaute gecircnico consiste na inserccedilatildeo de marcadores geneacuteticos de seleccedilatildeo

(gene codificando resistecircncia a neomicina ou higromicina entre outros) flanqueados

por sequumlecircncias pertencentes ao locus cromossocircmico de interesse Atraveacutes do

processo de recombinaccedilatildeo homoacuteloga o marcador pode entatildeo substituir o gene que

se quer estudar Desse modo pode ser possiacutevel analisar a funccedilatildeo de determinado

gene atraveacutes das alteraccedilotildees - decorrentes de sua ausecircncia - na fisiologia do

parasita No presente estudo os genes repoacuterteres que codificam resistecircncia aos

72

antibioacuteticos G418 e higromicina foram flanqueados por sequumlecircncias a montante e a

jusante da regiatildeo codificante do gene TcKAP7 As construccedilotildees foram usadas para

transfectarT cruzi e gerar mutantes para o gene TcKAP7 a fim de se estudar o

efeito que a ausecircncia do gene TcKAP7 causa no metabolismo do parasita

Apoacutes obtenccedilatildeo de uma populaccedilatildeo de T cruzi mutante para o gene TcKAP7

(kap7neokap7higro) resistente a ambos antibioacuteticos G418 e higromicina B o

DNA desta populaccedilatildeo foi extraiacutedo para anaacutelise por PCR e Southern blot a fim de

confirmar a eficiecircncia do nocaute

441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes

UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN

Foram realizadas vaacuterias reaccedilotildees de PCR a fim de confirmar a deleccedilatildeo do

gene TcKAP7 do genoma do T cruzi Dm28c e a substituiccedilatildeo dos seus alelos pelos

genes neo e higro As reaccedilotildees de PCR foram feitas com DNA de T cruzikap7kap7 (tipo

selvagem) e com DNA de T cruzikap7neokap7higro utilizando diversas combinaccedilotildees de

primers (TABELA 5) Na figura 32 observa-se que o gene TcKAP7 (747 pb) foi

amplificado somente na PCR realizada com DNA de T cruzi tipo selvagem (FIGURA

19 A canaleta 1) enquanto que os genes neo (795 pb) e higro (1026 pb) soacute foram

amplificados nas reaccedilotildees que conteacutem DNA da populaccedilatildeo do T cruzi kap7neokap7higro

(FIGURA 19 B canaletas 2 e 3) Os tamanhos esperados para amplificaccedilotildees usando

primers externos agraves construccedilotildees e os primers dos genes de resistecircncia foram

identificados no gel de agarose indicando que os cassetes se integraram

corretamente no locus do gene TcKAP7 (FIGURA 19 B canaletas 4 a 7) Um

esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados nas reaccedilotildees de PCR pode ser

visualizado na figura 19 C

QUADRO 5 ndash COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA

CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP7

Pares de primers Tamanho esperado

(pb)

1 KAP7F + KAP7R 747

2 NEOF + NEOR 795

73

3 HIGROF + HIGROR 1026

4 EXTF + NEOR 1410

5 EXTF + HIGROR 1634

6 NEOF + EXTR 1358

7 HIGROF + EXTR 1360

74

FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E

T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS

LEGENDA 1 KAP7F + KAP7R 2 NEOF + NEOR (795 pb) 3 HIGROF + HIGROR (1026 pb) 4

EXTF + NEOR (1410 pb) 5 EXTF + HIGROR (1634 pb) 6 NEOF + EXTR (1358 pb) e 7

HIGROF + EXTR (1360 pb) No quadro A encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7kap7 (WT) e no quadro B encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7neokap7higro

(NO) No quadro C estaacute um esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados

442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do

tipo Southern blot

Neste ensaio foi utilizado DNA total extraiacutedo de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem)

e T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute) Foram utilizadas trecircs sondas (1) Um

fragmento do gene TcKAP7 (primeiros 598 pb da CDS) (2) o gene neo e (3) o gene

higro O DNA total das duas amostras foi digerido com a enzima de restriccedilatildeo HindIII

O padratildeo de digestatildeo desta enzima pode ser visualizado na figura 20 De acordo

com o mapa de restriccedilatildeo a inserccedilatildeo do cassete neo no locus KAP7 geraria um

fragmento HindIIIHindIII de 1024 pb enquanto a inserccedilatildeo do cassete higro geraria

um fragmento de 1032 pb cujos tamanhos satildeo diferentes do fragmento

HindIIIHindIII do locus original (1776 pb) As hibridizaccedilotildees mostram bandas

compatiacuteveis com os tamanhos dos fragmentos HindIIIHindIII esperados para cada

situaccedilatildeo acima (FIGURA 21) Podemos observar que a sonda KAP7 somente

reconhece uma banda de tamanho esperado apenas no DNA do parasita selvagem

(canaleta 1 FIGURA 21) enquanto que bandas correspondentes aos genes neo e

higrosomente aparecem no DNA do mutante KAP7 (canaleta 2 FIGURA 21)

75

FIGURA 20 ndash REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener LEGENDA Este esquema representa esquematicamente em escala os genes kap3 neo e higro as regiotildees upstream e downstream e os siacutetios de clivagem da enzima KpnI

FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT LEGENDA A Autoradiograma e B Padrotildees dos fragmentos obtidos da digestatildeo do DNA com a enzima de restriccedilatildeo HindIII Foram utilizadas trecircs sondas TcKAP7 neomicina e higromicina 1) DNA de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem) e 2) T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute)

76

45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot

O antisoro contra a proteiacutena TcKAP7 obtido apoacutes imunizaccedilatildeo dos

camundongos foi utilizado em ensaio do tipo western blot para avaliar se TcKAP7

ainda estava sendo expresso no T cruzi apoacutes o nocaute gecircnico

O que se observou foi novamente como esperado que a proteiacutena TcKAP7 natildeo eacute

mais expressa no T cruzi kap7neokap7higro (figura 22) Pode-se observar a presenccedila

de TcKAP7 ( aprox 28 kDa) no extrato das formas epimastigotas de T cruzi kap7kap7

(figura 22A) mas natildeo no extrato de epimastigotas de T cruzi

kap7neokap7higro (figura 22B)

FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT LEGENDA Imunoblot de extratos de epimastigotas de T cruzi kap7kap7 (A) e de T cruzi kap7neokap7higro (B) reagidos com anti-TcKAP7

46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T

cruzi para TcKAP7

Sabendo-se que TcKAP7 estaacute associada ao cinetoplasto e pode estar

envolvida na compactaccedilatildeo do kDNA do T cruzi como foi mostrado para as KAPs de

Crithidia fasciculata (XU amp RAY 1993 XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) sua

ausecircncia poderia levar a alteraccedilatildeo na estrutura do DNA mitocondrial dos parasitas

nocauteados Portanto o primeiro passo foi verificar se havia alteraccedilotildees na

77

morforlogia do parasita Formas epimastigotas do mutante de T cruzi foram

analisadas ao microscoacutepio oacuteptico apoacutes coloraccedilatildeo Como pode ser observado na

figura 23 epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 apresentam uma

morfologia fusiforme com o cinetoplasto caracteriacutestico em forma de barra localizado

anteriormente ao nuacutecleo natildeo se evidenciando portanto nenhuma alteraccedilatildeo em

relaccedilatildeo agrave morfologia dos parasitas do tipo selvagem

FIGURA 23 - COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS LEGENDA A) Formas epimastigotas B) Forma epimastigota em maior aumento

Formas epimastigotas de parasitas do tipo selvagem e nocauteados foram

entatildeo analisados pela teacutecnica de microscopia eletrocircnica de transmissatildeo para

visualizar com mais detalhe o cinetoplasto e verificar se sua estrutura estava

alterada pela ausecircncia da TcKAP7 (FIGURA 24) A figura 24A mostra um corte

ultrafino de um epimastigota de T cruzi do tipo selvagem que apresenta o

cinetoplasto compacto e em forma de bastatildeo caracteriacutestico de formas

epimastigotas sem nenhuma alteraccedilatildeo aparente O mesmo pode ser visto na figura

24B para o epimastigota de T cruzi nocauteado A disposiccedilatildeo estrutura e aspecto

do cinetoplasto de ambos os parasitas selvagem e nocauteado natildeo apresentaram

nenhuma diferenccedila entre si mostrando que mesmo apoacutes o nocaute da KAP7 a

estrutura do cinetoplasto permanece aparentemente inalterada

78

FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO

79

47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para

TcKAP7

Os parasitas mutantes foram analisados a fim de verificar se alteraccedilotildees na

estrutura do kDNA pela ausecircncia de KAP7 natildeo estavam levando a alteraccedilotildees na

fisiologia do parasita alterando sua multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade

Inicialmente foi analisado o perfil da curva de crescimento das formas

epimastigotas Observou-se que natildeo havia diferenccedila na curva de crescimento dos

parasitas nocauteados em relaccedilatildeo ao parasita selvagem (FIGURA 25)

FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT)

LEGENDA Curva de crescimento do mutante de T cruzi para TcKAP7 () e do T cruzi Dm28c ()

Em seguida os parasitas nocauteados foram analisados quanto a sua capacidade

de diferenciaccedilatildeo em tripomastigotas metaciacuteclicos Foram realizadas contagens

diferenciais em cacircmara de Neubauer a partir do sobrenadante da metaciclogecircnese

a cada 24 h apoacutes a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em meio TAU3AAG durante um periacuteodo

de 3 dias (72 h) A partir dessas contagens foram construiacutedos curva com a contagem

do nuacutemero de metaciacuteclicos ao longo dos trecircs dias (FIGURA 26)

Nenhuma alteraccedilatildeo foi observada quando os parasitas nocauteados foram

submetidos ao processo de metaciclogecircnese in vitro Ou seja pode-se afirmar que

80

mesmo apoacutes o nocaute do gene TcKAP7 as formas epimastigotas do parasita

conseguem se diferenciar em formas metaciacuteclicas

FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO LEGENDA Metaciclogecircnese in vitro de T cruzi Dm28c tipo selvagem () e T cruzi nocauteado ()

Uma vez que os parasitas nocauteados foram capazes de se diferenciar de

epimastigota a tripomastigota metaciacuteclico resolveu-se investigar se estes eram

capazes de infectar ceacutelulas in vitro Foi possiacutevel perceber as formas amastigotas

dentro de ceacutelulas VERO em cultura mostrando que o parasita natildeo perdeu sua

capacidade de infecccedilatildeo (dados natildeo mostrados) Assim pode-se concluir que aleacutem

de sofrer diferenciaccedilatildeo os mutantes de T cruzi para KAP7 tambeacutem mantiveram sua

capacidade de infecccedilatildeo

48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de


Para averiguar a importacircncia da proteiacutena TcKAP7 na biologia do parasita

recorremos a ensaios de RNA de interferecircncia (RNAi) jaacute que existe uma alta

similaridade entre TcKAP7 e seu ortoacutelogo em Trypanosoma brucei

81

A via de RNA de interferecircncia consiste em um mecanismo de silenciamento

gecircnico que para a ceacutelula funciona como sistema de defesa O mecanismo inicia-se

atraveacutes da expressatildeo de um RNA dupla fita (dsRNA) contendo uma sequecircncia

complementar ao gene de interesse Este dsRNA seraacute entatildeo clivado em pequenos

fragmentos de cerca de 22 a 25 nucleotiacutedeos atraveacutes da atividade de uma

ribonuclease do tipo III denominada Dicer Estes pequenos RNAs seratildeo

direcionados e permaneceratildeo unidos a um complexo proteico denominado RISC

(ldquoRNA-InducedSilencingComplexrdquo) Nesse complexo os pequenos RNAs de

interferecircncia (siRNA) ligam-se por complementaridade ao RNA mensageiro do gene

a ser inativado guiando-os para degradaccedilatildeo pelas nucleases presentes no

complexo impedindo a siacutentese da respectiva proteiacutena (ULLU et al 2002) O vetor

utilizado para promover o silenciamento do gene TbKAP7 foi o p2T7-177 Este

plasmiacutedeo integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de repeticcedilotildees 177

(FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005) Este vetor apresenta dois promotores

de polimerase em oposiccedilatildeo induziacuteveis por tetraciclina flanqueando a sequumlecircncia de

interesse Desta forma satildeo geradas duas moleacuteculas de mRNA que pareadas

formam a moleacutecula de RNA fita dupla capaz de induzir a maquinaria de degradaccedilatildeo

A induccedilatildeo da inibiccedilatildeo de TbKAP7 atraveacutes de RNAi levou a uma diminuiccedilatildeo da

multiplicaccedilatildeo celular do parasita a partir do quarto dia do experimento (FIGURA 27)

Os resultados obtidos neste ensaio mostraram que a participaccedilatildeo da TbKAP7

no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene TbKAP7

levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita

82

FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T

brucei

LEGENDA Curva de crescimento de linhagem celular de RNAi de TbKAP7 em T brucei induzido por

tetraciclina As ceacutelulas foram diluiacutedas a uma densidade celular inicial de 1 X 106 ml na presenccedila e

ausecircncia de tetraciclina As densidades celulares foram determinadas pela contagem de ceacutelulas a

intervalos de 24 horas durante oito dias apoacutes iniacutecio de adiccedilatildeo de tetraciclina A linha com quadrados

mostra a curva de crescimento celular na presenccedila de tetraciclina (+TET) A linha com losangos

mostra a curva de crescimento celular na ausecircncia de tetraciclina (- TET)

49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP7

491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP7

O cultivo de E coli BL-21(DE3) STAR contendo o plasmiacutedeo pET28a-

TcKAP7 foi feito em meio LB a 37 oC com a induccedilatildeo da expressatildeo realizada a uma

densidade oacutetica de DO600 de 08 com a adiccedilatildeo de 05 mM de ITPG durante a noite a

37 oC

As ceacutelulas foram recuperadas por centrifugaccedilatildeo ressuspensas sonicadas e

centrifugadas para a purificaccedilatildeo de TcKAP7 atraveacutes da cromatografia de afinidade

em resina de Ni-NTA (Figura 28A) Foi possiacutevel obter grande quantidade de

83

amostra com grau de pureza alto como visualizado atraveacutes de anaacutelise por SDS-

PAGE (Figura 28B)

FIGURA28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE LEGENDA A) Cromatograma de afinidade B) SDS-PAGE da cromatografia de afinidade Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE

Devido agrave presenccedila de bandas com possiacuteveis contaminantes as fraccedilotildees que

continham a proteiacutena de interesse foram submetidas agrave purificaccedilatildeo por cromatografia

de troca iocircnica onde a purificaccedilatildeo eacute realizada baseada na afinidade por cargas

entre as proteiacutenas e a resina

Para esta purificaccedilatildeo utilizou-se a coluna SP Hitrap (GE Healthcare Life

Sciences) que eacute uma coluna de carga negativa Essa resina foi escolhida pois o pH

do tampatildeo em que se encontrava TcKAP7 era menor que o pI da proteiacutena Nessas

condiccedilotildees a carga superficial de TcKAP7 eacute positiva Para favorecer a interaccedilatildeo

TcKAP7 e resina foi feita uma diluiccedilatildeo de TcKAP7 para retirada de NaCl A eluiccedilatildeo

da proteiacutena foi realizada com um gradiente segmentado de tampatildeo B para

84

cromatografia de troca iocircnica TcKAP7 foi eluiacuteda com 68 do tampatildeo B (FIGURA

29)

FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA

LEGENDA A) Cromatografia de troca iocircnica B) SDS-PAGE da cromatografia de troca iocircnica Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE Curva em azul representa absorbacircncia em 280 nm Linha em verde indica concentraccedilatildeo de tampatildeo B para eluiccedilatildeo da amostra

410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP7

A amostra purificada por troca iocircnica foi submetida agrave cromatografia de

exclusatildeo molecular tambeacutem chamada de gel filtraccedilatildeo que consiste na separaccedilatildeo

de biomoleacuteculas de acordo com seu tamanho e forma A coluna neste processo

conteacutem um poliacutemero com ligaccedilotildees cruzadas com poros de tamanho definido As

moleacuteculas maiores iratildeo migrar mais rapidamente que as menores pois natildeo satildeo

85

capazes de penetrar no interior dos poros da resina eluindo diretamente da coluna

As moleacuteculas menores por entrarem pelos poros da resina e levarem mais tempo

percorrendo os poros satildeo eluiacutedas mais tarde em relaccedilatildeo as que satildeo maiores

Ao comparar o volume de eluiccedilatildeo de TcKAP7 com o volume de eluiccedilatildeo de

proteiacutenas com massa molecular conhecidos (dados natildeo mostrados) foi possiacutevel

verificar que TcKAP7 parece ser um monocircmero em soluccedilatildeo Para confirmar esses

dados a mesma amostra foi submetida ao experimento de espalhamento dinacircmico

de luz (DLS)

O DLS eacute uma teacutecnica que se estima a distribuiccedilatildeo de tamanho das

populaccedilotildees de partiacuteculas que estatildeo presentes na amostra permitindo a detecccedilatildeo de

agregados proteicos ou de diferentes estados de oligomerizaccedilatildeo na amostra

indicando heterogeneidade Eacute importante ressaltar que para maiores chances de

sucesso em ensaios de cristalizaccedilatildeo a amostra deve encontrar-se monodispersa

Os dados de DLS mostram que 911 da massa de TcKAP7 analisada

apresenta um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm que representa uma massa

aparente de 29 kDa (FIGURA 30) Isto eacute condizente com um monocircmero cuja massa

teoacuterica seria de aproximadamente 28 kDa (incluindo a cauda de 6 histidinas) de

acordo com a prediccedilatildeo feita pelo servidor Expasy Protparam

(httpwebexpasyorgprotparam)A polidispersividade da amostra foi baixa

indicando que a mesma estava homogecircnea

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

M

assa

Rh (nm)

fr80

fr82

fr84

fr85

86

FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP7 LEGENDA Anaacutelise por DLS de TcKAP7 contendo as fraccedilotildees obtidas na cromatografia de afinidade As fraccedilotildees 80 84 e 85 apresentam um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm

Aleacutem disso tambeacutem foram obtidas informaccedilotildees sobre o envelope de TcKAP7

a partir dos dados coletados atraveacutes da teacutecnica de SAXS mostrando que o raio de

giro (Rg) do envelope de TcKAP7 estaacute de acordo com o estimado por DLS (FIGURA

31)

FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS

411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante

Atraveacutes da anaacutelise do espectro de dicroiacutesmo circular pode-se verificar o

conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da proteiacutena e inferir enovelamento da proteiacutena

recombinante Os dados obtidos para a TcKAP7 revelaram a presenccedila de estruturas

α caracterizadas pelos miacutenimos pronunciados em 208 nm e 222 nm e de estruturas

coiled na amostra de TcKAP7 caracterizada pelos miacutenimos pronunciados em 205

nm (FIGURA 32) Este resultado estaacute de acordo a prediccedilatildeo de estrutura secundaacuteria

87

realizada pelo servidor PSIPRED (httpbioinfcsuclacukpsipred (FIGURA 33)

Esses resultados sugerem que a proteiacutena recombinante possui correto

enovelamento

FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7

FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE TcKAP7

412 Anaacutelise estrutural de TcKAP7

A fim de obter-se a estrutura tridimensional de TcKAP7 por cristalografia de

raios-X foram realizados ensaios de cristalizaccedilatildeoFoi possiacutevel observar a formaccedilatildeo

de um cristal em apenas uma condiccedilatildeo Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000

10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M

A visualizaccedilatildeo atraveacutes de luz ultra-violeta atraveacutes do equipamento Rock

Imager Fomulatrix permitiu identificaacute-lo como cristal de proteiacutena jaacute que este

diferencia-se de cristal de sal pela fluorescecircncia quando excitado em comprimento

de onda de 280 nm

-20

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

200 210 220 230 240 250 260

Ɵ M

RV

x 1

03

(de

g cm

2d

mo

l-1)

Comprimento de onda (nm)

88

O perfil do cristal pode ser visualizado na figura 34 Esse cristal encontra-se

pequeno e mal-formado Aleacutem disso os meacutetodos para a determinaccedilatildeo estrutural de

uma estrutura ineacutedita (sem homologia com estruturas conhecidas) necessitam de

mais de um cristal Dessa forma foram realizados refinamentos dessas condiccedilotildees

iniciais visando aumentar q quantidade de cristais aumentar seu tamanho e

melhorar sua organizaccedilatildeo A concentraccedilatildeo de PEG (5 A 10) e do pH (6 a 9) com

intervalos de 1 unidade foram alterada Entretanto mesmo assim natildeo foi possiacutevel a

obtenccedilatildeo de cristais adequados para a difraccedilatildeo de raios X e novos refinamentos

seratildeo necessaacuterios

FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI LEGENDA AObtenccedilatildeo do cristal de TcKAP7 na condiccedilatildeo de Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000 10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M e B Cristal de TcKAP7 visto sob luz ultravioleta

Uma vez que natildeo foi possiacutevel durante o desenvolvimento desse projeto a

obtenccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica de TcKAP7 procedeu-se com a construccedilatildeo de

seu modelo molecular

A modelagem molecular eacute uma ferramenta que permite a obtenccedilatildeo de

modelos da estrutura tridimensional de uma determinada proteiacutena com base em

homologia sequencial ou estrutural com proteiacutenas cujas estruturas tridimensional

foram experimentalmente resolvidas

Para a construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp

BLUNDELL 1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a

estruturas tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um

modelo baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para

a qual se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura

tridimensional jaacute foi resolvida Nesse caso foram utilizadas estruturas de duas

A B

89

proteiacutenas como molde para a construccedilatildeo da estrutura de TcKAP7 A estrutura da

proteiacutena HMGB1(coacutedigo de acesso no banco de dados de proteiacutenas 2GZK)

(wwwpdborg) para a porccedilatildeo amino-terminal e a estrutura do fator A de transcriccedilatildeo

mitocondrial (coacutedigo de acesso 3TQ6) para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena

(FIGURA 35A) Duas proteiacutenas foram selecionadas para a construccedilatildeo do modelo de

TcKAP7 visto que a similaridade de sequencia entre TcKAP7 e proteiacutenas com

estruturas resolvidas eacute bastante baixo A similaridade sequencial de TcKAP7 e

proteiacutena HMGB1 eacute de 224 e entre TcKAP7 e o fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial

eacute de 264 No entanto ambas proteiacutenas possuem alta similaridade em relaccedilatildeo agrave

estrutura secundaacuteria (mais de 90) Para aumentar a confiabilidade do modelo

utilizamos uma proteiacutena para construir a sequencia N-terminal de TcKAP7

(aminoaacutecidos 1-184) e outra para o C-terminal (aminoaacutecidos 185-248)

A qualidade do modelo pode ser avaliada por exemplo atraveacutes de graacuteficos e

tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de cada aacutetomo constituinte do

modelo Neste trabalho foi utilizado o graacutefico de Ramachandran (FIGURA 35B) nele

pode-se visualizar todas as combinaccedilotildees possiacuteveis de acircngulos dieacutedricos Ψ (psi)

versus os Φ (phi) nos aminoaacutecidos de um polipeptiacutedeo e que contribuem para a

conformaccedilatildeo das estruturas das proteiacutenas (RAMACHANDRAN et al 1963) Dos 230

resiacuteduos apenas 5 estatildeo em regiotildees natildeo permitidas do graacutefico Esse eacute um

excelente valor pois eacute similar ao valor meacutedio encontrado para estruturas

experimentalmente determinadas com resoluccedilatildeo de no miacutenimo 20 Aring

(httpwwwebiacukthornton-srvdatabasesprofunc)

Tambeacutem eacute possiacutevel visualizar a topologia de TcKAP7 (FIGURA 35 C) que

mostra as regiotildees de α-heacutelices e regiotildees de coiled presentes na proteiacutena

corroborando com os dados obtidos na espectroscopia de dicroiacutesmo circular

90

FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP7 LEGENDA AModelo tridimensional de KAP7 B Graacutefico de Ramachandran e C Topologia de TcKAP7

A anaacutelise da superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostra que existem regiotildees

ricas em aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras

proteiacutenas com carga carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos (FIGURA

36)

91

FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE TcKAP7 LEGENDA Visualizaccedilatildeo de diferentes regiotildees de TcKAP7 Vermelho potencial negativo Azul potencial positiva Branco Neutro

413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de

TcKAP7

4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP7

92

A prediccedilatildeo de funccedilatildeo para TcKAP7 foi realizada a partir do enovelamento de

proteiacutenas utilizando o servidor Profunc (httpwwwebiacukthornton-

srvdatabasesprofunc) O objetivo do servidor ProFunc eacute ajudar na identificaccedilatildeo de

uma possiacutevel funccedilatildeo bioquiacutemica de uma proteiacutena a partir da sua estrutura

tridimensional Ele utiliza uma seacuterie de meacutetodos incluindo comparaccedilatildeo de

enovelamento conservaccedilatildeo dos resiacuteduos e modelos 3D funcionais tanto para

identificar provaacuteveis siacutetios ativos da proteiacutena quanto possiacuteveis homoacutelogos no Protein

Data Bank (PDB) Neste procedimento tenta-se ajustar a estrutura da proteiacutena de

interesse aos tipos de enovelamentos de proteiacutenas conhecidas Atualmente mais de

1000 tipos jaacute foram registrados e depositados em bibliotecas de enovelamentos

Sabe-se que o alinhamento estrutural entre proteiacutenas consideradas de uma

mesma famiacutelia mesmo que seja apenas na regiatildeo do siacutetio ativo pode ser um

importante meacutetodo para se inferir a funccedilatildeo da sequecircncia em estudo (LASKOWSKI et

al 2003) A evoluccedilatildeo tende a conservar funccedilotildees que dependem mais diretamente

das estruturas 3D que das similaridades entre as sequecircncias de aminoaacutecidos das

proteiacutenas (SANCHEZ et al 2000)

Neste trabalho as quatro estruturas que possuem maior similaridade

estrutural com TcKAP7 estatildeo depositadas no Protein Data Bank (PDB) com os

coacutedigos 3TQ6 4NOD 3TMM 4NNU Todas as estruturas satildeo referentes agrave proteiacutena

TFAM (fator transcricional A mitocondrial)

As estruturas proteicas foram obtidas no banco de dados puacuteblicos de

proteiacutenas PDB (Protein Data Bank) e submetidas a um alinhamento estrutural com o

modelo de TcKAP7 (FIGURA 35A) no programa WinCoot Esse alinhamento pode

ser visualizado na figura 37 As regiotildees em vermelho representam as regiotildees de

TcKAP7 que apresentam interaccedilatildeo com DNA pois se alinham com as regiotildees de

ligaccedilatildeo agrave DNA das outras proteiacutenas e as regiotildees em azul representam regiotildees sem

homologia com as demais

Esse resultado sugere que TcKAP7 pode interagir com DNA com isso estes

dados podem ser utilizados para nortear mais estudos sobre a interaccedilatildeo das

proteiacutenas KAPrsquos com o DNA do cinetoplasto de T cruzi

93

FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD 3TTM 4NNU E TCKAP7 LEGENDA Em vermelho encontram-se as regiotildees de TcKAP7 que podem interagir com DNA (Resiacuteduos 1-67 e 140-166) e em azul regiotildees sem homologia com as demais

4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA

As prediccedilotildees estruturais sugeriram que a proteiacutena TcKAP7 possui motivos

similares agrave proteiacutenas que interagem com DNA No entanto a sequecircncia de

aminoaacutecidos entre as proteiacutenas eacute bastante baixa Como a funccedilatildeo de TcKAP7

permanece obscura foram realizados alguns ensaios para tentar verificar a

possibilidade desta proteiacutena interagir com kDNA Para isto utilizou-se a teacutecnica de

dicroiacutesmo circular para avaliar se a presenccedila de kDNA poderia resultar em

alteraccedilotildees estruturais em TcKAP7 o que seria uma evidecircncia da possiacutevel interaccedilatildeo

entre esta proteiacutena e o aacutecido nucleico

Foram realizadas medidas de dicroiacutesmo circular com amostras de TcKAP7

kDNA e TcKAP7 na presenccedila de kDNA Para a anaacutelise de dados foi realizado o

somatoacuterio das curvas obtidas com as amostras de TcKAP7 e kDNA separadamente

Este somatoacuterio resultou em uma curva teoacuterica que indica o perfil teoacuterico de uma

amostra contendo TcKAP7 e kDNA sem interaccedilotildees presentes Aacute essa curva foi

sobreposta a curva experimental da medida de dicroiacutesmo circular de TcKAP7 na

94

presenccedila de kDNA A figura 38 ilustra essa sobreposiccedilatildeo onde pode-se verificar que

as curvas natildeo se sobrepotildeem portanto alteraccedilotildees estruturais ocorrem em TcKAP7

na presenccedila de kDNA

FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7 LEGENDA Em azul encontra-se o espectro experimental de TcKap7 na presenccedila de DNA em vermelho o espectro teoacuterico de TcKAP7 e DNA

Para investigar mudanccedilas estruturais associadas a interaccedilatildeo com kDNA foi

realizada uma coleta de dados de SAXS na presenccedila de 1ug de kDNA

A comparaccedilatildeo dos modelos de baixa resoluccedilatildeo por SAXS indica uma

diferenccedila conformacional pontual da proteiacutena na presenccedila de kDNA As figuras 28 e

29 mostram os envelopes da proteiacutena TcKAP7na ausecircncia (FIGURAS 39A e 40A) e

presenccedila de kDNA de T cruzi (FIGURA 39B e FIGURA 40B) Percebe-se uma

diferenccedila de densidade eletrocircnica na regiatildeo da heacutelice (Residuos 140 - 166

evidenciados em vermelho) No envelope de TcKAP7 ela eacute bastante flexiacutevel e natildeo eacute

observada densidade eletrocircnica nessa regiatildeo no entanto na presenccedila de kDNA

essa mesma regiatildeo mostra-se mais riacutegida e eacute possiacutevel estimar seu posicionamento

baseado na densidade eletrocircnica Aleacutem disso essa heacutelice eacute predita como interatora

de DNA com base nas anaacutelises estruturais previamente realizadas nesse trabalho

Esses dados sugerem uma mudanccedila conformacional da proteiacutena na presenccedila

do kDNA fazendo com que esta mude seu arranjo estrutural para permanecer ligada

agrave moleacutecula de DNA sugerindo uma interaccedilatildeo entre TcKAP7 e DNA do cinetoplasto

-22

-17

-12

-7

-2

3

200 210 220 230 240 250 260

ϴM

RW

x 1

03

(de

g cm

-2 d

mo

l-1)


Kap7+DNA

95

de T cruzi Esses dados corroboram com o que foi visto na superfiacutecie eletrostaacutetica

(FIGURA 36) e no alinhamento estrutural (FIGURA 37)

FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXSResiduos 140- 166 evidenciados em vermelho

96

FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DE TcKAP7 VISTO EM DIFERENTES AcircNGULOS LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXS Residuos 140- 166 evidenciados em vermelho

97

5 DISCUSSAtildeO

O Trypanosoma cruzi pertence a um grupo que divergiu muito cedo na

linhagem eucarioacutetica apresentando diversas caracteriacutesticas uacutenicas em relaccedilatildeo a

outros eucariotos Uma dessas caracteriacutesticas eacute a presenccedila de uma mitococircndria

uacutenica ramificada pelo corpo do protozoaacuterio contendo uma regiatildeo especializada o

cinetoplasto onde reside o DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como kDNA O

kDNA eacute composto por uma rede de moleacuteculas interligadas entre si os maxiciacuterculos e

os miniciacuterculos (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Mais de 30 proteiacutenas envolvidas na

replicaccedilatildeo e na manutenccedilatildeo do kDNA jaacute foram identificadas e acredita-se que um

nuacutemero aproximado de 100 proteiacutenas muitas delas presentes apenas em

cinetoplastiacutedeos possam estar envolvidas nesses processos (LIU et al 2005) A

maioria dessas proteiacutenas foi identificada em T brucei e C fasciculata e

possivelmente vaacuterias delas principalmente aquelas envolvidas em replicaccedilatildeo

devem estar codificadas no genoma do T cruzi

Apesar de serem conhecidos muitos dos componentes da maquinaria de

replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos e maxiciacuterculos natildeo se pode dizer o mesmo para as

proteiacutenas envolvidas na manutenccedilatildeo da estrutura do kDNA Com exceccedilatildeo de 4

proteiacutenas com caracteriacutesticas de histonas H1 (KAP1 a 4) encontradas associadas ao

cinetoplasto de C fasciculata pouco ainda eacute conhecido sobre as proteiacutenas que

participam da organizaccedilatildeo do kDNA em outros tripanosomatiacutedeos

Zavala-Castro e colaboradores (2002) identificaram sete proteiacutenas variando

de 19 a 31 kDa associadas ao kDNA de formas epimastigotas de T cruzi a partir

de kDNA extraiacutedo de ceacutelulas fixadas com formaldeiacutedo Os tamanhos observados satildeo

compatiacuteveis com aqueles das KAPs encontradas por Xu e Ray (1993) usando

experimento similar em C fasciculata entretanto nenhuma das possiacuteveis KAPs

descritas por Zavala-Castro e colaboradores foi caracterizada

Noacutes iniciamos estudos objetivando identificar proteiacutenas envolvidas na

organizaccedilatildeo e segregaccedilatildeo do kDNA de T cruzi a partir dos dados fornecidos pelo

sequenciamento do genoma desse parasita fazendo uma comparaccedilatildeo com as

KAPs de C fasciculata Estudos realizados por Cavalcanti e colaboradores (2009)

usando como modelo as sequecircncias de KAPs de C fasciculata identificaram 35

proteiacutenas relacionadas em diferentes tripanosomatiacutedeos cujos genomas estatildeo

sequenciados (11 em T cruzi 7 em L braziliensis 6 em L major e L infantum e 5

98

em T brucei) Essas sequecircncias puderam ser agrupadas em 7 tipos diferentes de

KAPs (KAP1 a 7) Das 7 KAPs T cruzi possui 5 (TcKAP3 a 7) cuja a sintenia

gecircnica eacute uma das caracteriacutesticas marcantes jaacute que alguns genes divergem em

relaccedilatildeo ao tamanho e portanto no tamanho da proteiacutena codificada As KAPs de T

cruzi e T brucei satildeo maiores do que as de C fasciculata e Leishmania spp Isso

pode sugerir que KAPs possam ter evoluiacutedo para um tamanho que comporte

basicamente suas funccedilotildees de associaccedilatildeo com o kDNA de maneira mais eficiente

Os resultados obtidos por Cavalcanti et al (2009) para TcKAP4 e TcKAP6

mostraram que em epimastigotas e amastigotas estas duas proteiacutenas estatildeo

distribuiacutedas ao longo de toda a rede de kDNA consistente com o que foi observado

em C fasciculata (XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) poreacutem CfKAP4 tambeacutem

apresentou um padratildeo de marcaccedilatildeo nos poacutelos opostos do kDNA sugerindo que

essa KAP em particular se associe aos miniciacuterculos receacutem-replicados antes de sua

reintegraccedilatildeo agrave rede de kDNA (XU et al 1996) Contudo em tripomastigotas de T

cruzi estas duas proteiacutenas estatildeo distribuiacutedas na periferia da rede de kDNA

(CAVALCANTI et al 2009) indicando que diferente de C fasciculata elas

apresentam uma dinacircmica de associaccedilatildeo que depende da forma evolutiva do

parasita possivelmente refletindo distintas interaccedilotildees com proteiacutenas da rede de

kDNA em epimastigotas e tripomastigotas No presente trabalho ampliamos o

conhecimento sobre as KAPs de T cruzi estudando o papel da KAP7 na fisiologia

desse parasita

Em C fasciculata a regulaccedilatildeo da expressatildeo de vaacuterios genes que codificam

proteiacutenas mitocondriais ocorre durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia

consenso [(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos

mRNAs (BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998

PASION et al 1996) O mesmo foi observado para L major onde uma sequecircncia

parecida com aquela encontrada em C fasciculata (CATAGA) foi identificada nas

regiotildees 5rsquo e 3rsquo de vaacuterios genes cuja a expressatildeo era maior na fase S do ciclo celular

(ZICK et al 2005) Analisando as regiotildees 5rsquo e 3rsquo do transcrito do gene TOP2 de T

cruzi que codifica a topo II mitocondrial descrito por Fragoso e Goldenberg (1992)

tambeacutem podemos observar a sequecircncia CATAGA repetida duas vezes na regiatildeo

5rsquoUTR e uma vez na regiatildeo 3rsquo-UTR do transcrito desse gene

Como relatamos neste trabalho a sequecircncia da regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito

TcKAP7 natildeo mostrou nenhum elemento com as caracteriacutesticas daquele envolvido na

99

regulaccedilatildeo de genes expressos na fase S do ciclo celular de outros

tripanosomatiacutedeos

Em relaccedilatildeo agrave localizaccedilatildeo de TcKAP7 verificamos atraveacutes de ensaios de

imunofluorescecircncia a distribuiccedilatildeo de TcKAP7 na regiatildeo dos poacutelos da rede de kDNA

das formas epimastigotas de T cruzi poreacutem ainda natildeo analisamos como esta

proteiacutena estaacute distribuiacuteda nas formas tripomastigotas que possuem a rede de kDNA

com formato arredondado e menos compactada

A localizaccedilatildeo de KAP7 na regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi

sugere que ela tenha funccedilotildees na replicaccedilatildeo da rede de kDNA pois nessa regiatildeo

estatildeo concentradas diversas proteiacutenas necessaacuterias para finalizaccedilatildeo do processo de

replicaccedilatildeo de miniciacuterculos

Para a construccedilatildeo do modelo molecular de TcKAP7 foram utilizadas

estruturas de duas proteiacutenas a estrutura da proteiacutena HMGB1 (2GZK) para a porccedilatildeo

amino-terminal e a estrutura da proteiacutena fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial (3TQ6)

para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena ambas apresentam alta similaridade em

relaccedilatildeo agrave estrutura secundaacuteria (mais de 90) e tratam-se de proteiacutenas de um

mesmo grupo HMG (High-mobility group) Em T brucei TbKAP6 uma proteiacutena do

grupo HMG estaacute envolvida na replicaccedilatildeo e manutenccedilatildeo do kDNA (WANG et al

2014) Baseado nesses dados juntamente com os dados da imunofluorescecircncia

indireta pode-se sugerir um papel de TcKAP7 na replicaccedilatildeo da rede de kDNA

Embora ainda natildeo saibamos como KAP7 se associa com o kDNA de T

cruzi eacute possiacutevel que isso ocorra de duas maneiras atraveacutes de ligaccedilotildees

eletrostaacuteticas natildeo-especiacuteficas ou de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos

miniciacuterculos

Atraveacutes de ensaios de SAXS foi possiacutevel perceber que a proteiacutena sofre

alteraccedilotildees conformacionais na presenccedila do kDNA sugerindo sua interaccedilatildeo com

esse aacutecido nucleacuteico Esta interaccedilatildeo pode ser eletrostaacutetica uma vez que a anaacutelise da

superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostrou a predominacircncia de regiotildees ricas em

aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras proteiacutenas

com carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos mais uma vez sugerindo

a interaccedilatildeo com kDNA

Poreacutem natildeo se pode descartar a possibilidade de que a interaccedilatildeo de TcKAP7

com o kDNA seja atraveacutes de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos

Nos tripanosomatiacutedeos a rede de kDNA assume a forma de um disco achatado

100

perpendicular ao flagelo onde os miniciacuterculos estatildeo alinhados em fibrilas orientadas

paralelamente ao eixo do disco (LIU et al 2005) Acredita-se que a ordenaccedilatildeo e

compactaccedilatildeo dos miniciacuterculos estatildeo relacionadas agrave proacutepria estrutura da moleacutecula de

miniciacuterculo Os miniciacuterculos apresentam regiotildees ricas em A+T que podem causar

curvaturas na moleacutecula (MARINI et al 1984 NTAMBI et al 1984) facilitando sua

inserccedilatildeo de forma ordenada no disco de kDNA aleacutem disso possuem regiotildees

conservadas onde estatildeo localizadas as origens de replicaccedilatildeo Essas regiotildees por

sua vez podem ser reconhecidas por proteiacutenas tais como a KAP7 que ajudam a

estabilizar a estrutura Os resultados com C fasciculata mostram que KAP2 3 e 4 se

ligam em regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos ricas em A+T mas que natildeo satildeo

aquelas que geram a curvatura das moleacuteculas (XU et al 1996) Contudo KAP1 se

liga de maneira inespeciacutefica aos miniciacuterculos (HINES amp RAY 1998) Aleacutem disso

existe a sequecircncia universal de miniciacuterculo (UMS) e as proteiacutenas que se ligam a

essa sequecircncia (UMSBP) as quais podem participar de interaccedilotildees com as KAPrsquos

Em C fasciculata CfKAP3 sozinha consegue condensar a rede de kDNA e inibir a

decatenaccedilatildeo pela enzima topo II Poreacutem a interaccedilatildeo entre CfKAP3 e CfUMSBP

pode descondensar a rede de kDNA e reestabelecer a decatenaccedilatildeo mediada pela

topo II indicando que as proteiacutenas KAPrsquos dos tripanosomatiacutedeos podem apresentar

diferentes funccedilotildees em diferentes espeacutecies (KAPELLER et al 2011)

Para investigar a importacircncia de TcKAP7 no T cruzi e seu envolvimento ou

natildeo com o rearranjo topoloacutegico do kDNA durante o processo de diferenciaccedilatildeo do

parasita realizamos a deleccedilatildeo do gene TcKAP7 Nenhuma alteraccedilatildeo estrutural ou

morfoloacutegica na rede de kDNA foi observada no mutante de T cruzi para TcKAP7 Do

mesmo modo o parasita mutante natildeo apresentou perfil de crescimento alterado e

foi capaz de se diferenciar nas formas tripomastigotas metaciacuteclicas e infectar ceacutelulas

VERO onde se diferenciaram em formas amastigotas O mesmo foi visto quando foi

realizado o nocaute do gene TcKAP3 (DE SOUZA et al 2010)

Uma das hipoacuteteses para explicar esse fato eacute que alguma outra KAP de T

cruzi possa estar assumindo o papel da TcKAP7 talvez a TcKAP4 que se localiza

nos poacutelos do cinetoplasto quando da inserccedilatildeo dos miniciacuterculos na rede apoacutes serem

replicados na regiatildeo cinetoflagelar A redundacircncia no papel das KAPs faz com que a

rede de kDNA seja compactada e segregada corretamente mesmo na ausecircncia de

uma delas (DE SOUZA et al 2010) Sabe-se que o nocaute do gene Cfkap2 ou do

gene Cfkap3 separadamente natildeo mostrou nenhuma alteraccedilatildeo no fenoacutetipo de C

101

fasciculata Poreacutem a deleccedilatildeo de ambos os genes causou diversas alteraccedilotildees

aumento nos niacuteveis de mRNAs mitocondriais reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo inibiccedilatildeo da

divisatildeo celular e acuacutemulo de ceacutelulas com morfologias anormais (AVLIYAKULOV et

al 2004)

Com o intuito de complementar os estudos para a caracterizaccedilatildeo do gene

TcKAP7 foram realizados ensaios de RNA de interferecircncia visando analisar a

funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei jaacute que a maquinaria de RNAi em T

cruzi eacute inexistente (DA ROCHA et al 2003) Com isso foi visto que a participaccedilatildeo da

TbKAP7 no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene

TbKAP7 levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita corroborando com os

dados encontrados para TbKAP6 (WANG et al 2014)

Esperamos que o conhecimento das diversas moleacuteculas envolvidas na

organizaccedilatildeo e replicaccedilatildeo da rede de kDNA assim como o entendimento dos

mecanismos fisioloacutegicos que ocorrem nesta estrutura tatildeo peculiar que eacute o

cinetoplasto dos tripanosomatiacutedeos possam nos ajudar a esclarecer vaacuterios aspectos

relacionados a biologia destes eucariotos primitivos e a evoluccedilatildeo do genoma

mitocondrial ao longo do processo evolutivo

102

6 CONCLUSOtildeES

Com base nos resultados observados neste trabalho foi possiacutevel concluir

1 ndash A proteiacutena TcKAP7 eacute uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T

cruzi e possui caracteriacutesticas que a identificam como KAPs do tipo histona H1

incluindo seu tamanho e sua composiccedilatildeo de aminoaacutecidos e sua superfiacutecie

eletrostaacutetica

2 ndash TcKAP7 estaacute localizada nos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi podendo

estar envolvida na replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos

3 - TcKAP7 sofre mudanccedilas conformacionais na presenccedila do kDNA de T

cruzi evidenciando sua interaccedilatildeo com o aacutecido nucleico

4 ndash O mutante de T cruzi para TcKAP7 natildeo apresentou alteraccedilatildeo na

estrutura do cinetoplasto e na morfologia do parasita

5 ndash A proliferaccedilatildeo e a diferenciaccedilatildeo do T cruzi natildeo foram alteradas quando

o parasita teve o gene TcKAP7 deletado do genoma

6 ndash O silenciamento do gene TbKAP7 eacute essencial no metabolismo do T

brucei levando agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita

103

7 REFEREcircNCIAS AGABIAN N Trans splicing of nuclear pre-mRNAs Cell 61 1157-1160 1990 AVLIYAKULOV N K LUKES J amp RAY D S Mitochondrial histone-like DNA-binding proteins are essential for normal cell growth and mitochondrial function in Crithidia fasciculata Eukaryot Cell 3 518-26 2004 BATISTA M MARCHINI F K CELEDON P A FRAGOSO S P PROBST C M PRETI H OZAKI L S BUCK G A GOLDENBERG S KRIEGER M A A high-throughput cloning system for reverse genetics in Trypanosoma cruzi BMC Microbiol v 10 p 259 2010 BELTRAO HDE B P CERRONI MDE D R FREITAS A Y PINTO C VALENTE VDA S A VALENTE G COSTA EDE e J SOBEL Investigation of two outbreaks of suspected oral transmission of acute Chagas disease in the Amazon region Para State Brazil in 2007 Trop Doct v39 n4 Oct p231-2 2009 BENNE R RNA editing in trypanosomes Eur J Biochem 221(1) 9-23 1994 BERRIMAN M GHEDIN E HERTZ-FOWLER C BLANDIN G RENAULD H BARTHOLOMEU D C LENNARD N J CALER E HAMLIN N E HAAS B BOHME U HANNICK L ASLETT M A SHALLOM J MARCELLO L HOU L WICKSTEAD B ALSMARK U C M ARROWSMITH C ATKIN R J BARRON A J BRINGAUD F BROOKS K CARRINGTON M CHEREVACH I CHILLINGWORTH T J CHURCHER C CLARK L N CORTON C H CRONIN A DAVIES R M DOGGETT J DJIKENG A FELDBLYUM T FIELD M C FRASER A GOODHEAD I HANCE Z HARPER D HARRIS B R HAUSER H HOSTETLER J IVENS A JAGELS K JOHNSON D JOHNSON J JONES K KERHORNOU A X KOO H LARKE N LANDFEAR S LARKIN C LEECH V LINE A LORD A MACLEOD A MOONEY P J MOULE S MARTIN D M A MORGAN G W MUNGALL K NORBERTCZAK H ORMOND D PAI G PEACOCK C S PETERSON J QUAIL M A RABBINOWITSCH E RAJANDREAM M A REITTER C SALZBERG S L SANDERS M SCHOBEL S SHARP S SIMMONDS M SIMPSON A J TALLON L TURNER C M R TAIT A TIVEY A R VAN AKEN S WALKER D WANLESS D WANG S WHITE B WHITE O WHITEHEAD S WOODWARD J WORTMAN J ADAMS M D EMBLEY T M GULL K ULLU E BARRY J D FAIRLAMB A H OPPERDOES F BARRELL B G DONELSON J E HALL N FRASER C M MELVILLE SE EL-SAYED N M The Genome of the African Trypanosome Trypanosoma brucei Science 309 (5733) 416-422 2005

104

BIRKENMEYER L amp RAY D S Replication of kinetoplast DNA in isolated kinetoplasts from Crithidia fasciculata J Biol Chem 261 2362ndash2368 1986 BIRKENMEYER L SUGISAKI H RAY D S Structural characterization of site-specific discontinuities associated with replication origins of minicircle DNA from Crithidia fasciculata J Biol Chem 262 2384ndash2392 1987 BONALDO M C SOUTO-PADRON T DE SOUZA W GOLDENBERG S Cell-substrate adhesion during Trypanosoma cruzi differentiation J Cell Biol 106 1349-1358 1988 BOUCHER N WU Y DUMAS C DUBEacute M SERENO D BRETON M PAPADOPOULOU B A common mechanism of stage-regulated gene expression in Leishmania mediated by a conserved 3rsquo-untranslated region element J Biol Chem 277(19) 511-520 2002 BRENER Z ANDRADE Z A BARRAL-NETO M Trypanosoma cruzi e Doenccedila de Chagas Ed Guanabara Koogan 2ordf ediccedilatildeo 2000 BROWN L M amp RAY D S Cell cycle regulation of RPA1 transcript levels in the trypanosomatid Crithidia fasciculata Nucleic Acids Res 25 3281ndash3289 1997

CAMARGO E P Growth and differentiation in Trypanosoma cruzi Origin of metacyclic trypomastigotes in liquid media Rev Inst Med Trop Satildeo Paulo 6 93-100 1964 CAMPBELL D A THOMAS S STURN N Transcription in kinetoplastid protozoa why be normal Microbes Infect 5 1231-1240 2003 CAVALCANTI D P THIRY M DE SOUZA W amp MOTTA M C The kinetoplast ultrastructural organization of endosymbiont-bearing trypanosomatids as revealed by deep-etching cytochemical and immunocytochemical analysis Histochem Cell Biol 130(6)1177-85 2008 CAVALCANTI D P SHIMADA M K PROBST C M SOUTO-PADRON T C B S DE SOUZA W GOLDENBERG S FRAGOSO S P MOTTA M C M Expression and subcellular localization of kinetoplast-associated proteins in the different developmental stages of Trypanosoma cruzi BMC Microbiol 9 120 2009

105

CLAYTON C E Life without transcriptional control From fly to man and back again EMBO J 21 1881-1888 2002 CONTRERAS V T SALLES J M THOMAS N MOREL C M GOLDENBERG S In vitro differentiation of Trypanosoma cruzi under chemically defined conditions Mol Biochem Parasitol 16 315-327 1985 CONTRERAS V T ARAUJO-JORGE T C BONALDO M C THOMAS N BARBOSA H S MEIRELLES M N L GOLDENBERG S Biological aspects of the DM 28C clone of Trypanosoma cruzi after metacyclogenesis in chemically defined media Mem Inst Oswaldo Cruz 83 123-133 1988 COSGROVE W B amp SKEEN M J The cell cycle in Crithidia fasciculata Temporal relationships between synthesis of deoxyribonucleic acid in the nucleus and in the kinetoplast J Protozool May17(2)172-7 1970 DA ROCHA W OTSU K TEIXEIRA S M R DONELSON J E Tests of cytoplasmic RNA interference (RNAi) and construction of a tetracycline-inducible T7 promoter system in Trypanosoma cruzi Mol Biochem Parasitol v 133 n 2 p 175-186 2003 DE SOUZA F S RAMPAZZO R DE C MANHAES L SOARES M J CAVALCANTI D P KRIEGER M A GOLDENBERG S amp FRAGOSO S P Knockout of the gene encoding the kinetoplast-associated protein 3 (KAP3) in Trypanosoma cruzi effect on kinetoplast organization cell proliferation and differentiation Mol Biochem Parasitol 172(2) 90-98 2010 DE SOUZA W amp SOUTO-PADRON W The paraxial structure of the flagellum of trypanosomatidae J Parasitol 66(2) 229-236 1980 DE SOUZA W Cell biology of Trypanosoma cruzi Int Rev Cytol 86 197-283 1984 DE SOUZA W O parasito e sua interaccedilatildeo com os hospedeiros In Trypanosoma cruzi e a doenccedila de Chagas Guanabara Koogan Rio de Janeiro 75-86 1999 DE SOUZA W Basic cell biology of Trypanosoma cruzi Current Pharmaceutical Design 8 269-285 2002

106

DE SOUZA W SANTANNA C CUNHA-E-SILVA N L Electron microscopy and cytochemistry analysis of the endocytic pathway of pathogenic protozoa Prog Histochem Cytochem v 44 n 2 p 67-124 2009 DE SOUZA W Meacutetodos morfoloacutegicos Disponiacutevel em lthttpwwwfiocruzbrchagascgicgiluaexesysstarthtmsid=12gt Acesso em 18012015 DIAS E LARANJA F S MIRANDA A amp NOBREGA G Chagas disease a clinical epidemiologic and pathologic study Circulation v14 n 6 p1035-60 1956 DIAS J C P Epidemiologia Em Trypanosoma cruzi e a Doenccedila de Chagas Zigman Brener Zilton Andrade Manoel Barral-Neto 2 ed Rio de Janeiro Editora Guanabara Koogan 2000 DOCAMPO R DE SOUZA W MIRANDA K ROHLOFF P MORENO S N Acidocalcisomes ndash conserved from bacteria to man Nat Rev Microbiol 3 251-261 2005 EL-SAYED N M MYLER P J BARTHOLOMEU D C NILSSON D AGGARWAL G TRAN A N GHEDIN E WORTHEY E A DELCHER A L BLANDIN G WESTENBERGER S J CALER E CERQUEIRA G C BRANCHE C HAAS B ANUPAMA A ARNER E ASLUND L ATTIPOE P BONTEMPI E BRINGAUD F BURTON P CADAG E CAMPBELL D A CARRINGTON M CRABTREE J DARBAN H DA SILVEIRA J F DE JONG P EDWARDS K ENGLUND P T FAZELINA G FELDBLYUM T FERELLA M FRASCH A C GULL K HORN D HOU L HUANG Y KINDLUND E KLINGBEIL M KLUGE S KOO H LACERDA D LEVIN M J LORENZI H LOUIE T MACHADO C R MCCULLOCH R MCKENNA A MIZUNO Y MOTTRAM J C NELSON S OCHAYA S OSOEGAWA K PAI G PARSONS M PENTONY M PETTERSSON U POP M RAMIREZ J L RINTA J ROBERTSON L SALZBERG S L SANCHEZ D O SEYLER A SHARMA R SHETTY J SIMPSON A J SISK E TAMMI M T TARLETON R TEIXEIRA S VAN AKEN S VOGT C WARD P N WICKSTEAD B WORTMAN J WHITE O FRASER C M STUART K D ANDERSSON B The genome sequence of Trypanosoma cruzi etiologic agent of Chagas disease Science 309(5733) 409-415 2005 ESTEacuteVEZ A M amp SIMPSON L Uridine insertiondeletion RNA editing in trypanosome mitochondria--a review Gene 240(2) 247-60 1999

107

FIELD M C amp CARRINGTON M The trypanosome flagellar pocket Nature Reviews Microbiology 7 775ndash786 2009 FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA S PARIS Z STURM N R CAMPBELL D A LUKES J The Trypanosoma brucei La protein is a candidate poly(U) shield that impacts spliced leader RNA maturation and tRNA intron removal Int J Parasitol 35(4) 359-66 2005 FRAGOSO S P amp GOLDENBERG S Cloning and characterization of the gene encoding Trypanosoma cruzi DNA topoisomerase II Mol Biochem Parasitol 55 127-34 1992 GILLINGER G amp BELLOFATTO V Trypanosome spliced leader RNA genes contains the first identified RNA polymerase II promoter in these organisms Nucleic Acids Res 29 1556-1564 2001 GLUENZ E SHAW M K GULL K Structural asymmetry and discrete nucleic acid subdomains in the Trypanosoma brucei kinetoplast Mol Microbiol 64(6) 1529-1539 2007 GOLDENBERG S CONTRERAS V T SALLES J M BONALDO M C LIMA FRANCO M P A LINSS J LAFAILLE J VALLE D MOREL C M Facts and hypothesis on Trypanosoma cruzi differentiation Mem Inst Oswaldo Cruz 79 39-44 1985 GULL K The cytoskeleton of trypanosomatid Annu Rev Microbiol 53 629-655 1999 HANNAERT V BRINGAUD F OPPERDOES F R MICHELS P A Evolution of energy metabolism and its compartmentation in Kinetoplastida Kinetoplasttid Biol Dis 2(1) 11 2003 HINES J C amp RAY D S The Crithidia fasciculata KAP1 gene encondes a highly basic protein associated with kinetoplast DNA Mol Biochem Parasitol 94 41-52 1998 HINES J C amp RAY D S Structure of discontinuities in kinetoplast DNA-associated minicircles during S phase in Crithidia fasciculata Nucleic Acids Res 36(2) 444ndash450 2008

108

HOARE C A [Rationalization of the terminology for the developmental stages of trypanosomatid flagellates] Med Parazitol (Mosk) v40 n3 May-Jun p307-9 1971 IVENS A C PEACOCK C S WORTHEY E A MURPHY L AGGARWAL G BERRIMAN M SISK E RAJANDREAM M A ADLEM E AERT R ANUPAMA A APOSTOLOU Z ATTIPOE P BASON N BAUSER C BECK A BEVERLEY S M BIANCHETTIN G BORZYM K BOTHE G BRUSCHI C V COLLINS M CADAG E CIARLONI L CLAYTON C COULSON R M CRONIN A CRUZ A K DAVIES R M DE GAUDENZI J DOBSON D E DUESTERHOEFT A FAZELINA G FOSKER N FRASCH A C FRASER A FUCHS M GABEL C GOBLE A GOFFEAU A HARRIS D HERTZ-FOWLER C HILBERT H HORN D HUANG Y KLAGES S KNIGHTS A KUBE M LARKE N LITVIN L LORD A LOUIE T MARRA M MASUY D MATTHEWS K MICHAELI S MOTTRAM J C MULLER-AUER S MUNDEN H NELSON S NORBERTCZAK H OLIVER K ONEIL S PENTONY M POHL T M PRICE C PURNELLE B QUAIL M A RABBINOWITSCH E REINHARDT R RIEGER M RINTA J ROBBEN J ROBERTSON L RUIZ J C RUTTER S SAUNDERS D SCHAFER M SCHEIN J SCHWARTZ D C SEEGER K SEYLER A SHARP S SHIN H SIVAM D SQUARES R SQUARES S TOSATO V VOGT C VOLCKAERT G WAMBUTT R WARREN T WEDLER H WOODWARD J ZHOU S ZIMMERMANN W SMITH D F BLACKWELL J M STUART K D BARRELL B AND MYLER P J The genome of the kinetoplastid parasite Leishmania major Science 309 (5733) 436-442 2005 KAPELLER I MILMAN N YAFFE N amp SHLOMAI J Interactions of a replication initiator with histone H1-like proteins remodel the condensed mitochondrial genome J Biol Chem 286(47) 40566-74 2011 KOZIN M B amp SVERGUN D I Automated matching of high- and low-resolution structural models J Appl Cryst 34 33-41 2001 KLINGBEIL M M DREW M E LIU Y MORRIS J C MOTYKA S A SAXOWSKY T T WANG Z ENGLUND P T Unlocking the secrets of trypanosome kinetoplast DNA network replication Protist Dec152(4)255-62 2001 LAIRD P W Trans splicing in trypanosomes - archaism or adaptation Trends Genet 5(7) 204-208 1989 LASKOWSKI R A et al From protein structure to biochemical function Journal of Structural and Functional Genomics 4 167-177 2003

109

LEBOWITZ J H SMITH H Q RUSCHE L BEVERLEY S M Coupling of poly(A) site selection and trans-splicing in Leishmania Genes Dev 7 996ndash1007 1993 LENZI H L D N OLIVEIRA M T LIMA amp C R GATTASS Trypanosoma cruzi paninfectivity of CL strain during murine acute infection Exp Parasitol v84 n1 Oct p16-27 1996 LEVINE N D CORLISS J O COX F E DEROUX G GRAIN J HONIGBERG B M LEEDALE G F LOEBLICH A R LOM J LYNN D MERINFELD E G PAGE F C POLJANSKY G SPRAGUE V VAVRA J amp WALLACE F G A newly revised classification of the protozoa J Protozool 27 (1) p37-58 1980 LIU B LIU Y MOTYKA S A AGBO E E C ENGLUND P T Fellowship of the rings the replication of kinetoplast DNA Trends Parasitol 21 363-369 2005 LUKES J HINES J C EVANS C J AVLIYAKULOV N K PRABHU V P CHEN J amp RAY D S Disruption of the Crithidia fasciculata KAP 1 gene results in structural rearrangement of the kinetoplast disc Mol Biochem Parasitol 117 179-186 2001 MAA Y F amp HSU C C Performance of sonication and microfluidization for liquid-liquid emulsification Pharm Dev Technol (2) 233-40 1999 MACRAE J I OBADO S O TURNOCK D C ROPER J R KIERANS M KELLY J M FERGUSON M A The suppression of galactose metabolism in Trypanosoma cruzi epimastigotes causes changes in cell surface molecular architecture and cell morphology Mol Biochem Parasitol 147 (1) p 126-36 2006 MADISON-ANTENUCCI S GRAMS J HAJDUK S L Editing machines The complexities of trypanosome RNA editing Cell 108 435-438 2002 MAHMOOD R amp RAY D S Nuclear extracts of Crithidia fasciculata contain factors that bind to the 5_ untranslated regions of TOP2 and RPA1 mRNAs containing sequences required for their cell cycle regulation J Biol Chem 273 23729ndash23734 1998

110

MAHMOOD R HINES J C RAY D S Identification of cis and trans elements involved in the cell cycle regulation of multiple genes in Crithidia fasciculata Mol Cell Biol 19 6174ndash6182 1999 MAIER D FARR C L POECKB ALAHARI A VOGEL M FISCHER S KAGUNIL S amp SCHNEUWLY S Mitochondrial single-stranded DNA-binding protein is required for mitochondrial DNA replication and development in Drosophila melanogaster Mol Biol Cell 12821ndash830 2001 MAIR G SHI H LI H DJIKENG A AVILES H O BISHOP J R FALCONE F H GAVRILESCU C MONTGOMERY J L SANTORI M I STERN L S WANG Z ULLU E TSCHUDI C A new twist in trypanosome RNA metabolism cis-splicing of pre-mRNA RNA 6(2) 163-169 2000 MARINI J C EFFRON P N GOODMAN T C SINGLETON C K WELLS R D WARTELL R M ENGLUND P T Physical characterization of a kinetoplast DNA fragment with unusual properties J Biol Chem 259(14) 8974-8979 1984 MATTHEWS K R TSCHUI C ULLU E A common pirimidine rich motif governs trans-splicing and polyadenylation of tubulin polycistronic pre-mRNA in trypanosomes Genes Dev 8 491-501 1994 McCARTHY-BURKE C TAYLOR Z A BUCK G A Characterization of the spliced leader genes and transcripts in Trypanosoma cruzi Gene 82(1) 177-89 1989 MEDINA-ACOSTA E amp CROSS G A Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple mini-prep procedure Mol Biochem Parasitol 59 327-329 1993 MOREL C CHIARI E CAMARGO E MATTEI D ROMANHA A SIMPSON L Strains and clones of Trypanosoma cruzi can be characterized by restriction endonuclease fingerprinting of kinetoplast DNA minicircles Proc Natl Acad Sci USA 77 6810-6814 1980 NILSEN T W Trans-splicing in protozoa and helminths Infect Agents Dis 1(4) 212-218 1992 NTAMBI J M MARINI J C BANGS J D HAJDUK S L JIMINEZ H E KITCHIN P A KLEIN V A RYAN K A ENGLUND P T Presence of a bent

111

helix in fragments of kinetoplast DNA minicircles from several trypanosomatid species Mol Biochem Parasitol 12(3) 273-286 1984 OGBADOYI E O ROBINSON D R GULL K A high-order trans-membrane structural linkage is responsible for mitochondrial genome positioning and segregation by flagellar basal bodies in trypanosomes Mol Biol Cell (5)1769-79 2003 ONN I KAPELLER I ABU-ELNEEL K SHLOMAI J Binding of the universal minicircle sequence binding protein at the kinetoplast DNA replication orign J Biol Chem 281(49) 37468-37476 2006 PASION S G HINES J C OU X MAHMOOD R RAY D S Sequences within the 5_ untranslated region regulate the levels of a kinetoplast DNA topoisomerase mRNA during the cell cycle Mol Cell Biol 16 6724ndash6735 1996 PEACOCK C S SEEGER K HARRIS D MURPHY L RUIZ J C QUAIL M A PETERS N ADLEM E TIVEY A ASLETT M KERHORNOU A IVENS A FRASER A RAJANDREAM M A CARVER T NORBERTCZAK H CHILLINGWORTH T HANCE Z JAGELS K MOULE S ORMOND D RUTTER S SQUARES R WHITEHEAD S RABBINOWITSCH E ARROWSMITH C WHITE B THURSTON S BRINGAUD F BALDAUF S L FAULCONBRIDGE A JEFFARES D DEPLEDGE D P OYOLA S O HILLEY J D BRITO L O TOSI L R BARRELL B CRUZ A K MOTTRAM J C SMITH D F BERRIMAN M Comparative genomic analysis of three Leishmania species that cause diverse human disease Nat Genet 39(7) 839-47 2007 PORTO-CARREIRO I ATTIAS M MIRANDA K DE SOUZA W CUNHA-E-SILVA N Trypanosoma cruzi epimastigote endocytic pathway cargo enters the cytostome and passes through an early endosomal network before storage in reservosomes Eur J Cell Biol 79 858-869 2000 POVELONES M L Beyond replication division and segregation of mitochondrial DNA in kinetoplastids Mol Biochem Parasitol 196(1) 53-60 2014 RAMACHANDRAN G N RAMAKRISHNAN C amp SASISEKHARAN V Stereochemistry of polypeptide chain configurations J Mol Biol 7 95ndash9 1963 RAY D S Conserved sequence blocks in kinetoplast minicircles from diverse species of trypanosomes Mol Cell Biol 9 1365ndash1367 1989

112

REDMOND S VADIVELU J FIELD M C RNAit an automated web-based tool for the selection of RNAi targets in Trypanosoma brucei Mol Biochem Parasitol v 128 p 115ndash118 2003 ROY CHOWDHURY A BAKSHI R WANG J YILDIRIR G LIU B PAPPAS-BROWN V TOLUN G GRIFFITH J D SHAPIRO T A JENSEN R E ENGLUND P T The killing of African trypanosomes by ethidium bromide PLoS Pathog (12) e1001226 2010 SALI A amp BLUNDELL T L Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints J Mol Biol 234(3) 779-815 1993 SAMBROOK J FRITSHC EF MANIATIS T Molecular Cloning A laboratory manual Cold Spring Harbor NY USA 1989 SANCHEZ R et al Protein structure modeling for structural genomics Nature Structural Biology 7 986-990 2000 SHAPIRO T A amp ENGLUND P T The structure and replication of kinetoplast DNA Annu Rev Microbiol 49 117-143 1995 SHLOMAI J Assembly of kinetoplast DNA Parasitol Today 10 341-346 1994 SIMPSON L SBICEGO S APHASIZHEV R Uridine insertiondeletion RNA editing in trypanosome mitochondria a complex business RNA 9 265ndash276 2003 SOARES MJ SOUTO-PADROacuteN T DE SOUZA W Identification of a large prelysosomal compartment in the pathogenic protozoon Trypanosoma cruzi J Cell Sci 102(1) 157-167 1992 SOARES MJ The reservosome of Trypanosoma cruzi epimastigotes an organelle of the endocytic pathway with a role on metacyclogenesis Memoacuterias do Instituto Oswaldo Cruz 94(1) 139-141 1999 SOUSA M A A simple method to purify biologically and antigenically preserved bloodstream trypomastigotes of Trypanosoma cruzi using Deae-cellulose columns Mem Inst Oswaldo Cruz 78(3) 317-333 1983

113

STEINDEL M KRAMER PACHECO L SCHOLL D SOARES M DE MORAES M H EGER I KOSMANN C SINCERO T C STOCO P H MURTA S M DE CARVALHO-PINTO C J GRISARD E C Characterization of Trypanosoma cruzi isolated from humans vectors and animal reservoirs following an outbreak of acute human Chagas disease in Santa Catarina State Brazil Diagn Microbiol Infect Dis 60(1)25-32 2008 STUART K FEAGIN J E ABRAHAM J M RNA editing the creation of nucleotide sequences in mRNAmdasha minireview Gene 82 155ndash160 1989 STUART K RNA editing in trypanosomatid mitochondria Annu Rev Microbiol 45 327-344 1991 STUART KD SCHNAUFER A ERNST NL PANIGRAHI AK Complex management RNA editing in trypanosomes Trends Biochem Sci 30(2) 97-105 2005 SVERGUN D I Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria J Appl Crystallogr 25 495-503 1992 SVERGUN D I Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing Biophys J 76(6) 2879-86 1999 SVERGUN D I PETOUKHOV M V amp KOCH M H Determination of domain structure of proteins from X-ray solution scattering Biophys J 80(6) 2946-53 2011 TANOWITZ H B L V KIRCHHOFF D SIMON S A MORRIS L M WEISS amp M WITTNER Chagas disease Clin Microbiol Rev v5 n4 Oct p400-19 1992 TOWBIN H STAEHLIN T BORDON J Electrophoretic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad USA 76 4350-4354 1979 ULLU E amp TSCHUDI C Trans splicing in trypanosomes requires methylation of the 5 end of the spliced leader RNA Proc Natl Acad Sci USA 88(22) 10074-10078 1991

114

ULLU E DJIKENG A SHI H TSCHUDI C RNA interference advances and questions Phil Trans R Soc Lond B 357 65ndash70 2002 VANHAMME L amp PAYS E Control of Gene Expression in Trypanosomes Microbiol Rev 59(2) 223ndash240 1995 WANG J PAPPAS-BROWN V ENGLUND P T amp JENSEN R E TbKAP6 a mitochondrial HMG box-containing protein in Trypanosoma brucei is the first trypanosomatid kinetoplast associated protein essential for kinetoplast DNA replication and maintenance Eukaryot Cell 13(7)919-32 2014 WICKSTEAD B ERSFELD K GULL K Targeting of a tetracycline-inducible expression system to the transcriptionally silent minichromosomes of Trypanosoma brucei Mol Biochem Parasitol v 125 p211ndash216 2002 WIRTZ E LEAL S OCHATT C CROSS G A A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei Mol Biochem Parasitol 99 89ndash101 1999 WOODWARD R amp GULL K Timing of nuclear and kinetoplast DNA replication and early morphological events in the cell cycle of Trypanosoma brucei J Cell Sci Jan95 ( Pt 1)49-57 1990 XU C amp RAY D S Isolation of proteins associated with kinetoplast DNA networks in vivo Proc Natl Acad Sci USA 90 1786-1789 1993 XU C W HINES J C ENGEL M L RUSSEL D G RAY D S Nucleus-encoded histone H1-like proteins are associated with kinetoplast DNA in the trypanosomatid Crithidia fasciculata Mol Cell Biol 16 564-576 1996 ZAVALA-CASTRO J E ACOSTA-VIANA K BAYLON-PACHECO L GONZAacuteLEZ-ROBLES A GUZMAacuteN-MARIacuteN E ROSALES-ENCINA J L Kinetoplast DNA-binding protein profile in the epimastigote form of Trypanosoma cruzi Arch Med Res 33(3)250-256 2002 ZICK A ONN I BEZALEL R MARGALIT H SHLOMAI J Assigning functions to genes identification of S-phase expressed genes in Leishmania major based on post-transcriptional control elements Nucleic Acids Res 33 4235-4242 2005

115

ZINGALES B PEREIRA M E OLIVEIRA R P ALMEIDA K A UMEZAWA E S SOUTO R P VARGAS N CANO M I DA SILVEIRA J F NEHME N S MOREL C M BRENER Z MACEDO A Trypanosoma cruzi genome project biological characteristics and molecular typing of clone CL Brener Acta Trop 68(2) 159-173 1997 ZWIERZYNSKI T A amp BUCK G A RNA-protein complexes mediate in vitro capping of the spliced-leader primary transcript and U-RNAs in Trypanosoma cruzi Proc Natl Acad Sci USA 88(13) 5626-5630 1991

FLAacuteVIA SOUZA MORINI



Tese apresentada ao Curso de Poacutes Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular Departamento de Biologia Celular Setor de Ciecircncias Bioloacutegicas Universidade Federal do Paranaacute como requisito parcial agrave obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutora em Biologia Celular e Molecular Orientador Dr Stenio Perdigatildeo Fragoso

CURITIBA

2015
























Amo vocecircs

AGRADECIMENTOS
















Obrigada






adoro vocecircs















ajudar e ensinar




amizade






Valeu galera






(Isaac Newton)

RESUMO






























ABSTRACT



























LISTA DE FIGURAS





































LISTA DE TABELAS






SUMAacuteRIO




18































19





















20








SOUZA 1984)





21












triatomiacutedeo














DE SOUZA 1984 1999 2002)

22






23























1999)












24









et al 2005)
























25







2007)


























26








1989)














16 O cinetoplasto





flagelo

17 A rede de kDNA




27
















28



























(FIGURA 6)

29











30












31










ENGLUND 1995)























32




2005)










33



































34




2004)
















35

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL







estrutural




36



311 Reagentes





Cult-lab RPMI 1640

















glicose 555 mM


80

37


bovina)









mercaptoetanol 5 mM








bovino 02



6X e SDS 1










X-100 4



38




SDS 01



mM e metanol 20











mM pH 60






metaciacuteclico

321 Epimastigotas




39






























40




























41




























colocircnia


42
































43





























44






















45



30 min a 4 degC














alta pressatildeo

Micro-canais


46




























47






al 1973)























cd

MRWobs

10][

48































49











western blot









suave










50




















KAP7GtwFor (5rsquo-





51

































52































53



TcKAP7





TcKAP7
















54



















55















56







cada uma






















57








UPS-NEO-DOWN






















58










UPS-HIGRO-DOWN





















59







]-dCTP (10




fabricante











a ndash70 C












60








DMI6000











900












61





























62








63








GENE TbKAP7

KAP7RNAiF


KAP7RNAiR

















e trecircs semanas

64









65

4 RESULTADOS





37









Dm28c



66










sequenciado


67









68

















69

A

B









70











o kDNA do parasita

71















72




























(pb)

1 KAP7F + KAP7R 747

2 NEOF + NEOR 795

73


4 EXTF + NEOR 1410


6 NEOF + EXTR 1358


74








tipo Southern blot















75



76












cruzi para TcKAP7






77



















78


79


TcKAP7

















80
















81























82


brucei












37 oC




83


PAGE (Figura 28B)












84


29)









85








de luz (DLS)













0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

M

assa

Rh (nm)

fr80

fr82

fr84

fr85

86





31)









87



enovelamento











de onda de 280 nm

-20

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

200 210 220 230 240 250 260

Ɵ M

RV

x 1

03

(de

g cm

2d

mo

l-1)


88
























A B

89


























90





36)

91



TcKAP7


92































93

















94




















-22

-17

-12

-7

-2

3

200 210 220 230 240 250 260

ϴM

RW

x 1

03

(de

g cm

-2 d

mo

l-1)


Kap7+DNA

95




96


97

5 DISCUSSAtildeO

































98





















desse parasita














99
























miniciacuterculos











100



































101




al 2004)














102

6 CONCLUSOtildeES





eletrostaacutetica











103


104



105


106


107


108


109


110


111


112


113


114


115

























Amo vocecircs

AGRADECIMENTOS
















Obrigada






adoro vocecircs















ajudar e ensinar




amizade






Valeu galera






(Isaac Newton)

RESUMO






























ABSTRACT



























LISTA DE FIGURAS





































LISTA DE TABELAS






SUMAacuteRIO




18































19





















20








SOUZA 1984)





21












triatomiacutedeo














DE SOUZA 1984 1999 2002)

22






23























1999)












24









et al 2005)
























25







2007)


























26








1989)














16 O cinetoplasto





flagelo

17 A rede de kDNA




27
















28



























(FIGURA 6)

29











30












31










ENGLUND 1995)























32




2005)










33



































34




2004)
















35

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL







estrutural




36



311 Reagentes





Cult-lab RPMI 1640

















glicose 555 mM


80

37


bovina)









mercaptoetanol 5 mM








bovino 02



6X e SDS 1










X-100 4



38




SDS 01



mM e metanol 20











mM pH 60






metaciacuteclico

321 Epimastigotas




39






























40




























41




























colocircnia


42
































43





























44






















45



30 min a 4 degC














alta pressatildeo

Micro-canais


46




























47






al 1973)























cd

MRWobs

10][

48































49











western blot









suave










50




















KAP7GtwFor (5rsquo-





51

































52































53



TcKAP7





TcKAP7
















54



















55















56







cada uma






















57








UPS-NEO-DOWN






















58










UPS-HIGRO-DOWN





















59







]-dCTP (10




fabricante











a ndash70 C












60








DMI6000











900












61





























62








63








GENE TbKAP7

KAP7RNAiF


KAP7RNAiR

















e trecircs semanas

64









65

4 RESULTADOS





37









Dm28c



66










sequenciado


67









68

















69

A

B









70











o kDNA do parasita

71















72




























(pb)

1 KAP7F + KAP7R 747

2 NEOF + NEOR 795

73


4 EXTF + NEOR 1410


6 NEOF + EXTR 1358


74








tipo Southern blot















75



76












cruzi para TcKAP7






77



















78


79


TcKAP7

















80
















81























82


brucei












37 oC




83


PAGE (Figura 28B)












84


29)









85








de luz (DLS)













0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

M

assa

Rh (nm)

fr80

fr82

fr84

fr85

86





31)









87



enovelamento











de onda de 280 nm

-20

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

200 210 220 230 240 250 260

Ɵ M

RV

x 1

03

(de

g cm

2d

mo

l-1)


88
























A B

89


























90





36)

91



TcKAP7


92































93

















94




















-22

-17

-12

-7

-2

3

200 210 220 230 240 250 260

ϴM

RW

x 1

03

(de

g cm

-2 d

mo

l-1)


Kap7+DNA

95




96


97

5 DISCUSSAtildeO

































98





















desse parasita














99
























miniciacuterculos











100



































101




al 2004)














102

6 CONCLUSOtildeES





eletrostaacutetica











103


104



105


106


107


108


109


110


111


112


113


114


115
















Amo vocecircs

AGRADECIMENTOS
















Obrigada






adoro vocecircs















ajudar e ensinar




amizade






Valeu galera






(Isaac Newton)

RESUMO






























ABSTRACT



























LISTA DE FIGURAS





































LISTA DE TABELAS






SUMAacuteRIO




18































19





















20








SOUZA 1984)





21












triatomiacutedeo














DE SOUZA 1984 1999 2002)

22






23























1999)












24









et al 2005)
























25







2007)


























26








1989)














16 O cinetoplasto





flagelo

17 A rede de kDNA




27
















28



























(FIGURA 6)

29











30












31










ENGLUND 1995)























32




2005)










33



































34




2004)
















35

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL







estrutural




36



311 Reagentes





Cult-lab RPMI 1640

















glicose 555 mM


80

37


bovina)









mercaptoetanol 5 mM








bovino 02



6X e SDS 1










X-100 4



38




SDS 01



mM e metanol 20











mM pH 60






metaciacuteclico

321 Epimastigotas




39






























40




























41




























colocircnia


42
































43





























44






















45



30 min a 4 degC














alta pressatildeo

Micro-canais


46




























47






al 1973)























cd

MRWobs

10][

48































49











western blot









suave










50




















KAP7GtwFor (5rsquo-





51

































52































53



TcKAP7





TcKAP7
















54



















55















56







cada uma






















57








UPS-NEO-DOWN






















58










UPS-HIGRO-DOWN





















59







]-dCTP (10




fabricante











a ndash70 C












60








DMI6000











900












61





























62








63








GENE TbKAP7

KAP7RNAiF


KAP7RNAiR

















e trecircs semanas

64









65

4 RESULTADOS





37









Dm28c



66










sequenciado


67









68

















69

A

B









70











o kDNA do parasita

71















72




























(pb)

1 KAP7F + KAP7R 747

2 NEOF + NEOR 795

73


4 EXTF + NEOR 1410


6 NEOF + EXTR 1358


74








tipo Southern blot















75



76












cruzi para TcKAP7






77



















78


79


TcKAP7

















80
















81























82


brucei












37 oC




83


PAGE (Figura 28B)












84


29)









85








de luz (DLS)













0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

M

assa

Rh (nm)

fr80

fr82

fr84

fr85

86





31)









87



enovelamento











de onda de 280 nm

-20

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

200 210 220 230 240 250 260

Ɵ M

RV

x 1

03

(de

g cm

2d

mo

l-1)


88
























A B

89


























90





36)

91



TcKAP7


92































93

















94




















-22

-17

-12

-7

-2

3

200 210 220 230 240 250 260

ϴM

RW

x 1

03

(de

g cm

-2 d

mo

l-1)


Kap7+DNA

95




96


97

5 DISCUSSAtildeO

































98





















desse parasita














99
























miniciacuterculos











100



































101




al 2004)














102

6 CONCLUSOtildeES





eletrostaacutetica











103


104



105


106


107


108


109


110


111


112


113


114


115









Amo vocecircs

AGRADECIMENTOS
















Obrigada






adoro vocecircs















ajudar e ensinar




amizade






Valeu galera






(Isaac Newton)

RESUMO






























ABSTRACT



























LISTA DE FIGURAS





































LISTA DE TABELAS






SUMAacuteRIO




18































19





















20








SOUZA 1984)





21












triatomiacutedeo














DE SOUZA 1984 1999 2002)

22






23























1999)












24









et al 2005)
























25







2007)


























26








1989)














16 O cinetoplasto





flagelo

17 A rede de kDNA




27
















28



























(FIGURA 6)

29











30












31










ENGLUND 1995)























32




2005)










33



































34




2004)
















35

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL







estrutural




36



311 Reagentes





Cult-lab RPMI 1640

















glicose 555 mM


80

37


bovina)









mercaptoetanol 5 mM








bovino 02



6X e SDS 1










X-100 4



38




SDS 01



mM e metanol 20











mM pH 60






metaciacuteclico

321 Epimastigotas




39






























40




























41




























colocircnia


42
































43





























44






















45



30 min a 4 degC














alta pressatildeo

Micro-canais


46




























47






al 1973)























cd

MRWobs

10][

48































49











western blot









suave










50




















KAP7GtwFor (5rsquo-





51

































52































53



TcKAP7





TcKAP7
















54



















55















56







cada uma






















57








UPS-NEO-DOWN






















58










UPS-HIGRO-DOWN





















59







]-dCTP (10




fabricante











a ndash70 C












60








DMI6000











900












61





























62








63








GENE TbKAP7

KAP7RNAiF


KAP7RNAiR

















e trecircs semanas

64









65

4 RESULTADOS





37









Dm28c



66










sequenciado


67









68

















69

A

B









70











o kDNA do parasita

71















72




























(pb)

1 KAP7F + KAP7R 747

2 NEOF + NEOR 795

73


4 EXTF + NEOR 1410


6 NEOF + EXTR 1358


74








tipo Southern blot















75



76












cruzi para TcKAP7






77



















78


79


TcKAP7

















80
















81























82


brucei












37 oC




83


PAGE (Figura 28B)












84


29)









85








de luz (DLS)













0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

M

assa

Rh (nm)

fr80

fr82

fr84

fr85

86





31)









87



enovelamento











de onda de 280 nm

-20

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

200 210 220 230 240 250 260

Ɵ M

RV

x 1

03

(de

g cm

2d

mo

l-1)


88
























A B

89


























90





36)

91



TcKAP7


92































93

















94




















-22

-17

-12

-7

-2

3

200 210 220 230 240 250 260

ϴM

RW

x 1

03

(de

g cm

-2 d

mo

l-1)


Kap7+DNA

95




96


97

5 DISCUSSAtildeO

































98





















desse parasita














99
























miniciacuterculos











100



































101




al 2004)














102

6 CONCLUSOtildeES





eletrostaacutetica











103


104



105


106


107


108


109


110


111


112


113


114


115


AGRADECIMENTOS
















Obrigada






adoro vocecircs















ajudar e ensinar




amizade






Valeu galera






(Isaac Newton)

RESUMO






























ABSTRACT



























LISTA DE FIGURAS





































LISTA DE TABELAS






SUMAacuteRIO




18































19





















20








SOUZA 1984)





21












triatomiacutedeo














DE SOUZA 1984 1999 2002)

22






23























1999)












24









et al 2005)
























25







2007)


























26








1989)














16 O cinetoplasto





flagelo

17 A rede de kDNA




27
















28



























(FIGURA 6)

29











30












31










ENGLUND 1995)























32




2005)










33



































34




2004)
















35

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL







estrutural




36



311 Reagentes





Cult-lab RPMI 1640

















glicose 555 mM


80

37


bovina)









mercaptoetanol 5 mM








bovino 02



6X e SDS 1










X-100 4



38




SDS 01



mM e metanol 20











mM pH 60






metaciacuteclico

321 Epimastigotas




39






























40




























41




























colocircnia


42
































43





























44






















45



30 min a 4 degC














alta pressatildeo

Micro-canais


46




























47






al 1973)























cd

MRWobs

10][

48































49











western blot









suave










50




















KAP7GtwFor (5rsquo-





51

































52































53



TcKAP7





TcKAP7
















54



















55















56







cada uma






















57








UPS-NEO-DOWN






















58










UPS-HIGRO-DOWN





















59







]-dCTP (10




fabricante











a ndash70 C












60








DMI6000











900












61





























62








63








GENE TbKAP7

KAP7RNAiF


KAP7RNAiR

















e trecircs semanas

64









65

4 RESULTADOS





37









Dm28c



66










sequenciado


67









68

















69

A

B









70











o kDNA do parasita

71















72




























(pb)

1 KAP7F + KAP7R 747

2 NEOF + NEOR 795

73


4 EXTF + NEOR 1410


6 NEOF + EXTR 1358


74








tipo Southern blot















75



76












cruzi para TcKAP7






77



















78


79


TcKAP7

















80
















81























82


brucei












37 oC




83


PAGE (Figura 28B)












84


29)









85








de luz (DLS)













0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

M

assa

Rh (nm)

fr80

fr82

fr84

fr85

86





31)









87



enovelamento











de onda de 280 nm

-20

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

200 210 220 230 240 250 260

Ɵ M

RV

x 1

03

(de

g cm

2d

mo

l-1)


88
























A B

89


























90





36)

91



TcKAP7


92































93

















94




















-22

-17

-12

-7

-2

3

200 210 220 230 240 250 260

ϴM

RW

x 1

03

(de

g cm

-2 d

mo

l-1)


Kap7+DNA

95




96


97

5 DISCUSSAtildeO

































98





















desse parasita














99
























miniciacuterculos











100



































101




al 2004)














102

6 CONCLUSOtildeES





eletrostaacutetica











103


104



105


106


107


108


109


110


111


112


113


114


115













ajudar e ensinar




amizade






Valeu galera






(Isaac Newton)

RESUMO






























ABSTRACT



























LISTA DE FIGURAS





































LISTA DE TABELAS






SUMAacuteRIO




18































19





















20








SOUZA 1984)





21












triatomiacutedeo














DE SOUZA 1984 1999 2002)

22






23























1999)












24









et al 2005)
























25







2007)


























26








1989)














16 O cinetoplasto





flagelo

17 A rede de kDNA




27
















28



























(FIGURA 6)

29











30












31










ENGLUND 1995)























32




2005)










33



































34




2004)
















35

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL







estrutural




36



311 Reagentes





Cult-lab RPMI 1640

















glicose 555 mM


80

37


bovina)









mercaptoetanol 5 mM








bovino 02



6X e SDS 1










X-100 4



38




SDS 01



mM e metanol 20











mM pH 60






metaciacuteclico

321 Epimastigotas




39






























40




























41




























colocircnia


42
































43





























44






















45



30 min a 4 degC














alta pressatildeo

Micro-canais


46




























47






al 1973)























cd

MRWobs

10][

48































49











western blot









suave










50




















KAP7GtwFor (5rsquo-





51

































52































53



TcKAP7





TcKAP7
















54



















55















56







cada uma






















57








UPS-NEO-DOWN






















58










UPS-HIGRO-DOWN





















59







]-dCTP (10




fabricante











a ndash70 C












60








DMI6000











900












61





























62








63








GENE TbKAP7

KAP7RNAiF


KAP7RNAiR

















e trecircs semanas

64









65

4 RESULTADOS





37









Dm28c



66










sequenciado


67









68

















69

A

B









70











o kDNA do parasita

71















72




























(pb)

1 KAP7F + KAP7R 747

2 NEOF + NEOR 795

73


4 EXTF + NEOR 1410


6 NEOF + EXTR 1358


74








tipo Southern blot















75



76












cruzi para TcKAP7






77



















78


79


TcKAP7

















80
















81























82


brucei












37 oC




83


PAGE (Figura 28B)












84


29)









85








de luz (DLS)













0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

M

assa

Rh (nm)

fr80

fr82

fr84

fr85

86





31)









87



enovelamento











de onda de 280 nm

-20

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

200 210 220 230 240 250 260

Ɵ M

RV

x 1

03

(de

g cm

2d

mo

l-1)


88
























A B

89


























90





36)

91



TcKAP7


92































93

















94




















-22

-17

-12

-7

-2

3

200 210 220 230 240 250 260

ϴM

RW

x 1

03

(de

g cm

-2 d

mo

l-1)


Kap7+DNA

95




96


97

5 DISCUSSAtildeO

































98





















desse parasita














99
























miniciacuterculos











100



































101




al 2004)














102

6 CONCLUSOtildeES





eletrostaacutetica











103


104



105


106


107


108


109


110


111


112


113


114


115







(Isaac Newton)

RESUMO






























ABSTRACT



























LISTA DE FIGURAS





































LISTA DE TABELAS






SUMAacuteRIO




18































19





















20








SOUZA 1984)





21












triatomiacutedeo














DE SOUZA 1984 1999 2002)

22






23























1999)












24









et al 2005)
























25







2007)


























26








1989)














16 O cinetoplasto





flagelo

17 A rede de kDNA




27
















28



























(FIGURA 6)

29











30












31










ENGLUND 1995)























32




2005)










33



































34




2004)
















35

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL







estrutural




36



311 Reagentes





Cult-lab RPMI 1640

















glicose 555 mM


80

37


bovina)









mercaptoetanol 5 mM








bovino 02



6X e SDS 1










X-100 4



38




SDS 01



mM e metanol 20











mM pH 60






metaciacuteclico

321 Epimastigotas




39






























40




























41




























colocircnia


42
































43





























44






















45



30 min a 4 degC














alta pressatildeo

Micro-canais


46




























47






al 1973)























cd

MRWobs

10][

48































49











western blot









suave










50




















KAP7GtwFor (5rsquo-





51

































52































53



TcKAP7





TcKAP7
















54



















55















56







cada uma






















57








UPS-NEO-DOWN






















58










UPS-HIGRO-DOWN





















59







]-dCTP (10




fabricante











a ndash70 C












60








DMI6000











900












61





























62








63








GENE TbKAP7

KAP7RNAiF


KAP7RNAiR

















e trecircs semanas

64









65

4 RESULTADOS





37









Dm28c



66










sequenciado


67









68

















69

A

B









70











o kDNA do parasita

71















72




























(pb)

1 KAP7F + KAP7R 747

2 NEOF + NEOR 795

73


4 EXTF + NEOR 1410


6 NEOF + EXTR 1358


74








tipo Southern blot















75



76












cruzi para TcKAP7






77



















78


79


TcKAP7

















80
















81























82


brucei












37 oC




83


PAGE (Figura 28B)












84


29)









85








de luz (DLS)













0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

M

assa

Rh (nm)

fr80

fr82

fr84

fr85

86





31)









87



enovelamento











de onda de 280 nm

-20

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

200 210 220 230 240 250 260

Ɵ M

RV

x 1

03

(de

g cm

2d

mo

l-1)


88
























A B

89


























90





36)

91



TcKAP7


92































93

















94




















-22

-17

-12

-7

-2

3

200 210 220 230 240 250 260

ϴM

RW

x 1

03

(de

g cm

-2 d

mo

l-1)


Kap7+DNA

95




96


97

5 DISCUSSAtildeO

































98





















desse parasita














99
























miniciacuterculos











100



































101




al 2004)














102

6 CONCLUSOtildeES





eletrostaacutetica











103


104



105


106


107


108


109


110


111


112


113


114


115


RESUMO






























ABSTRACT



























LISTA DE FIGURAS





































LISTA DE TABELAS






SUMAacuteRIO




18































19





















20








SOUZA 1984)





21












triatomiacutedeo














DE SOUZA 1984 1999 2002)

22






23























1999)












24









et al 2005)
























25







2007)


























26








1989)














16 O cinetoplasto





flagelo

17 A rede de kDNA




27
















28



























(FIGURA 6)

29











30












31










ENGLUND 1995)























32




2005)










33



































34




2004)
















35

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL







estrutural




36



311 Reagentes





Cult-lab RPMI 1640

















glicose 555 mM


80

37


bovina)









mercaptoetanol 5 mM








bovino 02



6X e SDS 1










X-100 4



38




SDS 01



mM e metanol 20











mM pH 60






metaciacuteclico

321 Epimastigotas




39






























40




























41




























colocircnia


42
































43





























44






















45



30 min a 4 degC














alta pressatildeo

Micro-canais


46




























47






al 1973)























cd

MRWobs

10][

48































49











western blot









suave










50




















KAP7GtwFor (5rsquo-





51

































52































53



TcKAP7





TcKAP7
















54



















55















56







cada uma






















57








UPS-NEO-DOWN






















58










UPS-HIGRO-DOWN





















59







]-dCTP (10




fabricante











a ndash70 C












60








DMI6000











900












61





























62








63








GENE TbKAP7

KAP7RNAiF


KAP7RNAiR

















e trecircs semanas

64









65

4 RESULTADOS





37









Dm28c



66










sequenciado


67









68

















69

A

B









70











o kDNA do parasita

71















72




























(pb)

1 KAP7F + KAP7R 747

2 NEOF + NEOR 795

73


4 EXTF + NEOR 1410


6 NEOF + EXTR 1358


74








tipo Southern blot















75



76












cruzi para TcKAP7






77



















78


79


TcKAP7

















80
















81























82


brucei












37 oC




83


PAGE (Figura 28B)












84


29)









85








de luz (DLS)













0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

M

assa

Rh (nm)

fr80

fr82

fr84

fr85

86





31)









87



enovelamento











de onda de 280 nm

-20

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

200 210 220 230 240 250 260

Ɵ M

RV

x 1

03

(de

g cm

2d

mo

l-1)


88
























A B

89


























90





36)

91



TcKAP7


92































93

















94




















-22

-17

-12

-7

-2

3

200 210 220 230 240 250 260

ϴM

RW

x 1

03

(de

g cm

-2 d

mo

l-1)


Kap7+DNA

95




96


97

5 DISCUSSAtildeO

































98





















desse parasita














99
























miniciacuterculos











100



































101




al 2004)














102

6 CONCLUSOtildeES





eletrostaacutetica











103


104



105


106


107


108


109


110


111


112


113


114


115


ABSTRACT



























LISTA DE FIGURAS





































LISTA DE TABELAS






SUMAacuteRIO




18































19





















20








SOUZA 1984)





21












triatomiacutedeo














DE SOUZA 1984 1999 2002)

22






23























1999)












24









et al 2005)
























25







2007)


























26








1989)














16 O cinetoplasto





flagelo

17 A rede de kDNA




27
















28



























(FIGURA 6)

29











30












31










ENGLUND 1995)























32




2005)










33



































34




2004)
















35

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL







estrutural




36



311 Reagentes





Cult-lab RPMI 1640

















glicose 555 mM


80

37


bovina)









mercaptoetanol 5 mM








bovino 02



6X e SDS 1










X-100 4



38




SDS 01



mM e metanol 20











mM pH 60






metaciacuteclico

321 Epimastigotas




39






























40




























41




























colocircnia


42
































43





























44






















45



30 min a 4 degC














alta pressatildeo

Micro-canais


46




























47






al 1973)























cd

MRWobs

10][

48































49











western blot









suave










50




















KAP7GtwFor (5rsquo-





51

































52































53



TcKAP7





TcKAP7
















54



















55















56







cada uma






















57








UPS-NEO-DOWN






















58










UPS-HIGRO-DOWN





















59







]-dCTP (10




fabricante











a ndash70 C












60








DMI6000











900












61





























62








63








GENE TbKAP7

KAP7RNAiF


KAP7RNAiR

















e trecircs semanas

64









65

4 RESULTADOS





37









Dm28c



66










sequenciado


67









68

















69

A

B









70











o kDNA do parasita

71















72




























(pb)

1 KAP7F + KAP7R 747

2 NEOF + NEOR 795

73


4 EXTF + NEOR 1410


6 NEOF + EXTR 1358


74








tipo Southern blot















75



76












cruzi para TcKAP7






77



















78


79


TcKAP7

















80
















81























82


brucei












37 oC




83


PAGE (Figura 28B)












84


29)









85








de luz (DLS)













0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

M

assa

Rh (nm)

fr80

fr82

fr84

fr85

86





31)









87



enovelamento











de onda de 280 nm

-20

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

200 210 220 230 240 250 260

Ɵ M

RV

x 1

03

(de

g cm

2d

mo

l-1)


88
























A B

89


























90





36)

91



TcKAP7


92































93

















94




















-22

-17

-12

-7

-2

3

200 210 220 230 240 250 260

ϴM

RW

x 1

03

(de

g cm

-2 d

mo

l-1)


Kap7+DNA

95




96


97

5 DISCUSSAtildeO

































98





















desse parasita














99
























miniciacuterculos











100



































101




al 2004)














102

6 CONCLUSOtildeES





eletrostaacutetica











103


104



105


106


107


108


109


110


111


112


113


114


115


LISTA DE FIGURAS





































LISTA DE TABELAS






SUMAacuteRIO




18































19





















20








SOUZA 1984)





21












triatomiacutedeo














DE SOUZA 1984 1999 2002)

22






23























1999)












24









et al 2005)
























25







2007)


























26








1989)














16 O cinetoplasto





flagelo

17 A rede de kDNA




27
















28



























(FIGURA 6)

29











30












31










ENGLUND 1995)























32




2005)










33



































34




2004)
















35

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL







estrutural




36



311 Reagentes





Cult-lab RPMI 1640

















glicose 555 mM


80

37


bovina)









mercaptoetanol 5 mM








bovino 02



6X e SDS 1










X-100 4



38




SDS 01



mM e metanol 20











mM pH 60






metaciacuteclico

321 Epimastigotas




39






























40




























41




























colocircnia


42
































43





























44






















45



30 min a 4 degC














alta pressatildeo

Micro-canais


46




























47






al 1973)























cd

MRWobs

10][

48































49











western blot









suave










50




















KAP7GtwFor (5rsquo-





51

































52































53



TcKAP7





TcKAP7
















54



















55















56







cada uma






















57








UPS-NEO-DOWN






















58










UPS-HIGRO-DOWN





















59







]-dCTP (10




fabricante











a ndash70 C












60








DMI6000











900












61





























62








63








GENE TbKAP7

KAP7RNAiF


KAP7RNAiR

















e trecircs semanas

64









65

4 RESULTADOS





37









Dm28c



66










sequenciado


67









68

















69

A

B









70











o kDNA do parasita

71















72




























(pb)

1 KAP7F + KAP7R 747

2 NEOF + NEOR 795

73


4 EXTF + NEOR 1410


6 NEOF + EXTR 1358


74








tipo Southern blot















75



76












cruzi para TcKAP7






77



















78


79


TcKAP7

















80
















81























82


brucei












37 oC




83


PAGE (Figura 28B)












84


29)









85








de luz (DLS)













0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

M

assa

Rh (nm)

fr80

fr82

fr84

fr85

86





31)









87



enovelamento











de onda de 280 nm

-20

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

200 210 220 230 240 250 260

Ɵ M

RV

x 1

03

(de

g cm

2d

mo

l-1)


88
























A B

89


























90





36)

91



TcKAP7


92































93

















94




















-22

-17

-12

-7

-2

3

200 210 220 230 240 250 260

ϴM

RW

x 1

03

(de

g cm

-2 d

mo

l-1)


Kap7+DNA

95




96


97

5 DISCUSSAtildeO

































98





















desse parasita














99
























miniciacuterculos











100



































101




al 2004)














102

6 CONCLUSOtildeES





eletrostaacutetica











103


104



105


106


107


108


109


110


111


112


113


114


115


Documents

CARACTERIZAÇÃO DE TcKAP7: UMA PROTEÍNA ASSOCIADA AO