Caratterizzazione fitochimica mediante tecniche analiticheavanzate di Cannabis sativa L.

Candidato: Davide Maran Relatore: Prof.ssa Stefania BenvenutiCorrelatore: Dott. Gianpaolo Grassi

Questo progetto di tesi sperimentale è iniziato con un tirocinio di 200 ore presso il Centro diRicerca CREA nella sede distaccata di Rovigo, che attualmente rappresenta il centro di eccellenzaper lo studio della Cannabis. Grazie all’accoglienza del Primo ricercatore Dott.Gianpaolo Grassi ealla sua conoscenza sulla canapa maturata in oltre 20 anni di studi, ho potuto dedicarmi allo studioanalitico mediante tecniche gascromatografiche di oltre 180 accessioni di canapa, caratterizzate davariabilità agrocolturali ed ambientali.

Successivamente le attività di ricerca sono continuate presso il laboratorio “Phyto and MORE”del Dipartimento di Scienze della Vita dell'Università di Modena e Reggio Emilia, responsabileProf.ssa Stefania Benvenuti. Qui sono state svolte numerose indagini volte ad identificare,quantificare, separare e isolare i principali cannabinoidi.

In particolare, gli obiettivi di questo progetto di tesi sono stati principalmente 3:

1) ANALISI QUALITATIVA• Sviluppo e ottimizzazione di una metodica TLC per consentire in modo rapido la

separazione e l’identificazione dei principali fitocannabinoidi;• Identificazione dei principali fitocannabinoidi nelle infiorescenze di Cannabis mediante

tecniche GC-FID, HPLC-UV/DAD, HPLC-ESI-MS e MS2;

2) ANALISI QUANTITATIVA• Quantificazione dei principali fitocannabinoidi nelle infiorescenze di Cannabis mediante

tecniche GC-FID e HPLC-UV/DAD e comparazione dei risultati ottenuti;

3) ESTRAZIONE E ISOLAMENTO• Applicazione di differenti tecniche di estrazione sul materiale vegetale di C. sativa L.;• Isolamento dell'acido cannabidiolico e cannabidiolo dal materiale vegetale di C. sativa L. e

caratterizzazione NMR.

Nella tesi sono riportati cenni di carattere storico, botanico e legislativo della Cannabis.Vengono descritte la composizione chimica, gli effetti biologici e le attività terapeutiche di questapianta, secondo quanto riportato dalla più recente letteratura scientifica. Vengono inoltre trattate leprincipali metodologie estrattive e analitiche attualmente utilizzate nell'ambito della ricerca.

Finalità del lavoro è quindi la riscoperta, attraverso la selezione di varietà, il controllo analiticoe le tecniche di estrazione più efficaci, di alcuni principi attivi della canapa, magari meno famosi dialtri ad attività psicotropa, di notevole interesse fitoterapico e nutraceutico.

1) ANALISI QUALITATIVA TLC

Dopo differenti test siamo riusciti a trovare un buon metodo per la visualizzazione deiprincipali cannabinoidi all'interno della pianta di Cannabis sativa L.A) PREPARAZIONE DEI CAMPIONI:

-400 mg di infiorescenze sbriciolate;-Si eseguono 3 estrazioni con 20 ml etanolociascuna; ad ogni estrazione segue unasonicazione di 15 min a 40°C in bagno adultrasuoni;-Filtrazione con filtro a pieghe in pallone;-Concentrazione al rotavapor a 40° e si porta avolume in un matraccio da 10 ml.

Dopo aver deposto sulla TLC i campioni in esame, si fanno eluire in camera cromatografica con 10ml di cloroformio e 1 goccia di acido acetico (30-33 minuti). Per la visualizzazione si immerge insoluzione di ammonio molibdato e cerio solfato con conseguente riscaldamento.

CBD

CBG

CBDA

CBGA

Analisi TLC CAN15 delle varietà Carmagnola (deposizione 1 e 3, rispettivamente 10 e 20 µl) e Santhica (deposizione 2e 4, rispettivamente 20 e 10 µl)

HPLC-UV/DAD

PREPARAZIONE DEI CAMPIONI

-Le infiorescenze sono state private di semi emateriale legnoso, quindi sono state macinate conmulino a martelli in modo da ottenere unagranulometria idonea al processo di estrazione (siè prestata particolare attenzione a nonsurriscaldare i campioni);-Si pesano 250 mg di infiorescenze tramitebilancia analitica e posizionamento in beuta;-Si eseguono due estrazioni da 10 ml di metanoloe una da 5 ml (volume totale 25 ml); ad ogniestrazione segue una sonicazione di 15 min a40°C in bagno ad ultrasuoni;-Si filtra con filtro di carta a pieghe e si porta avolume con metanolo in un matraccio tarato;-Si esegue una seconda filtrazione per mezzo dimembrane di acetato di cellulosa, quindi si riponein vial ambrati per HPLC.D o po a v e r t e s t a t o d i f f e r e n t i c o l o n ne

cromatografiche la miglior colonna per separare i cannabinoidi è risultata essere la Ascentis®Express Express C18 [(15 cm x 3 mm, 2.7 μm, Supelco Analytical (USA)]. Si ottiene unarisoluzione soddisfacente, è la più sensibile e selettiva nei confronti di questi analiti, i picchirisultano separati fino a “base line”, con buona simmetria e l’analisi puo essere condotta in tempirelativamente brevi con durata massima di 40 minuti. Il post run è stato impostato a 15 min.

Gradiente ottimale Fasi mobili

Tempo H2O (0,1% HCOOH) ACN (0,1% HCOOH)

0' 40% 60%

13' 40% 60%

17' 20% 80%

22' 10% 90%

Condizioni cromatografiche.

Allo scopo di determinare la natura dei componenti presenti nel campione Santhica, è stataeffettuata l’analisi HPLC-UV/DAD. I n base ai dati riportati in letteratura, i quattro picchi piùabbondanti appartengono alla classe dei cannabinoidi: cannabigerolo e cannabidiolo hanno unmassimo di assorbimento a 210 nm, mentre acido cannabigerolico e acido cannabidiolicopossiedono un massimo di assorbimento intorno ai 220 nm (Peschel and Politi, 2015).

Cannabigerolo e cannabidiolo hanno mostrato spettri di assorbimento molto simili, quindi sonostati discriminati in base ai loro differenti tempi di ritenzione. Inoltre, per un’ulteriore conferma,sono state eseguite analisi HPLC-ESI-MS e MS2 grazie alle quali sono stati confermati in base aipesi molecolari delle due sostanze.

Fig. 74. Spettri di assorbimento associati ai picchi dell'analisi HPLC-UV/DAD

1: CBDA; 2: CBGA; 3: CBG; 4: CBD

HPLC-ESI-MS E MS 2

I dati cromatografici, come i tempi di ritenzione e gli spettri UV, da soli non possono forniresufficienti informazioni per la corretta identificazione dei costituenti di matrici complesse. Perquesto motivo, sono state condotte analisi HPLC-ESI-MS in trappola ionica, in modalità full-scanper individuare lo ione quasi-molecolare. Sono stati inoltre eseguiti esperimenti MS2 per studiare laframmentazione dei composti. Le analisi MS e MS2 sono state eseguite in modalità positiva e inmodalità negativa, in quanto in entrambe le modalità i composti di interesse ionizzano in modosoddisfacente, fornendo maggiori informazioni sulla loro corretta identificazione. Tramite laletteratura presente, (Aizpurua-Olaizola et al., 2014) è stato possibile identificare in modo affidabilequattro componenti principali nell’estratto di Cannabis sativa L..

È stato utilizzato un sistema Agilent Technologies modular model 1200, costituito da undegasatore sotto vuoto, una pompa binaria, un autocampionatore, accoppiato ad uno spettrometro dimassa a trappola ionica 6310A (IT) con una sorgente ESI, seguendo le stesse condizionicromatografiche HPLC. Le molecole allo stato gassoso, impattando con gli elettroni, hanno datoluogo a delle specie radical-anioniche. Gli ioni così formati, a causa dell’eccesso di energia fornita,hanno frammentato in una serie di molecole, le quali sono state separate in base al rapporto m/z, daun analizzatore a trappola ionica. I risultati ottenuti sono descritti nelle figure seguenti.

Analisi HPLC-ESI-MS di un estratto metanolico del campione Santhica. L’asse y rappresenta l’intensità del segnale,l’asse x rappresenta il tempo (min) e l’asse z il rapporto massa/carica. In nero (t=25,92) acido cannabidiolico, in rosso(t=25,95) acido cannabigerolico, in blu (t=26,22) cannabigerolo, in viola (t=26,42) cannabidiolo e in verde “Base peak

chromatogram”.

Extracted Ion Chromatograms in modalità positiva a valori di m/z 315.3, ione pseudo-molecolare di cannabidiolo.

Extracted Ion Chromatograms in modalità positiva a valori di m/z 317.3, ione pseudo-molecolare di cannabigerolo.

Extracted Ion Chromatograms in modalità positiva a valori di m/z 361.3, ione pseudo-molecolare di acidocannabigerolico.

Extracted Ion Chromatograms in modalità positiva a valori di m/z 359.3, ione pseudo-molecolare di acidocannabidiolico.

I risultati ottenuti hanno confermato i dati riportati in letteratura e i problemi legati alladecarbossilazione degli acidi nell’analisi in HPLC-ESI-MS (Aizpurua-Olaizola et al., 2014).

2) ANALISI QUANTITATIVAANALISI GC-FID

Per la preparazione dei campioni è stato utilizzato come solvente etanolo con 0,01% Prazepamcome standard interno e 0,01% squalene come riferimento.Le analisi sono state condotte tramite un apparato SHIMADZU GC-2010 PLUS, dotato dirivelatore a ionizzazione di fiamma (FID-2010 PLUS) su colonna capillare Rxi-5ms (30m x 0,25mm I.D. x 0,25 µm) fornita da RESTEK. Le condizioni operative adottate sono le seguenti:

• Flusso di aria 400 ml min-1, flusso di idrogeno 30 ml min-1, flusso di azoto 40 ml min-1

• FID miscela aria/idrogeno in rapporto 10:1• Iniezione di 1 μl mediante uno Split con rapporto di splittaggio 1/25 ml min-1

• Temperature: colonna 240°C, iniettore 280°C; rilevatore 300°C.Sono state condotte un totale di 183 analisi che hanno permesso la quantificazione dei principalicannabinoidi: CBDV, THCV, CBD, THC, CBG, CBN.Vista l'enorme quantità di analisi, di seguito vengono riportati solo alcuni gas-cromatogrammi diparticolari varietà:

Cannabis con alto contenuto di THCA. THC rilevato intorno al 21%; Cannabis con prevalente contenuto di THCV.

ANALISI HPLC-UV/DAD

La linearità del metodo analitico e i valori di LOD e LOQ sono stati determinati direttamentedalle curve di calibrazione di cannabigerolo, cannabidiolo, acido cannabigerolico e acidocannabidiolico. Di seguito i cromatogrammi di due varietà.

Cromatogramma HPLC del campione Santhica. Cromatogramma HPLC del campione Carmagnola.

CONFRONTO GC-FID E HPLC-DAD

Sono stati scelti 7 campioni per eseguire un confronto tra le metodiche analitiche utilizzate.

RISULTATI GC

Campioni CBD mg/g CBG mg/g THC mg/gSanthica 2,8 16,1 0,22077 175,6 5,1 7Carmagnola 55,9 2,7 2,1Carmaleonte 4,4 0,5 0,3Codimono 7,7 0,1 0,3Eletta campana 23,4 0,9 1,3Ermo 0,2 0 0,4

RISULTATI HPLC-UV/DAD

campione CBDA mg/g CBGA mg/g CBD mg/g CBG mg/g

Santhica1,36 12,17 3,82 7,25

SD 0,09 0,9 0,25 0,27

2077127,7 <LOQ 25,4 <LOQ

SD 1,06 0,17

Carmagnola35,74 1,82 24,5 1,96

SD 0,24 0,03 0,36 0,1

Carmaleonte3,79 <LOQ 2,86 <LOQ

SD 0,1 0,13

Codimono7,27 <LOQ 4,2 <LOQ

SD 0,05 0,07

Elettacampana

20,22 0,9 0,18 0,27SD 0,63 0,02 0,1 0,02

Ermo0,25 0,17 0,1 0,05

SD 0,09 0,02 0,05 0,06

Grazie ai risultati ottenuti, è stato possibile delineare un profilo fitochimico delle diversevarietà di Cannabis sativa L.

Possiamo concludere che nell'analisi gas cromatografica non vengono visualizzati icannabinoidi acidi. In linea di massima, le quantità dei cannabinoidi neutri corrispondono allasommatoria dei cannabinoidi neutri ed acidi rilevati in HPLC. Visto che la gas cromatografia si basasul riscaldamento del campione ad elevate temperature, i cannabinoidi acidi si trasformano nei lorocorrispettivi neutri. Come già descritto, i cannabinoidi neutri sono degli artefatti di estrazione;derivano dalla decarbossilazione degli acidi dovuta al trattamento durante i processi di raccolta;all'esposizione alla luce; alle alte temperature; al pH. Resta comunque da valutare il valore piùbasso riscontrato in GC rispetto all'HPLC. Tali discordanze possono dipendere da diversi fattori:dalla stagionatura della droga, dai metodi di estrazione, da tutte le variabili strumentali: nel GCavviene la decarbossilazione a differenza dell'HPLC e una parte dei cannabinoidi viene degradata;nelle analisi GC è stato valutato il contenuto di cannabinoidi grazie allo standard interno, nell'HPLCtramite le curve di taratura con lo standard.

3) SEPARAZIONE ED ISOLAMENTOSCELTA DEL METODO ESTRATTIVO

Sono stati sperimentati diversi metodi di estrazione per la C.sativa ai fini di ottenere un estrattocon il più alto contenuto di cannabinoidi possibile. I risultati delle prove effettuate sono stati iseguenti:n° Metodo estrattivo Resa% Cannabinoidi estratti

1 Estrazione con agitatore magnetico

5,67 Buon contenuto di cannabinoidi neutri, scarsi gli acidi

2 Soxtec 6,52 Numerosi cannabinoidi sia neutri che acidi

3 Bagno ad ultrasuoni in acetone 5,84 Alto contenuto di cannabinoidi acidi

4 Bagno ad ultrasuoni in metanolo 7,20 Alto contenuto di cannabinoidi acidi

5 Soxhlet 7,73 Numerosi cannabinoidi, principalmente neutri

Alla luce dei dati ottenuti dalle prove estrattive, si è optato per l’utilizzo della metodica 5 perisolare il CBD, e della metodica 4 per estrarre il CBDA.

Tramite la cromatografia liquida preparativa su colonna è stato possibile quindi isolare i duefitocannabinoidi CBD e CBDA rispettivamente dalle varietà Carmagnola e Codimono. Peraumentare la purezza del CBDA è stato necessario suddividere l’isolamento in due step diseparazione, più precisamente in due colonne, una successiva all’altra.

La colonna è stata impaccata ad umido utilizzando gel di silice, ed è stata scelta, come fasemobile, il cloroformio. In testa alla colonna è stato caricato l'estratto ottenuto solubilizzato in pochiml di cloroformio. Per favorire l’eluizione della colonna si è utilizzato azoto. Durante la procedurasi è passati a un gradiente cloroformio-metanolo fino ad arrivare a una fase mobile al 100% inmetanolo.

A sinistra: separazione dei componenti principali tramite

cromatografia su colonna; a destra il riassunto su TLC delle

frazioni principali: in alto la visualizzazione sotto luce UV a

365 nm. In basso le frazioni derivatizzate con reattivo ammonio

molibdato e cerio solfato.

Cromatogramma e 3D plot della provetta 35 – C1 (99.6 % di purezza; resa del 1,10% rispetto all'estratto di partenza)

Cromatogramma e 3D plot della frazione C3 F7 bis (92,5% di purezza; resa del 1,25% rispetto all'estratto di partenza)

La frazioni ottenute sono state caratterizzate mediante spettroscopia a risonanza magnetica nucleare(NMR) per confermare la presenza di CBDA e CBD; i dati ottenuti sono stati confrontati con quellipresenti in letteratura (Choi et al., 2004). Sono stati eseguiti sia esperimenti 1H-NMR sia 13C-NMR.

CBDA CBGA CBD CBG

Aizpurua-Olaizola, O., Omar, J., Navarro, P., Olivares, M., Etxebarria, N., Usobiaga, A., 2014.Identification and quantification of cannabinoids in Cannabis sativa L. plants by highperformance liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 406, 7549–7560. doi:10.1007/s00216-014-8177-x

Choi, Y.H., Hazekamp, A., Peltenburg-Looman, A.M., Frédérich, M., Erkelens, C., Lefeber, A.W.,Verpoorte, R., 2004. NMR assignments of the major cannabinoids and cannabiflavonoidsisolated from flowers of Cannabis sativa. Phytochem. Anal. 15, 345–354.

Peschel, W., Politi, M., 2015. 1H NMR and HPLC/DAD for Cannabis sativa L. chemotypedist inct ion, extract profi l ing and speci ficat ion. Talanta 140, 150–165.doi:10.1016/j.talanta.2015.02.040