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THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
Spécialité
Microbiologie environnementale
Ecole Doctorale Sciences de l’Environnement d’Ile de France (ED129)
Présentée par
Caroline SAURET
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR de L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
ECOLOGIE DES COMMUNAUTES BACTERIENNES MARINES SOUMISES
A UNE POLLUTION PETROLIERE
Influence des facteurs environnementaux, de la prédation et de la
récurrence des pollutions
Soutenue le 15 décembre 2011
Devant le jury composé de :
M. Robert Duran, Professeur, Pau Rapporteur
M. Télesphore Sime-Ngando, Directeur de Recherches, Clermont-Ferrand Rapporteur
M. Stéphane Blain, Directeur de Recherches, Banyuls sur mer Examinateur
Mme Madeleine Goutx, Directeur de Recherches, Marseille Examinatrice
Mme Urania Christaki, Professeur, Lille Examinatrice
M. Jean-François Ghiglione, Chargé de recherche, Banyuls sur mer Directeur de thèse
M. Daniel Delille, Ingénieur de Recherches HDR, Banyuls sur mer Directeur de thèse
THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
Spécialité
Microbiologie environnementale
Ecole Doctorale Sciences de l’Environnement d’Ile de France (ED129)
Présentée par
Caroline SAURET
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR de L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
ECOLOGIE DES COMMUNAUTES BACTERIENNES MARINES SOUMISES
A UNE POLLUTION PETROLIERE
Influence des facteurs environnementaux, de la prédation et de la
récurrence des pollutions
Soutenue le 15 décembre 2011
Devant le jury composé de :
M. Robert Duran, Professeur, Pau Rapporteur
M. Télesphore Sime-Ngando, Directeur de Recherche, Clermont-Ferrand Rapporteur
M. Stéphane Blain, Directeur de Recherche, Banyuls sur mer Examinateur
Mme Madeleine Goutx, Directeur de Recherche, Marseille Examinatrice
Mme Urania Christaki, Professeur, Lille Examinatrice
M. Jean-François Ghiglione, Chargé de recherche, Banyuls sur mer Directeur de thèse
M. Daniel Delille, Ingénieur de Recherche HDR, Banyuls sur mer Directeur de thèse
« Le provisoire est le statut définitif de la science »
Marcel Conche
A mon grand-père.
Remerciements
Voici donc le moment tant attendu et tant redouté des remerciements. Comment
résumer en quelques lignes ces quatre années passées à Banyuls et n’oublier personne ?
Maintenant que je suis arrivée au bilan, je me rends compte que beaucoup de gens ont croisé
mon chemin et contribué de près ou de loin à l’élaboration de cette thèse. Je remercie par
avance tous ceux qui n’apparaitront pas dans cette page.
Ma thèse s’est déroulée au laboratoire Arago de Banyuls sur mer, au LOMIC.
J’exprime toute ma gratitude à Philippe Lebaron, Jean-Marc Guarini d’abord et Stéphane
Blain ensuite pour m’avoir permis d’y travailler. Je n’aurais pu espérer mieux comme cadre
de travail.
Je remercie également Stéphane Blain pour avoir accepté de présider mon jury de
thèse.
J’adresse toute ma gratitude à Robert Duran et Télesphore Sime-Ngando pour
m’avoir fait l’honneur d’être les rapporteurs de cette thèse, ainsi qu’à Madeleine Goutx et
Urania Christaki qui ont accepté d’examiner mon travail et avec qui j’ai eu le bonheur de
collaborer sur plusieurs projets scientifiques.
Je ne saurais comment remercier mes directeurs de thèse, Daniel Delille, pour avoir
accepté de diriger cette thèse et surtout Jean-François Ghiglione qui m’a encadrée durant
mon master, puis mon doctorat. Je te remercie Jeff pour la confiance que tu as su instaurer
entre nous, ta pédagogie, ta présence et ton enthousiasme de chaque instant. A mon arrivée à
Banyuls, je n’étais pas sure de vouloir faire une thèse. C’est toi qui m’en a donné le goût et
qui a fait en sorte que cela se réalise. Merci pour cette belle expérience, ces quatre ans sans
nuage ; je ne suis pas sure que tous les doctorants puissent en dire autant. Encore merci.
Je remercie également les personnes qui ont contribué scientifiquement à cette thèse.
Je pense en particulier à Gilles Vétion pour toute la partie chimie à Banyuls. Gilles, c’est un
plaisir de travailler avec toi. Je pense aussi à Cathy et Marc, avec qui j’ai passé de très bons
moments à Marseille (sur le Seawake II et ailleurs) et pour tous leurs conseils avisés.
Daniela, je t’envoie mes remerciements à l’autre bout du monde, merci pour ton grand
professionnalisme et ta sympathie. Agathe, je te remercie pour ton implication dans
l’expérience en mésocosmes et pour ta gentillesse. Enfin, merci à toi Raphaël, pour ta
précieuse aide pour la qPCR et aussi à toi Sonja pour m’initier aux joies du pyroséquençage.
Je remercie les personnes qui m’on permis de participer à des missions scientifiques :
Xavier Durrieu de Madron pour CASCADE et Chritian Grenz pour le Mexique. Merci Pascal
pour m’avoir accompagnée dans cette mission oh ! combien dépaysante. Je n’oublie pas mes
partenaires d’Atalante, Jocelyne, Tatiana, Marina, et les autres.
J’adresse mes remerciements à l’équipe FLUMECO, Pascal, Audrey, François, pour
m’avoir donné l’occasion de donner des conférences et animer des TP/TD avec une grande
liberté. Ce fut une expérience très enrichissante pour moi.
Je remercie bien sûr toute l’équipe microbio, en particulier tous ceux que je suis
venue déranger pour des questions de débutante : Nyree, Cécile, Clémence, Laurent,
Delphine, Nicole et les autres. Les pauses-café, c’était sympa aussi. Cette année encore, il y
aura une session macarons, c’est promis.
Et puis, j’ai tous mes amis proches et moins proches à remercier, ça fait du monde !
Par ordre d’apparition chronologique (comme ça il n’y aura pas de jaloux), je remercie mes
amis de M2 : Aude, Moinchami, Barbara, Arturo, Guillaume ; j’espère qu’on gardera
contact. Qu’aurait été ma thèse sans ma petite Rozenn, la complice de chaque instant. Qu’est
ce qu’on a pu rigoler, merci pour tout ça. Solveig aussi, je te remercie, tu as toujours le
sourire, c’est magique. Merci à Sabine, toi aussi tu as toujours le sourire, je ne sais pas
comment vous faites les filles ! Merci pour votre soutien inconditionnel et votre gentillesse.
Quand est ce qu’on retourne à la zumba ? C’est à mon tour de te remercier, Mélissa, pour
nos discussions philosophiques. Une grand merci général à, Raph, Loubet, Anaïs, Camille,
Rémy, Marion, Matt, Sabrina, Sophie, Damien, Sébastien, et tous les autres, pour tous les
bons moments passés ensemble. Vivement la reprise des soirées jeux de société et des week-
ends dans les Corbières. Je dis un grand merci à mes « nouvelles » copines, Marine (qui ne
pourra pas assister à ma soutenance de thèse pour une obscure raison, mais je t’aime quand
même), Alicia pour ton tempérament et ta joie de vivre, Julie, mon petit bisounours préféré et
Chloé pour ta contribution à IBISCUS et pour ton soutien sur le bateau bien sûr mais surtout
pour ton amitié. Vous êtes des « vraies » filles, ça fait du bien ! Je remercie aussi d’avance
les nouvelles recrues qui vont devoir me supporter l’année prochaine : Tatiana, Marine,
Nathalie…
Aller, je te consacre un petit paragraphe, ma Chacha, le futur prix Nobel de médecine.
Tout ne rentrerait pas dans ces quelques lignes alors je te dis simplement merci, tu sais ce
qu’il y a derrière.
J’ai aussi une pensée particulière pour mon oncle, Philippe, sans qui je n’aurais peut
être pas eu l’idée de faire des études aussi longues et qui m’a toujours soutenue, ainsi que
pour mon parrain qui a toujours été présent malgré la distance, tu es la crème des parrains
Foinou. Je pense aussi à tous les membres de ma famille qui ont suivi ma thèse de loin : ma
Lolo bien sûr, tu es bien plus qu’une cousine, Adrien, les Tatis, les Tontons et tous les
autres…
Je ne pourrais clore ces remerciements sans citer mes grands parents, qui, seront fiers
de leur petite fille, et mes parents, Marie-Noëlle et Pierre. J’aurais pu choisir n’importe quel
métier, vous m’auriez soutenue, et vous continuez à le faire malgré mes 27 ans bien sonnés.
Un grand merci à vous. Je remercie également mes deux petits bouts qui ne sont plus si petits
que ça. Ma Dadi pour sa joie de vivre et son insouciance et mon Cola, mon futur médecin
préféré, vous êtes mes deux rayons de soleil. Vous savez combien je vous aime tous les
quatre…
Et puis je finirai par une pensée pour mon grand-père, Gabriel, qui aurait adoré lire
cette thèse mais je sais que tu la liras là-haut…
TABLE DES MATIERES
Chapitre 1 : Etat de l’art ..................................................................................................... 15
1. La pollution pétrolière : un problème toujours d’actualité ................................................15
2. Les communautés bactériennes au sein des écosystèmes marins pélagiques et leur réponse
face à un apport de pétrole .........................................................................................................23
2.1. Ecologie des bactéries marines totales et hydrocarbonoclastes ..................................................... 23
2.2. Le métabolisme des hydrocarbures ............................................................................................. 29
2.3. Le pétrole parmi les facteurs de contrainte des communautés bactériennes marines ...................... 31
3. Impact des facteurs environnementaux sur les communautés bactériennes contaminées
par les pétroles et sur la biodégradation des hydrocarbures .....................................................37
3.1. Facteurs abiotiques ..................................................................................................................... 38
3.1.1. Composition et concentration du pétrole ............................................................................. 38
3.1.2. Production de biosurfactants ............................................................................................... 41
3.1.3. Rayonnement UV, température, salinité, ressources en oxygène et pression......................... 43
3.1.4. Ressources en sels nutritifs (« bottom-up ») ........................................................................ 46
3.1.5. Récurrence de la pollution .................................................................................................. 49
3.2. Les facteurs de type « top-down » ............................................................................................... 50
3.2.1. Dynamique de l‘abondance des protozoaires, des virus et des bactéries ............................... 51
3.2.2. Impact des protozoaires et des virus sur la structure des communautés bactériennes ............ 53
3.2.3. Impact des protozoaires et des virus sur l‘activité bactérienne ............................................. 55
3.2.4. Mécanismes de résistance bactériens et interactions virus - protozoaires .............................. 60
4. La bioremédiation des hydrocarbures pétroliers ...............................................................62
4.1. Comment remédier à la pollution pétrolière ? .............................................................................. 62
4.2. Addition de microorganismes hydrocarbonoclastes : la bio-addition ............................................ 68
4.3. Fertilisation organique et inorganique : la biostimulation ............................................................. 70
5. Evolution récente des méthodes d’étude des communautés microbiennes marines totales
et hydrocarbonoclastes................................................................................................................76
5.1. Dénombrement des bactéries totales et hydrocarbonoclastes ........................................................ 77
5.2. Etude de la diversité ................................................................................................................... 79
5.3. Mesure d‘activité bactérienne totale et hydrocarbonoclaste .......................................................... 88
5.4. Lien diversité / activité ............................................................................................................... 90
6. Objectifs de la thèse .............................................................................................................95
Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines
............................................................................................................................................ 99
1. Préambule ............................................................................................................................99
2. Article 1: Spatial and temporal variations of bacterial community structure and PAH-
degrading bacterial abundance in Mediterranean harbors subjected to various PAH-pollutant
levels. .........................................................................................................................................101
Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport
de pétrole et à la biostimulation. ....................................................................................... 133
1. Préambule ......................................................................................................................... 133
2. Article 2: Influence of pollution history on the response of coastal bacterial and
nanoeukaryote communities to crude oil and biostimulation assays. ...................................... 135
Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de
pétrole ............................................................................................................................... 161
1. Préambule ......................................................................................................................... 161
2. Article 3: Strong evidence of top-down control on biostimulated diesel-degrading
bacterial communities ............................................................................................................... 163
Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope
Probing. ............................................................................................................................ 197
1. Préambule ......................................................................................................................... 197
2. Chapitre de livre: Monitoring of oil-degrading bacteria by stable isotope probing. ....... 199
3. Article 4: Dominance of Cycloclasticus sp. as key phenanthrene degrader in pristine and
chronically oil polluted coastal seawaters revealed by DNA-stable isotope probing and massive
pyrosequencing. ........................................................................................................................ 215
Chapitre 6 : Discussions générales et perspectives............................................................ 239
1. Quelle est l’importance de la richesse bactérienne spécifique dans la biodégradation des
hydrocarbures ? ........................................................................................................................ 239
2. Comment améliorer la bioremédiation des hydrocarbures ? .......................................... 243
3. Quel est l’impact du « top-down » sur la biodégradation des hydrocarbures et sa relation
avec le contrôle de type « bottom-up » ? .................................................................................. 245
4. Comment caractériser les assemblages microbiens impliqués dans la dégradation du
pétrole ? ..................................................................................................................................... 247
GLOSSAIRE ..................................................................................................................... 249
REFERENCES ................................................................................................................. 251
ANNEXE .......................................................................................................................... 283
LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX
Hors articles :
Figure 1: Principales contributions annuelles pour la pollution pétrolière mondiale entre
1990 et 1999 (en pourcentages), adapté du rapport du National Research Council
(NRC) de 2003. ....................................................................................................... 16
Figure 2 : Principaux accident pétroliers de 1970 à 2010 (Jernelöv 2010). .......................... 17
Figure 3 : Différents exemple de pollution pétrolière de grande ampleur. ............................ 19
Figure 4 : Processus abiotiques et biotiques conduisant à l’élimination naturelle du pétrole
en milieu marin....................................................................................................... 22
Figure 5 : Schéma conceptuel des réseaux trophiques microbiens dans les systèmes
aquatiques pélagiques. Bianchi et al. (1988) ........................................................... 24
Figure 6 : Arbre phylogénétique basé sur le maximum de vraisemblance du domaine des
bactéries. Les phyla sont distingués par la couleur de leur branche et les noms
d’espèces indiquées en rouge appartiennent à la GEBA (Genomic Encyclopedia of
Bacteria and Archaea) (Wu et al. 2009) . ................................................................ 26
Figure 7 : Phylogénie des principaux groupes de bactéries hydrocarbonoclastes marines. En
bleu, les microorganismes qui dégradent les hydrocarbures saturés, en rouge, ceux
qui dégradent les hydrocarbures aromatiques polycycliques et en noir les bactéries
non-dégradantes. .................................................................................................... 27
Figure 8 : Mécanisme général de dégradation aérobie des hydrocarbures par les
microorganismes (Das et al. 2011). ........................................................................ 30
Figure 9 : Diagramme schématique représentant les tendances générales observées dans de
nombreuses études après un apport de pétrole : des changements dans la
composition du pétrole accompagnés par des changements dans l’abondance des
organismes hydrocarbonoclastes clés (Head et al. 2006). ....................................... 35
Figure 10 : Schéma conceptuel des facteurs abiotiques et biotiques pouvant affecter les
communautés bactériennes touchées par la pollution pétrolière et in fine la
biodégradation. ...................................................................................................... 37
Figure 11 : Composés hydrocarbonés et non hydrocarbonés présents dans les pétroles bruts
(Bianchi et al. 1988). .............................................................................................. 39
Figure 12 : Exemple de dégradation d’un pétrole (Head et al. 2006). .................................. 39
Figure 13 : Alternance proie-prédateur entre les abondances bactériennes, virales et/ou de
protozoaires illustrant la dynamique du « killing the winner ». .............................. 52
Figure 14 : Principaux mécanismes d’interactions identifiés entre les bactéries, les HNF et
les virus (Miki et al. 2008; Berdjeb 2010). .............................................................. 61
Figure 15 : Exemple de biofilm formé par Rhodococcus corynebacterioides sur un support
chitineux incubé avec 0, 25% de kérosène (v/v) pendant 120 h vu au microscope
scanner à électron (Gentile et al. 2006). ................................................................. 69
Figure 16 : Historique et évolution étape par étape de l’Ecologie microbienne durant les 50
dernières années (Maron et al. 2007). .................................................................... 76
Figure 17 : Exemple de profil de CE-SSCP avec assignation des pics par construction d’une
banque de clone et migration individuelle des clones. Chaque pic de CE-SSCP (à
gauche) correspond un clone (à droite) qui a été affilié phylogénétiquement
(Rodríguez-Blanco et al. 2009). .............................................................................. 83
Figure 18 : Principe de fonctionnement du pyroséquençage automatisé ultra-haut débit. .... 85
Figure 19 : Exemple d’expérience de microarray avec ADNc. ............................................. 87
Figure 20 : Principe des activités enzymatiques extracellulaires chez les bactéries (selon Van
Wambecke, communication personnelle). ............................................................... 88
Figure 21 : Exemple d’activité hydrolytique extra-cellulaire : la glucosidase. ..................... 89
Figure 22 : Protocole d’expériences en métagénomique, métatranscriptomique et
métaprotéomique. Inspiré de (Shelswell 2006; Maron et al. 2007; Moran 2009). ... 91
Figure 23 : Méthodes d’identification des microorganismes par l’utilisation de radio-isotopes
(Dumont et al. 2005). ............................................................................................. 92
Figure 24 : Schéma synthétique représentant les différentes possibilités pour le marquage des
biomolécules par des isotopes stables (Gutierrez-Zamora et al. 2010). ................... 92
Figure 25 : Ensemble des méthodes utilisables pour l’étude des communautés bactériennes
impliquées dans la dégradation des hydrocarbures en milieu marin. Adapté de Weiss
et al. (2008). ........................................................................................................... 93
Figure 26 : Sites d’échantillonnage de l’étude en Baie de Marseille. ................................. 100
Figure 27 : Photo des erlenmeyers ayant servis à l’incubation des bactéries avec le
phénanthrène marqué au 13
C durant l’expérience de DNA-SIP. Les erlenmeyers les
plus jaunes sont ceux dans lesquels les bactéries hydrocarbonoclastes se sont
développées. ......................................................................................................... 198
Figure 28 : Principe général de l’expérience de dilution-extinction.................................... 240
Figure 29 : Mesures d’activités enzymatiques extracellulaires dans les 11 dilutions
différentes. Protocole indiqué dans l’article 3 de ce manuscrit. ............................ 241
Figure 30 : Evolution des profils CE-SSCP dans les différentes dilutions successives, avant et
après ajout de phénanthrène. En rouge, sont représentés les nombres de ribotypes
détectés dans chaque profil. Ce nombre diminue au cours de dilutions et diminue
encore dans chaque dilution après ajout de phénanthrène. ................................... 242
Tableau 1 : Dégradation des hydrocarbures in situ et in vitro (Bianchi et al. 1988). ............ 21
Tableau 2 : Proportions des différentes familles d’hydrocarbures dans quelques pétroles
couramment utilisés (Bianchi et al. 1988). .............................................................. 40
Tableau 3 : Biosurfactants/bioémulsifiants polymériques (en haut) et glycolipidiques (en bas)
produits par différents types de microorganismes marins (Satpute et al. 2010). ...... 42
Tableau 4 : Efficacité de différents agents d’induction de lyse virale sur des bactéries marines
(Jiang et al. 1996). ................................................................................................. 53
Tableau 5 : Aperçu des études sur le « top-down control » en milieu marin pollué par les
hydrocarbures. ....................................................................................................... 59
Tableau 6 : Liste des 33 substances prioritaires établie dans la circulaire DCE 2007/20 du
05/03/07 relative à la constitution et la mise en œuvre du programme de surveillance
pour les eaux littorales en application de la directive 2000/60/CE du 23 octobre
2000 du Parlement et du Conseil établissant un cadre pour une politique
communautaire dans le domaine de l’eau. En rouge, les molécules potentiellement
présentes dans les pétroles...................................................................................... 65
Tableau 7 : Composants des fertilisants utilisés ou testés comme agents de bioremédiation
(Prince 1993). ........................................................................................................ 73
Tableau 8 : Méthodes d’empreintes moléculaires classiquement utilisées en Ecologie
microbienne. ........................................................................................................... 81
Tableau 9 : Méthodes actuelles de séquençage (Cardenas et al. 2008). ................................ 85
Tableau 10 : Aperçu des différentes méthodes de microbiologie et de biologie moléculaire
utilisées pour l’étude des microorganismes dans les zones polluées par les
hydrocarbures. Adapté de Weiss et al. (2008). ........................................................ 94
Tableau 11 : Conditions proposées pour la mise en place d’une expérience visant à tester
l’impact du « top-down » sur l’efficacité des approches de biostimulation. ........... 246
LISTE DES ABREVIATIONS
ADN/ADNc Acide Désoxyribonucléique (complémentaire)
AIE Agence Internationale de l‘Energie
ARDRA Amplified Ribosomal DNA Restriction Fragment Analysis
(A)RISA (Automated) Ribosomal Intergenic Space Analysis
ARN/ARNr Acide Ribonucléique ribosomal
BAC Chromosome Bactérien Artificiel
BTEX Benzène, toluène, éthylbenzène et xylène
BP Bacterial Production
CCA Canonical Correspondence Analysis
CEDRE CEntre de Documentation de Recherche et d‘Expérimentation sur les
pollutions des eaux
CTD Conductivity, Temperature, Depth
DAPI 4',6'-diamidino-2-phénylindole
DCE Directive-Cadre Européenne
DOC/COD Carbone Organique Dissout
DGGE Denaturing Grandient Gel Electrophoresis
dNTP Désoxyribonucléotide
EPA Environmental Protection Agency
FL1 Foward scatter
FIC Frequency of Infected Cells
FVIC Frequency of Visibly Infected Cells
FISH Fluorescence in situ Hybridisation
FWHM Full Width Half Maximum
GC-MS Chromatographie en phase Gazeuse couplée à un Spectromètre de
Masse
GF Green cell Fluorescence
HAP Hydrocarbure Aromatique Polycyclique
HCB Hydrocarbonoclastic Bacteria (bactéries hydrocarbonoclastes)
HNF Heterotrophic Nanoflagellates
MCA 7-amino-4-méthylcoumarin
MPN/NPP Most probable number/nombre le plus probable
MUF 4-méthylumbelliférone
OCDE Organisation de Coopération de Développement Economiques
OMI Organisation Maritime Internationale
OPA Oil Pollution Act
OPRC Oil pollution, Prepardness, Response and Cooperation
OTU Operational Taxonomic Unit
pb Paire de bases
PCB Biphenyles polychlorés
PCE Perchloréthylène
PCR Polymerase Chain Reaction
PFGE Pulse Fragment Gel Electrophoresis
COP/POC Carbone Organique Particulaire
ppm Parties par million
REACH Règlement sur l‘enregistrement, l‘évaluation, l‘autorisation et les
restrictions des substances chimiques
rpm Rotation par minute
RT Retro-transcription
S (précédé d‘un
nombre)
Coefficient de sédimentation
SIP Stable Isotope Probing
SML Surface Microlayer
SSC Side Scatter
SSU Small SubUnit
SSW Surface seawater
TCA Acides tricarboxyliques
THC Total Hydrocarbon Compounds
SSCP Single Strand Conformational Polymorphism
tep Tonne équivalent pétrole
TCE Trichloréthylène
TGGE Temperature Gradient Gel Electrophoresis
T-RFLP Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphisms
U Unité
UCM Unresolved complex mixture
UNCLOS Convention des nations unies sur le droit de la mer
UPGMA Unweighted Pair-Group Method with Averages
UV Ultraviolet
VIBM Viral Induced Bacterial Mortality
ZMPV Zone Marine Particulièrement Vulnérable
ETAT DE L’ART
CHAPITRE 1
15 Chapitre 1 : Etat de l’art
Chapitre 1 : Etat de l’art
1. La pollution pétrolière : un problème toujours d‘actualité
La pollution pétrolière est
une conséquence directe et
inévitable de l’exploitation
massive du pétrole. Tant
que le pétrole sera exploité,
l’ensemble des écosystèmes
seront fortement menacés
par la pollution.
De nos jours, l‘exploitation du pétrole et les dommages qu‘elle
engendre ont atteint leur paroxysme. Alors que le 19e siècle était
celui du charbon, le 20e a été celui du pétrole, une substance
pouvant fournir jusqu‘à deux fois plus d‘énergie pour la même
quantité. La tonne équivalent pétrole (tep) a remplacé la tonne
équivalent charbon comme unité d‘énergie. La découverte de « l‘or
noir » a résolument bouleversé notre mode de vie à tel point que la
quasi-totalité de nos activités dépendent aujourd‘hui de son
exploitation. Le marché du pétrole représente à lui seul 35% des
transports mondiaux de marchandises. Inévitablement, la pollution
marine engendrée par le commerce du pétrole est à la hauteur de
celui-ci. On estime notamment que 70% de la pollution pétrolière a
pour récepteur terminal le milieu aquatique et les quantités de
pétrole déversées dans les océans chaque année se chiffrent en
millions de tonnes. Or les besoins en énergie et donc, pour l‘heure
en pétrole, ne cessent de s‘accroître au fur et à mesure que la
population mondiale augmente. L‘Agence Internationale de
l‘Energie (AIE) estime que la demande mondiale pourrait passer à
près de 125 millions de barils par jour en 2030 contre 85 en 2005 et
seulement 10 à la fin de la seconde guerre mondiale (à noter qu‘un
baril équivaut à 159L de pétrole et qu‘une tonne fait environ 7,6
barils, ce chiffre variant en fonction de la masse volumique du
liquide). Selon l‘AIE, à l‘avenir, même des prix extrêmement élevés
ne diminueront pas l‘évolution de la consommation de pétrole.
Pourtant cette ressource n‘est pas inépuisable. En tant qu‘énergie
fossile, elle est condamnée à disparaitre avant la fin du 21e siècle.
Actuellement les principaux fournisseurs de pétrole se situent au
Moyen-Orient, en Afrique, en Asie centrale et en Amérique latine.
Mais même dans ces sites, la tendance va vers une raréfaction des
NB : Les mots qui apparaissent en orange sont définis dans un glossaire en fin de manuscrit.
Avec le temps, les sources
de pollution se sont
diversifiées.
gisements d‘hydrocarbures exploitables. L‘accroissement de la
demande et l‘appauvrissement de la ressource conduisent
inévitablement à une tension des marchés pétroliers. Cette tension
pousse les industriels à aller chercher le précieux liquide dans des
gisements toujours plus profonds et plus difficilement exploitables.
Ainsi depuis les 30 ou 40 dernières années, nous assistons à un
changement dans la façon d‘exploiter le pétrole. Par répercussion,
les sources et types de pollution ont évolué et se sont multipliées.
Par le passé, sous l‘influence de la nouvelle manne pétrolière et
le manque de vigilance face à la toxicité du produit de nombreux
navires pétroliers se sont brisés en mer (Amoco Cadiz, Exxon
Valdez, Erika, Prestige…) relarguant d‘importantes quantités de
pétrole. Les rejets volontaires de raffineries, et de navires pétroliers
(déballastages, dégazages) ont également fait l‘objet d‘une pollution
plus insidieuse dont les quantités étaient et restent encore
aujourd‘hui supérieures à celles provenant des déversements
accidentels.
Figure 1: Principales contributions annuelles pour la pollution pétrolière mondiale entre 1990 et 1999 (en
pourcentages), adapté du rapport du National Research Council (NRC) de 2003.
Les accidents pétroliers ont
toujours été révélateurs des
effets néfastes du pétrole
sur l’environnement
marin.
Contrairement à ce que l‘on pourrait penser, la principale source
de pollution pétrolière a toujours été le suintement naturel de
gisements de pétrole (Fig. 1). Néanmoins, là où un écoulement
naturel n‘a que peu de conséquences sur l‘écosystème marin car il
est généralement adapté à cet apport continu, les pollutions
massives ont toujours été extrêmement dommageables de part leur
soudaineté dans des espaces très réduits. Par le passé, ce type
d‘accidents pétroliers à répétition et les dommages économiques et
écologiques majeurs qu‘ils ont provoqués ont contribué à marquer
l‘opinion publique. Ils ont attiré l‘attention des autorités
gouvernementales et des scientifiques pour la lutte contre la
17 Chapitre 1 : Etat de l’art
pollution pétrolière d‘origine anthropique, ce qui a fortement
contribué à la naissance de l‘Ecotoxicologie. On peut notamment
souligner les travaux d‘Atlas et ses collaborateurs qui font référence
dans le domaine de la microbiologie environnementale appliquée
aux pollutions pétrolières depuis les années 70 (Atlas et al. 1972;
Atlas 1975; Atlas et al. 1977). Les mesures qui ont résulté de cette
prise de conscience ont permis de diminuer progressivement le
nombre d‘accidents et de rejets illicites (Fig. 2).
Figure 2 : Principaux accident pétroliers de 1970 à 2010 (Jernelöv 2010).
Des accidents d’ampleur
sans précédent font leur
apparition.
Malheureusement les accidents de navires pétroliers ont depuis
été supplantés par de nouveaux types de pollution massive. En effet,
sous la menace de la disparition progressive du pétrole,
l‘exploitation de gisements en milieux « extrêmes » (plus de 1000m
de profondeur sous la surface des océans) s‘est intensifiée à la fin
du 20e siècle en dépit des risques de catastrophes majeurs encourus.
La vétusté des sites ainsi que le surcoût lié à leur réparation (plus
élevé que le pétrole lui-même) a conduit à une dégradation de bon
nombre de ces sites d‘extraction. C‘est ainsi que depuis une dizaine
d‘année, certains gisements de grande profondeur notamment en
Russie, dans les états de l‘ex-union soviétique et en Afrique de
l‘ouest menaçaient et menacent encore de rompre. Pourtant, ce n‘est
La catastrophe de l’an
passé dans le Golfe du
Mexique rappelle à tous les
dangers de l’exploitation
excessive du pétrole pour
l’environnement et la santé
publique.
pas dans ces pays mais à 66 Km au large de la Louisiane que le
20/04/2011, la plate-forme pétrolière Deepwater Horizon
(autrement dénommée Macondo/MC 252) a été victime d‘une
explosion suivie d‘un incendie déversant, selon les estimations, de
500000 à 1000000 tonnes de pétrole en moins de 2 mois (Fig. 3),
atteignant ainsi le triste record du plus important déversement connu
à ce jour sur les côtes américaines (la plus importante catastrophe
pétrolière mondiale étant la guerre du Koweit en 1991 qui provoqua
une pollution environ 5 fois plus importante). A titre indicatif, les
déversements massifs d‘hydrocarbures pétroliers et de gaz toxiques
tel que le méthane ont provoqué l‘empoisonnement de 8183 oiseaux
(dont 6104 retrouvés morts), 1144 tortues (dont 609 retrouvées
mortes) et 109 mammifères (dont 100 retrouvés morts). La pollution
a également détruit bon nombre de niches écologiques pour la ponte
des poissons et des crustacés sur les côtes Nord et Est du Golfe du
Mexique (Mascarelli 2010; Steiner 2010; Whigham et al. 2010). Les
dégâts économiques d‘une telle catastrophe se chiffrèrent eux en
milliards de dollars et c‘est une population qui s‘étend sur plusieurs
centaines de kilomètres qui fut directement affectée par la pollution
des ressources alimentaires liées à la pêche et aux zones agricoles.
a. b.
19 Chapitre 1 : Etat de l’art
c.
Figure 3 : Différents exemple de pollution pétrolière de grande ampleur.
a. Image satellite du Golfe du Mexique après la catastrophe de la plateforme pétrolière Deepwater horizon dans
laquelle le pétrole est reflété par les rayons du soleil. Source : NOAA
b. Enfouissement de résidus pétroliers issus de l'exploitation des sables bitumineux, Fort Mac Murray, province
de l‘Alberta, Canada. Auparavant, la plaine de la rivière Athabasca était recouverte par la forêt boréale. Pour
extraire les sables bitumineux, la terre a été creusée sur plus de 60 mètres de profondeur. L‘eau pompée dans la rivière sert à séparer le bitume du sable dans de grandes cuves chauffées. Puis ce bitume est transformé en
pétrole liquide. Photo de Yann Arthus-Bertrand (www.goodplanet.com)
c. Inventaire de 2750 sites pollués (par les hydrocarbures principalement) en Arctique. Le réchauffement
climatique provoque depuis quelques dizaines d‘années la fonte progressive des glaces au niveau des pôles.
L‘activité humaine en est facilitée dans ces zones, les rejets de polluants de type hydrocarbures et autres se
multiplient alors que leur élimination demeure particulièrement difficile à mettre en œuvre.
(www.robindesbois.org)
Ce type d‘accident n‘est malheureusement pas anecdotique. Il
faut s‘attendre à subir de nouvelles catastrophes dans les prochaines
années. En plus de ce type de gisements à hauts risques qui
menacent de rompre dans certaines régions du globe, l‘industrie
pétrolière est de plus en plus amenée à s‘orienter vers des réserves
dites « non traditionnelles » à savoir des gisements qui ne peuvent
être exploités par des techniques d‘extraction courantes comme les
De nouvelles sources de
pollution font leur
apparition en raison des
difficultés de plus en plus
importantes pour prélever
le pétrole.
schistes bitumineux ou les sables asphaltiques. L‘exploration de
zones reculées comme l‘Arctique et les grands fonds marins (plus
de 3000m de profondeur sous l‘eau, puis plusieurs kilomètres dans
les sous-sols marins) est également très sérieusement envisagée
pour l‘exploitation de nouveaux gisements (Fig. 3). Leur
exploitation nécessite bien plus d‘énergie et de ressources que la
production du pétrole traditionnel mais les prix pétroliers en
constante hausse font que ces réserves non traditionnelles
deviennent de plus en plus rentables. Une des conséquences
majeures de ce changement est l‘augmentation considérable des
risques de pollution par les hydrocarbures. Par exemple, les schistes
bitumineux forment une roche-mère argileuse contenant de grandes
quantités de kérogène, matière organique susceptible de donner des
hydrocarbures par distillation. Les ressources mondiales de schistes
bitumineux seraient très importantes et assurément elles devraient
être rapidement exploitées. Mais ce type de gisement est bien plus
polluant qu‘un gisement classique et la quantité de déchets pollués
qui en découlent est extrêmement importante. La technologie pour
éliminer ces déchets n‘est pas encore connue et les experts estiment
qu‘il faudrait des centaines d‘années pour que ce type de site se
décontamine naturellement. En outre, le lessivage de ce type de sol
hautement contaminé produit des effluents extrêmement toxiques
qui polluent non seulement les terrains mais aussi les nappes
phréatiques et les cours d‘eau (in fine la mer) avec des effets quasi-
irréversibles. Ainsi, malgré la raréfaction de la ressource, l‘industrie
du pétrole n‘a pas dit son dernier mot. Puisqu‘il faut des millions
d‘années pour qu‘il se forme, il est incontestable que le pétrole
finira par disparaitre mais d‘ici là il est fortement probable que
l‘homme et son environnement soient exposés à de nouvelles
sources de pollution pétrolière sans précédent dans l‘ampleur et la
difficulté de traitement.
Au regard de ce nouveau comportement face à l‘exploitation du
pétrole, il ne fait aucun doute que la lutte contre la pollution
21 Chapitre 1 : Etat de l’art
pétrolière engagée par les autorités gouvernementales et les
scientifiques doive perdurer et s‘intensifier. Cette lutte passe avant
tout par la compréhension et l‘évaluation de l‘impact des
hydrocarbures pétroliers sur les écosystèmes marins. On sait depuis
maintenant quelques décennies qu‘une fois déversé dans l‘eau de
mer, le pétrole est soumis à l‘action d‘un certain nombre de facteurs
physico-chimiques conduisant à son élimination partielle (Fig. 4).
On note ainsi successivement des phénomènes de dispersion du
pétrole, d‘évaporation des molécules les plus volatiles, de photo-
oxydation des hydrocarbures lourds, d‘émulsification des composés
hydrophobes, d‘absorption et d‘agrégation des hydrocarbures avec
la matière organique particulaire (MOP) et de dissolution de ces
composés en matière organique dissoute (MOD) (Bianchi et al.
1988).
Tableau 1 : Dégradation des hydrocarbures in situ et in vitro (Bianchi et al. 1988).
La biodégradation est le
processus le plus abouti
dans l’élimination des
polluants.
Mais en plus de ces facteurs physico-chimiques, la
biodégradation par les microorganismes est indéniablement le
processus le plus abouti dans l‘élimination des polluants d‘origine
pétrolière (Atlas 1981). Même s‘il est relativement lent, ce
processus permet une dégradation quasi-complète (transformation
en CO2) des hydrocarbures (Tableau 1). Neuf genres de
cyanobactéries, 103 de champignons et 14 d‘algues sont connus à ce
jour pour être capables de dégrader les hydrocarbures. Mais il a été
établi que les bactéries (79 genres recensés en 2005) étaient
qualitativement et quantitativement les plus efficaces dans cette
fonction (Prince 2005). Ce processus naturel a pour nom la
bioremédiation. Tout l‘enjeu est de comprendre ce phénomène en
tenant compte de la complexité des processus qui le composent et
les contraintes qui en modifient l‘efficacité de manière à
l‘influencer favorablement lors de pollutions importantes et ainsi
contribuer activement à l‘élimination des contaminants.
Note pour le lecteur : Les Archaea n‘interviennent quasiment pas dans la
dégradation des hydrocarbures. Nous emploierons donc le terme de
biodégradation pour désigner le métabolisme des hydrocarbures par les bactéries
uniquement durant l‘ensemble de ce manuscrit.
Figure 4 : Processus abiotiques et biotiques conduisant à l’élimination naturelle du pétrole en milieu
marin.
23 Chapitre 1 : Etat de l’art
2. Les communautés bactériennes au sein des écosystèmes marins pélagiques et leur réponse
face à un apport de pétrole
2.1. Ecologie des bactéries marines totales et hydrocarbonoclastes
Les bactéries marines
jouent un rôle majeur dans
les cycles biogéo-
chimiques.
La « boucle microbienne »
a révolutionné la vision
classique de chaîne
trophique linéaire en
intégrant le rôle clé de
reminéralisation de la
matière organique par les
bactéries et l’apport de
matière organique issue de
leur prédation par les
virus, flagellés et ciliés,
eux-mêmes prédatés par le
métazooplancton.
L‘Ecologie est une science ayant pour objet les relations des
organismes entre eux et avec leur environnement. L‘Ecologie
microbienne marine a connu de nombreuses « révolutions » depuis
la découverte des microorganismes au sein des écosystèmes marins
au début du 20e siècle (Waksman 1934). Il a fallu attendre les
années 70 et la mise au point de techniques élaborées de
microscopie pour s‘apercevoir que l‘abondance bactérienne était en
réalité cent fois plus élevée que les estimations faites à partir des
méthodes cultivables (Hobbie et al. 1977). Dès lors, est née l‘idée
que malgré leur taille (0.2-2µm) et l‘immensité des océans
(1370.106 Km
3), les bactéries marines de part leur abondance (10
5
cellules par millilitre d‘eau de mer en moyenne) devaient jouer un
rôle majeur dans l‘évolution des cycles biogéochimiques (Williams
1981; Kirchman et al. 1982). D‘abord, compte tenu de la surface
des océans (70% de la planète) la respiration aérobie exercée par les
bactéries hétérotrophes marines s‘est révélée jouer un rôle clé dans
les budgets globaux de matière et d‘énergie (Pomeroy 1974).
Ensuite, ce changement a modifié le schéma classique du réseau
trophique linéaire. Le concept de « boucle microbienne », formalisé
au début des années 1980 par un collectif de chercheurs travaillant
en milieu marin (Azam et al. 1983) a donné naissance à l‘Ecologie
microbienne marine moderne dans laquelle les bactéries tiennent
une place centrale dans les flux de matière puisque 10 à 50% de la
matière organique issue de la production primaire est reminéralisée
sous l‘action des microorganismes hétérotrophes (Fig. 5). Ceux-là
sont ingérés par les prédateurs (nanoglagellés et ciliés), eux-mêmes
ingérés par le métazooplancton. Depuis le schéma originel de la
boucle microbienne, le concept a évolué pour aboutir davantage à
un réseau trophique microbien dans lequel les interactions entre les
microorganismes sont plus complexes (Sherr et al. 2009). Par
exemple, la distinction entre microorganismes autotrophes et
hétérotrophes est de moins en moins faite. Il a été montré que 50%
du nano-phytoplancton peut être constitué d‘algues mixotrophes
combinant sources d‘énergies lumineuse et chimique pour assurer
les biosynthèses cellulaires (Sanders et al. 1992; Arenovski et al.
1995; Li et al. 1996). La photo-hétérotrophie bactérienne (capacité
de combiner comme sources d‘énergie la lumière et des molécules
organiques) serait également largement répandue (Kolber et al.
2001). Enfin les adaptations récentes du réseau trophique microbien
prennent en compte le compartiment viral, longtemps ignoré dans
l‘étude des transferts de matière en milieu marin (Wilhelm et al.
1999).
Figure 5 : Schéma conceptuel des réseaux trophiques microbiens dans les systèmes aquatiques pélagiques.
Bianchi et al. (1988)
Du fait de leur taille microscopique, il est apparu rapidement que
les bactéries étaient non seulement particulièrement abondantes
dans les océans mais également quelles étaient capables de
coloniser tous les biotopes marins, de la microcouche de surface,
aux fonds abyssaux, des zones polaires aux tropiques, s‘adaptant à
25 Chapitre 1 : Etat de l’art
La culture cellulaire est la
base de la microbiologie
marine. Néanmoins elle est
inadaptée pour l’étude de
la diversité bactérienne.
Durant les 30 dernières
années, les méthodes de
culture ont fait place aux
techniques de biologie
moléculaire pour l’étude de
la diversité bactérienne.
Les méthodes moléculaires
ont permis de révéler la
grande diversité génétique
des procaryotes.
chaque fois aux contraintes environnementales, laissant supposer
une grande diversité génétique et métabolique chez les bactéries
(Woese et al. 1977). Rapidement, le problème de l‘étude de cette
diversité s‘est posé. L‘étude des microorganismes s‘est faite durant
de très nombreuses années par la culture cellulaire. Cette méthode
consiste à prélever un échantillon naturel et à l‘incuber dans un
milieu de culture généraliste ou spécifique puis compter les colonies
en partant du principe qu‘une colonie est initiée par une cellule
unique. Même si incontestablement cette approche comporte des
avantages notamment pour l‘isolation de souches bactériennes
inconnues, l‘étude morphologique de ces souches ainsi que leur
caractérisation génétique et métabolique, elle ne permet d‘obtenir
qu‘une vision très restreinte d‘un assemblage bactérien naturel.
L‘écart entre le nombre de bactéries retrouvé dans les cultures et le
comptage par microscopie à épifluorescence a fait naitre le concept
de « plate count anomaly » (Staley et al. 1985). Il a été estimé que
seulement 0.1 à 1% des bactéries étaient cultivables dans le milieu
marin (Giovannoni et al. 1990). Une alternative permettant d‘éviter
les biais de la culture a été trouvée dans la biologie moléculaire. Les
bases de notre compréhension actuelle de la diversité bactérienne
ont été posées par Carl Woese et ses collègues (1977) lorsqu‘ils ont
démontré par l‘analyse du gène de la petite-sous unité de l‘opéron
de l‘ARN ribosomique que les êtres vivants étaient répartis en 3
grands domaines : les bactéries, les archées et les eucaryotes. A la
suite de cette découverte, des méthodes de clonage et de séquences
spécifiques de gènes provenant de l‘environnement ont été mises au
point (Olsen et al. 1986; Pace et al. 1986) et des inventaires
moléculaires ont pu être réalisés (Giovannoni et al. 1990). Depuis,
les approches moléculaires pour comprendre la diversité
phylogénétique et fonctionnelle des bactéries ont largement
contribué à notre connaissance des microorganismes marins. On
dénombre aujourd‘hui une vingtaine de phyla bactériens différents
(Fig. 6). Parmi ces phyla, on retrouve des espèces bactériennes
extrêmement variées génétiquement et métaboliquement laissant
supposer une place prépondérante de la diversité bactérienne dans la
structure et la fonction des communautés naturelles.
Figure 6 : Arbre phylogénétique basé sur le maximum de vraisemblance du domaine des bactéries. Les
phyla sont distingués par la couleur de leur branche et les noms d’espèces indiquées en rouge
appartiennent à la GEBA (Genomic Encyclopedia of Bacteria and Archaea) (Wu et al. 2009) .
Il a été montré (surtout dans le sol) que la diversité
métabolique, portée par une grande diversité génétique,
favorisait la stabilité des écosystèmes ainsi que leur
27 Chapitre 1 : Etat de l’art
La diversité bactérienne est un
facteur déterminant pour la
plasticité des communautés en
milieu naturel comme pour faire
face à un apport de pétrole.
productivité. Une communauté bactérienne très diversifiée sera
plus à même de faire face à une perturbation du milieu et
reviendra plus rapidement à son état d‘origine qu‘une
communauté moins diversifiée (Atlas et al. 1991; Girvan et al.
2005). Cela prend tout son sens dans le cas d‘une pollution
pétrolière. En effet, parmi les bactéries marines, cela fait tout
juste un siècle que des bactéries capables d‘utiliser les
hydrocarbures pétroliers comme seule source d‘énergie et de
carbone ont été isolées pour la première fois (Söhngen 1913),
ce sont les bactéries hydrocarbonoclastes (HCB pour
hydrocarbonoclastic bacteria).
Figure 7 : Phylogénie des principaux groupes de bactéries hydrocarbonoclastes marines. En bleu, les
microorganismes qui dégradent les hydrocarbures saturés, en rouge, ceux qui dégradent les
hydrocarbures aromatiques polycycliques et en noir les bactéries non-dégradantes.
Il n‘est pas étonnant qu‘une telle fonction ait depuis été
retrouvée dans tous les écosystèmes du globe, y compris dans
des zones dites extrêmes comme les régions polaires (Whyte et
al. 1995), les déserts (Al-Hadrami et al. 1995) ou les sources
chaudes (Zarilla et al. 1984), dans la mesure où le pétrole, de
Les bactéries hydrocarbo-
noclastes sont capables d’utiliser
les hydrocarbures comme seule
source de carbone et d’énergie.
Elles sont :
- ubiquistes
-diversifiées
-spécifiques de leur substrat
-plus nombreuses dans les
milieux pollués.
La dégradation totale du pétrole
ne peut se faire que grâce à
l’intervention de plusieurs
groupes bactériens possédant des
équipements enzymatiques
complémentaires.
part son abondance et son aspect hautement réduit, représente
un apport très important en carbone et en énergie utilisables par
les microorganismes. La plupart des bactéries
hydrocarbonoclastes appartiennent aux -protéobactéries. On
peut noter quelques genres majoritaires parmi les 79
récemment répertoriés (Prince 2005) : Acinetobacter,
Alcanivorax, Alcaligenes, Cycloclasticus, Flavobacterium,
Marinobacter, Pseudoalteromonas, Pseudomonas,
Thallassolituus, Oleispira et Vibrio (Fig. 7). De nombreuses
études ont montré qu‘elles étaient ubiquistes et présentes en
faible quantité même dans les environnements dépourvus de
contamination (Colwell et al. 1977; Leahy et al. 1990).
Naturellement, leurs effectifs sont accrus dans les zones
chroniquement polluées par les hydrocarbures et augmentent
après un apport de pétrole (Atlas 1981; Floodgate 1995). Mais
chacun de ces genres bactériens n‘est capable de dégrader
qu‘un nombre restreint d‘hydrocarbures alors que le pétrole est
composé de centaines voire de milliers de molécules
différentes. Par exemple il a été clairement établi que le genre
Alcanivorax est prépondérant dans la dégradation des alcanes
(Yakimov et al. 1998) alors que le genre Cycloclasticus est
associé à la dégradation des hydrocarbures aromatiques
polycycliques (HAP) n‘excédant pas trois cycles benzéniques
(Dyksterhouse et al. 1995). La biodégradation totale d‘un
pétrole n‘est donc possible que grâce à la mise en place d‘un
consortium bactérien comprenant des groupes dont les
équipements enzymatiques complémentaires permettent la
biodégradation quasi-totale de ces différents types
d‘hydrocarbures (Head et al. 2006). Si les bactéries dégradant
les composés les plus simples (comme les alcanes linéaires à
courte chaine) sont abondantes dans l‘environnement, celles
qui possèdent les machineries enzymatiques pour dégrader les
composés les plus complexes (comme par exemple les
29 Chapitre 1 : Etat de l’art
Le niveau de dégradation d’un
pétrole dépend des ressources
métaboliques bactériennes
présentes dans le milieu
contaminé.
composés aromatiques de plus de quatre cycles) sont beaucoup
moins répandues (Rodriguez-Blanco et al. 2010). Le niveau de
dégradation des pétroles (mélange de composés facilement
dégradables et de composés récalcitrants) est donc totalement
dépendant de la diversité métabolique des bactéries
hydrocarbonoclastes présentes dans l‘environnement pollué. La
diversité des espèces bactériennes est un facteur décisif dans la
réponse des communautés bactériennes à ce type de variation
environnementale. Son étude est primordiale pour la
compréhension du phénomène d‘élimination naturelle des
polluants pétroliers.
2.2. Le métabolisme des hydrocarbures
La biodégradation des
hydrocarbures fait intervenir le
dioxygène qui sert à l’utilisation
d’enzymes de type oxygénase.
Note pour le lecteur : l‘étude des voies métaboliques des hydrocarbures
n‘ayant pas fait l‘objet de ce travail de thèse, nous présentons ici à titre
indicatif quelques voies métaboliques classiques de manière à avoir une
idée du type de fonctions (et donc de gènes) qu‘il est possible de cibler dans les analyses en PCR quantitative que l‘on abordera un peu plus tard dans ce
manuscrit.
La dégradation des hydrocarbures est une fonction
distribuée dans une grande diversité de groupes
phylogénétiques et les mécanismes qui interviennent sont très
diversifiés, en grande partie à cause de la multitude de
molécules de type hydrocarbure différentes. Toutefois, Das et
al. (2011) ont proposé un schéma général de la dégradation des
hydrocarbures par les microorganismes en condition aérobie,
condition prépondérante en milieu pélagique (Fig. 8).
L‘attaque initiale intracellulaire est un processus oxydatif et
l‘activation ainsi que l‘incorporation d‘oxygène est la clé de la
réaction enzymatique catalysée par les oxygénases et les
peroxydases. Les voies périphériques de dégradation
convertissent les hydrocarbures étape par étape en
intermédiaires du catabolisme, à l‘aide par exemple du cycle
des acides tricarboxyliques (TCA ou cycle de Krebs). La
biosynthèse de molécules pour la biomasse de la cellule se fait
à partir de métabolites précurseurs comme l‘acétyl-CoA, le
succinate ou le pyruvate. Les sucres nécessaires à de
nombreuses biosynthèses et à la croissance sont produits par la
glycogénèse.
Figure 8 : Mécanisme général de dégradation aérobie des hydrocarbures par les microorganismes (Das et
al. 2011).
La biodégradation des alcanes se
fait par l’intermédiaire d’une
mono-oxygénase.
Dans ce processus, on peut distinguer deux grands types de
métabolismes, associés aux deux classes majoritaires qui
composent les pétroles : les alcanes linéaires et les
hydrocarbures aromatiques. Les n-alcanes ayant un nombre de
carbone supérieur ou égal à 9 sont les hydrocarbures les plus
facilement dégradables par une très large variété de micro-
organismes. Le principal mécanisme de dégradation des
alcanes et le plus fréquent est celui correspondant à une
oxydation du groupe méthyle terminal, conduisant à la
formation d‘un alcool primaire, d‘un aldéhyde puis d‘un acide
mono-carboxylique faisant intervenir une mono-oxygénase
(Bianchi et al. 1988). La dégradation des alcanes ramifiés est
plus lente et plus difficile comparativement à celle des alcanes
linéaires. En ce qui concerne la dégradation des hydrocarbures
31 Chapitre 1 : Etat de l’art
La dégradation des
hydrocarbures aromatiques
polycycliques est initiée par une
dioxygénase.
aromatiques polycycliques (HAP), plus le nombre de cycles
augmente dans la molécule plus celle-ci est difficilement
dégradable. Ainsi de nombreuses bactéries ont été répertoriées
pour la dégradation de molécules comme le benzène ou le
naphtalène alors qu‘à ce jour seules quelques espèces sont
connues pour dégrader les HAP de plus de 4 cycles tel que le
benzo[a]pyrène (Rodriguez-Blanco et al. 2010). Quel que soit
l‘HAP, la plupart du temps, une dioxygénase assure
l‘incorporation de deux atomes d‘oxygène dans la première
phase de l‘oxydation qui conduit à des diols de configuration
cis. Généralement, l‘oxydation se poursuit par une rupture
ortho ou méta du cycle portant sur les groupements hydroxyle,
avec obtention d‘un nouveau diol ayant un cycle aromatique de
moins que le composé initial et ainsi de suite jusqu‘à la
dégradation de tous les cycles benzéniques (Bianchi et al.
1988).
2.3. Le pétrole parmi les facteurs de contrainte des communautés bactériennes marines
Les communautés bactériennes
naturelles s’organisent dans
l’espace et le temps sous
l’influence des facteurs
environnementaux.
En l‘absence de pétrole, les communautés bactériennes
naturelles s‘organisent dans l‘espace et dans le temps sous
l‘influencent des facteurs environnementaux qui les
contraignent.
Les études portant sur les variations spatiales montrent des
résultats contrastés. Certaines n‘ont pas trouvé de différence
notable entre des sites situés à quelques kilomètres de distance
en Antarctique (Murray et al. 1998) comme à plus de 1500Km
en mer Arabique (Riemann 1999). D‘autres au contraire ont
trouvé des variations dans des sites séparés de 10 km
(Ghiglione et al. 2005 ; Rodriguez-Blanco et al. 2009) ou de
plusieurs dizaines de km entre la côte et le large des côtes
catalanes (Schauer et al. 2000), sur des gradients de salinité en
mer du Nord (Riemann et al. 2002) ou encore dans le panache
du Rhône dans le Sud de la France (Troussellier et al. 2002).
La structure des communautés
bactériennes en milieu marin est
influencée à l’échelle de la
saison.
La température, la salinité, le
DOC et les événements de
blooms phytoplanctoniques
comptent parmi les facteurs
environnementaux capables
d’affecter significativement la
structure des communautés
bactériennes marines.
Ces changements peuvent être expliqués par bon nombre de
facteurs, comme la salinité dans les deux derniers cas cités.
Toutefois, l‘hétérogénéité des résultats tendrait à montrer que
d‘une part certains environnements sont plus stables que
d‘autres (Fuhrman et al. 2008) et d‘autre part que selon la
technique moléculaire employée pour l‘étude des
communautés bactériennes, les changements sont plus ou
moins bien décelés (Jaspers et al. 2001).
Les variations de structuration dans le temps semblent plus
homogènes d‘une étude à l‘autre. Certains trouvent des
variations à micro-échelle de temps (10sec à 30min) (Seymour
et al. 2004; Seymour et al. 2005) ou à l‘échelle de la journée et
jusqu‘à la semaine (Acinas et al. 1997; Fandino et al. 2001).
Mais de manière générale, les plus grands changements
surviennent à l‘échelle du mois voire de l‘année, les
communautés bactériennes évoluant selon les saisons. Cette
tendance a été retrouvée aussi bien en mer Méditerranée
(Ghiglione et al. 2005), qu‘en mer Adriatique (Celussi et al.
2007), dans la mer du Nord (Sapp et al. 2007), l‘Atlantique
(Kan et al. 2006) ou encore le Pacifique (Fuhrman et al. 2006).
Les changements temporels de structure de communauté sont
dus aux facteurs environnementaux qui évoluent selon les
saisons.
Plusieurs études ont évalué statistiquement l‘importance
relative de différents paramètres environnementaux sur les
changements spatio-temporels des assemblages bactériens
(Ghiglione et al. 2008; Lami et al. 2009). Généralement, les
variations de température (été versus hiver), de salinité
(dessalures), de concentrations en sels inorganiques et matière
organique ainsi que la présence de blooms phytoplanctoniques
semblent être responsables des changements de structure de
communauté bactérienne (Ghiglione et al. 2008; Lami et al.
2009). Furhman et ses collaborateurs (2006) ont même
33 Chapitre 1 : Etat de l’art
Le pétrole est un facteur
supplémentaire qui contraint les
communautés bactériennes, mais
son importance relative par
rapport à d’autres facteurs
environnementaux est inconnue.
En cas de déversement de
pétrole, les bactéries sensibles
aux hydrocarbures disparaissent
pour laisser la place aux
bactéries hydrocarbonoclastes.
démontré l‘existence de tendances temporelles extrêmement
reproductibles dans la composition d‘une communauté
bactérienne composées de 171 OTUs pendant plus de 4 ans
dans leur Observatoire microbiologique, à 20Km au large des
côtes Sud-Californiennes. Les modèles de distribution et
d‘abondance des taxa microbiens étaient très prévisibles et
fortement influencés par un large éventail de facteurs
abiotiques et biotiques (Fuhrman et al. 2006).
En cas de pollution pétrolière, les hydrocarbures viennent se
rajouter à tous ces facteurs environnementaux avec pour effet
d‘affecter les communautés bactériennes, mais leur importance
relative par rapport aux autres paramètres environnementaux
est aujourd‘hui inconnue.
Si le pétrole peut être toxique pour bon nombre d‘espèces
marines, les bactéries hydrocarbonoclastes sont, au contraire,
favorisées par un apport d‘hydrocarbures. Alcanivorax,
Cycloclasticus, Oleiphilus et Oleispira sont par exemple quatre
genres extrêmement compétitifs qui utilisent préférentiellement
le pétrole plutôt que des sucres comme source de carbone
(Harayama et al. 2004; Kostka et al. 2011). Comme la plupart
des HCB, ces bactéries appartiennent au groupe des -
protéobactéries, particulièrement représenté dans les milieux
pollués. A l‘inverse, les Cytophaga / Flexibacter / Bacteroides
(CFB) pourtant particulièrement présentes dans
l‘environnement marin non pollué sont quasiment introuvables
dans les zones contaminées (MacNaughton et al. 1999). Les -
protéobactéries et les cyanobactéries semblent également
sensibles à l‘apport de pétrole (Harayama et al. 2004).
Cependant, il est difficile de généraliser cette tendance à tous
les memebres de ces phyla. Par exemple, il existe chez les
cyanobacteria certaines espèces capables de dégrader les
hydrocarbures (tel que Agmenellum quadruplicatum qui oxyde
le phénanthrène grâce à un système de mono-oxygénase)
Le pétrole provoque un
bouleversement dans la structure
des communautés bactériennes.
Le pétrole induit la mise en place
d’un consortium bactérien de
biodégradation des
hydrocarbures avec une
alternance de différents types
bactériens comportant des
capacités métaboliques
complémentaires.
(Raghukumar et al. 2001). Mais le plus souvent les pétroles
sont toxiques pour les cyanobactéries car les composés
aromatiques, notamment, inhibent la photosynthèse et la
croissance de ces cellules. Par contre, celles qui résistent au
pétrole pourraient fournir de l‘oxygène et permettre la fixation
de l‘azote au profit de la communauté bactérienne dégradante
(Sorkhoh et al. 2008).
Ces différentes sensibilités au pétrole provoquent des
bouleversements très rapides dans la structure des
communautés bactériennes juste après l‘apport de pétrole. Dès
1976, quelques jours après un accident pétrolier en Alaska, des
changements de la structure des communautés microbiennes
touchées par l‘épandage de pétrole ont pu être observés
(Horowitz et al. 1977). Depuis, de nombreuses études
effectuées autant en microcosmes (Röling et al. 2002; Sei et al.
2003; Cappello et al. 2007) que sur des échantillons naturels
(Peterson et al. 2003; Yakimov et al. 2004; Mascarelli 2010)
ont confirmé qu‘après un apport soudain de pétrole, le ratio
entre HCB et bactéries totales augmentait fortement. On assiste
en générale à une baisse de la diversité totale des communautés
bactériennes au profit de certaines espèces avantagées
sélectivement par la nouvelle source de matière organique et
particulièrement bien adaptées à la présence de certains
hydrocarbures. L‘élimination conjointe des bactéries sensibles
au pétrole et la stimulation des HCB conduit souvent à une
augmentation de l‘abondance bactérienne et à un regain
d‘activité globale de la communauté dans les premiers jours
après la pollution (Atlas 1981). Rapidement un consortium de
biodégradation se met en place. Les bactéries capables de
métaboliser les molécules les plus simples sont sélectionnées
en premier. Lorsque ces composés viennent à disparaitre,
d‘autres bactéries ayant eu le temps de s‘acclimater aux
molécules les plus complexes (les hydrocarbures aromatiques
35 Chapitre 1 : Etat de l’art
polycycliques par exemple) prolifèrent à leur tour et prennent
l‘ascendant sur le reste de la communauté (Fig. 9). Cela se
traduit par une alternance de différents groupes bactériens qui
se poursuit jusqu‘à l‘élimination quasi-complète des
hydrocarbures (voir la revue de Head et al., 2006).
Figure 9 : Diagramme schématique représentant les tendances générales observées dans de nombreuses
études après un apport de pétrole : des changements dans la composition du pétrole accompagnés par des
changements dans l’abondance des organismes hydrocarbonoclastes clés (Head et al. 2006).
La résilience des communautés
bactériennes touchées par la
pollution pétrolière semble n’être
que partielle.
Il est relativement difficile d‘évaluer le potentiel de
résilience d‘une zone impactée par les pétroles car cela
nécessite un suivi de la quantité de pétrole, de la toxicité des
molécules et des communautés bactériennes sur de longues
périodes. Certaines études ont montré que la communauté
bactérienne de départ pouvait être partiellement rétablie
(Brakstad et al. 2005; Bordenave et al. 2007). Toutefois, les
bactéries dégradant des composés pétroliers très complexes
(comme les composés aromatiques de plus de quatre cycles) ne
font pas toujours partie de la communauté bactérienne naturelle
soumise à une pollution. Cela conduit à la persistance de ces
Il existe peu d’études permettant
de relier statistiquement la
structure des communautés
bactérienne à la présence de
pétrole.
composés dans l‘environnement, entrainant une toxicité du
milieu à long terme. Pelletier et ses collaborateurs (2004) ont
d‘ailleurs montré que même dans les cas où la dégradation des
hydrocarbures apparaissait totale, il pouvait rester une toxicité
résiduelle due aux composés les plus récalcitrants non détectés
par les méthodes chimiques employées. Il est donc possible
que cette toxicité résiduelle perturbe la flore bactérienne
durablement.
Enfin, même si les travaux sur l‘impact du pétrole sur les
communautés bactériennes sont nombreux, peu d‘études ont
déjà tenté de relier statistiquement la pollution pétrolière aux
variations de structure de communauté. Seuls Denaro et al.
(2005), dans l‘eau de mer du port de Messine en Italie, Ben
Said et al. (2010), dans les sédiments du lagon de Bizerte en
Tunisie ainsi que Zhang et al., (2007), dans l‘eau de la baie
d‘Hong Kong, ont montré que la pollution pouvait affecter
significativement les bactéries marines et que cet effet pouvait
même être prédominant parmi tous les autres facteurs physico-
chimiques. Il reste aujourd‘hui nécessaire de tester ce
paramètre dans d‘autres types d‘environnements afin d‘évaluer
la part de responsabilité du pétrole sur la structuration des
communautés bactériennes parmi les autres facteurs
environnementaux.
Note pour le lecteur : la première étude de ce manuscrit est consacrée à
l‘évaluation statistique de l‘importance relative des HAP parmi d‘autres
facteurs environnementaux sur la structure des communautés bactériennes
dans plusieurs ports de la baie de Marseille.
37 Chapitre 1 : Etat de l’art
3. Impact des facteurs environnementaux sur les communautés bactériennes contaminées par
les pétroles et sur la biodégradation des hydrocarbures
Les facteurs physico-chimiques
et/ou biologiques influencent
directement l’évolution du pétrole
dans le milieu marin et les
communautés bactériennes dans
leur fonction de biodégradation
des hydrocarbures.
Depuis les premières investigations sur la pollution
pétrolière, un grand nombre d‘études ont entrepris de
comprendre le devenir du pétrole en milieu marin et les
facteurs environnementaux pouvant affecter l‘élimination des
polluants pétroliers. La température, la pression, les ressources
en oxygène, pour ne citer qu‘eux, peuvent jouer un rôle à la
fois sur la transformation chimique du pétrole mais aussi sur
sa biodégradation par les microorganismes. Néanmoins,
comme nous l‘avons vu précédemment, les bactéries ne sont
pas sans interactions avec d‘autres compartiments biologiques
et l‘importance de la prédation des bactéries par les
protozoaires ainsi que la lyse virale ont été très peu abordés
dans la littérature (Fig. 10). Nous aborderons dans cette partie
les effets des facteurs physico-chimiques et biologiques sur les
communautés bactériennes touchées par une pollution
pétrolière.
Figure 10 : Schéma conceptuel des facteurs abiotiques et biotiques pouvant affecter les communautés
bactériennes touchées par la pollution pétrolière et in fine la biodégradation.
3.1. Facteurs abiotiques
3.1.1. Composition et concentration du pétrole
La dégradation du pétrole dépend
en grande partie de sa
composition et de sa
concentration. Elle dépend
également de son
« comportement » dans le milieu
marin.
Les alcanes et les hydrocarbures
aromatiques polycycliques sont
deux classes prépondérantes dans
la composition des pétroles.
La composition d‘un pétrole détermine sa toxicité et son
potentiel de dégradation. Une fois déversé dans l‘eau, le
pétrole prend diverses formes qui conditionnent fortement le
temps qu‘il sera nécessaire pour l‘éliminer. Selon sa
consistance, il va former un film hydrophobe à l‘interface eau-
air, former des émulsions dans la colonne d‘eau ou encore
couler au fond des océans sous forme de goudron sous l‘action
de processus hydrodynamiques (Cooney 1984). La dispersion
du pétrole et de manière générale tout processus tendant à
augmenter la surface de contact eau-huile (émulsion « huile-
dans-eau ») permet un meilleur accès à l‘oxygène et aux
ressources en azote et phosphore. Ce phénomène physique
augmente largement la dégradation des hydrocarbures. A
l‘inverse la formation d‘une « mousse au chocolat » (émulsion
« eau-dans-huile ») freine le processus (Bianchi et al. 1988;
Leahy et al. 1990).
Malgré sa complexité, les composés du pétrole sont divisés
en quatre principales familles (Fig. 11) :
- les hydrocarbures saturés (alcanes linéaires et ramifiés,
cycloalcanes) et les hydrocarbures aromatiques mono- ou
polycycliques (2 à 6 cycles de benzène), représentant 30 à
70% de ces composés pétroliers,
- les asphaltènes, composés de haut poids moléculaire et de
structure chimique complexe à base de cycles aromatiques
condensés et d‘hétéroatomes comme l‘oxygène, le souffre ou
l‘azote
- les composés cycliques azotés, soufrés et oxygénés,
- et les métaux (nickel, fer, sodium, cuivre, aluminium).
39 Chapitre 1 : Etat de l’art
Figure 11 : Composés hydrocarbonés et non hydrocarbonés présents dans les pétroles bruts (Bianchi et al.
1988).
Comme cela a déjà été évoqué précédemment, tous ces
composés ne sont pas dégradés équitablement (Saliot 1981).
Figure 12 : Exemple de dégradation d’un pétrole (Head et al. 2006). a. Composition d‘un pétrole brut léger de la mer du Nord (en haut) et le résultat de sa dégradation partielle
(en bas).
b. Chromatographes montrant la séparation des composés du pétrole. Le pétrole dégradé est caractérisé
par sa composition ; les hydrocarbures saturés ont été biodégradés, seuls restent les terpénoides
cycliques.
Plus il est raffiné, plus le pétrole
est dégradé rapidement.
Les composés saturés sont dégradés en premier, viennent
ensuite les aromatiques et les asphaltènes et résines résistent à
la dégradation, ce qui entraine une modification dans la
composition du pétrole au cours de sa dégradation (Fig. 12).
Plus les molécules d‘un pétrole sont saturées mieux celui-ci
est biodégradé. A l‘inverse les asphaltènes, les composés
soufrés et les cycles aromatiques compliquent drastiquement
la biodégradation (Jobson et al. 1972; Walker et al. 1976).
Les proportions relatives de ces différents composés sont
reliées au degré de raffinage du pétrole. Un fuel lourd peut
contenir plus de 2000 molécules différentes avec une large
proportion de composés récalcitrants à la dégradation alors
que l‘essence en contient environ 200, majoritairement riches
en hydrocarbures saturés et aromatiques (Head et al, 2006).
Ainsi un pétrole de type « léger d‘Arabie » sera mieux dégradé
qu‘un pétrole brut de type « Bunker C » (tableau 2).
Pétrole Saturés Aromatiques Polaires (résine) Asphaltènes
Louisiane du Sud 69 20 10,3 0,3
Koweit 44 28,3 23,2 4,5
Bunker C 21,1 34,2 30,3 14,4
Léger d'Arabie 48 35 9 7,5
Tunisien (Asthart) 48 32 12 8
Vénézuelien 46 21,6 19,3 9
Tableau 2 : Proportions des différentes familles d’hydrocarbures dans quelques pétroles couramment
utilisés (Bianchi et al. 1988).
Bien sûr, il va de soi que la dégradation du pétrole dépend
également de sa concentration. Plus le pétrole est déversé
rapidement et en quantités importantes (accident pétrolier par
exemple) plus les dommages sur la faune marine macro- et
microscopique sont importants, et plus l‘élimination totale des
polluants est lente et longue.
Ceci peut en partie s‘expliquer par le fait que la
composition et la concentration du pétrole déterminent la
façon dont les communautés bactériennes s‘adaptent à la
41 Chapitre 1 : Etat de l’art
Deux types de pétrole différents
ne sont pas dégradés de manière
identique par une même
communauté bactérienne.
pollution. Deux types de pétroles différents induisent des
changements différents sur une même communauté
bactérienne (Rodríguez-Blanco et al. 2010). Il est donc
important de connaitre la composition du pétrole pour évaluer
sa capacité à être éliminé par des processus hydrodynamiques
mais aussi par le compartiment bactérien.
3.1.2. Production de biosurfactants
Les bactéries produisent des
biosurfactants qui leur permettent
une meilleure accessibilité au
pétrole.
Comme on vient de le voir, le pétrole a besoin d‘être
dissout dans l‘eau ou de se présenter sous forme de
microémulsion pour être accessible aux bactéries. Mais en
raison de son hydrophobicité, cet état n‘est pas systématique et
le manque d‘accessibilité du pétrole aux microorganismes est
un réel frein à son élimination. Pour pallier à cette contrainte,
bon nombre de bactéries se sont adaptées au fil du temps pour
excréter des agents tensio-actifs, amphiphiles, appelés aussi
biosurfactants ou bioémulsifiants. Récemment, Satpute et al.
(2010) listaient les biosurfactants et bioémulsifiants produits
par les microorganismes marins révélant la diversité de ces
molécules et leur fort potentiel pour les applications
industrielles (Tableau 3). Elles permettent de réduire l‘énergie
nécessaire au transfert de matière entre la surface du pétrole et
l‘intérieur des cellules bactériennes (Ron et al. 2002). La
nature chimique de ces composés est extrêmement variable
d‘une bactérie à l‘autre. Cela peut être :
- des molécules de faible poids moléculaire de type
glycolipides dans lesquels les carbohydrates sont attachés à
de longues chaines d‘acides aliphatiques ou de lipopeptides
(rhamnolipides, lipides trehalos et sophorolipides)
- ou des composés plus complexes de type polysaccharides,
protéines, lipopolysaccharides, lipoprotéines ou encore un
mélange de biopolymères.
Tableau 3 : Biosurfactants/bioémulsifiants polymériques (en haut) et glycolipidiques (en bas) produits par
différents types de microorganismes marins (Satpute et al. 2010).
43 Chapitre 1 : Etat de l’art
Un grand nombre de
biosurfactants sont produits par
des souches du genre
Acinetobacter.
Les premiers permettent de diminuer les tensions de
surface. Ils sont sécrétés par exemple par certaines souches de
Pseudomonas (Lang et al. 1999) ou d’Alcanivorax
borkumensis (Abraham et al. 1998; Yakimov et al. 1998). Les
seconds sont moins efficaces dans la réduction de la tension de
surface mais servent de revêtement pour les gouttelettes de
pétrole et préviennent de leur coalescence (Rosenberg et al.
1997). Cette classe de bioémulsifiants intervient à de faibles
concentrations pour des ratios avec le pétrole de l‘ordre de
1:100 à 1:1000. Leur spécificité pour le substrat est
considérable. Certains peuvent par exemple fonctionner pour
l‘émulsification des molécules aromatiques de haut poids
moléculaire seulement. Les plus étudiés sont les biosurfactants
produits par les différentes souches du genre Acinetobacter
(Navon-Venezia et al. 1995; Rosenberg 2010). La production
de bioémulsifiant est induite par des signaux moléculaires
intervenant dans le « quorum sensing » (Ron et al. 2002). Elle
confère un avantage sélectif aux bactéries qui les produisent et
augmentent la dégradation du pétrole (Nerurkar et al. 2009;
Satpute et al. 2010). C‘est pourquoi elles font l‘objet d‘un
grand intérêt pour les expériences de bioremédiation ; un
aspect que nous aborderons dans la partie 3 de cette
introduction générale.
3.1.3. Rayonnement UV, température, salinité, ressources en oxygène et pression
Les UV modifient la nature des
hydrocarbures et des molécules
aromatiques en particulier.
La photo-dégradation des hydrocarbures par les UV est un
phénomène avéré mais qui a été très peu étudié. Pourtant, ce
processus pourrait être prépondérant dans les zones tropicales,
particulièrement ensoleillées, et/ou pauvres en sels nutritifs
(Ehrhardt et al. 1992). L‘action des UV sur les molécules
aromatiques et polaires, en particulier, libère des radicaux
libres capables de dégrader ces même molécules (Gorman
1992). Ainsi les processus photochimiques peuvent
rapidement altérer la composition initiale du pétrole, ce qui
La biodégradation se fait à un
optimum de température de 25 à
37°C.
peut avoir une influence sur la biodégradabilité des
hydrocarbures par les bactéries (Nicodem et al. 1997).
Même s‘il a été montré récemment que la dégradation de
diesel ou de pétrole brut pouvait aussi bien se faire à 25, 10 ou
4°C en conditions contrôlées avec de l‘eau de Méditerranée
(Rodríguez-Blanco et al. 2010), de manière générale on note
un effet de la température sur la dégradation des
hydrocarbures. D‘abord par ce que la température change la
nature même du pétrole. Lorsque les températures sont basses,
la volatilisation des composés de faibles poids moléculaires,
toxiques pour les microorganismes, ralentit, la viscosité du
pétrole augmente et l‘émulsification est plus difficile. Ce
phénomène diminue l‘étalement des nappes et donc leur
dégradation (Bianchi et al. 1988). Ensuite la température agit
sur la physiologie des microorganismes. L‘oxydation des
hydrocarbures a été observée à la fois à des températures
proches de zéro (ZoBell 1973; Delille 2000) et à des
températures autour de 70°C (Mateles et al. 1967). Mais la
biodégradation optimale a été observée en culture pure autour
de 25 à 37°C, ce qui correspond à l‘optimum de température
de bon nombre d‘enzymes bactériennes. Au-dessous, l‘énergie
à fournir pour le métabolisme des molécules doit être plus
grande et au-dessus, la stabilité des enzymes est compromise.
De ce fait, même si la biodégradation est un processus pouvant
se faire toute l‘année, certains auteurs proposent qu‘elle soit
plus efficace en été qu‘en hiver (Atlas et al. 1973).
A part dans les zones hypersalées,
la salinité n’est pas une barrière
à la dégradation des
hydrocarbures.
Il semblerait que la salinité n‘ait que peu d‘impact sur la
dégradation des hydrocarbures. Le métabolisme de ces
molécules est compatible avec des salinités très faibles (eaux
douces) ou plus élevées (eau de mer) puisqu‘il concerne, dans
ces deux types de milieux, des microorganismes adaptés à ces
salinités. Seules de très fortes salinités comme celles des
marais salants seraient un frein à la dégradation en raison du
45 Chapitre 1 : Etat de l’art
manque d‘oxygène régnant dans ces zones (Ward et al. 1978).
L’oxygène est prépondérant dans
le métabolisme des
hydrocarbures.
Les ressources en oxygène constituent un facteur
particulièrement important dans la biodégradation des
hydrocarbures (Cerniglia 1992). En effet, en milieu aérobie, la
dégradation des hydrocarbures est initiée par une étape
d‘oxydation faisant intervenir des hydroxylases et des
oxygénases à forte dépendance en oxygène. En milieu
anaérobie, l‘oxygène est remplacé par d‘autres types
d‘accepteurs d‘électrons mais le rendement y est
drastiquement réduit, la dégradation y est donc
particulièrement lente (ex : sédiments) (Coates et al. 1997).
Les fortes pressions diminuent
drastiquement la dégradation des
hydrocarbures.
Enfin, la pression semble également être un facteur
important dans la dégradation des hydrocarbures. Dans le cas
d‘un accident pétrolier, l‘attention est généralement portée sur
le pétrole qui s‘étale à la surface de l‘eau mais une grande
partie de ce pétrole coule au fond de la mer. Or la profondeur
moyenne des mers et océans est de 3800m, ce qui correspond
à une pression de 380 bars, un état qui ralentit fortement
l‘activité métabolique des microorganismes. Même s‘il a été
observé des phénomène de dégradation sous des pressions très
élevées (4940 m de profondeur) (Schwarz et al. 1975), le
manque d‘oxygène, et la faible température qui règnent au
fond des océans s‘ajoutent à la forte pression et rendent la
dégradation des hydrocarbures particulièrement lente par
rapport à la surface (Leahy et al. 1990).
Pour l‘ensemble de ces paramètres (UV, température,
salinité, ressources en oxygène et pression), les communautés
bactériennes impliquées dans la dégradation des
hydrocarbures présentent des spécificités. Ces contraintes
environnementales peuvent être particulièrement marquées et
variables d‘un endroit à un autre. Qu‘il y ait du pétrole ou non,
les communautés bactériennes y sont généralement adaptées
(Baldwin et al. 2005). Nous pouvons prendre comme exemple
Les facteurs d’origine abiotique
influencent les communautés
bactériennes impliquées dans la
dégradation du pétrole.
marquant les différences qui opposent les communautés
bactériennes hydrocarbonoclastes des milieux pélagiques et
benthiques.
Note pour le lecteur : le benthos est cité ici à titre d‘exemple en
comparaison avec le milieu pélagique mais nous tenons à préciser que
l‘ensemble des travaux de cette thèse reposent sur la dégradation des
hydrocarbures dans la colonne d‘eau uniquement.
La présence d‘oxygène dans le pelagos et l‘anaérobie
présente après quelques millimètres dans le benthos
déterminent complètement la composition des communautés
bactériennes et les métabolismes impliqués dans la
dégradation des hydrocarbures (Miralles et al. 2007). Les
facteurs environnementaux abiotiques sont donc des
paramètres importants dans la réponse des communautés
bactériennes aux hydrocarbures et ont une influence sur leur
biodégradation (Freijer et al. 1996; Sugai et al. 1997). Nous en
avons présenté cinq, dans cette partie, qui contribuent
généralement de manière significative à la structuration des
communautés bactériennes contaminées par le pétrole. Mais
ces facteurs sont bien plus nombreux et d‘autres comme le pH,
la houle ou encore le vent ont également leur importance. Il
serait inutile d‘en faire l‘inventaire complet ici mais nous
pouvons retenir que ces facteurs dans leur ensemble devraient
être systématiquement pris en compte dans les études sur la
biodégradation des pétroles, le choix des facteurs à étudier
dépendant bien sûr du type d‘environnement (zone pélagique
avec la lumière, la salinité, la température versus zone
benthique avec entre autres la pression, la teneur en oxygène
et la granulométrie, par exemple) (Bianchi et al. 1988).
3.1.4. Ressources en sels nutritifs (bottom-up)
Le métabolisme bactérien repose sur l‘utilisation de sels
nutritifs permettant de synthétiser les constituants cellulaires
(glucides, lipides, protéines et acides nucléiques). Ces sels
nutritifs sont :
47 Chapitre 1 : Etat de l’art
- le carbone, principal constituant cellulaire
- l‘azote et le phosphore, constituants des acides nucléiques et
des protéines
- le fer, le potassium, le cuivre, le zinc ou le magnésium qui
servent le plus souvent de co-facteurs dans les réactions
métaboliques.
- des éléments à l‘état de traces.
Les sels nutritifs ne sont pas
équitablement répartis dans le
milieu marin.
En milieu naturel, le manque de
ressources nutritives conduit à la
limitation de la croissance et de la
respiration bactérienne.
Un profil « classique » des ressources en azote et phosphore
dans une colonne d‘eau stratifiée montre le plus souvent une
concentration très faible dans la zone euphotique supérieure et
des concentrations plus fortes proches du sédiment. On parle
de nitrocline et de phosphacline pour exprimer la diminution
brutale de ces sels nutritifs avec la profondeur. De même que
généralement les quantités en sels nutritifs sont plus faibles au
large que près des côtes en raison des apports par les fleuves
(Conley 1999). En milieu pélagique, leur consommation
rapide par les microorganismes et le manque d‘apports
allochtones conduisent souvent à des limitations. Des
expériences en mésocosmes ont notamment montré que dans
certaines zones comme la Méditerranée Nord-occidentale, le
phosphore pouvait être un élément limitant pour la croissance
et la respiration bactérienne (Wambeke et al. 2002).
D‘ailleurs, bon nombre d‘études ont révélé que les ressources
nutritives pouvaient expliquer en partie la structuration des
communautés bactériennes aquatiques (Cho et al. 2004;
Ghiglione et al. 2008; Pradeep Ram et al. 2008).
Lors de déversements, le pétrole fournit une grande
quantité de carbone utilisable par les bactéries alors qu‘il ne
contient que très peu d‘azote et de phosphore (sous forme de
molécules particulièrement récalcitrantes à la dégradation la
plupart du temps). Il se crée alors un déséquilibre entre les
ressources en carbone, azote et phosphore, les rapports
stœchiométriques classiques entres les différents éléments
Les ressources en sels nutritifs
limitent la croissance bactérienne
et donc la biodégradation des
hydrocarbures.
En plus de son effet sur
l’abondance bactérienne, le
manque de ressources nutritives
influence la structure des
communautés bactériennes
impliquées dans la dégradation
du pétrole.
(rapport de Redfield : C :N :P = 106 :16 :1) sont bouleversés.
Le développement des bactéries hydrocarbonoclastes est alors
drastiquement limité par les ressources en nutriments
inorganiques ; ceci étant particulièrement valable en zone
oligotrophe (Atlas et al. 1972). La biodisponibilité des
nutriments limitant pour la croissance et la biomasse, en
particulier l‘azote et le phosphore, est un facteur clé dans le
processus de bioremédiation naturelle des hydrocarbures. En
plus de limiter l‘abondance bactérienne, il semblerait que la
disponibilité des nutriments puisse avoir un rôle important
dans la structuration des communautés dégradant le pétrole.
Selon le lieu de la catastrophe et les quantités de sels nutritifs
disponibles, l‘apport de pétrole pourrait sélectionner certaines
bactéries plutôt que d‘autres au sein des communautés en
fonction de leurs besoins en azote et phosphore (Röling et al.
2002; Head et al. 2006). Roling et al (2002) ont montré
qu‘une même communauté bactérienne ne s‘adaptait pas de la
même façon au pétrole selon les quantités d‘azote et de
phosphore disponibles. De plus, en milieu limité, les bactéries
hydrocarbonoclastes seraient en compétition pour les
nutriments avec les bactéries non-dégradantes et le
phytoplancton. Un tel partage des ressources a été
conceptualisé par la « ressource-ratio theory » appliqué aux
milieux pollués (Smith et al. 1998). Cette théorie prédit que la
structure et la fonction des communautés biologiques sont
influencées non seulement par la quantité limitée en
nutriments mais aussi par les besoins de chacun des différents
organismes pour la ressource en fonction de leurs besoins
métaboliques spécifiques. Elle aide à prédire la composition et
les propriétés des communautés bactériennes
hydrocarbonoclastes (Smith et al. 1998; Head et al. 2006).
Note pour le lecteur : le manque de ressources nutritives est un problème
majeur dans l‘élimination naturelle des hydrocarbures. Il sera plus
largement abordé dans la partie « bioremédiation » de cette introduction générale. Nous verrons alors comment s‘affranchir de cette limitation et
quelles en sont les conséquences pour la biodégradation des hydrocarbures.
49 Chapitre 1 : Etat de l’art
3.1.5. Récurrence de la pollution
La récurrence des pollutions
pétrolières conditionnent la façon
dont les communautés
bactériennes peuvent réagir à un
apport de pétrole.
Les bactéries provenant d’un site
chroniquement pollué sont
davantage réactives que celles
d’un site dépourvu de pollution.
Différents auteurs ont suggéré que des communautés
bactériennes soumises de manière chronique à des
contaminants pétroliers répondraient plus favorablement à un
nouvel apport que des communautés n‘ayant jamais été
soumises à une contamination (Bartha 1986). Pourtant cette
hypothèse a été très peu testée expérimentalement.
L‘adaptation de certaines communautés bactériennes aux
hydrocarbures s‘explique par trois mécanismes majeurs.
D‘abord, dans la mesure où le pétrole stimule la prolifération
des bactéries hydrocarbonoclastes en leur offrant un avantage
sélectif, les milieux pollués chroniquement sont plus riches en
bactéries hydrocarbonoclastes (HCB). En cas d‘apport soudain
de pétrole, l‘abondance relative de ces HCB permet d‘assurer
la mise en place rapide d‘un consortium de dégradation (Atlas
1981; Cooney 1984). Ensuite, les bactéries sont capables de
transférer des gènes du catabolisme des hydrocarbures par
conjugaison. Toujours en raison du nombre d‘HCB, la
probabilité pour que ce type d‘échange survienne dans un
environnement chroniquement pollué est plus grande (Hada et
al. 1981; Leahy et al. 1990). Enfin, dans les zones polluées,
des mécanismes d‘induction des enzymes d‘intérêt ont été
retrouvés en présence de pétrole (Suzuki et al. 2001; Priefert et
al. 2004).
En terme de structure de communautés, cette adaptation se
traduit par une plus grande stabilité des bactéries face à
l‘apport de pétrole dans les zones chroniquement polluées.
Cette stabilité confère aux bactéries la capacité de répondre
plus rapidement aux nouvelles sources d‘hydrocarbures que
les bactéries dépourvues de contamination (Head et al. 2006;
Maila et al. 2006; Bordenave et al. 2007). Cela leur permet
également de dégrader avec plus d‘efficacité les composés les
plus simples et de débuter la dégradation des composés les
plus complexes plus rapidement grâce à une machinerie
enzymatique pré-adaptée (Riis et al. 1995; Bordenave et al.
2008). Les expériences de bioremédiation devraient donc
prendre davantage en compte l‘historique du site pollué.
Note pour le lecteur : Un des chapitres de cette thèse est en grande partie
consacré à l‘évaluation expérimentale de l‘effet de la récurrence de la
pollution sur la capacité des communautés bactériennes à répondre à un
déversement soudain de pétrole (chapitre 2).
3.2. Les facteurs de type top-down
Nous avons vu précédemment que les communautés
bactériennes pouvaient être affectées par des facteurs
environnementaux abiotiques. Les facteurs biotiques sont
également responsables d‘une grande partie de la mortalité
bactérienne et induisent, tout autant que les facteurs
abiotiques, des changements de structure de communauté chez
les bactéries marines (Miki et al. 2008).
Bien qu’ils jouent un rôle
majeur, les facteurs de type « top-
down » sont très peu considérés
dans les études sur la
biodégradation des
hydrocarbures.
Notre pour le lecteur : il est important à ce stade de l‘introduction de
définir l‘attaque bactérienne par les protozoaires et les virus. La prédation désignant la plupart du temps un mode d‘ingestion, nous choisissons dans
ce manuscrit de le réserver à l‘attaque bactérienne par les protozoaires.
Nous parlerons de lyse virale en ce qui concerne l‘attaque par les virus. De
plus, nous assumons le fait que la prédation des bactéries est
majoritairement assurée par les nanoflagellés hétérotrophes et les ciliés
(tous deux appartenant aux protozoaires). Aussi l‘attention sera consacrée à
ces deux groupes pour évaluer la prédation sur le compartiment bactérien
en milieu aquatique (Atlas et al. 1976).
Les protozoaires et les virus tiennent une place centrale
dans les écosystèmes marins. Comme les bactéries, ils sont
ubiquistes, abondants et diversifiés autant par leur tailles que
par leurs modes nutritionnels (Kirchman et al. 2008). Il ne fait
désormais aucun doute que la prédation par les protozoaires et
la lyse virale jouent un rôle particulièrement important dans la
régulation des communautés bactériennes marines. En cas de
pollution pétrolière, l‘abondance, la diversité et l‘activité
bactérienne sont des paramètres cruciaux dans l‘élimination
des polluants. L‘évaluation du « top-down control » sur ces
51 Chapitre 1 : Etat de l’art
paramètres devrait donc être systématique dans les études sur
la bioremédiation des hydrocarbures. Pourtant, si les
connaissances sur les virus et les protozoaires ont largement
progressé ces dernières années, leur considération dans les
milieux pollués est encore très rare et les quelques études qui
leur sont consacrées donnent des résultats contradictoires.
Cette partie a donc pour objectif de faire le point sur les
connaissances actuelles sur les milieux pollués mais aussi
d‘établir un parallèle avec les données acquises en milieux non
pollués.
3.2.1. Dynamique de l‘abondance des protozoaires, des virus et des bactéries
Les protozoaires et les virus ne
sont pas éliminés par les pétroles
et sont capables de limiter la
concentration bactérienne dans
les zones polluées, laissant
supposer un effet négatif sur la
biodégradation des
hydrocarbures.
Les protozoaires phagotrophes et en particulier les
nanoflagellés hétérotrophes (HNF, 2-10µm) ainsi que les virus
sont les premiers responsables de la mortalité bactérienne
(Fuhrman et al. 1995). Par conséquent, ils régulent la
concentration bactérienne en milieu marin (Fuhrman et al.
1995; Zhang et al. 2007). Leurs abondances relatives semble
beaucoup varier dans l‘espace et dans le temps et serait
fonction de l‘état physiologique et de l‘abondance de leur
proies (Guixa-Boixareu et al. 1996; Pedrós Alió et al. 2000).
Les changements successifs d‘abondance des bactéries, virus
et protozoaires forment généralement des cycles proie-
prédateur (Fig. 13) permettant aux trois compartiments de se
maintenir autour de concentrations constantes tout au long de
l‘année (Pernthaler 2005).
Figure 13 : Alternance proie-prédateur entre les abondances bactériennes, virales et/ou de protozoaires
illustrant la dynamique du « killing the winner ».
Alors que les concentrations totales en bactéries et virus restent relativement constantes dans le temps, les
concentrations individuelles des différents groupes changent complètement. Comme le groupe bactérien 1 est abondant, les virus et protozoaires adaptés aux bactéries de ce groupe deviennent abondants à leur tour et
éliminent la population bactérienne. Un deuxième type bactérien est alors avantagé par l‘élimination du
compétiteur 1 et peut se développer. Une population virale et/ou de protozoaires infecte alors ce deuxième
groupe et celui-ci est à son tour éliminé. Une troisième population bactérienne peut prendre sa place et ainsi de
suite. Ce modèle montre des changements drastiques dans la structure de communauté et un maintien de la
diversité bactérienne avec des abondances relatives amplifiées sous conditions de pollution pétrolière, suggérant
un effet notable des protozoaires et des virus sur les bactéries et donc sur la dégradation des hydrocarbures.
Adapté de Kirchman et al., 2008.
De manière générale, les virus sont retrouvés en plus grand
nombre dans les milieux eutrophisés et les zones côtières, où
les bactéries sont plus abondantes (Weinbauer et al. 1993;
Wilhelm et al. 1999). Le nombre de protozoaires est
également plus élevé lorsque l‘abondance bactérienne
augmente (Bak et al. 1987). Comme on l‘a vu plus tôt, dans
les zones polluées par les hydrocarbures, les bactéries se
multiplient largement grâce à l‘abondante quantité de carbone.
Les protozoaires et les virus sont dans un premier temps
affectés par les effets toxiques du pétrole, mais par la suite
leurs effectifs sont augmentés en raison du plus grand nombre
de bactéries (Fig. 13), laissant supposer un effet accru du
« top-down » sur les populations bactériennes (Kota et al.
1999). Toyoda et al. (2005) ont par exemple noté une
augmentation de l‘abondance bactérienne après l‘ajout de
kérosène ou de pétrole de type Bunker-A suivie par une
53 Chapitre 1 : Etat de l’art
Les protozoaires seraient plus
sensibles au pétrole que les virus,
offrant à ces derniers un
avantage sélectif dans les milieux
pollués.
prolifération des protozoaires et des virus. Néanmoins, il
semblerait que les protozoaires soient plus sensibles aux
molécules toxiques que les virus. Il a en effet été montré que
certains protozoaires ne survivaient pas à la pollution (Dalby
et al. 2007). Cette sensibilité des protozoaires offrirait aux
virus un avantage certain pour l‘utilisation de la ressource
bactérienne. Toyoda et al. (2005) ont d‘ailleurs proposé que la
sensibilité et la prévalence des protozoaires face au pétrole
puisse être un des facteurs clé dans l‘évolution de la chaine
trophique microbienne dans les environnements pollués. De
plus, il a été montré qu‘un certain nombre de polluants comme
en particulier les HAP, seraient des stimulants de la
production virale, un phénomène appelé « prophage
induction » (Jiang et al. 1996; Cochran et al. 1998). Les virus
seraient donc capables de survivre à l‘apport de pétrole mais
en plus pousseraient les bactéries à rentrer dans un cycle
lytique en présence de certains hydrocarbures (Tableau 4). Ils
auraient donc un impact non négligeable sur l‘abondance
bactérienne en milieu pollué et donc sur l‘efficacité de
biodégradation des polluants.
Tableau 4 : Efficacité de différents agents d’induction de lyse virale sur des bactéries marines (Jiang et al.
1996).
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques sont les agents qui provoquent le plus la lyse des bactéries parmi
un ensemble de facteurs d‘induction à la fois biochimiques et physiques.
3.2.2. Impact des protozoaires et des virus sur la structure des communautés
bactériennes
Les interactions entre les bactéries, les virus et les
protozoaires sont complexes et portent au-delà de la simple
Les protozoaires et les virus
régulent la structure des
communautés bactériennes dans
les zones polluées.
relation d‘abondance entre les proies et les prédateurs. Non
seulement les protozoaires et les virus ont un impact avéré sur
l‘abondance bactérienne, mais ils sont également capables de
réguler la structure des communautés bactériennes dans les
milieux non pollués (Suzuki 1999; Weinbauer et al. 2004;
Longnecker et al. 2010) comme pollués (Kota et al. 1999;
Danovaro et al. 2003). La probabilité de rencontre entre un
prédateur et sa proie étant aléatoire, plus un groupe bactérien
est abondant, plus il est exposé à la prédation. Les groupes
bactériens majoritaires sont donc plus touchés par les
protozoaires et les virus. Cela conduit à une réduction de leur
effectifs et induit des changements de structure de
communauté, un phénomène appelé « killing the winner »
(Fig. 13) (Thingstad et al. 1997; Thingstad 2000; Pernthaler
2005).
La prédation par les protozoaires
et la lyse virale permettent un
renouvellement des communautés
bactériennes.
En milieu pollué, les communautés bactériennes sont
dominées par quelques groupes majoritaires, avantagés
sélectivement par l‘apport de pétrole. La prédation pourrait
donc affecter préférentiellement ces groupes d‘intérêt (Jürgens
et al. 2000; Jiang et al. 2006) et ainsi diminuer la dégradation
des hydrocarbures. Dans ce cas, les protozoaires et les virus
contraindraient négativement les communautés bactériennes
impliquées dans la dégradation du pétrole. Toutefois, il a été
montré à plusieurs reprises que les effets de type « top-down »
pouvaient être également positifs pour les bactéries car ils
maintiendraient une diversité métabolique chez les
populations bactériennes (Middelboe et al. 2003; Corno et al.
2008). Les données sur ce sujet manquent drastiquement
concernant les environnements pollués, mais on peut supposer
qu‘un tel contrôle des virus et des protozoaires sur les
bactéries puissent être à l‘origine d‘un renouvellement dans
les communautés bactériennes qui permettrait une meilleure
dégradation des hydrocarbures.
55 Chapitre 1 : Etat de l’art
La prédation par les protozoaires
se fait le plus souvent en fonction
de la taille des proies
bactériennes.
Les virus sont également
spécifiques de leur hôte, c’est la
condition sine qua none pour que
les virus puissent adhérer à la
surface des cellules bactériennes.
L‘attaque sélective des protozoaires sur les bactéries est un
phénomène répandu et explicable par plusieurs mécanismes.
D‘abord il semblerait que la prédation des protozoaires sur les
bactéries soit taille-spécifique. Les cellules les plus grandes
ont une probabilité de contact avec les prédateurs supérieure
aux autres, elles sont donc davantage impactées par le « top-
down control » (Šimek et al. 1997; Hahn et al. 1999; Jurgens
et al. 1999). Pour la même raison, les cellules en division
seraient aussi plus exposées à la prédation (Sherr et al. 1992).
Wotton et al. (2007) ont également trouvé des mécanismes de
reconnaissance des proies chez les protozoaires via des
épitopes de surface cellulaires. Indépendamment de la taille
des bactéries, les protozoaires pourraient donc « choisir » leur
proie.
L‘attaque spécifique des virus pour certains groupes
bactériens a également été vérifiée (Thingstad 2000;
Weinbauer et al. 2004). L‘une des principales raisons est leur
adaptation pour l‘infection d‘hôtes particuliers via des
récepteurs qui leurs sont spécifiques à la surface des cellules
bactériennes (Moebus et al. 1981; Moebus 1992). Un certain
nombre d‘autres effets, plus indirects peuvent être évoqués
pour expliquer l‘impact des virus sur la structure des
communautés bactériennes : par exemple, la libération de
substrat labile lors de la lyse virale peut favoriser certains
groupes bactériens non infectés (Middelboe et al. 2003), les
virus sont capables de transférer des gènes à leurs hôtes ou
encore certains hôtes pourraient trouver un avantage au cycle
lysogénique des virus (Jiang et al. 1998; Wommack et al.
2000). Un grand travail reste à faire concernant la spécificité
des virus pour les bactéries hydrocarbonoclastes en particulier.
3.2.3. Impact des protozoaires et des virus sur l‘activité bactérienne
Les virus et les protozoaires ont un impact à la fois sur
l‘abondance et la diversité bactérienne. C‘est donc sans
surprise que les études sur le « top-down control » observent
également un effet sur l‘activité bactérienne (del Giorgio et al.
1996; Hahn et al. 2001; Danovaro et al. 2003). Le principal
challenge étant de déterminer si cet effet est positif, à savoir
s‘il favorise l‘activité bactérienne (par des phénomènes
indirects de stimulation ; la dégradation des hydrocarbures par
exemple) ou si au contraire il est négatif, en contraignant
l‘abondance des bactéries et donc in fine en limitant l‘activité
bactérienne totale (ralentissement de l‘élimination naturelle du
pétrole).
La prédation et la lyse virale ont
des effets pouvant tout aussi bien
stimuler qu’inhiber l’activité des
communautés bactériennes.
L’effet négatif du « top-down » se
traduit par une sélection de
groupes bactériens peu actifs.
Cela pourrait avoir des
conséquences dramatiques pour
la dégradation des
hydrocarbures.
En réalité, il semblerait que ces effets antagonistes
interviennent tour à tour, les protozoaires et les virus agissant
comme des régulateurs (plus que des stimulants ou des
inhibiteurs à part entière) de l‘activité bactérienne (Miki et al.
2008). Del Gorgio et al. (1996) ont montré que les bactéries
métaboliquement actives subissaient une prédation quatre fois
plus importante que les bactéries non actives. Deux autres
études ont confirmé que la lyse virale des bactéries les plus
actives diminuait la production bactérienne au large de la mer
Méditerranée (Bonilla-Findji et al. 2009) comme près des
côtes (Zhang et al. 2007). La prédation et la lyse virale
sélectionneraient donc des bactéries dormantes ou/et
résistantes faisant diminuer l‘activité bactérienne totale (Hahn
et al. 2001). En cas de pollution pétrolière, les bactéries
avantageusement sélectionnées par l‘apport d‘hydrocarbures
sont généralement très actives (Bordenave et al. 2007;
Cappello et al. 2007; Coulon et al. 2007). Il serait donc
possible que ces bactéries soient particulièrement exposées à
la prédation en raison de leur grande activité, ce qui
reviendrait à éliminer les principaux groupes bactériens
impliqués dans la dégradation des hydrocarbures, avec un effet
supposé négatif sur celle-ci. Pourtant dans leur étude, del
57 Chapitre 1 : Etat de l’art
L’effet positif du « top-down »
serait dans le maintien de
l’activité bactérienne globale par
une forte pression de prédation et
une libération de nutriments par
les cellules bactériennes digérées
ou lysées.
Le « priming effect » est l’apport
de matière labile permettant une
meilleure dégradation de matière
difficilement dégradable.
Gorgio et al. (2006) suggéraient que cette attaque
préférentielle des bactéries actives combinée avec la pression
de prédation empêchait l‘ensemble des groupes bactériens de
rentrer en phase stationnaire de croissance, maintenant ainsi
l‘activité globale de la communauté. Ce phénomène serait
expliqué par la libération de matière labile (stérols, acides gras
saturés, etc…) par les protozoaires phagotrophes et les cellules
bactériennes lysées par les virus. Cette idée est d‘autant plus
pertinente pour les virus qui, induisant la lyse bactérienne,
libéreraient de la matière organique très peu altérée et
facilement dégradable alors que le transport de cette matière à
travers les vacuoles phagocytaires des flagellés subirait
davantage de dommages notamment sous l‘action d‘enzymes
hydrolytiques (Noble et al. 1999; Riemann et al. 2002; Salcher
et al. 2007). Là où dans les milieux non pollués, ce relargage
stimule directement les bactéries, un effet supplémentaire
devrait être ajouté en milieu pollué par les hydrocarbures.
Dans ce cas, le carbone n‘est pas limitant. Il serait donc
logique que la matière organique libérée par la lyse des
bactéries et le broutage des protozoaires ne stimule pas ou peu
les bactéries restantes. Toutefois, il a été remarqué dans les
études sur les communautés bactériennes du sol, qu‘une
source de matière organique facilement dégradable pouvait
favoriser la dégradation de matière de moins bonne qualité, un
effet connu sous le nom de « priming effect » (Bingeman et al.
1953; Fontaine et al. 2003). Par cet effet, le métabolisme de la
matière organique labile libère de l‘énergie favorisant
l‘activité générale des bactéries, ce qui leur permet d‘assimiler
plus facilement les composés plus complexes. Bien qu‘il n‘y
ait aucune étude équivalente en condition de pollution par les
pétroles, il vient d‘être montré que cette théorie serait tout à
fait valable, voire même prépondérante en milieu marin
(Guenet et al. 2010). Nous pouvons émettre l‘hypothèse que le
La libération de matière
organique et de sels nutritifs
induite par la lyse virale et la
phagotrophie pourrait stimuler
les bactéries hydrocarbonoclastes
dans leur fonction de
biodégradation des
hydrocarbures.
relargage de matière fraiche par les protozoaires et les cellules
lysées augmenterait l‘activité de la communauté bactérienne
totale et favoriserait les bactéries hydrocarbonoclastes dans
leur fonction de dégradation des hydrocarbures. Si cette
hypothèse s‘avérait juste, elle pourrait offrir de nouvelles
pistes concernant la biostimulation des bactéries
hydrocarbonoclastes (voir partie 3 de cette synthèse
bibliographique).
Outre la matière organique, ce relargage permettrait
également de libérer 50% de l‘azote et du phosphore ingéré
par les flagellés au cours de la prédation sous forme
inorganique (Fenchel 1982; Güde 1985). Dans la mesure où
les bactéries impliquées dans la dégradation du pétrole sont la
plupart du temps limitées par les sels nutritifs, un tel apport
favoriserait radicalement l‘activité bactérienne et la
biodégradation des hydrocarbures. Le peu d‘études qui
évaluent l‘impact de la lyse virale et/ou du broutage par les
protozoaires sur l‘activité bactérienne et la biodégradation
montrent des résultats contrastés et ne permettent pas se
s‘orienter clairement vers les unes ou les autres hypothèses
présentées ici. Alors que Kota et al. (1999) ont trouvé un effet
négatif de la prédation sur la dégradation des hydrocarbures,
Mattison et al. (2005) au contraire, ont démontré que celle-ci
favorisait la dégradation des alkylbenzènes et Tso et Taghon
(2006) arrivèrent à la même conclusion pour la minéralisation
du phénanthrène. Il y a de fortes chances pour que ces effets
soient variables en fonction du lieu de l‘étude et de l‘état
physiologique des communautés de prédateurs et de proies
(Weinbauer et al. 2007; Miki et al. 2008).
Finalement, la plupart des études réalisées par le passé pour
évaluer l‘importance du « top-down » sur les communautés
bactériennes en milieu pollué se sont focalisées sur
l‘abondance des différents microorganismes (tableau 5). Des
59 Chapitre 1 : Etat de l’art
études supplémentaires sont nécessaires pour renseigner sur
l‘effet du « top-down » sur la structure et l‘activité des
communautés bactériennes.
Tableau 5 : Aperçu des études sur le « top-down control » en milieu marin pollué par les hydrocarbures.
Principe de l’étude Observations Impact sur les
bactéries Référence
Mésocosme avec des protozoaires
pélagiques (<50 µm) et un
traitement aux hydrocarbures
Elimination complète des ciliés sous l‘effet
des polluants
Croissance des HNF en 3 jours
Limitation de l‘abondance
bactérienne par les
protozoaires
Bak et
Nieuwland
(1987)
Induction expérimentale de virus
par ajout de polluants à partir
d‘échantillon naturel
Les polluants induisent le cycle lytique des
bactéries et augmente la production virale
Cochran et al.
(1998)
Prédation des bactéries par le
protozoaire Tetrahymena
pyriformis dans des cultures de
dégradation du toluène
Effet du toluène sur le protozoaire à des fortes
concentrations uniquement
Limitation de l‘abondance
bactérienne par le protozoaire
Cox et al.
(1999)
Effet du pétrole brut de type
Ekofisk sur un écosystème
planctonique
Les polluants inhibent la croissance des
diatomées et des copépodes mais stimule les
bactéries, les choanoflagellés et les ciliés
La prédation n‘affecte pas
l‘abondance bactérienne
Dahl et al.
(1983)
Microcosme pour tester l‘impact
du pétrole sur les microeucaryotes
marins et leur effet sur les
communautés bactériennes
La structure des communautés des
microeucaryotes est modifiée par l‘ajout de
pétrole au profit de Paraphysomonas
foraminifera
Limitation de l‘abondance
bactérienne par les
microeucaryotes
Dalby et al.
(2007)
Revue sur les virus et la pollution
marine La pollution augmente la production de virus par les bactéries
Danovaro et al.
(2003)
Induction expérimentale de virus
par ajout de polluants à partir
d‘échantillon naturel
Les polluants induisent le cycle lytique des
bactéries et augmente la production virale
Jiang et Paul.
(1996)
Test de l‘influence de la prédation
par les protozoaires sur la
biodégradation du pétrole dans des
sédiments d‘aquifère
Les protozoaires résistent au pétrole
Limitation de l‘abondance
bactérienne par les
protozoaires
Kota et al.
(1999)
Mésocosmes pour étudier les
changements de communauté de
flagellés et de ciliés marins sous
l‘influence de pétrole brut
Augmentation de l‘abondance des flagellés et
ciliés après l‘ajout de pétrole
La structure des communautés des
microeucaryotes est modifiée par l‘ajout de
pétrole au profit des Euplotidae et des
Scuticociliatia de grande taille
Limitation de l‘abondance et
de la production bactérienne
par les flagellés et les ciliés
Gertler et al.
(2010)
Mésocosme pour étudier
l‘interaction bactéries-HNF-virus
sous addition de pétrole lourd
Virus et HNF résistent à la pollution
Limitation de l‘abondance
bactérienne par les HNF et les
virus
Ohwada et al.
(2003)
Réponse expérimentale d‘un
écosystème marin au pétrole brut
et au Corexit 9527
Augmentation de l‘abondance des bactéries et
des zooflagellés après ajout de pétrole +
Corexit
Limitation de l‘abondance
bactérienne par les
zooflagellés
Parsons et al.
(1984)
Protozoaires de la subsurface d‘un
sédiment pollué par du gazole
Les protozoaires se multiplient fortement
même sous influence du pétrole
Pas d‘impact sur l‘abondance
bactérienne. Suspicion même
d‘un effet positif des
protozoaires
Sinclair et al.
(1993)
Mésocosme pour étudier les
interactions bactéries-HNF-virus
sous addition de bunker-A ou de
kérosène
Le kérosène inhibe les HNF et les virus alors
que le Bunker-A les stimule
Les Virus et HNF sont en compétition pour
les bactéries
Limitation de l‘abondance
bactérienne par les HNF et les
virus
Toyoda et al.
(2005)
Etude des facteurs qui influencent
la prédation de Cyclidium sp. et
Euplotes sp. (deux ciliés) sur des
bactéries PAH-dégradantes
Les multiples propriétés des bactéries (taille,
hydrophobicité, C : N ratio, contenu en
protéines et capacité de dégradation des PAH)
influence leur sensibilité à la prédation par les
ciliés.
La capacité de dégradation des
PAH n‘a pas d‘importance
dans la sensibilité des
bactéries aux ciliés
Tso et Taghon
(1998)
Effet des protozoaires sur la
minéralisation du naphtalène dans
les sédiments marins
Les bactéries sont 9 fois moins abondantes
lorsqu‘il n‘y a pas de protozoaires
La dégradation du naphtalène
est 4 fois plus importante dans
le milieu avec protozoaires
Tso et Taghon
(2006)
3.2.4. Mécanismes de résistance bactériens et interactions virus - protozoaires
Au cours de l’évolution, les
bactéries ont appris à résister à la
prédation.
Les bactéries
hydrocarbonoclastes résistantes
aux protozoaires et aux virus
pourraient être avantagées par
rapport aux bactéries sensibles
dans la cas d’un pollution
pétrolière.
Les protozoaires peuvent
également ingérer des virus et les
virus peuvent infecter les
protozoaires.
On distingue différentes stratégies chez les bactéries pour
échapper au broutage par les protozoaires. Elles peuvent par
exemple former des filaments (Jurgens et al. 1999), augmenter
leur mobilité (Matz et al. 2002) ou encore se diviser en deux
cellules, une de grande taille très active et une de petite taille
inactive (Lebaron et al. 1999). Les bactéries ont également
développé des mécanismes de résistances contre les virus
notamment par mutation de la structure des récepteurs
membranaires permettant d‘éviter l‘attachement aux virus, la
production d‘ecto-enzymes capables d‘hydrolyser les
protéines de capside virale ou encore la délétion spontanée
d‘une partie de génome bactérien (Weinbauer et al. 2004). Ces
phénomènes de résistance ont un « coût » énergétique qui se
traduit par une baisse de la compétitivité chez certains groupes
bactériens (Lenski 1988). Il est tout à fait probable qu‘en cas
de pollution pétrolière, la résistance aux flagellés et/ou aux
virus soit un avantage sélectif pour certains types de bactéries
et pour les bactéries hydrocarbonoclastes en particulier. Bien
qu‘il n‘existe aucune étude à ce jour sur le sujet, nous pouvons
émettre l‘hypothèse que l‘effet concomitant de la compétition
entre les bactéries pour les ressources en carbone et les
capacités de résistances de certaines d‘entre elles pourraient
conduire à la sélection de groupes bactériens particuliers, tout
à fait spécifiques du milieu et des prédateurs.
Enfin, les interactions entres les flagellés et les virus eux-
mêmes ne peuvent être ignorées car elles pourraient être
déterminantes pour leurs effets synergiques sur les bactéries.
En effet, les protozoaires et les virus sont en compétition pour
la ressource bactérienne (Fuhrman 1999). Les flagellés
peuvent également ingérer des virus. Selon Gonzales et Suttle
(1993), 2,6 à 4,8% de la production virale serait absorbée par
61 Chapitre 1 : Etat de l’art
les flagellés en zone côtière marine. Inversement, certaines
études ont montré une augmentation de la production virale en
présence de flagellés via une meilleure activité bactérienne
(Šimek et al. 2001; Sime-Ngando et al. 2005; Weinbauer et al.
2007). Les virus peuvent à leur tour infecter les flagellés
(Massana et al. 2007). Le diagramme de Miki et Jacquet
(2008) ci-dessous (Fig. 14) illustre bien la complexité des
échanges et impacts que peuvent avoir les bactéries, les virus
et les protozoaires entre eux. De nouvelles investigations sont
nécessaires pour évaluer plus précisément l‘importance et
l‘effet de ces interactions sur les assemblages microbiens en
milieu pollué.
Figure 14 : Principaux mécanismes d’interactions identifiés entre les bactéries, les HNF et les virus (Miki
et al. 2008; Berdjeb 2010).
4. La bioremédiation des hydrocarbures pétroliers
4.1. Comment remédier à la pollution pétrolière ?
La pollution d’origine
anthropique du milieu marin est
une conséquence de notre mode
de vie industrialisé et constitue
une préoccupation majeure
depuis ces 50 dernières années.
Toute substance introduite dans l‘environnement en
quantité anormale est considérée comme un contaminant. Un
excès de contaminant peut aboutir à une contamination. Les
effets délétères que les contaminants ont sur la faune et la flore
conduisent à la pollution des écosystèmes. Les pollutions
marines sont définies par l‘organisation maritime
internationale (OMI) comme « l‘introduction dans
l‘environnement marin par l‘homme, directement ou non, de
substance ou d‘énergie générant des effets néfastes sur
l‘environnement ou susceptibles d‘affecter la santé humaine,
les activités halieutiques (pêche), les sites, les aménagements
et l‘utilisation de l‘eau de mer ».
Avec des analogues de polluants tels qu‘on les définit
aujourd‘hui, provenant des activités géothermiques et
volcaniques, des poussières de l‘espace et des comètes, la
« pollution naturelle » représente 100 tonnes de matériel par
jour (Marcano et al. 2003). Toutefois, l‘industrialisation
intensive de ces deux derniers siècles est la source de
nombreuses pollutions bien plus dommageables pour
l‘environnement que la pollution naturelle. Les substances
chimiques sont désormais déversées de manière soudaine, dans
de petites zones et dans des écosystèmes souvent peu adaptés
aux molécules polluantes avec des dommages extrêmement
importants sur les écosystèmes. Les substances chimiques
issues de l‘activité humaine sont nombreuses. On trouve parmi
les polluants les plus courants :
- les hydrocarbures aliphatiques, aromatiques, de type benzène,
toluène, éthylbenzène et xylène (BTEX),
- les hydrocarbures chlorés comme les biphényles polychlorés
(PCB), le trichloréthylène (TCE), le perchloréthylène (PCE),
63 Chapitre 1 : Etat de l’art
Les sources et les types de
pollutions sont nombreux et
provoquent des dommages
extrêmement importants sur les
écosystèmes.
Un ensemble de formations
gouvernementales et de
réglementations ont été mises en
place ces dernières années pour
faire face à la pollution
pétrolière.
Au niveau international, on peut
retenir le Oil Pollution Act qui
est un véritable guide de la
pollution pétrolière en milieu
marin.
- les composés nitro-aromatiques et organophosphorés,
- les solvants (ex : white spirit)
- les pesticides
- les métaux lourds
- les dérivés de produits pharmaceutiques…
Quatre-vingt-dix pourcent de la pollution par ces molécules
est directement liée à des défaillances humaines et aux
activités industrielles, volontaires (élimination des déchets) ou
involontaires (accidents pétroliers par exemple) (Zhu et al.
2001).
En raison de l‘ampleur des dégâts, la pollution d‘origine
anthropique est donc devenue une préoccupation mondiale
(Megharaj et al. 2011), un large corpus de recherche sur la
bioremédiation de ces molécules s‘est mis en place ces
dernières décennies (Head et al. 1999) et de nombreuses
règlementations ont vu le jour.
La communauté internationale s'est notamment dotée de
textes précisant les grands principes internationaux en matière
de prévention et de lutte contre les pollutions marines.
La Convention des Nations Unies sur le Droit de la mer
(UNCLOS) comporte par exemple une partie dédiée à la
protection et la préservation du milieu marin: elle fonde la
compétence des états côtiers à réglementer la pollution par les
navires dans le respect du droit international et la possibilité de
créer des zones à protéger (ZMPV). MARPOL 73/78 est une
convention internationale pour la prévention de la pollution
par les navires. La convention OPRC (Oil Pollution
Preparedness, Response, and Cooperation) sur la préparation,
la lutte et la coopération en matière de pollution par les
hydrocarbures encourage, elle, les pays adhérents, l‘industrie
pétrolière et le secteur des transports maritimes à mettre en
place des dispositifs de lutte contre les déversements
d‘hydrocarbures. Aux Etats-Unis, le Oil Pollution Act, établi
Au niveau européen, la directive-
cadre stratégie pour le milieu
marin a pour objectif de
permettre une amélioration de
l’état du milieu marin d’ici une
dizaine d’année.
En France, des mesures ont été
prises de manière à pouvoir
répondre rapidement à une
éventuellement catastrophe
pétrolière.
en 1990 fait référence en matière de lutte contre la pollution
pétrolière.
Au niveau européen, l‘Agence Européenne pour la Sécurité
Maritime (AESM) assiste la Commission et les Etats membres
en matière de sécurité maritime, sûreté maritime et prévention
de la pollution causée par les navires. Dans la réglementation
européenne, on peut citer la directive 2008/56/CE du
Parlement européen et du Conseil du 17 juin 2008 établissant
un cadre d‘action communautaire dans le domaine de la
politique pour le milieu marin (directive-cadre « stratégie pour
le milieu marin »). Cette directive a pour objectif de pousser
les États membres de l‘Union européenne à prendre toutes les
mesures nécessaires pour réduire les impacts des activités sur
le milieu marin afin de réaliser ou de maintenir un bon état
écologique de ce milieu avant 2020. Toujours au niveau
européen, le REACH (règlement sur l'enregistrement,
l'évaluation, l'autorisation et les restrictions des substances
chimiques) a été mis en place en juin 2007 pour assurer un
niveau élevé de protection de la santé humaine et de
l'environnement contre les risques que peuvent poser les
produits chimiques. Enfin, la liste des 33 substances
prioritaires à suivre dans l‘environnement, élaborée dans le
cadre de la directive 2000/60/CE, est toujours d‘actualité. La
moitié des molécules de cette liste peuvent potentiellement
être présentes dans les pétroles (Tableau 6).
En France, un certain nombre de mesures ont été prises
pour la lutte contre la pollution pétrolière. Très concrètement,
le POLMAR est destiné à financer les opérations de
prévention et de lutte contre les pollutions marines
accidentelles. Récemment, le Grenelle de la Mer est venu
compléter les engagements pris lors du Grenelle de
l‘environnement, concernent la mer et le littoral. Il couvre un
large champ sur la thématique de la mer et de sa contribution
65 Chapitre 1 : Etat de l’art
au développement d‘activités durables. Le CEDRE, lui, est un
centre de documentation, de recherche et d‘expérimentations
sur les pollutions accidentelles des eaux, créé au lendemain de
l‘accident de l‘AMOCO CADIZ (1978) afin de conseiller les
administrations dans le choix des techniques et des moyens les
plus appropriés pour faire face à une pollution massive.
Une présentation détaillée de toutes ces mesures
internationales et nationales sont disponibles sur le site internet
du CEDRE.
Tableau 6 : Liste des 33 substances prioritaires établie dans la circulaire DCE 2007/20 du 05/03/07 relative
à la constitution et la mise en œuvre du programme de surveillance pour les eaux littorales en application
de la directive 2000/60/CE du 23 octobre 2000 du Parlement et du Conseil établissant un cadre pour une
politique communautaire dans le domaine de l’eau. En rouge, les molécules potentiellement présentes
dans les pétroles.
Il est important de souligner que l‘ensemble des mesures,
établies durant ces 40 dernières années, ont permis de
diminuer considérablement le nombre d‘accidents pétroliers et
de rejets volontaires. Néanmoins, comme on l‘a vu en
L’élimination du pétrole en
milieu marin est un processus
long qui s’effectue en plusieurs
étapes.
Tout de suite après un épandage
de pétrole, l’objectif est de limiter
la dispersion de la nappe qui se
trouve à la surface
Ce qui n’est pas récupéré est
ensuite dispersé pour favoriser la
dissolution du pétrole dans l’eau.
introduction, la pollution pétrolière est un problème loin d‘être
éradiqué. Voici donc les opérations menées en cas de
déversement accidentel de pétrole en milieu marin.
Généralement après un épandage, on distingue 3 phases
conduisant à l‘élimination du pétrole. Pendant environ 15
jours, le pétrole s‘étend sous forme de nappe, provoquant une
forte mortalité de la faune aquatique. Ensuite la nappe se
stabilise, les processus physico-chimiques et biologiques se
mettent en place pendant quelques mois voir années. Puis
enfin, souvent au bout d‘une dizaine d‘années, on observe en
apparence un retour à l‘équilibre. Il est possible d‘intervenir à
différents moments dans ce processus pour favoriser
l‘élimination des polluants. En premier lieu, il s‘agit de limiter
la dérive de la nappe vers le littoral à l‘aide de barrages
flottants gonflables et de pomper au maximum le pétrole en
surface voir de « l‘écrémer » à l‘aide d‘un tapis roulant, ou
encore de ramasser manuellement les boulettes de goudrons
déjà échouées sur les plages. Cela a pour avantage de
récupérer une petite partie du pétrole et n‘implique pas de
déversement de produit chimique. Néanmoins, ces actions ne
sont possibles que lorsque la mer est calme et que le pétrole
forme réellement une nappe, ce qui est rarement le cas lors
d‘un épandage. Cette intervention physique, ne permet en
général de récupérer qu‘une petite partie du pétrole (5 à 15%
tout au plus). Dans un deuxième temps, l‘objectif est de
disperser et/ou de faire couler la nappe de pétrole à l‘aide de
produits de coulage ou de dispersants. Ce procédé permet
d‘augmenter les surfaces de contact eau/pétrole où ont lieu les
réactions physico-chimiques et de biodégradation. Il a aussi un
intérêt sociétal majeur puisqu‘il fait « disparaitre »
visuellement la pollution. Pour autant, il est de plus en plus
controversé car, d‘une part cela induit de forts dégâts sur les
fonds marins, des zones où la biodégradation est difficile.
67 Chapitre 1 : Etat de l’art
La bioaugmentation et la
biostimulation sont les deux
techniques les plus performantes
pour favoriser l’élimination du
pétrole lorsque les méthodes
physiques ont déjà été employées.
D‘autre part, les produits dispersants peuvent être eux même
toxiques pour l‘environnement. Cela a été notamment le cas
lors de la catastrophe dans le golfe du Mexique, où des
quantités gigantesques de Corexit 9500 (4 millions de litres,
c‘est un record mondial) ont été déversées, dispersant le
pétrole mais aussi provoquant une deuxième catastrophe
écologique puisque ce produit est classé dans la catégorie
« toxique pour l‘environnement » (Steiner 2010).
On note bien ici les limites de ce type d‘approche. Une
alternative intéressante à ces méthodes physico-chimiques est
la stimulation des bactéries impliquées dans la dégradation du
pétrole. La biodégradation a pour avantage indéniable qu‘elle
est naturelle, qu‘elle n‘implique aucune intervention humaine,
et donc aucun effet supplémentaire sur la flore aquatique, et
surtout qu‘elle ne coûte rien. Son inconvénient majeur est
qu‘elle peut être très lente. Le challenge est donc d‘accélérer
ce processus naturel (Megharaj et al. 2011). Il existe pour cela
deux principales méthodes : i) l‘addition de microorganismes
hydrocarbonoclastes cultivés en laboratoire dans le milieu
pollué, appelé bioaddition ou bioaugmentation, et ii) la
stimulation des bactéries autochtones par l‘ajout de sels
nutritifs, de molécules surfactantes ou de matière organique,
appelé biostimulation (Swannell et al. 1996). A titre d‘exemple
dès 1976, Atlas et Budosh testaient un système de cylindres en
plexiglas flottant sur une zone pollué en Alaska. Après 21
jours d‘incubation des cylindres, l‘addition combinée d‘un
fertilisant oléophile (octyl phosphate et urée paraffiné) et
d‘une souche de Pseudomonas hydrocarbonoclaste avait
permis de dégrader 65% du pétrole brut, alors que cette
dégradation n‘était que de 51% avec le fertilisant seul, 27%
avec l‘ajout de bactéries hydrocarbonoclastes et 25% sans
intervention humaine. Depuis lors, ces deux techniques ont été
largement employées. Il reste encore pourtant beaucoup de
questionnement concernant la variation dans les résultats
obtenus sur la dégradation des hydrocarbures.
4.2. Addition de microorganismes hydrocarbonoclastes : la bio-addition
La bioaddition est une technique
qui a montré des résultats mitigés
par le passé en raison de la
difficulté des microorganismes
cultivés en laboratoire à
s’adapter au milieu naturel.
La bio-addition a montré des résultats contrastés et il y a eu
un débat sur l‘efficacité de cette méthode (Bartha 1986;
Cunningham et al. 2004). La plupart des expériences de
bioaugmentation ont porté sur des pollutions dans le sol, la
technique étant plus compliquée encore à mettre en œuvre
dans les milieux aquatiques en raison de la forte dilution des
microorganismes ajoutés (Tagger et al. 1983; El Fantroussi et
al. 2005). De manière générale, l‘utilisation de souches
bactériennes sélectionnées pour leur capacités métaboliques
des hydrocarbures a souvent échoué dans les environnements
naturels (Horowitz et al. 1978; Goldstein et al. 1985). La
raison principale évoquée pour expliquer cet échec est que les
bactéries cultivées en laboratoire n‘arrivent pas à faire face aux
stress biotiques et abiotiques des zones dans lesquelles elles
sont ré-introduites (Atlas et al. 1992; Leavitt et al. 1994; Vogel
1996). En plus de ne pas s‘acclimater, elles sont rapidement
diluées et disparaissent après leur ajout sous l‘action de ces
différents stress (MacNaughton et al. 1999). Ainsi le maintien
de l‘activité de ces bactéries sur une période prolongée après
leur inoculation est souvent le principal obstacle à la méthode
(Mishra et al. 2001). Dans l‘optique de l‘améliorer, certains
ont eu l‘idée d‘utiliser des supports comme niche protectrice
pour les inocula bactériens pouvant offrir à la fois une surface
d‘accrochage et un réservoir nutritionnel pour les bactéries
d‘intérêt (Van Veen et al. 1997; Gertler et al. 2009). Bien sûr,
il est nécessaire que le montage perdure suffisamment
longtemps dans l‘environnement pour que la méthode soit un
succès. Mais il faut également que le support soit non toxique,
non polluant, peu onéreux et biodégradable à long terme pour
69 Chapitre 1 : Etat de l’art
qu‘une fois la dépollution effectuée, il puisse de lui-même
s‘éliminer sans conséquences pour l‘environnement (Leenen et
al. 1996). L‘ensemble de ces contraintes a conduit par exemple
à l‘utilisation de supports de type chitineux provenant
d‘exosquelettes d‘arthropodes (crevettes, crabes, etc…) séchés
et traités à la soude (Fig. 15) (Li et al. 1992). La chitine est le
deuxième polysaccharide le plus abondant sur terre après la
cellulose et fait l‘objet d‘un grand intérêt industriel
(Muzzarelli 1973). Son utilisation est peu onéreuse et son
application dans les méthodes de bio-addition a largement
amélioré les résultats (Leenen et al. 1996; Gentili et al. 2006).
Figure 15 : Exemple de biofilm formé par Rhodococcus corynebacterioides sur un support chitineux incubé
avec 0, 25% de kérosène (v/v) pendant 120 h vu au microscope scanner à électron (Gentile et al. 2006).
L’amélioration récente des
techniques de bioaugmentation
devrait permettre de révéler le
potentiel de cette méthode.
D‘autres études ont employé des supports permettant en
plus d‘absorber le pétrole comme le « X-Oils® sorbent
material » sur lesquels des biofilms de bactéries
hydrocarbonoclastes (Alcanivorax par exemple) peuvent se
développer avec succès (Suni et al. 2004; Gertler et al. 2009).
Dans leur revue, Gentry et al. (2004) ont proposé d‘autres
solutions possibles pour améliorer l‘efficacité des expériences
de bioaugmentation, dont certaines adaptables au milieu
aquatique : utilisation de cellules encapsulées dans un support
de type alginate ou addition directe de gènes d‘intérêt dans le
but de transférer aux bactéries autochtones des capacités
métaboliques pour la dégradation des hydrocarbures qu‘elles
n‘avaient pas ou peu.
Après un abandon momentané de la méthode en raison des
mauvais résultats, l‘ensemble de ces approches a relancé les
tests et la bio-addition connait un nouvel intérêt dans les
études sur la bioremédiation (El Fantroussi et al. 2005; Gentili
et al. 2006). Il est prévu que les prochaines années apportent
une réponse définitive quant à la pertinence et à l‘efficacité de
la bioaugmentation (El Fantroussi et al. 2005).
4.3. Fertilisation organique et inorganique : la biostimulation
La biostimulation par ajout de
nutriments est une méthode
privilégiée pour améliorer la
biodégradation des
hydrocarbures.
La biostimulation consiste à
stimuler la croissance des
microorganismes autochtone en
levant la limitation par les
ressources nutritives.
La biostimulation consiste à ajouter des nutriments
organiques et/ou inorganiques aux environnements pollués par
les hydrocarbures de manière à éliminer le problème de la
limitation des bactéries par les ressources nutritives (voir
partie 3.1.4, pour l‘effet du « bottom-up » sur les
communautés bactériennes marines). Cette technique a jusque-
là montré des résultats plus encourageants que la
bioaugmentation et reste aujourd‘hui la meilleure façon de
favoriser la biodégradation des hydrocarbures. Son utilisation
très répandue est en grande partie due à son succès lors de la
catastrophe de l‘Exxon Valdez en 1989. Des tests d‘une
ampleur sans précédent ont alors été effectués pour comparer
l‘efficacité de plusieurs types de molécules devant améliorer la
dégradation du pétrole déversé (Venosa et al. 1990).
De manière générale, la biostimulation stimule la
croissance et l‘activité bactérienne, permettant ainsi une
meilleure biodégradation des hydrocarbures (Prince 1993;
Coulon et al. 2003). Elle provoque également la plupart du
temps des changements dans la structure des communautés
bactériennes en promouvant certaines bactéries plutôt que
d‘autres en fonction de leurs besoins nutritionnels respectifs et
leurs capacités de compétition pour la ressource (Smith et al.
1998; Head et al. 1999; Evans et al. 2004; Coulon et al. 2007).
L‘ajout de sels nutritifs inorganiques (ex : KNO3, NaNO3,
71 Chapitre 1 : Etat de l’art
Tout le succès de la
biostimulation repose sur le
choix de la quantité optimale de
sels nutritifs à appliquer à la
zone contaminée.
La « ressource ratio-theory » est
une piste permettant de prédire
l’effet de la biostimulation sur les
communautés bactériennes.
NH4NO3, K2HPO4 MgNH4PO4) a montré son efficacité par le
passé (Lee et al. 1989; Lee et al. 1991; Lee et al. 1995). Le
plus souvent, ces sels sont libérés sous forme de briquettes ou
de granules pour limiter leur dilution dans l‘eau (Safferman
1991). Il existe un consensus concernant l‘ajout de sels
nutritifs qui est réalisé en général à hauteur de 1 à 5% de la
quantité de pétrole avec un ratio entre l‘azote et le phosphore
de 5 à 10:1 (Swannell et al. 1996). Toutefois des résultats
variables ont été obtenus selon le type et la concentration en
sels nutritifs employés et les caractéristiques du milieu (Lee et
al. 1991). Cette variation dans l‘efficacité de la méthode
s‘explique par la difficulté de planifier des traitements adaptés
aux différents milieux pollués (Head et al. 1999). La plupart
des résultats concernant la biostimulation ont été obtenus
expérimentalement. Par conséquent, il n‘y a pas de schéma
clair permettant d‘adapter les traitements et de prédire la
réponse des systèmes microbiens à ces actions in situ. La seule
piste permettant de poser des bases théoriques à l‘application
de ce traitement est la « ressource-ratio theory » appliquée aux
environnements pollués (Smith et al. 1998). Cette théorie rend
compte de la structure et de la fonction des communautés
bactériennes en compétition pour les nutriments nécessaires à
leur croissance. Smith et al. (1998) ont montré que la
biodégradation d‘hexadécane et de phénanthrène était
influencée non seulement par la quantité absolue de nutriments
ajoutés mais aussi par les rapports relatifs entre l‘azote et le
phosphate. La principale observation faite par les auteurs était
qu‘il existait deux optimums distincts de ratios N:P pour la
biodégradation du phénanthrène à savoir 5:1 et 20:1
impliquant deux types de populations phénanthrène-
dégradantes différentes avec des besoins en nutriments
différents et des voies cataboliques différentes. La dégradation
du phénanthrène et de l‘hexadécane ne nécessitaient pas non
L’ajout de sels nutritifs favorise
certains types bactériens plutôt
que d’autres, induisant des
changements de structure de
communauté.
La biostimulation peut également
se faire par ajout de molécules
complexes organiques permettant
une meilleure accessibilité du
pétrole aux bactéries.
Les « slow release fertilizers »
permettent de libérer des
nutriments en continu.
plus les mêmes quantités en sels nutritifs, révélant que la
dégradation d‘un certain hydrocarbure ne requière pas la
même quantité de nutriments qu‘un autre. Ainsi les bactéries
sont sélectionnées en fonction de la quantité de sels nutritifs
ajoutés et la quantité requise pour la dégradation des
hydrocarbures. Ces auteurs suggèrent donc qu‘il serait possible
d‘influencer la sélection de certaines bactéries particulièrement
performantes dans les systèmes pollués en modifiant le rapport
N :P et ainsi accélérer la dégradation du pétrole (Smith et al.
1998; Head et al. 1999).
La biostimulation ne consiste pas uniquement à ajouter des
billes de sels nutritifs. Très rapidement, devant les limites de la
méthode (éparpillement des ressources ajoutées sous l‘action
des vagues par exemple et dissolution trop rapide des billes),
un certain nombre de produits (engrais) avec des compositions
(organique versus inorganique) et des propriétés variables
(hydrophobe versus hydrophile) ont été mis au point pour
améliorer la biodégradation et proposer des solutions adaptées
à chaque type d‘environnement pollué (Tableau 7) (Swannell
et al. 1996).
L‘utilisation d‘engrais à libération lente (« slow release
fertilizers ») est l‘une des approches les plus utilisées pour
prévenir les problèmes de lavage et pour fournir des sels
nutritifs de manière continue dans les zones pollués (Swannell
et al. 1996). Ces engrais se présentent généralement sous des
formes solides avec des nutriments insolubles ou solubles dans
l‘eau accrochés à des produits hydrophobes de type paraffine
ou huile végétale. Par exemple, lors de l‘accident de l‘Exxon
Valdez, un engrais à libération lente, le Customblen (Sierra
Chemical Co.) a été choisi comme l‘un des agents de
bioremédiation et a été appliqué sur plus de 120 Km de côtes
contaminées entre 1989 et 1990. Cet engrais se compose de
phosphate de calcium, de phosphate d‘ammonium et de nitrate
73 Chapitre 1 : Etat de l’art
d‘ammonium combiné à une huile végétale selon un ratio
N:P:K de 28:8:0. Les résultats ont montré que le Customblen
améliorait l‘élimination du pétrole sur certaines côtes de
l‘Alaska (Pritchard et al. 1992).
Tableau 7 : Composants des fertilisants utilisés ou testés comme agents de bioremédiation (Prince 1993).
Les émulsifiants fournissent des
ressources nutritives et
permettent en même temps une
meilleure accessibilité des
bactéries au pétrole.
L‘ajout de matière organique sous forme de produit
oléophile est une autre alternative. Un des problèmes majeurs
dans la dégradation des pétroles est son manque d‘accessibilité
aux bactéries qui pourraient les dégrader. L‘idée d‘utiliser des
molécules permettant de favoriser le contact entre les bactéries
et leur substrat est donc apparue assez rapidement dans les
expériences de biostimulation. Plusieurs produits contenant
des nutriments organiques ont été évalués et identifiés comme
des agents de bioremédiation. L‘Inipol EAP22 (Societé CECA
SA, France) est probablement l‘agent de bioremédiation le
plus connu pour la bioremédiation du pétrole en raison de son
utilisation pour la catastrophe de l‘Exxon Valdez. Ce produit
est une micro-émulsion contenant de l‘urée comme source
d‘azote, du laureth phosphate de sodium comme source de
phosphore, du 2-butoxy-1-ethanol comme surfactant et de
Les réels effets des molécules
d’origine industrielle pour la
bioremédiation des
hydrocarbures sont encore mal
connus.
l‘acide oléique pour rendre le mélange hydrophobe. L‘Inipol
présente plusieurs avantages. Il prévient la formation
d‘émulsions eau-dans-huile en réduisant la viscosité du pétrole
et les tensions inter-faciales, il fournit de manière continue une
source de nutriments utilisables pour la biodégradation des
hydrocarbures, il ne présente pas de toxicité pour la flore et la
faune et se dégrade facilement sous l‘action des
microorganismes (Ladousse et al. 1991). Néanmoins, certaines
études ont remis en question la pertinence de l‘emploi de ce
type de produit. Par exemple, Roberg et al. (2007) ont montré
que l‘Inipol pouvait être préférentiellement utilisé par les
microorganismes comme source de carbone plutôt que le
pétrole, ce qui aurait diminué la biodégradation des
hydrocarbures. Margesin et al (2007) ont suggéré que la
dégradation des hydrocarbures en présence d‘Inipol serait
abiotique.
Les bioémulsifiants et
biosurfactants d’origine
biologique ne souffrent pas d’une
potentielle toxicité pour
l’environnement et sont l’objet
d’un intérêt industriel majeur.
Enfin les biosurfactants/bioémulsifiants naturels sont
également utilisés pour la bioremédiation des hydrocarbures
(Voir tableau 3 dans la partie 3.1.2 de cette introduction). Ces
molécules peuvent servir dans de nombreux domaines (textile,
pharmaceutique, cosmétique, alimentation, exploitation de
minerais), dont la dépollution des milieux contaminés par les
hydrocarbures ou les métaux. De nouvelles recherches sont
toujours entreprises pour découvrir de nouvelles molécules
avec des propriétés inédites (Satpute et al. 2010).
Concrètement ces agents bioactifs sont employés dans de
nombreuses expériences de bioremédiation des hydrocarbures.
Par exemple, l‘Alasan est un bioémulsifiant complexe de haut
poids moléculaire anionique formé de polysaccharides et de
protéines, produit par Acinetobacter radioresistens KA53 qui a
été isolé en 1995 pour ses propriétés chimiques (Navon-
Venezia et al. 1995). Il permet notamment d‘améliorer la
solubilité et la biodégradation des hydrocarbures aromatiques
75 Chapitre 1 : Etat de l’art
A l’avenir, les bioémulsifiants et
biosurfactants devraient
largement améliorer les méthodes
de biostimulation des
communautés bactériennes
contaminées.
polycycliques. Il a été testé plusieurs fois expérimentalement
et des taux de dégradation deux fois supérieures du
fluoranthène et du phénanthrène ont été trouvés en sa
présence, révélant son potentiel pour les applications de
bioremédiation (Barkay et al. 1999; Dalby et al. 2007).
Nous attirons l‘attention du lecteur sur le fait que le bioémulsifiant Alasan
est celui qui a été employé dans l‘étude expérimentale du chapitre 3 de ce
manuscrit.
Ces molécules d‘origine biologique sont donc totalement
biodégradables, bien moins toxiques que leurs équivalents
artificiels et favorisent clairement la biodégradation des
pétroles à la fois par des processus physiques (solubilisation
des hydrocarbures) et biologiques (source de nutriments)
(Poremba et al. 1991). Ils offrent ainsi une alternative
intéressante aux produits jusqu‘alors employés. La découverte
de nouvelles molécules ainsi que l‘adaptation des traitements
expérimentaux à l‘environnement devraient permettre
d‘améliorer les méthodes de bioremédiation des hydrocarbures
pétroliers en milieu marin (Satpute et al. 2010).
5. Evolution récente des méthodes d‘étude des communautés microbiennes marines totales et
hydrocarbonoclastes
Un grand nombre de techniques
classiques et récentes sont
nécessaires et disponibles pour
étudier les communautés
bactériennes impliquées dans la
dégradation des hydrocarbures.
L‘étude des communautés bactériennes impliquées dans la
dégradation du pétrole nécessite la mise en place de techniques
diversifiées et complémentaires. Il s‘agit en effet d‘évaluer à la
fois l‘abondance des microorganismes, leur diversité mais
aussi et surtout leur activité, le challenge étant d‘arriver à
suivre spécifiquement les espèces bactériennes ayant la
capacité fonctionnelle de biodégradation des hydrocarbures.
Pour cela un certain nombre d‘outils « classiques » sont
disponibles, mais l‘apparition de technologies plus robustes et
de plus haut débit sont en train de révolutionner notre façon
d‘aborder l‘Ecologie microbienne (Fig. 16).
Figure 16 : Historique et évolution étape par étape de l’Ecologie microbienne durant les 50 dernières
années (Maron et al. 2007).
77 Chapitre 1 : Etat de l’art
5.1. Dénombrement des bactéries totales et hydrocarbonoclastes
Pour le dénombrement des
bactéries totales, on dispose :
- des méthodes microscopiques
- de la cytomètrie en flux
Pour le dénombrement de
bactéries présentant des activités
de dégradation des
hydrocarbures, on dispose de :
- la méthode du nombre le plus
probable
- la PCR quantitative
Les méthodes de culture ont été les premières méthodes
permettant de dénombrer les microorganismes. Néanmoins
elle s‘est révélée incomplète dans la mesure où il a été établi
qu‘elle ne permettait d‘isoler que de 0.1 à 1% des bactéries
d‘un échantillon naturel marin (Giovannoni et al. 1990). Elle
reste néanmoins incontournable pour l‘isolement et la
caractérisation de nouvelles souches. La quantification des
microorganismes se fait aujourd‘hui davantage à l‘aide de
microscopes par le biais de marquages fluorescents non
spécifiques (DAPI) ou spécifiques pour la détection de
groupes taxonomiques particuliers à travers la méthode du
FISH (fluorescent in situ hydridization). La cytomètrie en flux
est également particulièrement bien adaptée aux échantillons
liquides et offre un temps d‘analyse largement réduit par
rapport au comptage microscopique.
Plusieurs techniques très différentes permettent de
dénombrer de communautés fonctionnelles en milieu marin.
La méthode de Mac Grady (1918) est une méthode de culture
en dilution qui a été largement employée dans les études de
biodégradation des hydrocarbures (Mills et al. 1978; Delille et
al. 2000; Rodríguez-Blanco et al. 2010). Elle repose sur une
analyse statistique et fournit par calcul des nombres les plus
probables (NPP; MPN en anglais pour « most probable
number ») en utilisant la table de Mac Grady (Mac Grady,
1918). Il existe de nombreuses variantes à la méthode en
fonction de la charge microbienne à évaluer, du milieu
d‘incubation considéré et de la fonction ciblée. Pour évaluer le
NPP de bactéries marines capables de dégrader un ou plusieurs
hydrocarbures, l‘échantillon d‘eau de mer est généralement
dilué en série dans de l‘eau de mer stérile (évite le biais de la
culture sur un milieu riche prédéterminé) et mis en présence
d‘un ou plusieurs hydrocarbures, parfois même d‘un pétrole
La méthode des MPN est une
méthode de culture en dilutions
largement emplyée dans
l’énumération des bactéries
hydrocarbonoclastes.
La PCR quantitative permet de
quantifier le nombre de copies de
gènes de dégradation des
hydrocarbures dans une
communauté.
brut ou raffiné. Les dilutions positives sont identifiées après
incubation en présence d‘un marqueur coloré de respiration du
substrat (les plus utilisés sont la résazurine ou le bleu de
méthylène, indicateurs colorimétriques d'oxydo-réduction).
Cette méthode suppose que le micro-organisme est
normalement distribué dans le milieu et donc qu‘un même
volume d‘échantillon contient en moyenne le même nombre de
microorganismes (en réalité il en contient un peu plus ou un
peu moins); le nombre le plus probable correspond à la valeur
moyenne. L‘inconvénient majeur de cette technique est qu‘elle
a tendance à surestimer les microorganismes ciblés (Johnsen et
al. 2009; Wallenius et al. 2011). La PCR quantitative (qPCR)
est une alternative plus récente (Mackay 2004). Elle permet de
quantifier tout aussi bien les bactéries totales grâce à l‘emploi
d‘amorces universelles (gène ARNr 16S) que des bactéries
appartenant à un groupe particulier comme les bactéries PAH-
dégradantes, par exemple, par ciblage de gènes fonctionnels
(dioxygénase dans le cas des PAH). Elle a pour avantage
d‘être une des rares techniques permettant d‘obtenir un
pourcentage de bactéries ayant une fonction particulière par
rapport à une communauté totale. Cela permet d‘estimer
indirectement le potentiel fonctionnel de ce groupe.
L‘inconvénient de la méthode repose sur le fait qu‘il faille
définir des amorces spécifiques d‘un groupe, polyphylétique
dans le cas de la dégradation des hydrocarbures. Il existe un
risque dans la création des amorces : soit elles peuvent ne pas
être assez spécifiques et donc amplifier des microorganismes
n‘appartenant pas au groupe fonctionnel ciblé, soit elles
peuvent être trop spécifiques et sous-estimer la population
quantifiée (Cebron et al. 2008). En outre pour la dégradation
des hydrocarbures, il existe un grand nombre de gènes
fonctionnels. On ne pourra donc pas quantifier une population
HAP-dégradante totale mais un groupe possédant par exemple
79 Chapitre 1 : Etat de l’art
une naphtalène dioxygénase impliquée dans la première étape
de la dégradation du phénanthrène uniquement (Baldwin et al.
2003). Grâce à la création constante de nouvelles amorces, la
qPCR devrait néanmoins être une mesure de routine dans les
prochaines années.
5.2. Etude de la diversité
L’étude de la diversité
bactérienne dépend de la
définition de l’espèce chez les
bactéries et d’outils moléculaires
qui permettent de les discriminer
facilement.
Une espèce procaryotique est
constituée de souches qui
présentent des valeurs
d’hybridation ADN-ADN
supérieures ou égales à 70% et
une valeur ΔTm inférieure ou
égale à 5%.
L‘apparition des méthodes de biologie moléculaire dans les
années 80 a permis de s‘affranchir des biais des techniques de
culture classique et a révolutionné notre façon d‘étudier les
microorganismes. L‘étude des acides nucléiques sur la base du
gène de l‘ARNr 16S a donné l‘accès à une diversité
microbienne jusque-là inexplorée et a permis d‘améliorer
rapidement nos connaissances sur les milieux naturels (Head et
al. 1998). En 1985, Carl Woese dénombrait 11 groupes
bactériens phylogénétiquement différents (Woese et al. 1985)
alors qu‘en 2003, Rappé et Giovannoni en comptaient 53.
Cette « nouvelle » diversité a fait naître un certain nombre de
questionnements à la fois en termes méthodologiques et
Ecologiques.
La définition d‘une espèce bactérienne se heurte à un
problème majeur à savoir l‘absence de sexualité chez les
bactéries. En effet, si la définition d‘Ernst Mayr, « une espèce
est un ensemble d‘individus féconds entre eux et seulement
entre eux» (Mayr 1982), est encore utilisée pour les
organismes supérieurs, elle n‘est pas applicable aux
microorganismes. En outre, si des critères morphologiques
peuvent être utilisés pour la classification des
macroorganismes, ils ne sont pas suffisants pour classer les
microorganismes, trop simples d‘aspect pour être différenciés
à l‘aide de simples observations microscopiques. Aujourd‘hui,
plusieurs critères permettent de définir une espèce
bactérienne : des critères morphologiques ou physiologiques
(présence de flagelle ou non, couleur, forme, par exemple) et
Le gène codant pour la petite
sous unité (16S) de l’ARN
ribosomique est ubiquiste chez
les procaryotes, il contient des
régions conservées mais aussi
suffisamment divergentes d’une
espèce à l’autre pour pouvoir les
différencier.
Les méthodes d’empreintes
moléculaires permettent d’étudier
en routine la structure des
communautés bactériennes.
surtout des critères génétiques. Deux individus d‘une même
espèce procaryote présentent des valeurs d‘hybridation ADN-
ADN supérieures ou égales à 70% et une valeur ΔTm
inférieure ou égale à 5% (Wayne et al. 1987). Néanmoins,
cette technique est lourde à mettre en place, nécessite
l‘isolement des bactéries sur un milieu de culture et requiert
une certaine similarité avec les souches déjà identifiées. Pour
discriminer en routine les espèces bactériennes, le gène codant
pour la petite sous unité (16S) de l‘ARN ribosomique s‘est
révélé être le candidat idéal. Il est ubiquiste (puisque la
traduction de l‘ARN messager en protéine est une fonction
universelle chez les êtres vivants), il ne subit pas de transfert
génétique latéraux, il a une taille suffisante (~1500 pb) pour
contenir des informations phylogénétiques et il contient des
régions conservées mais aussi suffisamment divergentes d‘une
espèce à l‘autre pour pouvoir les différencier (Woese et al.
1985). Son analyse permet une classification des procaryotes à
différents niveaux taxonomiques (phylum, classe, ordre,
famille, genre, espèce).
Depuis ces 20 dernières années, le développement et
l‘utilisation en routine de techniques de biologie moléculaire
ont largement amélioré nos connaissances sur les
communautés microbiennes aquatiques. De plus, ces
techniques offrent la possibilité de suivre l‘évolution des
communautés bactériennes sous l‘influence de contraintes
environnementales. Ce sont donc des outils extrêmement
employés pour l‘étude des communautés bactériennes
soumises à des pollutions. La plupart de ces approches
impliquent une étape d‘amplification par PCR de fragments
d‘ADN extraits de l‘environnement (en général, il s‘agit de
l‘opéron ribosomal). L‘amplification est réalisée au moyen
d‘amorces universelles ou spécifiques des microorganismes
étudiés. L‘étape suivante consiste à détecter des variations de
81 Chapitre 1 : Etat de l’art
séquence dans les produits de PCR. Il peut être réalisé soit par
une approche « d‘empreinte moléculaire » qui repose sur
l‘analyse d‘un électrophérogramme qui permet la séparation
visuelle du mélange de fragments PCR selon un
polymorphisme de séquence (DGGE, TGGE, CE-SSCP) ou de
longueur (T-RFLP, ARISA) (tableau 8). Une autre approche
consiste à cloner les produits de PCR et les séquencer, ce qui
permet une identification taxonomique et phylogénétique
(Dorigo et al. 2005).
Méthode Principe
Taille des
fragments
Empreintes génétiques basées sur l’ADN génomique
PFGE : Pulse Fragment Gel
Electrophoresis
Migration du génome digéré par des enzymes de restriction Gros fragments
Empreintes génétiques basées sur les opérons ribosomiques
Méthodes basées sur les variations de longueur de fragments de restriction
ARISA : Automated Ribosomal
Intergenic Space Analysis
Examine les variations de longueur des régions intergéniques (ITS)
des ADN ribosomiques
400 à 1200 pb
ARDRA : Amplified Ribosomal DNA
Restriction Fragment Analysis
Séparation de fragments du gène ARNr 16S en fonction de la taille
sur gel d‘agarose
T-RFLP : Terminal Restriction
Fragment Lenght Polymorphism
Mise en évidence d‘un polymorphisme de restriction d‘un gène
particulier après digestion par des enzymes de restriction
< 1500 pb
Méthodes basées sur les variations de séquence ADN
DGGE : Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis
Séparation des ADN double brin par dénaturation à l‘urée-
formamide dans un gel d‘acrylamide
< 500 pb
TGGE : Temperature Gradient Gel
Electrophoresis
Séparation des ADN double brin par un gradient de température
dans un gel d‘acrylamide
< 500 pb
SSCP : Single Strand Conformation
Polymorphism
Séparation d‘ADN simples brins en fonction de la conformation
3D des séquences
< 400 pb
Tableau 8 : Méthodes d’empreintes moléculaires classiquement utilisées en Ecologie microbienne.
Nous pouvons souligner que la technique non destructive
de FISH reposant sur un marquage des cellules avec des
sondes spécifiques associées à un fluorochrome a été proposée
pour étudier la diversité bactérienne. Néanmoins, cette
technique est plus adaptée au suivi de certains groupes
taxonomiques qu‘à l‘analyse de la structure des communautés
d‘un échantillon complexe. En effet, la limitation du nombre
de fluorochromes utilisables par échantillon, le choix des
La CE-SSCP est une technique
d’empreinte moléculaire qui
permet de comparer la structure
des communautés bactériennes
d’un nombre théoriquement
infini d’échantillons.
sondes, les températures d‘hybridation, l‘auto-fluorescence de
certains microorganismes et l‘état physiologique des cellules
marquées sont autant de paramètres qui peuvent affecter le
résultat final, en produisant de faux positifs ou des faux
négatifs (Wagner et al. 2003).
Note pour le lecteur : nous faisons le choix ci-dessous de nous attarder sur
la technique d‘empreinte moléculaire CE-SSCP car c‘est celle qui a été
utilisée pour l‘ensemble de ces travaux de thèse.
Parmi les méthodes d‘empreinte moléculaire, la CE-SSCP
est une méthode qui repose sur le polymorphisme de la
conformation des simples brins par électrophorèse capillaire
(Lee et al. 1996). Brièvement, cette technique nécessite au
préalable une extraction d‘ADN génomique, une amplification
d‘un fragment d‘intérêt (par exemple une partie du gène ARNr
16S) avec des amorces fluorescentes, une dénaturation des
produits PCR et un maintien de la conformation simple brin
des fragments dénaturés par ajout d‘agent dénaturant qui
influent sur la force de stabilisation des liaisons hydrogènes.
Les fragments simples brins progressent à des vitesses
proportionnelles à leurs encombrements tridimensionnels dans
un gel non dénaturant. La technique de SSCP sur gel vertical a
été améliorée par une migration dans un séquenceur capillaire,
qui permet la co-migration des produits PCR de l‘échantillon
marqué avec un fluorochrome avec un standard de taille
marqué avec un autre fluorochrome. En fin d‘électrophorèse,
les fragments sont détectés par un laser grâce aux marquages
fluorescents. Le profil est composé de différents ribotypes qui
donnent une empreinte de la structure de la communauté
étudiée, et le marqueur interne permet de comparer un nombre
théoriquement infini de profils de communautés. L‘aire de
chaque pic composant ce profil est représentatif de la quantité
d‘un ou de plusieurs ribotypes, ce qui rend cette technique
semi-quantitative. Adaptée au milieu marin par Ghiglione et
al. (2005), elle a depuis été considérée par différents auteurs
83 Chapitre 1 : Etat de l’art
comme une technique plus sensible et plus reproductible que
d‘autres techniques d‘empreintes moléculaires tels que la
DGGE, la T-RFLP ou la LH-PCR pour length heterogeneity
polymerase chain reaction (Hong et al. 2007; Ducklow et al.
2011). La CE-SSCP peut être couplée au clonage/séquençage
pour obtenir une analyse taxonomique plus poussée des
différents ribotypes (Fig. 17).
Figure 17 : Exemple de profil de CE-SSCP avec assignation des pics par construction d’une banque de
clone et migration individuelle des clones. Chaque pic de CE-SSCP (à gauche) correspond un clone (à
droite) qui a été affilié phylogénétiquement (Rodríguez-Blanco et al. 2009).
Le pyroséquençage est une
méthode récente de séquençage à
très haut débit qui a l’avantage
d’être peu coûteuse et de fournir
une vision beaucoup plus
exhaustive de la diversité
bactérienne d’un échantillon que
les anciennes techniques
reposant sur la méthode Sanger.
La CE-SSCP a été employée avec succès pour l‘étude des
communautés bactériennes polluées par les hydrocarbures
(Rodríguez-Blanco et al. 2010). Néanmoins de nouveaux
outils tels que le pyroséquençage, la métagénomique ou les
microarrays sont en train de supplanter les méthodes
d‘empreintes moléculaires.
Le pyroséquençage est une technique récente de
séquençage très haut débit puisqu‘il permet d‘obtenir plus de
10.000 séquences dans un même échantillon là où l‘on pouvait
en générale en obtenir 200 dans des études de
clonage/séquençage de type Sanger (Fig. 18 et tableau 9).
Grâce au pyroséquençage, l‘analyse de la diversité dans un
échantillon environnemental est plus complète (Margulies et
al. 2005; Rogers et al. 2005). La technique a été notamment
employée récemment pour l‘analyse de la diversité des
microorganismes impliqués dans la dégradation des
hydrocarbures dans le golfe du Mexique, après la catastrophe
de la plateforme Deepwater Horizon (Kostka et al. 2011). Le
coût de la technique était un frein à ses débuts mais il est
devenu moins important que celui des séquençages classiques.
En plus, la méthode est plus rapide et les séquences obtenues
sont de plus en plus longues (une soixantaine de paires de
bases à sa création, plus de 400 aujourd‘hui). La méthode
présente néanmoins certains biais comme la formation de
séquences incorrectes ou de chimères de séquences qu‘il faut
pouvoir distinguer des séquences correctes et elle nécessite
une analyse bioinformatique lourde pour exploiter les données.
Mais le nombre de publications faisant référence à l‘utilisation
du pyroséquençage pour l‘analyse de la diversité bactérienne
est en pleine expansion et cette technique devrait rapidement
rendre obsolètes les méthodes de séquençages traditionnelles
dans les prochaines années.
85 Chapitre 1 : Etat de l’art
Figure 18 : Principe de fonctionnement du pyroséquençage automatisé ultra-haut débit.
Un simple brin de chaque fragment d‘ADN à séquencer est amplifié par PCR pour obtenir une banque d‘ADN
simple brin et immobiliser un brin par bille. (a) Chaque bille est capturée dans sa propre micro-chambre et
l‘ADN est amplifié par PCR, le résultat est une bille contenant des millions de copies du simple brin d‘origine.
(b) Pour le séquençage, les billes porteuses de l‘ADN sont placées dans une plaque contenant plus d‘un million
de fibres optiques individuelles avec des puits de capacité de l‘ordre du picolitre de manière à ce que chaque
puits ne contienne qu‘une seule bille. Le séquençage est ensuite réalisé par flots successifs des quatre bases azotées. Le brin se synthétisant est accompagné d‘un relargage de pyrophosphate qui active la luciférine et
provoque un flash lumineux qui est enregistré par la fibre optique (l‘intensité du signal étant proportionnel au
nombre de bases identiques successivement incorporées au brin d‘ADN). Le résultat et un fichier contenant une
succession de pics lumineux correspondant à la séquence du brin amplifié (Owen-Hughes et al. 2007).
Tableau 9 : Méthodes actuelles de séquençage (Cardenas et al. 2008).
La métagénomique est une
méthode en haut débit
permettant l’étude des génomes
dominants d’une communauté
naturelle.
La métagénomique est une approche dans laquelle des
fragments de génomes de très grande taille sont clonés dans
des vecteurs appropriés (chromosome bactérien artificiel,
BAC, par exemple) et séquencés par des méthodes de
séquençage haut débit (Fig. 21) (Shelswell 2006). Le
screening et le séquençage rapide d‘un nombre important de
clones porte le nom de « whole-genome shotgun sequencing »
(Chen et al. 2005), une approche qui a été employée avec
succès pour dresser un inventaire de la diversité bactérienne
dans la mer des Sargasses (Venter et al. 2004). Les données
issues de cette technique apportent des informations détaillées
sur la composition et la diversité de la communauté et donnent
L’utilisation de la
métagénomique dans les
environnements pollués est
facilitée par le nombre réduit de
génomes à étudier.
accès aux génomes quasi-complets des microorganismes les
plus abondants, permettant ainsi de révéler le rôle métabolique
de ces organismes (Handelsman 2004). Le whole-genome
sequencing peut également être appliqué à l‘étude de cultures
pures pour mieux comprendre la physiologie de certaines
souches et développer des outils pour la bioremédiation
(Lovley 2003). La limite de cette méthode est la difficulté à
reconstruire les génomes à partir des fragments et le manque
de génomes connus pouvant servir de modèle à la
reconstruction des métagénomes.
Un des intérêts majeurs à utiliser la métagénomique dans
les environnements pollués est que la plupart du temps, le
pétrole favorise le développement de quelques groupes
bactériens majoritaires et diminue drastiquement la richesse
bactérienne par rapport à un environnement non pollué. Par
conséquent, l‘effort de séquençage nécessaire à l‘analyse des
métagénomes des communautés bactériennes polluées par les
pétroles est moins important que pour des communautés
« classiques » et la reconstitution des génomes s‘en trouve
facilitée. Plusieurs études ont d‘ailleurs montré qu‘il était
possible d‘appliquer les outils de métagénomique avec succès
pour l‘étude des communautés hydrocarbonoclastes.
Ainsi, van Beilen et al. (2003) ont pu, par exemple,
explorer la diversité des alcane-hydroxylases dans
l‘environnement et Jeon et al. (2003) ont découvert une
bactérie contenant une « nouvelle » dioxygénase impliquée
dans la biodégradation du naphtalène dans des sédiments
contaminés. Le développement de cette approche couplée aux
récentes avancées des techniques de séquençage devraient
permettre une meilleure compréhension de la diversité et des
mécanismes physiologiques associés à la dégradation des
hydrocarbures.
Les puces d‘acides nucléiques ou « microarrays » sont une
87 Chapitre 1 : Etat de l’art
Les microarrays permettent
l’étudie haut débit de l’expression
des gènes.
technique d‘hybridation dans laquelle de nombreuses sondes
moléculaires sont utilisées pour détecter la présence relative et
l‘expression de multiples organismes et/ou de gènes (Fig. 19)
(Gentry et al. 2006). Dans les études des communautés
microbiennes des environnements pollués, les microarrays ont
été utilisés pour identifier et suivre les membres d‘un
consortium microbien mis en présence de benzène et de
toluène (Koizumi et al. 2002). Là encore, la généralisation de
la technique devrait grandement améliorer les études de
diversité et fonction des communautés hydrocarbonoclastes.
Figure 19 : Exemple d’expérience de microarray avec ADNc.
L‘ARN est extrait à partir de différents échantillons et rétro-transcrit en ADN complémentaire (cDNA), phase
pendant laquelle il est marqué à l‘aide de produits fluorescents. Les deux échantillons sont ensuite mélangés
ensemble pour comparaison et hybridation à la puce. Les différences d‘expressions des gènes sont révélées par
les profils de fluorescence sur l‘array (Coe et al. 2004).
Les avantages et inconvénients des techniques brièvement
décrites ci-dessus sont listés dans un tableau récapitulatif
(Tableau 10).
5.3. Mesure d‘activité bactérienne totale et hydrocarbonoclaste
Les mesures d’activité
bactérienne reposent
généralement sur une
incubation en présence d’un
substrat d’interêt marqué
radioactivement ou par un
fluorochrome.
Les méthodes employées pour mesurer l‘activité bactérienne
ont peu évolué depuis ces quarante dernières années.
On distingue la mesure de production bactérienne qui est une
mesure d‘assimilation d‘un substrat radioactif de type 3H-
thymidine ou 3H-leucine comme précurseurs de protéines
(Kirchman et al. 1985; Chin-Leo et al. 1988). La mesure consiste à
quantifier la radioactivité incorporée dans les cellules bactériennes
après un temps d‘incubation optimal et permet, en utilisant un
facteur de conversion, d‘exprimer une quantité de carbone
minéralisé par unité de volume et de temps.
Les mesures d‘activités enzymatiques extracellulaires reposent
sur le fait que dans l‘environnement, la matière organique se
présente majoritairement sous forme de macromolécules ne
pouvant pas être directement assimilées par les bactéries. Les
bactéries expriment donc des enzymes à la surface de leurs
membranes pour les hydrolyser avant de les incorporer pour être
métabolisées (Fig. 20). Il existe une multitude d‘enzymes
différentes selon le type de molécule à hydrolyser (lipase,
aminopeptidase, phosphatase, glucosidase, etc.).
Figure 20 : Principe des activités enzymatiques extracellulaires chez les bactéries (selon Van Wambecke,
communication personnelle).
La mesure de l‘activité enzymatique repose sur l‘emploi d‘un
analogue de substrat couplé avec une molécule fluorescente (Fig.
21). Les mesures d‘activité enzymatique suivent une cinétique de
Michaelis-Menten. La réaction enzymatique est mathématiquement
89 Chapitre 1 : Etat de l’art
exprimée par l‘équation: V = (Vmax.S) / (Km + S) où V est la
vitesse de la réaction enzymatique, S la concentration en substrat et
Km la constante de Mickaelis. Il est nécessaire d‘effectuer la
mesure dans un système où la concentration en substrat est
saturante, c'est-à-dire lorsque la vitesse d‘hydrolyse (Vmax)
n‘augmente plus en fonction de la concentration en substrat.
Figure 21 : Exemple d’activité hydrolytique extra-cellulaire : la glucosidase.
Le complexe MUF-β-D-Glucopyranoside, non fluorescent est clivé par une enzyme de type n-glucosidase
extracellulaire pour libérer une molécule de glucose pouvant être intégrée par la bactérie et une molécule de
MUF devenue fluorescente après hydrolyse.
Les cinétiques de
dégradation des
hydrocarbures sont
primordiales dans les études
sur la biodégradation.
Que ce soit pour la mesure de production bactérienne ou celle
des activités enzymatiques extracellulaires, il convient d‘incuber
un échantillon naturel avec un substrat radioactif ou fluorescent
durant un temps optimum. En fin d‘incubation, la radioactivité
incorporée par les bactéries ou la fluorescence libérée par celle-ci
sont mesurées. On peut ainsi estimer une quantité de substrat
utilisé par un certain nombre de cellules pour une période donnée.
Les temps d‘incubation pour les mesures de production bactérienne
et d‘activités extracellulaires n‘excédent pas quelques heures, ces
méthodes sont considérées comme représentatives de l‘activité
instantanée des communautés bactériennes in situ.
Il est également possible de réaliser des cinétiques de
dégradation de substrats d‘intérêt comme les hydrocarbures en
particulier. Il s‘agit alors simplement d‘incuber l‘échantillon
naturel en présence de la molécule, de doser à intervalles réguliers
la quantité restante de substrat et d‘en déduire la vitesse de
dégradation de la molécule. Ce type de méthode est extrêmement
employée dans les études sur la biodégradation des hydrocarbures
puisqu‘elle peut être couplée à des analyses de diversité
bactérienne et/ou de mesure d‘abondance pour obtenir une vision
globale de la dynamique de communauté bactérienne en présence
d‘hydrocarbures (Guha et al. 1999).
5.4. Lien diversité / activité
Tout l’enjeu de la
microbiologie
environnementale est
d’attribuer des fonctions à
des groupes bactériens
particuliers.
La métatranscriptomique et
la métaprotéomique sont
deux nouvelles techniques
permettant l’étude de la
diversité fonctionnelle d’une
communauté bactérienne, à
grande échelle.
L‘ensemble des techniques présentées jusqu‘à maintenant
permettent soit d‘étudier la diversité soit de mesurer l‘activité des
communautés bactériennes. Mais tout l‘enjeu de la microbiologie
environnementale est d‘attribuer des fonctions métaboliques
particulières à des groupes taxonomiques définis. Autrement dit
comment est-il possible de relier la diversité à l‘activité des
différents groupes de microorganismes dans les milieux naturels ?
Pour répondre à cette question, il existe actuellement plusieurs
outils. Le premier est la culture sur des milieux prédéfinis. Cette
technique reste toujours d‘actualité pour étudier la physiologie de
certaines souches. Mais nous avons déjà relevé que cette technique
est trop sélective pour l‘étude des communautés naturelles totales.
D‘autres méthodes sont apparues plus récemment.
La métatranscriptomique et la métaprotéomique sont,
comme la métagénomique, des méthodes d‘analyse des
constituants cellulaires à grande échelle (Maron et al. 2007; Moran
2009). Il a été reconnu clairement que les techniques d‘études des
gènes étaient limitées pour obtenir des informations sur les
fonctions exprimées par les communautés bactériennes in situ. Par
contre, l‘étude de l‘expression génique et la traduction en protéines
dans les milieux naturels sont deux nouveaux champs de
l‘Ecologie microbienne particulièrement prometteurs pour étudier
(i) de nouveaux gènes fonctionnels et de nouvelles voies
métaboliques de dégradation des hydrocarbures, en particulier, et
(ii) pour identifier les protéines préférentiellement associées à
certaines conditions environnementales comme l‘apport de pétrole,
dans des contextes variables (Fig. 22).
91 Chapitre 1 : Etat de l’art
Figure 22 : Protocole d’expériences en métagénomique, métatranscriptomique et métaprotéomique.
Inspiré de (Shelswell 2006; Maron et al. 2007; Moran 2009).
Les méthodes
radiographiques tout comme
le SIP permettent
d’identifier des bactéries
particulières dans une
communauté bactérienne
totale.
Encore relativement peu employées, la métatranscriptomique et
la métaprotéomique sont des approches prometteuses pour étudier
les mécanismes moléculaires de la biodégradation des
hydrocarbures.
Les méthodes radiographiques (FISH-microautoradiographie
ou isotope array) permettent également de s‘affranchir des biais
des méthodes culturales (Dumont et al. 2005). Brièvement ces
techniques consistent à incuber un échantillon naturel avec un
substrat radioactif et d‘hybrider les cellules d‘un échantillon à
l‘aide de sondes fluorescentes pour révéler les différents groupes
qui ont incorporé le substrat radioactif (Fig. 23). Comme nous
l‘avons souligné précédemment, cette technique est limitée par le
nombre de sondes utilisable, la rendant inapplicable pour l‘étude
de la diversité spécifique d‘un échantillon complexe. Elle est
également limitée par la connaissance préalable des organismes
ciblés nécessaire à la création des sondes.
Figure 23 : Méthodes d’identification des microorganismes par l’utilisation de radio-isotopes (Dumont et
al. 2005).
Le Stable Isotope Probing (SIP) est la dernière option pour
identifier les bactéries hydrocarbonoclastes au sein d‘une
communauté naturelle. Cette technique se décline selon le type de
biomolécule marquée (Fig. 24).
Figure 24 : Schéma synthétique représentant les différentes possibilités pour le marquage des
biomolécules par des isotopes stables (Gutierrez-Zamora et al. 2010).
Par rapport aux techniques citées précédemment, elle présente
l‘avantage de ne pas nécessiter de connaissance préalable des
microorganismes recherchés et ne fait pas appel à l‘emploi de la
radioactivité (Manefield et al. 2004). Elle a toutefois d‘autres
inconvénients qui seront largement présentés dans le chapitre 5 de
ce manuscrit, entièrement consacré à cette technique.
93 Chapitre 1 : Etat de l’art
Finalement, pour clore cette partie consacrée aux méthodes
d‘étude des communautés bactériennes soumises à une pollution
pétrolière, nous proposons de faire ici une synthèse des techniques
présentées ci-dessus sous forme d‘un schéma général (Fig. 25) et
d‘un tableau récapitulatif (Tableau 10) des avantages et
inconvénients de chacune des approches.
Figure 25 : Ensemble des méthodes utilisables pour l’étude des communautés bactériennes impliquées
dans la dégradation des hydrocarbures en milieu marin. Adapté de Weiss et al. (2008).
Methodologie Avantages Limitations
I. Enumération et identification des microorganismes totaux et spécifiques
Microscopie Permet de déterminer le nombre total de cellules,
les vivantes/mortes, actives/inactives avec
l‘emploi de marqueurs adaptés
Peu d‘informations sur l‘identité ou le rôle physiologique des µO* ;
difficile à mettre en place pour des échantillons de sédiment
Cytométrie en flux Grande efficacité due à l‘automatisation, temps
d‘analyse rapide
Idem microscopie
Culture Facile et robuste, idéal pour l‘isolation de souches
d‘intérêt. Média non-spécifiques ou spécifiques
pour examiner la croissance sous conditions
particulières
La plupart des µO provenant de l‘environnement ne sont pas encore
cultivables, en particulier ceux provenant des zones oligotrophes. Non
représentatif de la quantité totale de µO dans un échantillon naturel.
Difficulté de cultiver les anaérobies. La croissance d‘un µO peu être très
lente.
Nombre le plus
probable
Technique simple, quantification d‘une groupe
particulier
Biais de la culture, difficulté de choix dans le protocole, risques de
surestimation
Hybridation (dont
microarray)
Pas d‘étape de culture ni d‘extraction d‘acide
nucléique, aperçu instantané de la communauté
entière ou de groupes spécifiques, rapide et fiable,
possibilité de cibler l‘ARN pour un aperçu de
l‘activité
Difficulté pour l‘utilisation d‘échantillons de sédiment ou d‘échantillons
où les µO sont peu abondants, nécessite de connaitre les séquences
ciblées et d‘avoir des sondes adaptées.
PCR quantitative Détection rapide et quantification du gène de
l‘ARNr 16S ou de gènes fonctionnels
Il peu y avoir plusieurs copies du gène dans chaque cellule, des biais
dans les extractions d‘acides nucléiques, des hybridations non spécifiques
avec d‘autres gènes, nécessite des primers adaptés
Clonage/Séquençage Détection de nouvelles séquences et des espèces
dominantes, identification des séquences à partir
de banques de données
Biais d‘extraction des acides nucléiques, analyse longue, la qualité de
l‘analyse dépend du nombre de clones séquencés
Pyroséquençage Séquençage à heut débit, bien plus performant
que le clonage/séquençage classique,
représentation de la diversité d‘un échantillon
satisfaisante
Analyse des séquences complexe et longue, jusqu‘à présent les séquences
obtenues étaient relativement courtes ne permettant pas toujours une
bonne résolution phylogénétique
II. Détermination de la structure et/ou de la diversité de la communauté bactérienne
Profil physiologique
de la communauté
(Biolog, Inc.,
Hayward, CA)
Disponible dans le commerce, fournit des
informations sur la diversité métabolique dans
une courte période
Pas adapté aux molécules provenant de l‘environnement dans lequel a été
prélevé l‘échantillon, génère beaucoup de données à traiter
statistiquement
PLFA Les lipides totaux peuvent être analysés pour
créer une « empreinte » de la communauté
Le profil PLFA peut être influencé par les stress qui impacte la
communauté et sa physiologie
Empreintes
moléculaires
Rapide aperçu des groupes majoritaires d‘une
communauté, peut être couplées au
clonage/séquençage pour une identification de ces
groupes
Les groupes peu abondants sont difficilement détectables, information
qualitative avec une résolution limitée, peu nécessiter un équipement
sophistiqué
III. Mesures de l’activité
Analyses de l‘ARN Fournit des informations sur les gènes exprimés,
l‘expression de ces gènes peut être liée à une
fonction particulière
Quantité d‘ARN souvent faible, difficile à extraire et qui se dégrade
rapidement
SIP Identification de µO qui assurent une fonction
particulière au sein d‘une communauté naturelle,
peut être couplé à des mesures chimiques et
d‘autres techniques de biologie moléculaire
Les isotopes lourds peuvent être onéreux, difficulté d‘enrichissement des
groupes d‘intérêt et difficulté de séparation des acides nucléiques lourd et
légers
Production
bactérienne
Mesure relativement rapide de l‘activité globale
d‘une communauté
Difficulté dans le choix de la concentration en substrat et du temps
d‘incubation
Activités
enzymatiques
extracellulaires
Diversité dans les activités testées Idem production bactérienne, difficulté d‘interprétation
Expériences de
biodégradation du
substrat particulier
La mesure de la concentration en substrat et de
l‘abondance bactérienne et de la structure de
communauté sur une période de temps données
donne un aperçu de l‘activité de toute une
communauté
Prend du temps et fait appel à plusieurs méthodes d‘analyses très
différentes
IV. Nouvelles techniques, les « omics »
Métagénomique Etude haut débit sur l‘ensemble des génomes d‘un
échantillon naturel : « whole-genome shotgun
sequencing », composition et diversité de la
communauté, étude complète des génomes les
plus représentés
Techniques complexes et longues à réaliser, difficulté dans l‘analyse des
résultats
Métatranscriptomique Etude haut débit sur l‘ensemble des transcrits
d‘un échantillon naturel, évaluation du potentiel
métabolique de la communauté
Techniques complexes et longues à réaliser, difficulté dans l‘analyse des
résultats
Métaprotéomique Etude haut débit sur l‘ensemble des protéines
d‘un échantillon naturel, évaluation des gènes
exprimés par la communauté, test de conditions
particulières
Techniques complexes et longues à réaliser, difficulté dans l‘analyse des
résultats
* « µO » est l‘abréviation de microorganismes dans ce tableau.
Tableau 10 : Aperçu des différentes méthodes de microbiologie et de biologie moléculaire utilisées pour
l’étude des microorganismes dans les zones polluées par les hydrocarbures. Adapté de Weiss et al. (2008).
95
6. Objectifs de la thèse
Au regard des informations apportées dans cette étude bibliographique, il est indéniable
que les connaissances concernant le fonctionnement des communautés microbienne dans les
environnements pollués par les hydrocarbures ont largement été améliorées durant les quatre
dernières décennies. Pourtant, malgré la multitude d‘études réalisées en milieux pollués, les
stratégies de bioremédiation, souvent efficaces en condition contrôlée, donnent des résultats
parfois mitigés lorsqu‘ils sont appliqués à la réalité des environnements naturels. Cela
s‘explique en grande partie par la complexité du processus de biodégradation, de la diversité
génétique et métabolique des microorganismes en jeu, des facteurs environnementaux
affectant aussi bien le pétrole lui-même que les bactéries dans leur fonction de biodégradation
et enfin par la difficulté de prévoir précisément les effets de la bioremédiation sur les
microorganismes autochtones et donc sur l‘efficacité de l‘élimination des hydrocarbures.
Le travail de thèse présenté ici, a été réalisé dans le but de répondre à un certain nombre de
questions encore inabordées dans la littérature ou présentant jusque-là des résultats variables,
de manière à améliorer notre compréhension du processus de biodégradation des
hydrocarbures pétroliers et ainsi contribuer au perfectionnement des techniques d‘élimination
favorisées des polluants. A travers une étude in situ, deux études en milieu contrôlé
(microcosmes/mésocosmes) et en adaptant la technique de Stable Isotope Probing sur les
HAP en milieu marin, nous avons abordé les problématiques suivantes :
Qu‘elle est l‘importance relative de la pollution pétrolière, parmi les autres paramètres
environnementaux abiotiques, comme facteur de régulation de la structure des
communautés bactériennes marines ? (Chapitre 2)
A quel point la récurrence de la pollution influence-t-elle la réponse des communautés
bactériennes à un apport de pétrole ? (Chapitre 3)
Quel est l‘impact des facteurs de type « bottom-up » (nutriments et émulsifiant) et/ou
« top-down » (virus et protozoaires) sur la structure et l‘activité des communautés
bactériennes impliquées dans la biodégradation des hydrocarbures ? (Chapitre 3 et 4)
Comment identifier les bactéries responsables de la biodégradation des hydrocarbures
parmi les communautés naturelles totales en évitant les biais de culture? (Chapitre 5)
97
IMPACT DE LA POLLUTION PAR LES HAP SUR LES
COMMUNAUTES BACTERIENNES MARINES
CHAPITRE 2
99 Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines
Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les
communautés bactériennes marines
1. Préambule
Nous avons évoqué dans l‘introduction générale (Chapitre 1) la difficulté de prédire en
condition naturelle l‘impact relatif du pétrole sur les communautés bactériennes marines par
rapport à d‘autres paramètres environnementaux. Pour répondre à cette question, il est
primordial de réaliser des analyses in situ qui ne souffrent pas d‘éventuelles conditions
artificielles dues à l‘incubation en conditions de laboratoire. Pourtant, en comparaison aux
études menées en laboratoire, les études in situ demeurent relativement rares en raison de la
difficulté de mise en place d‘un suivi spatio-temporel à bord d‘un navire scientifique, de la
multitude des paramètres à mesurer pour une compréhension du milieu la plus complète
possible et donc du coût et du temps investis.
Nous proposons dans ce premier chapitre de résultat une étude in situ réalisée en baie de
Marseille (Fig. 26). Nous avons délibérément choisi de faire des transects bord-large dans
différents sites côtiers subissant des pollutions chroniques volontaires, dont 3 ports plus ou
moins ouverts à la mer et soumis à des pollutions variables et une station au niveau des rejets
d‘eaux usées de la ville de Marseille, en comparaison avec une station de référence côtière du
réseau national SOMLIT (station SOFCOM) censée être moins soumise aux pollutions. Nous
avons ciblé l‘impact sur les bactéries marines de la pollution par les hydrocarbures
aromatiques polycycliques (HAP), molécules prioritaires de la liste établie par l‘agence de
protection environnementale. Nous avons fait le choix d‘effectuer cette analyse à deux
saisons différentes de manière à observer les réponses de consortium bactériens différents à
des pollutions pétrolières plus ou moins marquées.
Tout l‘intérêt de cette étude reposait sur le large spectre des paramètres mesurés à la fois
pour le dosage chimiques des HAP (méthode fluorimétrique et dosage par chromatographie
en phase gazeuse), la mesure de nombreux paramètres environnementaux classiques
(température, salinité, pH, sels nutritifs, carbone organique dissout…) et les paramètres
bactériens comprenant l‘étude de la structure de communautés bactériennes dans les
différentes stations par CE-SSCP, l‘abondance des bactéries totales (cytométrie en flux) et
hydrocarbonoclastes par deux techniques complémentaires (MPN et PCR quantitative). Une
originalité de ce travail a consisté à évaluer par des analyses statistiques robustes (analyse
multivariée directe par analyse canonique de correspondance) l‘influence relative de la
pollution par les HAP parmi les autres facteurs environnementaux sur la structuration des
communautés bactériennes. Les résultats principaux de ce travail ont été de montrer que (i) les
HAP contribuaient significativement avec d‘autres paramètres environnementaux à la
structuration des communautés bactériennes dans les différents ports, (ii) que l‘abondance
relative des bactéries HAP-dégradantes dans les différents sites pouvait être indicatrice du
degré de pollution pétrolière.
Figure 26 : Sites d’échantillonnage de l’étude en Baie de Marseille.
101 Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines
2. Article 1: Spatial and temporal variations of bacterial community structure and
PAH-degrading bacterial abundance in Mediterranean harbors subjected to
various PAH-pollutant levels.
List of authors : Caroline Sauret1,2
, Marc Tedetti3,4
, Catherine Guigue3,4
, Chloé Dumas5 ,
Raphaël Lami1,2
, Madeleine Goutx3,4
, Jean-François Ghiglione1,2
(1) CNRS, UMR 7621, Laboratoire d'Océanographie Microbienne LOMIC, F-66651
Banyuls-sur-Mer, France;
(2) UPMC Univ Paris 06, UMR 7621, Observatoire Océanologique, F-66651 Banyuls-sur-
Mer, France;
(3) CNRS, UMR 6117, Laboratoire de Microbiologie, Géochimie et Ecologie Marines
LMGEM, 13009 Marseille, France;
(4) Aix-Marseille Université, UMR 6117, Laboratoire de Microbiologie, Géochimie et
Ecologie Marines LMGEM, 13007 Marseille, France;
(5) CEntre de Formation et de Recherche sur l'Environnement Marin (CEFREM), Université
de Perpignan, 66860 Perpignan, France
Correspondence:
Jean-François Ghiglione
CNRS, UPMC Univ Paris 06, UMR7621, Laboratoire d'Océanographie Microbienne LOMIC,
Avenue Fontaulé, F-66651 Banyuls-sur-Mer, France. Tel.: +33 4 68 88 73 16; fax: +33 4 68
88 73 98
E-mail address: [email protected] (J.F. Ghiglione)
Running title : Impact of PAH-pollution on coastal marine bacteria.
Keywords: PAH pollution, bacterial community structure, MPN, qPCR
Abstract
Most of the experiments exploring the effect of oil pollution on bacterial communities have
been conducted under controlled micro- or mesocosms experiments. However, in situ studies
dealing with environmental complexity are rare. In this study, short transects were done, at
two seasons, in 3 harbors, one wastewater effluent site and one reference control, along the
NW Mediterranean coast. We monitored the relative effect of polycyclic aromatic
hydrocarbons (PAH) on total and active bacterial community structures and on the PAH-
degrading functional group in particular. Most of the harbors presented high levels of PAH
contamination. In both seasons, significant correlations were found between PAH
concentration and PAH-degrading bacteria for the more enclosed harbors but not in the more
sites. Molecular fingerprint also showed clear changes in total and active bacterial
communities between harbors and coastal waters at both seasons. At each site, surface
microlayer from the harbors presented an original bacterial community structure together with
the highest PAH concentration and PAH degraders counts. Direct statistical multivariate
analysis confirmed the significant effect of PAH concentrations in the spatial distribution of
bacterial community structure in the NW Mediterranean coastal sites among other
environmental variables such as salinity, inorganic nutrients, temperature and chlorophyll.
103 Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines
Introduction
The shorelines are highly vulnerable to anthropogenic pressures (Rabouille et al. 2001;
Valiela 2006). Among the major hazardous pollutants, hydrocarbons are known to deeply
impact coastal communities. These chemicals comes from rivers (Fernandes et al. 1999),
atmospheric depositions (Lim et al. 2007) as well as discharges of effluents (Singh et al.
2004) or boat traffic (Birpinar et al. 2009). One particular aspect of their toxicity is that
hydrocarbons are accumulated in marine organisms causing important damages on marine life
and seawater quality (Moore & Dwyer 1974, Thakker et al. 1985, Baussant et al. 2001, Wurl
& Obbard 2004). The Mediterranean Sea is one of the most polluted areas, receiving around
20% of the global marine oil pollution including several major oil spills whereas it represents
less than 1% of the total ocean surface. It is bordered by 46 000 km of coasts that support
several high harbor activity stations and particular tourism pressure (Gomez 2003).
Bacteria constitute the main sink for hydrocarbons in marine environments (Paerl et al.
2003; Head et al. 2006). Thus, in order to better understand the process of biodegradation, it
is of major interest to monitor bacterial communities in oil polluted context (Head et al.
2006). Because of the difficulty to explore natural complex systems, most of studies that
investigated the effect of pollution on bacterial assemblages, simulated oil spills in artificial
conditions (Cappello et al. 2007; Gertler et al. 2009; Lekunberri et al. 2010). However, even if
such experiments present advantages for raising clear tendencies, field investigation remains
an essential approach for the study of in situ processes.
The quantification of PAH-degrading bacteria among natural communities is generally
achieved by two different methods, the most-probable-number (MPN) and the quantitative
PCR. The first is the classical cultivation-based approach that has been successfully employed
in the past for the estimation of hydrocarbon-degrading bacterial number, in situ as well as in
laboratory experiments (Mills et al. 1978; Johnsen et al. 2009; Rodríguez-Blanco et al. 2010).
The second is a recent molecular technique allowing the quantification of the number of
copies of genes responsible for the metabolism of hydrocarbon (Cebron et al. 2008). Even if
they give complementary results, their coupling for a better representation of hydrocarbon-
degrading bacterial potentialities in natural environments has been very few tested (Pérez-de-
Mora et al. 2010).
Concerning the assessment of bacterial community structure, a privileged way has
often been the high-throughput 16S rRNA-gene-based methods (Denaro et al. 2004; Brown et
al. 2005; Ghiglione et al. 2005; Miralles et al. 2007). Coupled with environmental parameter
measurements, multivariate statistical analyses revealed the factors that constrained bacterial
communities in space (Ghiglione et al. 2008) as well as in time (Lami et al. 2009) and
provided a detailed description of aquatic ecosystem functioning over large-scale sampling.
However, data about variations in bacterial community structure in the first meters from the
shore are particularly scarce (Zhang et al. 2007; Zhang et al. 2009) and studies including
pollutants as a driving parameter are almost inexistent (Ben Said et al. 2010).
Furthermore, among the hot spot for sampling strategies, the sea surface microlayer
(SML, uppermost 1-1000 µm layers) has received a belated interest. It can be enriched in
pollutants by up to 1500 times relative to concentrations occurring in the subsurface water
(SSW) (Wurl et al. 2004). Bacterioneuston (bacteria that compose SML) is there generally 102
to 104 more abundant that bacterioplankton (Hardy 1982). Thus, SML has been clearly
identified as a unique microbial ecosystem. It is of first importance in the degradation of
hydrocarbons that especially accumulate to the surface because of their hydrophobicity
(Hardy 1997; Agogué et al. 2005). Nevertheless, few studies investigated the structure of
SML bacterial community in the past (Franklin et al. 2005; Cunliffe et al. 2011).
In this study, we first looked at the relation between PAH concentrations and PAH-
degraders. Second, we evaluated the relative impact of PAH concentration together with the
environmental parameters on total and metabolically active bacterial community structures in
four different harbors in the NW Mediterranean Sea impacted by variable hydrocarbon
pollution levels.
105 Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines
Material and methods
Figure 1: Sampling sites of the study.
Study sites and sampling
As part of the EC2CO IBISCUS program, five sites were investigated in the coastal
Northwestern Mediterranean Sea (Southern France): one site located in the Gulf of Fos-sur-
mer (Port Bouc, 43°24.167'N, 04°59.024'E) and four sites in the Bay of Marseille (Saumaty,
43°21.476'N, 05°19.517'E, Vieux Port, 43°17.765'N, 05°22.417'E , Cortiou, 43°12.746'N,
05°24.091'E and SOFCOM, 43°14.3'N, 05°17.3'E) (Fig. 1). These sites were chosen because
they present contrasted sources of anthropogenic inputs. Port Bouc (PB, 5 m depth) is a
harbor subjected to discharges of petroleum hydrocarbons from the Fos-sur-mer
petrochemical complex, which includes shipping and industrial activities related to oil (Mille
et al. 2007). Port Bouc may also receive some freshwater inputs coming from the Rhône
River and the Berre Lagoon (Ulses et al. 2005). Saumaty (SA, 4 m depth) and Vieux Port
(VP, 6 m depth) are two harbors characterized by an intense maritime traffic, especially
during the summer. Vieux Port is a marina and is the main recreative harbor of Marseille.
During strong rainfalls, Vieux Port can overflow and receive large amounts of highly
hydrocarbon-loaded freshwaters. Saumaty is a dynamic fishing harbor that combines trawlers,
tuna boats and wholesale trading centers. Cortiou (CO, 10 m depth), in the south Bay of
Marseille, is the discharge area of the secondary-treated sewage effluent from Marseilles City
and fifteen surrounded municipalities. By dry weather, the sewage effluent is released with a
daily average flow rate of 2.3 m3 s
-1. SOFCOM (SOF, 60 m depth), situated near Frioul
Islands (5 km off Marseille), is the nearshore observation station of the Oceanology Center of
Marseille. It belongs to the Service d‘Observation en Milieu LITtoral (SOMLIT;
http://www.domino.u-bordeaux.fr/somlit_national/) and was chosen as a pristine reference
(i.e. unpolluted by petroleum).
Sampling was carried out in summer (June 2009) and winter (January 2010) aboard
the R/V Antédon II. For all these sites (except SOFCOM that represented a unique station
named SOFCOM-D0), five stations were sampled along a coast-open sea transect (D0-D4),
D0 being the station at 1-10 m from the shore and D4 the offshore station, located about 2 km
from D0. Seawater samples were collected in the morning in the subsurface seawater (SSW at
~ 0.1-0.5 m depth) using a 5-L Niskin bottle equipped with silicon ribbons and Viton o-rings.
Seawater was transferred (without silicon tubing) from the Niskin bottle into 5 L plastic
bottles (for microbial analyses) and 4 L Nalgene® polycarbonate bottles (for PAH and
biogeochemical analyses). At D0 stations, samples were also collected in the surface
microlayer (SML) using a stainless-steel screen (0.8 m × 0.6 m, 2 mm mesh) according to the
method by Garret (1965). The metal screen was deployed from an inflatable boat under very
low wind (< 2 m s-1
) and calm sea conditions. SML samples were poured into the
plastic/Nalgene®
bottles by means of a precombusted (450 °C, 6 h) glass funnel. The bottles
were washed with 1 M hydrochloric acid (HCl) and ultrapure water (i.e. Milli-Q water, final
resistivity: 18.2 MΩ cm-1
) before use, rinsed three times with the respective sample before
filling and placed in the dark after the sample collection.
Along with the discrete water samples, profiles of temperature, salinity and
chlorophyll a (Chla) concentration were obtained from a Seabird Electronics 19plus
conductivity temperature depth (CTD) profiler equipped with a WETStar Chla fluorometer
(WETLabs Inc, USA). In situ measurements of ultraviolet (UV) fluorescence were also
conducted with an EnviroFlu-HC fluorometer (TriOS Optical Sensors, Germany) to assess the
PAH global levels in the water column (see § ―Measurements of PAH fluorescence‖).
Analyses of DOC and nutrients
Samples for dissolved PAH and dissolved organic carbon (DOC) analyses were
filtered under a low vacuum (< 50 mm Hg) through precombusted GF/F (~ 0.7 µm) glass
fiber filters (47 mm diameter, Whatman) using polysulfone filtering systems. Filtered water
107 Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines
for DOC (duplicate) was transferred into pre-combusted 10 ml glass ampoules, sealed after
addition of 10 µl of 85% phosphoric acid (Sigma-Aldrich). DOC was measured on 2
replicates by high-temperature catalytic oxidation using a Shimadzu TOC 5000 Total Carbon
Analyzer according to Sohrin & Sempéré (2005). The accuracy and system blank of the
instrument were determined by the analysis of reference material including deep Atlantic
water and low carbon water reference standards (D. Hansell, Rosenstiel School of Marine and
Atmospheric Science, Miami, USA). The nominal analytical precision of the measurement
was within 2%.
Samples for nutrients were analyzed without being filtered. Samples for nitrate (NO3-),
nitrite (NO2-) and phosphate (PO4
3-) determination were collected into 50 ml polyethylene
flasks and stored frozen until analysis. Samples for ammonium (NH4+) determination were
collected into 60 ml polycarbonate tubes and analysed directly. NO3-, NO2
- and PO4
3- were
analyzed using automated colorimetric method as described in Aminot & Kérouel (2004,
2007). The detection limits were 0.05 µM for NO3- and NO2
-, and 0.02 µM for PO4
3-. NH4
+
concentration was measured by using the fluorescent procedure of Holmes et al. (1999),
offering a detection limit of 0.005 µM.
Measurements of PAH fluorescence (EnviroFlu-HC fluorometer)
The EnviroFlu-HC submersible UV fluorometer is a commercially available
instrument dedicated to the in situ and real time quantification of PAHs from raw (unfiltered)
water. It provides an excitation light at 254 nm with a Full-Width Half-Maximum (FWHM)
of 25 nm (254 ± 12.5 nm), and detects an emission light at 360 nm with a FWHM of 50 nm
(360 ± 25 nm). The EnviroFlu-HC fluorescence domain fits very well with that of
phenanthrene, which is one of the most fluorescent PAHs found in the aquatic environment
(Tedetti et al. 2010). Hence, the sensor was calibrated in the laboratory before each series of
cruises with standard solutions of phenanthrene (≥ 98%, Sigma-Aldrich) in the range 0.01-10
µg L-1
according to the procedure described in Tedetti et al. (2010). Linear regressions of
calibration curves had coefficients of correlation (R) > 0.99. The phenanthrene detection and
quantification limits were 0.12 and 0.40 µg L-1
, respectively, whereas the saturation value was
around 20 µg L-1
. For in situ measurements, the EnviroFlu-HC was set up on the 19plus
CTD. The EnviroFlu-HC/CTD system, managed from the rear of the ship, was first immersed
in the SSW and then deployed in the whole water column (Tedetti et al. 2010). SML
measurements were made in the laboratory on discrete water samples. Therefore, in this work,
the EnviroFlu-HC fluorescence data of SSW and SML samples are given in µg L-1
equivalent
phenanthrene with an average coefficient of variation of 10%. Although these fluorescence-
derived concentrations cannot be considered as ―real‖ concentrations of Phenanthrene, they
are used as indicator of the abundance of PAHs in the different samples. We then validated
the use of the EnviroFlu-HC fluorometer as an indicator of the PAH levels in our samples by
comparing the data with PAH quantification by gaz chromatography according to Guigue et
al. (2011). As expected, we observed a significant linear relationship (R = 0.69, n = 19, p =
0.001) between the phenanthrene concentrations issued from the EnviroFlu-HC fluorometer
and total dissolved PAH concentrations determined from GC-MS (r2=0.93, n=6, p<0.01).
Bacterial abundance
Total bacterial counts were determined by flow cytometry (Lebaron et al. 1998).
Briefly, 2 mL seawater samples were fixed with 2% formaldehyde for at least 1 h at 4°C. A 1
mL sub-sample was incubated with SYBR Green I (final conc. 0.05% [v/v] of the commercial
solution) for at least 15 min at 20°C in the dark and analysed with a FACS Calibur flow
cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) equipped with an air-cooled argon laser (488
nm, 15 mW). Stained cells were enumerated according to their side-angle-scattered light
(SSC) and green cell fluorescence (GF) collected through a 530 ± 30 nm bandpass filter.
Yellow–green fluorescent beads (1 μm diameter, Polysciences) were systematically added to
each analyzed sample to normalize SSC and GF emission. Data acquisition and analysis were
done with Cell-Quest software (Becton Dickinson). Acquisition was triggered by GF. The
volume analyzed and subsequent estimation of cell concentrations were calculated by
measuring the remaining volume and subtracting it from the initial volume. Sheath fluid was
seawater filtered through a 0.22 μm pore size membrane.
Quantification of PAH-degrading bacteria by Most-Probable-Number
The quantification of PAH-degrading bacteria was first performed by the most-
probable-number (MPN), A total of 100 μL of each sample was introduced in triplicate in a
48-well microplate with 900 μL of sterile culture medium (Marine Broth®
reconstituted without carbon source and one milliliter of resazurin per liter of medium). 16
dilutions/extinctions were carried out successively in the same medium for each sample. A
mixture of six PAHs (naphthalene, fluorene, phenanthrene, fluoranthrene, pyrene and benzo-
α-pyrene) prepared in dichloromethane was introduced into each well at a final concentration
of 10 µg mL-1
. Finally 10 μL of sterile silicone oil were also added in order to increase the
accessibility of PAHs to bacteria. The microplates were sealed with a sterile plastic film
109 Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines
and encircled with parafilm to prevent evaporation. The incubation took place in the dark at
room temperature for one week. After incubation, the wells that have changed color (from
blue to pink) due to oxidation of the resazurin contained in the medium were counted.
Classical MPN table gave the most probable number of bacteria able to degrade the mixture
of six PAHs.
Identification of PAH genes
All PAH genes were recovered using primers described previously (Cebron et al.
2008). Ten nanograms of DNA was used in PCR amplifications, with the following
conditions: one cycle of 94°C, 2 min, followed by 30 cycles of 94°C, 30 s; 52°C, 30 s; and
72°C, 30 s. Final concentrations of primers and MgCl2 were 2 mM. The PCR products were
subjected to electrophoresis (1.5% agarose), and the products of the expected size were
excised from the gel and eluted with a Gene Clean gel extraction kit (Q-Biogene). The
purified fragments were cloned with a TOPO TA cloning kit for sequencing (Invitrogen)
according to the manufacturer‘s instructions. Colonies were screened via PCR to determine
the insert size, and 120 clones of the expected size were sequenced by standard Sanger
sequencing. Sequences were trimmed of the vector sequence and aligned using the CLUSTAL
program in Mega version 3.1. Sequences were added to an alignment containing most of the
known PAH sequences. Within-group mean distances were calculated in Mega 3.1.
Phylogenetic trees of the translated sequences were constructed in Mega3.1 with the default
parameters, based on both neighbor-joining and minimum evolutionary algorithms with 500
bootstrap replicates. The PAH gene sequences from the clone libraries were submitted to
GenBank.
Quantification of PAH and 16S rRNA gene abundance
One group of PAH genes, related to Proteobacteria, was targeted by qPCR. This
group was selected because of its relative abundance in PAH clone libraries (see Results).
Primers for this PAH group were designed using ARB with an alignment containing a set of
environmental and strain-derived PAH sequences. One PAH-containing plasmid was used as
a positive control and for standard curves in the qPCR assays. The PAH-containing plasmid
related to the targeted PAH group was isolated from environmental clones (Qiaprep kit,
Qiagen). Products were quantified in triplicate using the picogreen assay. Standard reactions
with plasmid contained approximately 101-10
6 copies per reaction. All standard curves were
linear within the ranges tested. Quantitative PCR was performed in triplicate or quadruplicate
with 1 mL of diluted DNA (0.1 ng mL-1
) in a final volume of 12.5 µL using the Stratagene
SYBR green mix with an ABI 7500 (Applied Biosystems). The PCR conditions were an
initial denaturation step at 95°C (10 min), followed by 40 cycles of amplification at 95°C for
15 s, 60°C for 45 s, and 72°C for 45s, with a final dissociation step. Final primer
concentrations were 0.5 mM. Only single peaks were observed in the dissociation curves for
both the standards and samples, indicating specific amplification with each set of primers.
Amplification efficiencies were between 91% and 110%, and no inhibition was detected when
a known quantity of standard was added to each sample (data not shown). The detection limit
of qPCR assays was about 10 copies. To verify the specificity of the PAH primers, the qPCR
primer pair was used to amplify PAH genes from the experiment and the resulting products
were cloned. PCR products were cloned and sequenced as described above. Of 20 clones that
were analyzed all contained the expected PAH sequences related to the targeted group.
Nucleic acid extraction, 16S PCR amplification and CE-SSCP analysis
Back to the laboratory, samples for microbial analyses were successively filtered onto
2 µm pore-size filter (47 mm, PC Nuclepore) and 0.2 µm Sterivex and stored at -80 °C until
nucleic acid analysis. DNA and RNA extractions and 16S cDNA synthesis were performed
from Sterivex as previously described (Ghiglione et al. 2009). Both DNA and cDNA served
as a template for PCR amplification of the variable V3 region of the 16S rDNA using w49F
and fluorescently 5‘-labeled with phosphoramidite (TET, Eurogentec) w34R primers
according to Ghiglione et al. (2005). CE-SSCP and analysis of the electropherograms were
performed as described in a previous paper (Ghiglione et al. 2008). All peaks were checked
manually for correct retention time (i.e. 1 OTU, ±6 retention time AU) and shape.
Electrophoregrams were transferred to the SAFUM software (Zemb et al. 2007) to render a
profile of fluorescence intensity as a function of retention time per sample. It allowed the
comparison of CE-SSCP profiles based on the presence and intensity of each individual peak
and analysis using indirect multivariate analysis. Similarity matrices based on Bray-Curtis
distances and ordination analyses along with their corresponding dendrograms were generated
by the unweighted pair group method using average linkages (UPGMA) by using the
PRIMER 5 software (PRIMER-E, Ltd., UK).
Statistical analysis
To test the null hypothesis that there was no difference between bacterial communities
of different experimental conditions we conducted an analysis of similarities with the
111 Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines
subroutine ANOSIM of PRIMER according to a protocol previously described (Ghiglione et
al. 2008).
Data were also analyzed using CANOCO (Ter Braak et al. 2002) version 5.0.
Fingerprints were analyzed by their peak areas, generating an intensity matrix. The similarity
matrix was computed using Steinhaus‘s similarity index. A canonical correspondence analysis
(CCA) was used to investigate the variations in the intensity matrix under the constraint of
our set of environmental variables. Significant variables (i.e. variables that significantly
explained changes in 16S rDNA and 16S rRNA signals) in our data set were chosen using a
forward-selection procedure and 999 permutations.
Results
Environmental parameters
First of all, as expected the temperature of seawater in sampled sites was higher in
summer (mean= 19 and 11, SD=3 and 2.2, n=21 in summer and winter respectively, Table 1).
The temperature was also higher in enclosed harbors than in opened sites in summer whereas
it was the opposite in winter. The salinity was clearly decreased in Port Bouc station, near the
Rhône River (26.8) from the classical values of seawater (37.8), and Chlorophyll a (Chla) was
increased in this site in comparison to the others. The dissolve organic carbon (DOC)
concentration was approximately the same between the two seasons (mean= 125 and 104,
SD=65 and 45, n=26 in summer and winter respectively). However, the surface microlayer
(SML) was systematically enriched in DOC compared to the underlying seawater (mean=205
and 133, SD=77 and 52, n=5 in SML and mean=106 and 97, SD=47 and 42, n=21 in SSW in
summer and winter respectively).
Station Location
Site
depth
(m)
T (°C) S (psu) Chlα (µg.L-1) DOC (µM) NH4 (µM) NO3+NO2 (µM) PO4 (µM)
Sum. Win. Sum. Win. Sum. Win. Sum. Win. Sum. Win. Sum. Win. Sum. Win.
Sofcom * D0 43°14.3'N, 05°17.3'E 60 nd nd nd nd nd nd 132.1 65.1 10.05 0.85 6.5 1.55 0.25 0.06
Sofcom D0 43°14.3'N, 05°17.3'E 60 15.03 12.46 37.87 37.92 0.50 1.2219 61.6 61.8 0.14 0.04 0.5 2.37 0.05 0.02
Cortiou * D0 43°12.746'N, 05°24.091'E 10 nd nd nd nd nd nd 209.7 108.5 overload 50.41 45.25 20.27 3.74 1.27
Cortiou D0 43°12.746'N, 05°24.091'E 10 15.06 13.34 37.92 37.60 0.26 2.4094 111 161.4 overload 184.59 56 39.21 1.84 3.19
Cortiou D1 43°12.709'N, 05°24.056'E 20 15.13 13.31 37.85 37.20 0.28 2.9378 179.1 83.4 overload 53.60 57.75 18.43 3.93 1.05
Cortiou D2 43°12.571'N, 05°24.069'E 30 15.15 13.31 37.32 37.66 0.29 2.7152 101.9 67.1 overload 15.39 50.5 6.84 1.16 0.30
Cortiou D3 43°12.353'N, 05°24.042'E 50 15.01 13.24 37.95 37.42 0.23 2.5227 68.4 67.2 0.51 4.01 0.75 4.09 0.10 0.18
Cortiou D4 43°12.0'N, 05°24.0'E 60 14.90 13.17 37.93 37.52 0.27 2.5594 62.5 72.5 0.25 15.19 1.25 9.07 0.05 0.44
Saumaty * D0 43°21.476'N, 05°19.517'E 4 nd nd nd nd nd nd 321.7 176.4 4.21 3.40 26.5 17.09 1.75 0.64
Saumaty D0 43°21.476'N, 05°19.517'E 4 18.00 11.30 37.72 37.08 3.19 2.7391 180.6 78.6 6.66 0.82 9 10.35 0.16 0.13
Saumaty D1 43°21.400'N, 05°19.590'E 3 17.84 11.58 37.82 37.13 3.56 3.1004 71.4 76.9 0.70 0.60 8 12.76 0.03 0.12
Saumaty D2 43°21.413'N, 05°19.478'E 4 17.85 12.03 37.76 37.36 4.05 5.3989 72.1 72.9 0.72 0.47 3.25 8.98 0.10 0.14
Saumaty D3 43°21.433'N, 05°19.011'E 5 19.33 12.26 37.79 37.43 0.17 1.3727 66.9 74.4 0.26 1.13 1 7.34 0.04 0.04
Saumaty D4 43°21.060'N, 05°18.301'E 28 19.57 13.01 37.76 37.91 0.13 1.2572 67.3 66 0.19 0.09 1 1.45 0.08 0.04
Vieux Port * D0 43°17.765'N, 05°22.417'E 5 nd nd nd nd nd nd 138.7 123.3 0.75 1.76 0.75 9.16 0.77 0.34
Vieux Port D0 43°17.765'N, 05°22.417'E 5 20.13 8.63 37.97 37.31 0.58 1.7398 86 105.7 1.74 2.42 0.75 7.65 0.25 0.27
Vieux Port D1 43°17.696'N, 05°22.225'E 5 21.49 8.80 37.62 37.32 10.66 1.9543 83 82.8 0.14 1.09 1.25 5.86 0.20 0.16
Vieux Port D2 43°17.665'N, 05°21.891'E 5 21.49 9.03 37.51 37.38 7.69 0.2822 81.6 79.4 0.12 0.54 6.25 4.73 0.07 0.09
Vieux Port D3 43°17.796'N, 05°21.563'E 5 20.40 11.39 37.71 37.71 1.92 0.5044 77 75.6 overload 0.16 2 2.56 0.08 0.04
Vieux Port D4 43°17.909'N, 05°20.879'E 30 21.14 12.29 37.87 37.98 0.10 0.7137 66 69.5 0.11 0.17 1.5 1.83 0.08 0.04
Port Bouc * D0 43°24.167'N, 04°59.024'E 5 nd nd nd nd nd nd 224.7 193.8 6.61 2.83 4 19.16 0.34 0.16
Port Bouc D0 43°24.167'N, 04°59.024'E 5 22.52 8.00 26.73 32.26 5.90 3.4921 191.7 196.4 7.30 2.32 3.75 19.12 0.26 0.12
Port Bouc D1 43°24.030'N, 04°59.050'E 6 22.60 7.03 26.29 27.50 5.67 3.9899 163.7 184.4 5.26 1.80 3 18.46 0.25 0.08
Port Bouc D2 43°24.027'N, 04°59.245'E 6 22.53 6.75 26.23 26.93 5.47 4.0517 179.1 147.2 4.68 1.83 1.25 17.48 0.12 0.12
Port Bouc D3 43°23.788'N, 04°59.109'E 12 22.08 8.57 27.92 30.49 4.15 2.0944 169.8 149.1 4.79 1.76 1.5 17.63 0.24 0.07
Port Bouc D4 43°23.402'N, 04°58.889'E 12 22.26 11.89 36.02 37.14 0.96 0.9516 98.3 71.3 0.77 0.25 1.5 4.01 0.15 0.05
nd:not determined
Table 1: Physico-chemical characteristics of the stations located in the Marseilles Bay and
Fos-sur-mer gulf.
113 Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines
The concentrations in inorganic nutrients (NH4, NO3+NO2, PO4) were slightly higher
in summer with quantities means of 2-2.6µM for the NH4 (SD=3.2 and 3, n=21), 11-11.3 for
the NO3+NO2 (SD=8 and 18, n=26) and 0.35-0.6 for the PO4 (SD=0.6 and 1, n=26) in winter
and summer respectively. The most important difference was found for the wastewater
effluent site (Cortiou) that reached very high values of inorganic nutrients compared to the
other stations (Table 1).
PAH fluorescence
In summer, the maximal phenanthrene concentrations derived from the PAH-
fluorometer were found in the subsurface seawater (SSW) and the surface microlayer (SML)
of Port Bouc-D0 station (35.4 and 87.9 µg L-1
equivalent phenanthrene, respectively) and in a
lesser extent in the SSW and SML of Saumaty-D0 station (6.9 and 51.3 µg L-1
equivalent
phenanthrene, respectively, Fig. 2). Surprisingly, phenanthrene concentration in the SML of
SOFCOM-D0 (9.8 µg L-1
equivalent phenanthrene) was higher than those observed in the
SML of Cortiou-D0 and Vieux Port-D0 (~ 6 µg L-1
equivalent phenanthrene), while
concentration in the SSW of SOFCOM-D0 was roughly undetectable (0.08 µg L-1
equivalent
phenanthrene). The enrichment factor (EF: concentration in the SML / concentration in the
SSW) ranged from 1.7 (Cortiou) to 120 (SOFCOM). In Port Bouc, Vieux Port, Saumaty and
Cortiou sites, phenanthrene concentrations decreased noticeably along the coast-open sea
transect (from D0 to D4). In winter, phenanthrene concentrations were much lower than in
summer (Fig. 2). The highest values were recorded in SML of Saumaty-D0 and Vieux Port-
D0 stations, with 5.6 and 4.3 µg L-1
equivalent phenanthrene, respectively. Concentration in
the SML of SOF-D0 was much lower than in summer (0.5 µg L-1
equivalent phenanthrene).
EF were also lower than in summer, ranging from 0.95 (Cortiou) to 8.4 (SOFCOM). The
same trend was observed with a decrease in phenanthrene concentrations from D0 to D4 (Fig.
2).
Total bacterial abundance
The total bacterial abundance was until 6-fold higher in the Port Bouc site compared to
the others (Fig. 2). All sites included, bacterial abundance exhibited a coast-offshore gradient,
varying from 3.08 106 or 0.94 10
6 cells mL
-1 in the subsurface seawater at the harbors (D0)
down to 0.72 106 or 0.46 10
6 cells mL
-1, at the offshore stations (D4), in summer and winter
respectively. Thus, the D4 stations of the four transects reached approximately the same
values as the SOFCOM station (Fig. 2). The number of bacterial per milliliter was 3-times
higher in summer than in winter with averages of 2.28 106 and 0.75 10
6 cells mL
-1,
respectively. At both seasons, the minimum bacterial abundance were found at the D4 station
of Saumaty (3.38 105 3.21 10
5 cells mL
-1 in summer and winter, respectively). As for PAH,
the SML contained 0-2.16-fold more bacteria than the underlying seawater. The maximum
was found in the SML of D0 Saumaty in summer (7.18 106 cells mL
-1) and in the SML of the
Vieux Port in winter (1.18 106 cells mL
-1).
Figure 2: Quantification of PAH, copy number of PAH-degradation genes, most-probable-
number of PAH-degrading bacteria and total bacterial abundance in all sampled sites during
summer 2009 (black) and winter 2010 (White).
115 Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines
Abundance of PAH-degrading bacteria
The PAH-degrading bacterial abundance was determined by two different methods
that showed complementary results (Fig. 2).
By using the Most-Probable-Number method, the tendencies were almost the same
than fluorometer-quantified PAH and total bacterial abundance with (correlation between the
MPN and the PAH concentration in Vieux Port and Saumaty, R²=11.47, p<0.01) an
enrichment of the Port Bouc site and the SML of all sites together with a harbor-large gradient
and an increase in PAH-degrading bacterial number during the summer season (Fig. 2). The
results from the quantification of PAH-RHD genes by quantitative PCR were different. The
designed primers for qPCR targeted specific catabolic genes that were found in a small
proportion of PAH degrading bacteria mostly belonging to Cycloclasticus, Sphingomonas,
Sphingobium, Novosphingobium, Acidovorax, Burkholderia, uncultured Comamonas and
Pseudomonas genera (Fig. 3). As for MPN, when detected, such genes were practically
always present at higher abundance in summer than in winter (Fig. 2). However they were
only occasionally detected in SOFCOM, Cortiou and Port Bouc sites, whereas they were
almost always found in Saumaty and Vieux Port transects. The maximum of copies was for
the Vieux Port SSW-D0 station in summer with 6.3 104 copies mL
-1. The SML was not
enriched in PAH-RHD genes and not clear gradient of such genes could be found between
coast and offshore seawaters (Fig. 2).
Figure 3: Phylogenetic tree of PAH-degrading gene in coastal Mediterranean waters based
on a neighbour-joining analysis of translated nucleotide sequences. Numbers on branches
represent bootstrap proportions from 500 replicates.
Bacterial community structure analysis
Figure 4: UPGMA dendrogram generated from the DNA (D-) and RNA-based (R-) CE-SSCP
patterns of bacterial communities originated from Cortiou, Vieux Port, Saumaty, SOFCOM
and Port Bouc sites. D0 to D4 indicate the coast-large gradient in sampled stations in each
site, samples with an (*) correspond to the surface microlayer, S means summer and W means
winter.
117 Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines
The major variations in bacterial community structure were found in site origins of
samples (Fig. 4). ANOSIM was used to determine the significant differences among bacterial
communities from the different stations. Three different clusters were formed with samples
most coming from (i) Cortiou, (ii) Vieux Port and Saumaty and (iii) SOFCOM and Port Bouc
(ANOSIM R=0.451, p=0.001). However, all sites were significantly different between each
other with the highest value of R between Vieux Port and Port Bouc (R=6.22, p=0.001) and
the lowest value between Vieux Port and Saumaty (R=0.108, p=0.009). Some D3 and D4
samples from Cortiou, Vieux Port and Saumaty presented some similarities with samples
from SOFCOM and Port Bouc, revealing a coast-offshore gradient in bacterial community
structure. ANOSIM confirmed that samples from D0 to D2 were significantly different to
samples from D3 to D4 (R= 0.215, p=0.001). Most of the time, DNA and RNA-based samples
were separated (R=0.118, p=0.001), especially in the Port Bouc site. One exception could be
found for the SML of Vieux Port and Saumaty for which total and active bacterial community
structures were particularly closed and not significantly different (R=-0.018, p=0.5).
Although, the SML was different from the underlining seawater (R=0.103, p=0.002)
especially in Vieux Port and Saumaty (Fig. 4). Generally, winter and summer samples were
different (R=0.099, p=0.001).
Bacterial community structure and physico-chemical variables ecological analysis
We performed canonical correspondence analysis (CCA) using all physic-chemical
parameters as constrained variables of the bacterial community structure determined by CE-
SSCP fingerprints of all environmental samples. First of all, we separated the samples in two
groups according to nucleic-acid based profile (DNA or RNA-based community structure).
A summary of the results of CCA is shown in Table 2.
CE-SSCP samples DNA-based RNA-based
Total inertia 0.720 0.928
Sum of all canonical eigenvalues 0.290 0.415
Axis 1 Axis 2 Axis 1 Axis 2
Eigenvalues 0.113 0.066 0.179 0.105
Species-environment correlations 0.762 0.866 0.823 0.820
Cumulative percentage variance of
- species data 15.7 24.9 19.3 30.6
- species-environment relation 38.9 61.7 43.2 68.6
Table 2: Summary of results from canonical correspondence analyses of the bacterial
community structure data when constrained by physico-chemical variables.
The total percentage of variance of samples diversity data when using physico-
chemical variables to explain their bacterial community structure was 40.3% or 44.7% for
DNA and RNA-based analysis respectively, as indicated by the ratio between the sum of all
canonical eigenvalues to the total inertia (Ter Braak et al. 2002). The same physico-chemical
variables were necessary to build the model for both DNA- and RNA-based analysis, i.e.
salinity, temperature, phosphate, chlorophyll a and to a lesser extend dissolved organic
carbon, nitrate, nitrite and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH). Among all monitored
physico-chemical parameters, the PAH concentration was not the most determinant factor but
contributed significantly to the shaping of the bacterial community structure (p=0,002).The
cumulative percentage variance of species-environment relation indicates that the first and
second canonical axes account for 38.9 and 61.7% for DNA-based samples and 43.2 and
68.6% for RNA-based samples of this variance respectively (Table 2). Consequent axes
accounted for less than 10% of the variance each, and are not further considered here. The
eigenvalues of the ordination analyses, which also measure their relative importance are small
(<0.3) implying that CCA does not strongly separates species niches and therefore the biplot
rule must be used to interpret the fitted relative abundances of samples with respect to
physico-chemical variables in the CCA ordination diagram (Fig. 5).
Monte Carlo test for first and all canonical axes were highly significant (p<0.01)
indicating that the parameters selected are good explanatory variables of the community
structure. The first canonical axis of DNA-based analysis was highly positively correlate with
salinity (ca. 0.8) and to a lesser extend with nutrients (PO4, NO3NO2 and NH4; ca. 0.3 to 0.4)
chlorophyll a, temperature (ca. 0.1 to 0.2, respectively) and PAH (ca. less than 0.1) (Fig. 5).
The second axis was more positively correlated with nutrients (ca. 0.6) chlorophyll a and
temperature (ca. 0.5) and to a lesser extent positively correlated with DOC and salinity (ca.
0.1 to 0.2 respectively). The same parameters explained also the first two axis of RNA-based
analysis, with higher positive correlation of the first axis with salinity and nutrients (ca. 0.9 to
1.2). The second axis was positively correlated with temperature (ca. 0.7), nutrients (ca. 0.4 to
0.6), DOC and PAH (ca. 0.3) and negatively correlated with chlorophyll a and salinity (ca.
0.3). In both DNA- and RNA-based analysis, the two synthetic gradients clearly separated
samples from their geographic origin (Vieux Port and Saumaty different from Port de Bouc
and from Cortiou) observed when using diversity data alone indicating that their community
composition varies with different concentrations of these parameters (Fig. 5).
119 Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines
Figure 5: Canonical correspondence analysis of bacterial community structure from samples
in all stations using physico-chemical parameters. Arrows point in the direction of increasing
values of each variable. The length of the arrows indicates the degree of correlation with the
represented axes. The position of samples relative to arrows is interpreted by projecting the
points on the arrow and indicates the extent to which a sample bacterial community
composition is influenced by the environmental parameter represented by that arrow. Samples
are colored in blue for Cortiou, in yellow for Port Bouc and SOFCOM and in orange for
Saumaty and Vieux Port according to clusters determined by the CE-SSCP dendogram.
Discussion
Impact of PAH pollution on total and PAH-degrading bacterial abundances
The pollution by PAH (substances on the priority list of the United States
Environmental Protection Agency) monitored in the sampled area reveled various oil-
pollution levels and attested of the impact of anthropogenic pollutants in harbors and coastal
marine environment. Certainly because of oil-shipping and anthropogenic coastal activities,
all stations were PAH-enriched compared to the SOFCOM reference, especially during the
summer (Fig. 2). Total bacterial abundance was also increased in harbors sites certainly
because of combined effects of terrigenous inputs of organic matter and nutrients,
anthropogenic pollution from harbor activities and by-products of primary production (Zhang
et al. 2007; Zhang et al. 2009). As expected, most probable number (MPN) enumeration of
indigenous PAH-degrading microorganisms (mix of six PAH as sole source of carbon)
followed the same patterns of PAH concentrations (Atlas 1991). In Vieux Port and Saumaty
especially, MPN were directly correlated to PAH concentrations (R²=11.47, p<0.01).
Moreover, whereas MPN-PAH-degrading bacteria represented around 1% of total bacterial
abundance in Cortiou, Vieux Port, Saumaty and SOFCOM, this proportion was increased
until 2-5% in Port Bouc, the most polluted site.
The quantification of PAH-degrading genes by quantitative PCR showed
complementary results. By contrast to the MPN method, the designed primers for qPCR
targeted specific catabolic genes that were found in a small proportion of PAH degrading
bacteria mostly belonging to Cycloclasticus, Sphingomonas, Sphingobium, Novosphingobium,
Acidovorax, Burkholderia, uncultured Comamonas and Pseudomonas genera (Fig. 3). The
qPCR has the advantage to focus on specific bacteria that serve as pollution indicators but
also reveal different variations of sub-groups of bacteria from general patters of total PAH-
degradation bacterial populations (Baldwin et al. 2003; McKew et al. 2007; Smith et al.
2009). Thus, we found that PAH-degrading genes were particularly detected in Saumaty and
Vieux Port sites whereas they were almost not found in Port Bouc while total PAH-degrading
bacterial populations detected by MPN were the most abundant. This combined approach of
MPN and qPCR showed that Vieux Port and Saumaty, on one hand, and Port Bouc, on the
other hand were composed by different PAH-degrading bacterial communities that were
certainly adapted to different types of complex oil-pollutants.
Differences between MPN and qPCR-based results were also found in the coast-
offshore gradient and the SML versus SSW (Fig. 2). MPN-PAH-degrading bacteria
121 Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines
particularly enriched the SML. Such high concentration of bacteria highlighted the relative
importance of the SML environment in the degradation of oil-pollutants (Guerin 1989). By
contrast, specific bacteria targeted by qPCR were not more abundant in the SML than SSW
contrasting once again with MPN results. Indeed, the SML was clearly enriched by total
PAH-degrading bacteria but not by all ribotypes. This observation constituted the first
relevancy of a specific colonization of the SML by particular bacteria meaning that even if
they possess metabolic capacities for the degradation of PAH, some bacteria were not able to
survive in this particular micro-environment. Moreover, whereas MPN-PAH-degrading
bacterial concentration decreased from the harbors to the large, PAH-degrading genes
abundance was more homogeneous over the stations (Fig. 2). Even in SSW, specific PAH-
degrading populations did not necessarily follow total PAH-degrading communities. Finally,
identical patters in MPN and qPCR results were found in seasonal variations. In summer,
PAH concentrations together with total bacterial abundance and PAH-degrading bacteria were
drastically increased. Thus, both total and specific PAH-degradation metabolic capacities
were stimulated by higher pollutant levels (Medina Bellver et al. 2005). Further investigation
on such PAH-degraders, and their activity in particular, would allow a better comprehension
of natural oil-bioremediation process in highly oil-impacted areas.
Environmental factors driving spatial and temporal variations of bacterial community
structure in harbors
In order to evaluate the relative impact of PAH contamination on bacteria among other
environmental parameters, we first explored the bacterial community structures in the
different areas. The similarity comparison of CE-SSCP profiles revealed that bacterial
assemblages were clustered according to three main groups with a majority of samples from i)
Cortiou ii) Vieux Port and Saumaty and iii) SOFCOM and Port Bouc (Fig. 4). Such clustering
was in accordance with origin of samples, distance between sites and type of pollutions (Fig.
1). Indeed, Cortiou was the most eastern station (nearest station, at 13 Km to SOFCOM)
which is classically characterized by its consistent and daily discharge of partially treated
wastewaters from the city of Marseille. Such specificity in bacterial community structure has
already been found in same type of environment in the Hong Kong bay where strong
anthropogenic pollutions (complex mix between chemical and biological pollutants) are
responsible for disturbance of natural bacterial community (Zhang et al. 2007; Zhang et al.
2009). Vieux Port and Saumaty are two enclosed harbors, separated by only 7 Km (closest
stations) and are characterized by oil-pollution especially during tourism periods. Their
isolation could explain the specific acclimation of bacterial communities in each site (Ben
Said et al. 2010). Thought, as those harbors presented similar characteristics, their bacterial
community structures were not radically different (Fig. 4). Last, bacterial community
structure from Port Bouc (most western site) was totally different from the others, certainly
because of contrasted types of pollution from others harbors. Port Bouc is a chronically oil-
polluted harbor which is more open to sea than Vieux Port and Saumaty (Mille et al. 2007).
Such characteristic would have explained why samples from Port Bouc and SOFCOM were
grouped in a same cluster even if they were separated by 34 km.
Bacterial community structure in each site formed a very short gradient between
samples from the shore (D0, less than 10m from the dock or the shore) to samples at 2 Km
further (D4). Whereas D0, D1 and D2 samples showed particular community structures in
each sites, D3 and D4 samples were more similar to the SOFCOM station suggesting an
impact of anthropogenic pollutants in the very first meters of the shoreline. Only Zhang et al.,
(2007, 2009), studying bacterial community structure in marine areas submitted to
anthropogenic pressure sampled seawater as close to the shore as we did. Such approach
contrasts with numerous studies that did not start their sampling before at least 2.7 Km
offshore (Ghiglione et al. 2005). Previously changes in bacterial community structure were
observed at 9.3 Km (Ghiglione et al. 2005) or at 95 Km from the coast (Schauer et al. 2000)
in the NW Mediterranean sea. Probably, the distance to the coast of sampling was not suitable
to highlight the small-scale variations in bacterial community structure, especially in waters
directly impacted by anthropogenic activities.
A particular attention should be paid for the SML that occasionally presented
particular characteristics in the oil polluted harbors (ANOSIM R=0.215, p=0.001, Fig. 4). A
sine qua non condition for the investigation of the SML was its complete formation. Indeed,
the most distinct SML was found for Saumaty and Vieux Port, the two sites that are the most
isolated from open sea, where there was the lowest wind disturbance during sampling and
where SML could maintain during several days. Those environmental conditions together
with the sampling method of SML (metal screen in our case) could explain contrasted results
found in our study and the literature (Cunliffe et al. 2011). For example, whereas Agogué et
al. (2005) did not detected consistent difference between SML and SSW in the Bay of
Banyuls-sur-Mer (France) and the Olympic Harbor in Barcelona (Spain), other authors found
distinct bacterial community compositions in UK North Sea coast (Franklin et al. 2005) and
Pacific Ocean (Cunliffe et al. 2009). The specificity of bacterial community structure of the
123 Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines
SML could be explained by numerous particular conditions, such as high UV radiations,
water-air surface exchange, specific organic film, enrichments in nutrients, pollutants and
microbes that made the SML a unique micro-environments where only few species could live
(Hardy 1982; Wurl et al. 2004; Guitart et al. 2010). Moreover, the comparison of rDNA-based
and rRNA-based CE-SSCP profiles from SML revealed that active bacterial community
structure were almost similar to total community while active and total fractions differed in
SSW. Thus, we showed for the first time that SML could be a particular ecological niche
where only active adapted bacterial OTUs are able to survive. In the rest of SSW samples,
total and active fractions of bacterial community structure were significantly dissimilar, a
tendency that was in accordance with previous studies showing that most of ribotypes are not
always active in natural environments (Moeseneder et al. 2001; Lami et al. 2009).
All those observations were available in summer as in winter period. Nevertheless,
bacterial community structures from each site varied according to the season (Fig. 4). Such
change was not surprising as most previous studies exposed seasonal patterns of bacterial
community composition in sites very close to our sampling area (Banyuls-sur-Mer, Ghiglione
et al., 2005), in others Mediterranean Sites (Schauer et al. 2003; Pinhassi et al. 2006), in
Atlantic Ocean (Kan et al. 2006) as well as Pacific Ocean (Fuhrman et al. 2006) and others
locations (Morris et al. 2005; Mary et al. 2006; Riemann et al. 2008). Our result showed that
harbor bacterial communities were as dynamic as communities from the large and were
sensitive to seasonal fluctuations.
To explain such spatial and seasonal variations in bacterial community structure we
performed statistical analysis canonical correspondent analysis (CCA) of CE-SSCP profiles
together with complex environmental data set including concentration pollutants (PAH). This
method has already showed its efficiency in the comprehension of pristine marine
environment (Ghiglione et al. 2008). However very few studies have integrated the pollution
factor in their environmental data set (Ben Said et al. 2010). Our statistical analysis revealed
that environmental parameters could explain 40.27 to 44.71% of the variance of the bacterial
community structure. Among parameters, the salinity, temperature, phosphate and chlorophyll
a were the most important factors and DOC, nitrate, nitrite and PAH contributed to a less
extend to the variation of bacterial community structure in the sampled area (Fig. 5). The
PAH concentration estimated by the PAH-fluorometer, in particular, contributed significantly
to the shaping of the bacterial community structure but was not the most important factor by
contrast with Ben Said et al.‘s (2010) results on the oil-polluted Bizerte Lagoon sediments.
Zhang et al. (2009) showed also that in some cases the anthropogenic pollution could
substantially affect the bacterial community and disturb the natural patters of bacterial
community structure produced by seasonal changes of the ecosystems. In the present study,
such massive impact of pollutants was not observed. Bacterial communities in sampled
harbors were clearly impacted by oil-pollution but this effect did not surpassed the effect of
others physic-chemical parameters such as temperature and salinity. Zhang et al. (2009)
indicated that it was not contradictory to reach such conclusion as probably major bacterial
groups composing total bacterial community would follow general seasonal patterns, while
other factors as pollutant concentrations would ―stimulate or repressed‖ minor bacterial
groups. Further investigations should put the light on specific effects of pollutants on
particular groups composing total bacterial community.
Acknowledgments
This study is part of a research project ―IBISCUS‖ (Indicateurs Biologiques et
chImiques de Contaminations UrbaineS) from Université Aix-Marseille2/CNRS-INSU, which
aim at developing observation tools for pollution assessment in urban coastal marine
environnement and funded by 1) the Continental and Coastal Ecosphere (EC2CO) program
from CNRS and the Institut des Sciences de l‘Univers (INSU), and 2) ―ANR-ECOTECH 09-
ECOT-009-01‖, Agence Nationale de la Recherche (ANR) – Ademe/Ecotechnologies
program, both labeled by the Competitivity Cluster ―Pôle Mer PACA‖.
125 Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines
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131
IMPACT DE LA RECURRENCE DES POLLUTIONS SUR LA
REPONSE DES BACTERIES A L’APPORT DE PETROLE ET
A LA BIOSTIMULATION
CHAPITRE 3
133
Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport de pétrole et à la biostimulation.
Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la
réponse des bactéries à l’apport de pétrole et à la
biostimulation.
1. Préambule
Nous avons vu dans le premier article l‘intérêt incontestable des études in situ. Néanmoins,
afin de permettre une meilleure compréhension de l‘impact des hydrocarbures sur les
communautés bactériennes et la façon de les stimuler, il est également nécessaire de réaliser
des expériences en conditions contrôlées, en laboratoire, qui permettent de mieux maîtriser la
complexité des facteurs environnementaux. Ce type d‘approche a plusieurs avantages : (i) elle
permet de simuler des déversements soudain de pétrole et de suivre l‘évolution des
communautés bactériennes en réponse aux hydrocarbures, ce qui peut s‘avérer difficilement
faisable dans l‘environnement, (ii) elle permet de tester différentes hypothèses en contrôlant
les paramètres expérimentaux et (iii) elle permet l‘utilisation de contrôles expérimentaux ainsi
qu‘une meilleure reproductibilité. Il s‘agit en général de simuler une pollution sur des
échantillons naturels dans des systèmes expérimentaux de type microcosmes (<100 L) ou
mésocosmes (>100 L). Par ce type d‘approche, il est possible de suivre la dynamique de
l‘ensemble des populations microbiennes (bactéries mais aussi protozoaires et virus) sous
l‘influence de différents facteurs comme les ressources en sels nutritifs, l‘oxygénation, la
température, les populations de prédateurs de bactéries, et bien d‘autres.
Au regard de ce qui a été discuté en introduction générale, il ne fait aucun doute que
certains paramètres influençant la dégradation des hydrocarbures ont été par le passé
davantage étudiés que d‘autres. De manière surprenante, la question de l‘effet de la récurrence
des ajouts de pétrole n‘a pratiquement pas été abordée alors que plusieurs auteurs ont émis
l‘hypothèse d‘un rôle non négligeable des déversements chroniques dans la réponse des
communautés bactériennes à un apport d‘hydrocarbures. L‘effet de la prédation par les
protozoaires est également un facteur qui a été pris en compte que très tardivement dans les
expériences de bioremédiation. Par conséquent, les informations sur le contrôle de type « top-
down » en milieu pollué sont encore relativement rares et surtout elles ont donné des
tendances contradictoires. Enfin, bien que nombreuses, les expériences de biostimulation par
ajout de sels nutritifs et d‘émulsifiants montrent toujours des efficacités variables et surtout ne
prennent jamais en compte la récurrence des pollutions et le contrôle « top-down ».
Nous avons donc proposé d‘aborder l‘ensemble de ces aspects dans une expérience
intégrative en microcosmes (75 L) avec deux échantillons d‘origines différentes : un site
pollué chroniquement et un autre site dépourvu de pollution. Nous avons simulé un
déversement accidentel de pétrole brut sur les échantillons provenant de chaque site, avec ou
sans biostimulation (ajout de sels nutritifs ou de bioémulsifiant). Il s‘agissait de suivre à la
fois l‘évolution du compartiment bactérien mais aussi celui des nanoflagellés hétérotrophes,
leurs prédateurs directs, sous l‘influence du pétrole, durant environ 10 jours. Nous savions au
préalable que cette période correspondait en général à la mise en place d‘un consortium
bactérien de biodégradation des hydrocarbures mais également qu‘elle permettait d‘observer
des changements d‘abondances entre les bactéries et leurs prédateurs formant un cycle
s‘étalant approximativement sur cet intervalle de temps.
Comme attendu, l‘ajout de pétrole a eu un effet plus marqué sur la communauté
bactérienne originaire du site dépourvu de pollution que celle originaire du site
chroniquement pollué. Un consortium de biodégradation s‘est mis en place plus rapidement
dans le site chroniquement pollué et la dégradation des molécules les plus complexes (HAP) a
été meilleure. Toutefois, la biostimulation par ajouts de nutriments ou d‘émulsifiants a été
tout aussi efficace dans un site que dans l‘autre, permettant aux bactéries d‘être plus actives et
ainsi induisant une meilleure dégradation des hydrocarbures. Enfin, la prédation par les
protozoaires a provoqué une forte mortalité chez les bactéries se traduisant par une légère
baisse de la dégradation des hydrocarbures, révélant le rôle prépondérant du contrôle de type
« top-down » dans les stratégies de biostimulation.
135
Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport de pétrole et à la biostimulation.
2. Article 2: Influence of pollution history on the response of coastal bacterial and
nanoeukaryote communities to crude oil and biostimulation assays.
Soumis à Aquatic Microbial ecology.
List of authors: Caroline Sauret1,2
, Urania Christaki3, Paraskevi Moutsaki
4, Ioannis
Hatzianestis5, Jean-François Ghiglione
1,2
(1) CNRS, UMR7621, Laboratoire d'Océanographie Microbienne LOMIC, F-66651 Banyuls-
sur-Mer, France;
(2) UPMC Univ Paris 06, UMR 7621, Observatoire Océanologique, F-66651 Banyuls-sur-
Mer, France;
(3) Université Lille Nord de France, INSU-CNRS, UMR 8187, LOG, Laboratoire
d‘Océanologie et des Géosciences -, 32 avenue Foch, F-62930 Wimereux, France
(4) Technological Educational Institute of Crete, Sitia, 72300, Greece
(5) Hellenic Centre for Marine Research, Institute of Oceanography, 46.7 km Athens-Sounio
aven., 19013 Anavyssos, Greece
Correspondence:
Jean-François Ghiglione
CNRS, UPMC Univ Paris 06, UMR7621, Laboratoire d'Océanographie Microbienne LOMIC,
Avenue Fontaulé, F-66651 Banyuls-sur-Mer, France. Tel.: +33 4 68 88 73 16; fax: +33 4 68
88 73 98
E-mail address: [email protected] (J.F. Ghiglione)
Running title: Influence of pollution history in biostimulation assays.
Keywords: pollution history, biostimulation, 16S rDNA/rRNA, 18S rDNA
ABSTRACT
The pollution history has often been proposed to explain site-dependent
bioremediation efficiencies, but this hypothesis remains poorly explored. Here, microcosm
experiments were designed to evaluate the importance of the pollution history on the response
of microbial communities to crude oil and biostimulation assays. Pristine vs. chronically oil-
polluted seawaters from coastal Aegean Sea were supplemented with crude oil ± nutrients or
emulsifier and monitored above 10 days in microcosm experiments. The kinetics of bacterial
and heterotrophic nanoflagellate (HNF) abundances and community structures were followed
by microscopy counting and SSU rRNA gene community profiling, respectively. The addition
of crude oil had a more visible effect on bacteria originated from the pristine site with a higher
increase of the activity of given OTU and inactivation of other petroleum-sensitive bacteria,
as revealed by DNA and RNA-based comparison. Such changes resulted in a delay in the
apparition of a peak of bacterial abundance and in a lower bacterial degradation of the more
complex hydrocarbons. Biostimulation provoked a selection of different bacterial community
assemblages and stirred metabolically active bacteria, resulting in a clear increase of the peak
of bacteria and their HNF predators and higher oil degradation, independently of the pollution
history of the site. The present study gives a better knowledge of environmental
characteristics such as pollution history or top-down vs. bottom-up controls on oil bacterial
degraders which is crucial for the advance of site-specific bioremediation strategies.
137
Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport de pétrole et à la biostimulation.
Introduction
Hydrocarbon-degrading bacteria are ubiquitously distributed in marine environments
and are responsible for most of the petroleum degradation (Leahy et al. 1990; Yakimov et al.
2007). With regard to the low rates of natural biodegradation, bioremediation aims to
stimulate this process as an oil spill countermeasure within marine environments (Atlas 1981;
Prince 1993; Van Hamme et al. 2003). Among the environmental factors controlling bacteria,
the limitation by nutrient resources (Atlas et al. 1972) and the petroleum bioavailability
(Leahy et al. 1990) have been often considered to have a major impact on the rate of
hydrocarbon biodegradation. Biostimulation by nutrients (mainly nitrogen and phosphorus)
and/or surfactant (emulsifier) amendment remains the most commonly used strategy to
enhance bacterial degradation (Kasai et al. 2002; Head et al. 2006; Van Hamme et al. 2006).
Biostimulation may increase significantly the hydrocarbon biodegradation but it could also be
ineffective because of its unpredictable effects on the complex food web (Head et al. 1999).
The heterotrophic nanoflagellates (HNF, 2-10 µm in size) in particular have been clearly
identified as major players in the regulation of marine bacterial production and diversity
(Suzuki 1999; Jürgens et al. 2002; Longnecker et al. 2010). Atlas (Atlas et al. 1976) reported
that one of the major changes in microbial communities after oil pollution was the dominance
of flagellated protozoa (heterotrophic nanoflagellates - HNF) over other heterotrophs. In a
single study dealing with HNF diversity based on 18S rDNA clone libraries, it was shown that
cosmopolitan non-specialists can grow efficiently in oil-polluted seawater and control
bacterial abundance (Dalby et al. 2007). Compared to the number of studies investigating the
bacterial limitation by resources (―bottom-up effect‖ reviews by Van Hamme et al. 2003, and
Head et al., 2006), very few studies have investigated the influence of grazers (―top down
control‖) in a biodegradation context (Kota et al. 1999) and even fewer under biostimulation
conditions (Dalby et al. 2007; Gertler et al. 2010).
Bacterial degradation of hydrocarbons and biostimulation efficiencies could also be
dependent of the considered environment and especially its pollution history, enlightening the
difficulty of planning site-specific treatment strategies (Head et al. 2006). If enzymatic
capacities of a single cell are limited, an entire bacterial community presenting high metabolic
capacities is primordial in the degradation of complex mixtures of hydrocarbon such as crude
oil (Van Hamme et al. 2000). Such capacities may be higher for already acclimated bacterial
communities in chronically polluted site compared to a pristine environment (Bartha 1986),
but this hypothesis has been poorly explored in the literature.
Most of the studies using new culture-independent 16S rDNA-based methods showed
that biostimulation led to a decrease of the number of bacterial open taxonomic units (OTUs),
with fewer dominant groups and radical shifts in the bacterial community structure (Kasai et
al. 2002; Röling et al. 2002; Rodríguez-Blanco et al. 2010). 16S rDNA-based methods
describe the relative composition of the total bacterioplankton community, and previous
studies used 16S rRNA-based methods to characterize the active fraction of bacterial
communities in different environments (Moeseneder et al. 2001; Ghiglione et al. 2009; Lami
et al. 2009), based on the observation that the number of ribosomes per cell is proportional to
the growth rate (Kemp et al. 1993). Notably, Rodríguez-Blanco et al. (2010) underlined the
importance of coupling 16S rDNA- and 16S rRNA-based fingerprints to get a better view of
changes after a biostimulation treatment in both total (including dormant, senescent or dead
cells) and metabolically active communities.
The aim of the present study was to compare the responses of the bacterial
communities originated from a chronically oil-polluted environment (POLL) and from a
pristine environment (OLIG) to oil addition and biostimulation in presence of their HNF
predators. We hypothesized that the POLL site would be able to adapt easier to the oil input
than the OLIG pristine site because of his pre-exposition to hydrocarbons. Bacterial and
nanoeukaryotic consortia were assessed with the highly sensitive and reproducible capillary
electrophoresis single strand conformation polymorphism (CE-SSCP) technique (Ghiglione et
al. 2005) to follow the temporal changes of both total (based on 16S rDNA) and active (based
on 16S rRNA) bacterial community structure and total HNF community structure (based on
18S rDNA) during the course of the experiment. To the best of our knowledge, no study
exists on the community dynamics of both bacterial and their eukaryotic predators in oil-
polluted marine water.
139
Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport de pétrole et à la biostimulation.
Materials and methods
Microcosm experiments
Seawater samples from an unpolluted oligotrophic site (OLIG – Anavissos Bay,
Aegean Sea) or a chronically oil-polluted mesotrophic site (POLL – Elefsina Bay, Aegean
Sea) were collected in April and June 2005, respectively. The water was passed through a 10
µm Polycarbonate Nuclepore™ filter (147 mm) (Whatman plc, UK) in a gravity filtration
device (Bailey‘s Plastic Fabrication, Dartmouth, NS, Canada) to screen out larger organisms.
The seawater was then distributed evenly into four 75 L glass aquaria. One of the four
microcosms served as the control and nothing was added in the seawater. The following were
added to each of the other three microcosms: (i) crude oil (100 ppm), (ii) crude oil (100 ppm)
and 0.1 g L-1
of bat-guano as nutrients (containing KH2PO4 0.0077 g L-1
, NH4Cl 0.02 g L-1
and NaNO3 0.01 g L-1
), and (iii) crude oil and Alasan emulsifier (100 and 10 ppm,
respectively). Alasan (Navon-Venezia et al. 1995) is a bioemulsifier complex of an anionic
polysaccharide and proteins (provided by M. Yakimov, Istituto Sperimentale Talassografico –
CNR, Messina, Italy). We evaluated the initial total hydrocarbon (THC) concentration (same
protocol as described in section 2.2) to 0.0014 ppm for Anavyssos sample and 0.171 ppm for
Elefsina sample. Gentle continuous water mixing in each microcosm was accomplished by
using a commercial fish pump (Tunze, Italy) with 35 L h-1
circulating capacity. Incubations
took place in 21°C in the dark. Microcosm incubations lasted 10 days.
Hydrocarbon analysis
Oil composition was determined for the Anavissos experiment (OLIG) at time zero
and 62, 86, 134 and 254 hours after the crude oil addition and for the Elefsina experiment
(POLL) at time zero and at 62, 134 and 206 hours. For the hydrocarbon analysis 100 mL of
each microcosm were collected and, after the addition of n-C24D50, phenanthrene-D10,
pyrene-D10 and chrysene-D12 used as surrogate standards, were extracted with 20 ml of n-
hexane. The hexane extract was dried by passing through Na2SO4 and concentrated to a final
volume of 1 ml. Hydrocarbons were determined in the final solutions by gas chromatography
– mass spectrometry (Hewlett Packard 6890 GS/MSD). A CP-Sil 8 MS analytical column (30
m x 0.25 mm i.d. x 0.25 µm film thickness) was used and the oven temperature was
programmed from 60°C (1 min) to 300°C (10 min) at 5°C min-1
. The following compounds
were quantified: n-alkanes from C12 to C34, the unresolved complex mixture (UCM) of
hydrocarbons, the resolved compounds and some representative polycyclic aromatic
hydrocarbons (phenanthrene, chrysene, methyl- and dimethyl phenanthrenes and methyl-
chrysenes). The quantification was based on calibration curves obtained by injecting standard
solutions containing n-alkanes (C12 – C34) and the PAH compounds. The sum of the
concentrations of n-alkanes, UCM, resolved compounds and the PAH quantified in this study
is referred as total hydrocarbons (THC). The recoveries of the surrogate standards were
always above 80%. Replicate analyses showed that the variability of measured values was
always less than 10%. During the incubation time, to distinguish between physical removal
(mostly evaporation) and biodegradation, hydrocarbon concentrations were expressed relative
to 17α(H),21β(H)-hopane, a known degradation-resistant compound present in crude oil. The
percentage of biodegradation was calculated by dividing the concentration of individual
compounds relative to that of 17α(H),21β(H)-hopane at the time of measurement by the
concentrations relative to that of 17α(H),21β(H)-hopane at the start of the experiment.
Bacterial and nanoflagellate cell counts
To enumerate HNF and bacteria, 5-15 mL and 1-5 mL aliquots, respectively, were
sampled at 0, 19, 40, 65, 90, 114, 137, 185, 237 h for the POLL experiment ant at 0, 65, 86,
93, 110, 134, 164, 231, 255 h for the OLIG experiment. Samples were preserved with
formaldehyde at a final concentration of 2% kept at 4°C in the dark, filtered on black
Nuclepore filters (pore size: 0.8 µm and 0.2 µm for nanoflagellates and bacteria,
respectively), stained with DAPI (Porter et al. 1980) and stored at -20°C until counting.
Heterotrophic nanoflagellates and bacteria were enumerated using an Olympus AX-70
PROVIS epifluorescence microscope at 1000X.
Nucleic acid extraction, 16S and 18S PCR amplification and CE-SSCP analysis
Five hundred milliliters of seawater was filtered on 0.2 µm-pore-size filter (47 mm,
PC, Nucleopore) and frozen until nucleic acid extraction. Samples were taken during the
course of the experiment in time 0, 40, 65 and 114 h in the POLL microcosms and 0, 65, 93
and 134 h in the OLIG microcosms, according to the maximum bacterial and HNF
abundances (see results Fig. 2). DNA and RNA extractions and 16S cDNA synthesis were
performed as previously described (Ghiglione et al. 2009).
Both DNA and cDNA served as a template for PCR amplification of the variable V3
region of the 16S rDNA using w49F and fluorescently 5‘-labeled with phosphoramidite (TET,
Eurogentec) w34R primers according to Ghiglione et al. (2005).
141
Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport de pétrole et à la biostimulation.
DNA served also as a template for PCR amplification of the V8 variable region of the
18S by using phosphoramidite (TET)-labeled Uni1392r (5‘-ACG-GGC-GGT-GTG-TRC-3‘)
(Lane et al. 1985) and Euk1209f (5‘-CAG-GTC-TGT-GAT-GCC-CGC-3‘) (Giovannoni et al.
1988) primers. 18S rDNA amplification was done with the same products and thermocycler
as for 16S PCR amplification but using the following protocol: 94°C for 1 min, 65°C for 1min
and 72°C for 1min, 10 touchdown cycles of denaturation at 94°C for 1 min, annealing at 65°C
(with the temperature decreasing 1°C each cycle) for 1 min, and extension at 72°C for 1 min,
followed by 15 cycles of 94°C for 1 min, 55°C for 1 min and 72°C for 1 min and a final
elongation step at 72°C for 10 min.
CE-SSCP and analysis of the electropherograms were performed as described in a
previous paper (Ghiglione et al. 2008). All peaks were checked manually for correct retention
time (i.e. 1 OTU, ±6 retention time AU) and shape. Electrophoregrams were transferred to the
SAFUM software (Zemb et al. 2007) to render a profile of fluorescence intensity as a function
of retention time per sample. It allowed the comparison of CE-SSCP profiles based on the
presence and intensity of each individual peak and analysis using indirect multivariate
analysis. Similarity matrices based on Bray-Curtis distances and ordination analyses along
with their corresponding dendrograms were generated by the unweighted pair group method
using average linkages (UPGMA) by using the PRIMER 5 software (PRIMER-E, Ltd., UK).
To test the null hypothesis that there was no difference between bacterial communities of
different experimental conditions we conducted an analysis of similarities with the subroutine
ANOSIM of PRIMER according to a protocol previously described (Ghiglione et al. 2008).
DNA- and RNA-based fractions of each sample were also compared manually. A matrix was
established according to the presence or absence of peaks. It allowed to calculate for each
sample the percentage of peaks that were common in both DNA- and RNA-based fractions
(DNA+RNA+), that were only present in DNA-based fraction (DNA+RNA-) or only present
in RNA-based fraction (DNA-RNA+).
Results
Changes in hydrocarbon composition of crude oil
The total hydrocarbon concentration (THC) decreased linearly in both oil amended waters
with higher degradation observed at the end of the experiment for OLIG (51% remaining, Fig.
1A) compared to POLL experiment (77% remaining, Fig. 1B). Addition of nutrients and
emulsifier resulted in a more rapid and more efficient degradation of THC in the OLIG (52%
and 42% remaining in nutrients and emulsifier amended microcosms, respectively) as well as
in the POLL (44% and 59% remaining in nutrients and emulsifier amended microcosms,
respectively) (Fig. 1). In both nutrients and emulsifier amended microcosms, the degradation
of THC was severely reduced after 120 h.
Figure 1: Quantities (in percentage) of total hydrocarbon compounds (THC), n-alkanes and
polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in the oligotrophic site (OLIG) and the chronically
polluted site (POLL) during the microcosm experiments.
The general dynamic of two oil-representative classes of hydrocarbons, i.e. n-alkanes
and PAH, showed two stages. During the first 62 h in the POLL (Fig. 1B) or the first 86 h in
the OLIG conditions (Fig. 1A), we observed a maximal degradation of alkane but lower
143
Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport de pétrole et à la biostimulation.
degradation of PAH. This trend was inverted in a following stage with a slowdown of alkanes
degradation and an acceleration in PAH degradation in both conditions. This trend was
particularly marked for nutrients and emulsifier amended microcosms. After 200 h of
incubation, the decrease of n-alkanes and PAH was almost 2-times higher in the oil amended
POLL (remaining of 17% of n-alkanes and 37% of PAH, Fig. 1B) compared to the OLIG
(remaining of 30% of n-alkanes and 64% of PAH, Fig. 1A). In the nutrients and emulsifier
amended microcosms, a complete degradation of n-alkanes was observed after 136 h in the
OLIG site (Fig. 1A) whereas it occurred after 200 h in the POLL microcosm (Fig. 1B). We
also found a higher decrease of PAH compounds in nutrients or emulsifier amended
microcosms with higher degradation in the POLL compared to OLIG conditions. Indeed,
PAH remaining in the OLIG microcosm (Fig. 1A) at the end of the experiment were 57%,
64% and 31% of the initial quantity in the oil, oil+nutrients and oil+emulsifier microcosms,
respectively. These percentages were respectively of 37%, 9% and 13% in the POLL
conditions (Fig. 1B).
Bacterial and HNF abundances under oil pollution
The initial bacterial abundance was higher in the POLL (4.1 106 cells mL
-1) compared
to the OLIG (7.6 105 cells mL
-1). The addition of crude oil provoked a peak of the bacterial
abundance in the OLIG (5.5 106 cells mL
-1 after
93 h). The peak of bacterial abundance in the
oil polluted POLL (5.5106 cells mL
-1 after
65 h) was similar to the peak in the control
condition (6.7 106 cells mL
-1 after
65 h). In both sites, the HNF abundance remained relatively
low during the course of the experiment in both control and oil supplemented microcosms
(below 1.0 103 cells mL
-1). The addition of oil+nutrients or oil+emulsifier resulted in a drastic
increase of bacterial abundance (peak of 1.3 107 or 6.4 10
6 cells mL
-1 in the OLIG and
1.1 10
7
or 1.2 107 cells mL
-1 in the POLL, respectively) followed by a large increase of HNF
abundance (5.7 103 or 8.6 10
3 cells mL
-1 in the OLIG and 1.1 10
4 or 1.3 10
4 cells mL
-1 in the
POLL, respectively). The biostimulation also reduced the initial lag time of bacterial and HNF
increase in both OLIG and POLL relative to oil only condition (Fig. 2). Bacterial abundances
peaked later in the OLIG microcosms (93, 86 and 62 h for oil, oil+nutrients and
oil+emulsifier respectively) compared to POLL microcosms (40, 65 and 40 h for oil,
oil+nutrients and oil+emulsifier respectively) in response to oil or oil+nutrients or
oil+emulsifier addition (Fig. 2). HNF peaks always followed bacterial peaks, and occurred
between 86 and 134 h in the OLIG and between 65 and 114 h in the POLL site.
Figure 2: Bacterial and nanoflagellates abundances in the control, oil, oil+nutrients and
oil+emulsifier conditions in the OLIG and POLL microcosms.
Community structure of total (16S rDNA) and metabolically active (16S rRNA) bacteria
Community structure of total and metabolically active bacteria was obtained by
comparing 16S rDNA- and 16S rRNA-based CE-SSCP profiles, respectively. At the
beginning of the experiment, the number of DNA and RNA ribotypes in the OLIG (38 and 40
peaks, respectively) was higher than in the POLL microcosms (30 and 29 peaks,
respectively). The number of CE-SSCP peaks varied greatly in the OLIG microcosm with a
clear decrease in both DNA (from 38 to 27 ± 3, n=4) and RNA (from 40 to 22 ± 8, n=4) peaks
from the beginning to the end of the experiment in all conditions (Table 1). The largest
decrease in the number of peaks was found at the RNA level in the nutrients and emulsifier
conditions (from 40 to 19 and 14 peaks, respectively), whereas their decrease at the DNA
level was as high as for the control (Table 1).
145
Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport de pétrole et à la biostimulation.
During the course of the OLIG experiment, the percentage of peaks common to both
16S rDNA and 16S rRNA-based fingerprints (DNA+RNA+) decreased below 53% in all the
oil polluted microcosms, including nutrients and emulsifier conditions (mean= 39 ± 7%, n=9)
whereas it remained stable in the control samples (more than 64%, maximum of 81%,
mean=75 ± 8.3%, n=4) (Fig. 3A). The percentage of peaks unique to the 16S rDNA
fingerprints (DNA+RNA-) in the oil polluted microcosms varied between 18% and 56%
(mean=33.5 ± 11.4%, n=9) and remained always higher than in the control (mean=10 ± 1.9%,
n=4). The number of peaks unique to the 16S rRNA fingerprints (DNA-RNA+) also increased
drastically in the oil polluted microcosms (mean= 27.6 ± 3.9%, n=9) compared to the control
(mean=15.6 ± 6.9%, n=4) (Fig. 3A).
OLIG POLL
Time (h) 0 65 93 134 0 40 65 114
Bact
eria
DN
A Control 38 31 29 27 29 26 38 25
Oil 38 22 24 24 29 27 28 24
Oil + nutrients 38 35 27 28 29 22 24 29
Oil + emulsifier 38 26 22 30 29 28 25 30
RN
A Control 40 33 29 32 30 31 28 23
Oil 40 27 28 24 30 28 25 27
Oil + nutrients 40 36 26 14 30 30 30 41
Oil + emulsifier 40 25 22 19 30 27 29 28
Eu
kary
ote
DN
A Control 23 15 10 8 13 13 9 8
Oil 23 16 12 8 13 13 13 10
Oil + nutrients 23 16 10 6 13 13 11 10
Oil + emulsifier 23 6 5 6 13 9 11 10
Table 1: Number of detected ribotypes in CE-SSCP patterns of bacterial DNA and RNA-
based profiles and of eukaryotes DNA-based profiles in oligotrophic (OLIG) and chronically
polluted (POLL) sites in control, oil, oil+nutrients, oil+emulsifier at different times (0, 65, 93
and 134h for OLIG and 0, 40, 65 and 114h for POLL).
The number of CE-SSCP peaks were much more stable from the beginning to the end
of the POLL experiments on both DNA (from 29 to 27 ± 2, n=4) and RNA levels (from 30 to
29 ± 8, n=4) (Table 1). The differences in the presence/absence of DNA and RNA peaks
observed in the OLIG experiment between control and oil amended samples were less visible
in the POLL experiment with no clear difference between the trend of DNA+RNA+,
DNA+RNA- or DNA-RNA+ in control and oil polluted microcosms, including nutrients and
emulsifier conditions (Fig. 3B).
Figure 3: Percentage of ribotypes unique to the 16S rDNA (DNA) or the 16S rRNA (RNA)
CE-SSCP fingerprints, or common to both (DNA+RNA).
UPGMA dendrograms based on both presence/absence and relative abundance of CE-
SSCP peaks showed different bacterial community structures in OLIG and POLL microcosms
(data not shown, R=0.265, p=0.001) where clusters were different. In the OLIG experiments,
significant differences were found by the ANOSIM statistical test between three clusters in (i)
control (control versus oil R=0.337, p=0.006), (ii) oil only (oil versus nutrients and emulsifier
R=0.566, p=0.001) and (iii) oil with nutrients or emulsifier (nutrients versus emulsifier
R=0.098, p=0.19) (Fig. 4A). Incubation of water in confined conditions resulted in rapid
changes (less than 65 hours) in bacterial community structures for all conditions. In control
and oil amended clusters, bacterial community structure did not changed dramatically after 65
hours. In both clusters, RNA-based profiles formed a separated sub-cluster different from
DNA-based profiles (Fig. 4A). Changes after 65 h were more pronounced in the oil+nutrients
and oil+emulsifier microcosms. In one hand, oil+nutrients profiles were different at 65, 93
and 134 h with close DNA- and RNA-based profiles at each time. In another hand,
oil+emulsifier profiles changed from 65 to 93 h but showed similar profiles at 93 and 134 h,
with DNA- and RNA-based profiles found in separated sub-clusters (Fig. 4A).
147
Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport de pétrole et à la biostimulation.
Figure 4: UPGMA dendrograms generated from the DNA and RNA-based CE-SSCP patterns
of bacterial communities originated from (A) OLIG and (B) POLL in four different
conditions: control, oil, oil+nutrients (Nutrients), oil+emulsifier (Emulsifier) at different times
(0, 65, 93 and 134h for OLIG and 0, 40, 65 and 114h for POLL).
In the POLL experiments, UPGMA dendogram showed two different clusters with (i)
control and oil only and (ii) nutrients or emulsifier conditions (R=0.822, p=0.001) (Fig. 4B).
Control and oil samples were closer than in the OLIG microcosms and DNA- and RNA-based
profiles evolved separately during the course of the experiment. Until 65 h, oil+nutrients and
oil+emulsifier profiles were separated into two sub-clusters where DNA- and RNA-based
fingerprints of a given sample were closed. An important shift occurred after 65 h for both
DNA- and RNA-based oil+nutrients and oil+emulsifier profiles (Fig. 4B).
Changes in total nanoeukaryotic community structure
Total nanoeukaryotic community structures were studied by 18S rDNA-based CE-SSCP
analysis. As for bacterial community structure, eukaryotic community structures were
different in OLIG and POLL (data not shown, R=0.505, p=0.001). At the beginning of the
experiment, the number of OTUs in the OLIG microcosm was higher than in the POLL
microcosm (Table 1). During the 134 h of incubation, the number of OTUs decreased
dramatically in the OLIG experiment (from 23 to 7 ± 1, n=4), while it remained more stable
in the POLL microcosm (from 13 to 9 ± 1, n=4). In both sites, oil addition alone had no
important effect on the number of OTUs, relatively to what was observed in the control
during the incubation (11 ± 3, for OLIG control, 12 ± 4 for OLIG oil, 10 ± 2.6 for POLL
control, 12 ± 1.7 for POLL oil, with n=3 in each condition). Biostimulation, and in particular
with emulsifier addition, induced an important decrease in the number of OTUs in the OLIG
site (from 23 to 6 in less than 65 h in the oil+emulsifier condition) that was less important in
the POLL site (from 13 to 9 in less than 40 h). In both OLIG and POLL, the HNF community
structure evolved during the incubation time (Fig. 5). Whereas no clear tendency was found in
the OLIG microcosms since specific conditions did not cluster distinctly, in the POLL
microcosms Control+Oil and Nutients+Emulsifier clustered in two groups after 65h
(R=0.333, p=2.9).
Figure 5: UPGMA dendrograms generated from the DNA-based CE-SSCP patterns of
eukaryote communities from (A) OLIG and (B) POLL in four different conditions: control,
oil, oil+nutrients (Nutrients), oil+emulsifier (Emulsifier) at different times (0, 65, 93 and 134h
for OLIG and 0, 40, 65 and 114h for POLL).
149
Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport de pétrole et à la biostimulation.
Discussion
Influence of pollution history in the response of bacterial and nanoeukaryote communities to
the addition of oil only.
Overall, the addition of crude oil had a more visible effect on the OLIG compared to
POLL bacterial communities. As previously observed in other pristine environments, the
pollution in the OLIG site induced a dramatic decrease in both total (DNA-based) and
metabolically active (RNA-based) bacterial OTUs (Table 1) (Bordenave et al. 2007), which
was less marked in the chronically polluted POLL experiments. Moreover, the addition of oil
in the OLIG microcosms induced an increase of bacterial OTUs detected only on the DNA,
but not on the RNA level (DNA+RNA-), suggesting that some OTUs which originated from
this pristine environment became much less active to a point where they could not be detected
on the RNA-based CE-SSCP profiles. This situation was observed together with a large
increase in the proportion of metabolically active OTUs in the bacterial community, as
revealed by the remarkable increase of OTUs found at the RNA level but not at the DNA
level (Fig. 3). The contribution of these populations to the total community in terms of cell
numbers was probably too low for detection at the DNA level, but due to their high metabolic
activity and the accompanying 16S rRNA synthesis, these OTUs were detectable at the RNA
level (Moeseneder et al. 2001; Moeseneder et al. 2005; Lami et al. 2009). Our results
reinforce the hypothesis that the addition of oil in a pristine environment induced an increase
of the activity of given species and the inactivation of other petroleum-sensitive bacteria
(Head et al. 2006; Bordenave et al. 2007; Cappello et al. 2007; Coulon et al. 2007). Such
tendencies were less visible in the POLL microcosms (Table 1 and Fig. 3), suggesting that the
tolerance to oil within a bacterial community may be closely linked to their previous exposure
to pollution. Even if adaptation or intolerance to oil have already been observed in culture
conditions (Dott et al. 1989), our culture-independent approach, combining 16S rDNA and
16S rRNA-based analysis, has confirmed that pollution history can be a determinant
parameter in the response of bacteria and nanoeukaryotes communities.
The use of indirect gradient multivariate analysis revealed that the influence of the
pollution history mainly affected the timing of the bacterial community structure changes in
response to addition of oil only. UPGMA dendrograms showed clear changes after 65 h of oil
exposure in the OLIG microcosms, whereas faster changes (within 40 h) were found for
POLL bacterial communities (Fig. 4). This result is in accordance with previous hypothesis
suggesting a longer lag period for bacteria originated from pristine sites to adapt to oil
pollution (Head et al. 2006; Maila et al. 2006; Bordenave et al. 2007). In our experiment, the
changes in bacterial community structures coincided with the peaks of bacterial abundance
observed in both OLIG and POLL microcosms (Fig. 2). The selected populations on the
newly available carbon source peaked two days later in the OLIG (maximum abundance of
5.5 106 cells mL
-1 at 93 h) compared to the POLL microcosms (maximum of 5.5 10
6 cells mL
-
1 at 40 h). These changes concurred also with differential capacities of petroleum hydrocarbon
degradation between OLIG and POLL. In accordance with general trends observed after oil
pollution (Head et al. 2006), we found that n-alkanes were at first degraded (more than 40%
of n-alkanes degradation occurred in the first 62 h), followed by the degradation of the more
recalcitrant PAH fraction (less than 15% of PAH degradation in the first 62 h and up to 60%
after 200 h). The influence of pollution history on oil degradation was mainly visible on the
PAH fraction which was degraded more rapidly and twice more in POLL compared to OLIG
(Fig. 1). These results imply that bacterial communities subjected to previous hydrocarbon
exposure are more efficient in the degradation of the PAH fraction of the oil, relating to the
complex enzymatic machineries needed for the degradation of such recalcitrant compounds
(Riis et al. 1995). Our results agree with recent genomic and transcriptomic analysis revealing
higher PAH dioxygenase diversity in a chronically contaminated, compared to a pristine,
microbial mat (Bordenave et al. 2008).
Interestingly, the pollution history influenced also the response of nanoeukaryotic
communities (≤10 µm) to the addition of oil alone. The number of nanoeukaryotic OTUs
decreased drastically in pristine OLIG microcosms, whereas it remained more stable for the
pre-exposed POLL communities immediately after oil addition (Table 1). Changes in
nanoeukaryotic community structure occurred more rapidly in the POLL (between 40 h and
65 h) compared to the OLIG (between 65 h and 93 h) (Fig. 5). Successively to these changes
in community structure, the abundance of the opportunistic nanoeukaryotes peaked at 114 h in
the POLL (9.0 102 cells mL
-1), whereas no clear peak was found in the OLIG microcosms
(Fig. 2). Our results show that a small proportion of HNF could survive in oil-polluted
seawater (Andrews et al. 1974; Dalby et al. 2007). The peak of opportunistic nanoeukaryote
abundance in the POLL microcosm occurred following the peak of bacterial abundance,
revealing a classical prey-predator relationship (Pernthaler 2005). However, we could not find
any direct link between the peak of nanoeukaryote abundance or changes of nanoeukaryote
community structure on the evolution of the bacterial community structure, as well as any
negative or positive feedbacks on oil degradation. Overall, the addition of oil alone did not
result in an important increase in bacterial abundance or their predators compared to
151
Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport de pétrole et à la biostimulation.
biostimulation experiment (see below). Further studies are needed to address the role of
nanoeukaryote predators on oil biodegradation along with grazing experiment (Kota et al.
1999; Matz et al. 2003).
Response of bacteria and HNF communities after biostimulation by nutrients and an
emulsifier.
Biostimulation by nutrients or emulsifier addition on oil polluted microcosms did not
relieve the influence of the pollution history on the response of bacterial and eukaryotic
communities, which remained faster in the POLL microcosm compared to OLIG (Fig. 4 and
5). The magnitude of the increase in the activity of given OTUs and the inactivation of other
petroleum-sensitive bacteria was similar in biostimulated conditions compared to oil addition
alone (Fig. 3). However, UPGMA dendrograms showed that biostimulation with nutrients or
emulsifier selected different bacterial community assemblages with low similarities with the
control and oil alone bacterial communities (Fig. 4). This tendency was found for both OLIG
and POLL bacterial community structures, even if the shift was more rapid for the
communities in the POLL chronically polluted site. Interestingly, similar bacterial community
assemblages were found at both DNA and RNA levels after biostimulation in both OLIG and
POLL, a situation that was not observed in the control or oil alone conditions. This suggests
that independently to the pollution history of the site, biostimulation stirred metabolically
active bacterial community assemblages. In our study, this change led to a better
biodegradation of n-alkanes (disappearance in 134 h in the OLIG and 200 h in the POLL) as
well as PAH (almost disappearance in the POLL in 200h and 12% of PAH degraded more
than control in the OLIG) (Fig. 1). These results are in accordance with previous studies that
have established clear changes in bacterial communities after biostimulation (MacNaughton et
al. 1999; Röling et al. 2002; Coulon et al. 2007) and found similar 16S rDNA- and rRNA-
based assemblages at the end point of a biostimulation experiment (Rodríguez-Blanco et al.
2009). To our knowledge, we present here the first results on the influence of the pollution
history on both total and metabolically active bacterial community responses under two
biostimulation assays.
Surprisingly, the bacterial assemblages selected after inorganic nutrients addition or
Alasan bioemulsifier addition, generally clustered in a same group (Fig. 4). It is commonly
accepted that inorganic nutrients resources, mainly nitrogen and phosphorus, are limiting
factors of oil degradation by bacteria (Atlas et al. 1972; Swannell et al. 1996). For example,
some opportunistic species such as oil-degrading Alcanivorax populations are able to grow on
petroleum only when nutrient resources are sufficient (Cappello et al. 2007). Another limiting
factor is the low availability of oil for bacterial degradation; a problem that can be solved by
the use of emulsifiers. The Alasan emulsifier is a high-molecular-weight molecule isolated
from Acinetobacter radioresistens. Its emulsifying activity, resulting from the interaction of
proteins and polysaccharides, gives extremely stable oil-in-water emulsions, including: n-
alkanes with chain lengths of 10 or higher, alkyl aromatics, liquid paraffin and crude oil
(Navon-Venezia et al. 1995). It has already successfully been used both to enhance PAH
biodegradation (Barkay et al. 1999) and as a carbon and energy source in bacterial strain
isolation (Navon-Venezia et al. 1998). Besides its simple emulsifying effect, the chemical
structure of Alasan emulsifier may provide not only a fresh carbon and energy source, but
also an organic nutrient input for bacteria (Navon-Venezia et al. 1998). That may explain the
similar influence of nutrient addition or Alasan emulsifier addition on the bacterial
community structure observed in our study. It is difficult from our experimental procedure to
differentiate the relative actions of the Alasan bioemulsifier as to whether it acts primarily as
an emulsifier, a carbon or an organic nutrient source for bacterial communities.
As found in oil alone treatments, the changes in bacterial communities after
biostimulation was concomitant with a peak of bacterial abundance that occurred more
rapidly in the POLL compared to OLIG. The peaks of bacterial abundance were two to three
times higher than in the oil alone treatments, especially for the nutrient amendment. In both
OLIG and POLL, bacterial peaks of abundance were immediately followed by peaks of their
HNF predators, which were up to 10 times more abundant than in the oil alone treatments. As
observed in other pristine environments (Fenchel 1982), HNF controlled bacteria within less
than 48 hours of the height of their outbreak. Moreover, molecular analysis showed clear
changes in nanoeukaryotic community structures following the peak of bacteria (Fig. 5) with
a clear decrease in their OTU numbers (Table 1). It is generally accepted that HNF grazing on
bacteria is size-selective (Šimek et al. 1997; Hahn et al. 1999; Jurgens et al. 1999) and del
Gorgio et al. (1996) estimated that grazing rates on metabolically active bacteria could be four
or more times higher than those on inactive bacteria. Other authors found biochemical prey-
recognition mechanisms via specific cell surface epitopes, suggesting a possible grazing on
specific bacterial OTUs (Wootton et al. 2007; Martel 2009). We were unable to verify this
hypothesis in our experiment as we lacked significant evidence showing any important
changes in bacterial community structure relative to the variations in HNF abundance in either
OLIG or POLL microcosms (Fig. 5).
153
Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport de pétrole et à la biostimulation.
Under biostimulation, we found a decrease in degradation rates of total hydrocarbons
that coincided with the maximum of HNF abundance; a situation that was not found in the oil-
alone treatment where bacterial and HNF abundances were 2-fold lower. These results
reinforce the role of HNF predation on oil bacterial degradation already suggested in a
previous study on oil contaminated aquifer sediment (Kota et al. 1999) and confirm that HNF
can compromise the positive effect of biostimulation on hydrocarbon biodegradation.
Although the prey-predator relationship between bacteria and their HNF grazers is well
known in pristine marine environments, this relationship remains under-investigated in crude
oil polluted marine environments. Our results clearly show the responsive features of oil-
tolerant nanoeukaryotes and their grazing activity should be taken into account in future in
situ bioremediation practices. Further studies are needed to examine the effect of such
microbial responses to higher trophic levels.
Acknowledgements
The present study was conducted in the framework of COMMODE project (Communities of
Marine Micro-organisms for Oil Degradation, CE VK-CT2002-00077) that aimed to increase
our understanding of the dynamics of natural and anthropogenic remediation of crude oil-
polluted systems. We thank F. Ghigui and F. Saury for their contribution on data analysis and
G. Péma and S. Tarte for helpful comments on the manuscript. The experimental setting was
further supported by the EPEAEK II – ARXIMIDIS I project, co-funded by Greece and the
European Community.
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159
EFFET DU « TOP-DOWN » SUR LES COMMUNAUTES
BACTERIENNES EN PRESENCE DE PETROLE
CHAPITRE 4
161 Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de pétrole
Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés
bactériennes en présence de pétrole
1. Préambule
Nous venons de voir que la prédation des bactéries par les protozoaires était un facteur à
prendre en compte dans les expériences de biodégradation et de biostimulation en particulier.
Pour autant, le « top-down control » n‘est pas uniquement exercé par les protozoaires mais
aussi par les virus, un compartiment encore moins pris en compte dans les études de
bioremédiation. Les seules études sur le sujet n‘ont pas toujours pu estimer la part de
responsabilité du « top-down » dans la structuration et l‘activité des communautés
bactériennes polluées parmi les autres facteurs et en particulier les ressources en sels nutritifs
(« bottom-up »). Pour estimer l‘effet exclusif du « top-down » sur la biodégradation des
hydrocarbures et s‘afranchir de contrôle « bottom-up », nous avons imaginé une expérience
originale en mésocosmes (400 L) consistant à simuler un déversement de pétrole sur un
échantillon naturel d‘ordinaire peu soumis à la pollution pétrolière dans des conditions non-
limitantes en sels nutritifs maintenues tout au long de l‘expérience (15 jours). En comparaison
avec un bac non pollué, l‘analyse de l‘évolution de la structure des communautés bactériennes
ainsi que leur activité en période de forte prédation et lyse virale avait pour objectif de
déterminer l‘effet négatif ou positif du « top-down » sur la biodégradation des hydrocarbures.
Ainsi nous avons pu révéler un contrôle de type « top-down » largement dominé par les virus
ayant pour effet d‘importants remaniements des communautés bactériennes à la fois en termes
de biomasse et de structure. Nous avons utilisé la résolution d‘un pyroséquençage massif pour
identifier les espèces bactériennes stimulées par l‘apport de pétrole puis sensibles ou
résistantes à la prédation par les protozoaires ou la lyse virale. Certaines groupes bactériens se
sont ainsi montrés particulièrement sensibles à la prédation et/ou la lyse viral comme le genre
Vibrio, alors que d‘autres au contraire comme Percisivirga, Oleispira et Methylophaga,
s‘avérèrent résistantes, révélant leur rôle central dans la dégradation du pétrole dans nos
conditions. Finalement la forte influence des virus n‘a pas provoqué de diminution dans la
biodégradation des hydrocarbures par les bactéries puisque la pression de prédation a induit
un regain d‘activité globale chez celle-ci. Ce résultat original souligne l‘importance de
prendre en compte non seulement le compartiment bactérien mais aussi la boucle microbienne
dans son ensemble pour mieux comprendre le processus de biodégradation.
163 Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de pétrole
2. Article 3: Strong evidence of top-down control on biostimulated diesel-degrading
bacterial communities
List of authors: Caroline Sauret1,2
, Daniela Böttjer3,4
, Agathe Tallarmin5, Catherine Guigue
5,
Pascal Conan1,2
, Mireille Pujo-Pay1,2
, Madeleine Goutx5, Jean-François Ghiglione
1,2
(1) CNRS, UMR7621, Laboratoire d'Océanographie Microbienne LOMIC, F-66651 Banyuls-
sur-Mer, France;
(2) UPMC Univ Paris 06, UMR 7621, Observatoire Océanologique, F-66651 Banyuls-sur-
Mer, France;
(3) Department of Oceanography, School of Ocean and Earth Science and Technology,
University of Hawai‘i at Mãnoa, Honolulu, Hawaii, USA;
(4) Center for Microbial Oceanography, University of Hawai‘i at Mãnoa, Honolulu, Hawaii,
USA ;
(5) Centre d'Océanologie de Marseille, Campus de Luminy, 13 288 Marseille Cedex 9, France
Correspondence:
Jean-François Ghiglione
CNRS, UPMC Univ Paris 06, UMR7621, Laboratoire d'Océanographie Microbienne LOMIC,
Avenue Fontaulé, F-66651 Banyuls-sur-Mer, France. Tel.: +33 4 68 88 73 16; fax: +33 4 68
88 73 98
E-mail address: [email protected] (J.F. Ghiglione)
Running title: Influence of pure ―top-down‖ control on oil-polluted bacteria.
Keywords: Bacterial diversity, bacterial activity, pure ―top-down‖ control
Abstract
Both protistan grazing and viral lysis on bacteria (―top-down‖ control) has often been
assumed to play a pivotal role in the efficiency of oil biodegradation. Nevertheless, their
concomitant impact on bacterial assemblages involved in oil-biodegradation remains largely
unknown. We designed a mesocosm experiment (400 L) to investigate the effect of
heterotrophic nanoflagellates (HNF) and bacteriophages on bacterial abundance, community
structure and activities under unlimited nutrient condition and diesel pollution. The addition
of diesel together with inorganic nutrients resulted in a 10-fold increase in bacterial
abundance after seven days of incubation. We then observed a classical prey-predator cycle
that was more explicit in the diesel-amended compared to the control mesocosm. The ―top-
down‖ control was almost exclusively dominated by viral lysis rather than HNF predation
(77.73%). Massive pyrosequencing showed that some taxonomic groups, such as Vibrio, that
became dominant after oil addition, were particularly sensitive to viral predation, a sensitivity
that induced drastic shift in bacterial community structure. However, the ―top-down‖ control
resulted in an increase of bacterial richness that counterbalanced its dramatic and rapid
decrease after oil addition. Some ―predation-resistant‖ bacterial genera such as Percisivirga,
Oleispira and Methylophaga dominated the diesel-polluted bacterial community after the high
predation episode, revealing their pivotal role in oil polluted systems. Even if chemical
analysis showed relatively constant biodegradation rate during the course of our experiment,
we demonstrated that ―top-down‖ effect controlled the kinetics of bacterial carbon uptake and
ecto-enzyme activity through driving bacterial diversity. These results underline the
importance of taking into account not only the bacterial compartment, but also the entire
microbial loop to better understand the factors influencing the efficiency of biostimulation
strategies.
165 Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de pétrole
Introduction
For several decades, there has been a primordial challenge in understanding and
potentially enhancing natural biodegradation of hydrocarbons in environmental microbiology.
In oil spill countermeasure efforts, the biostimulation via the addition of nutrients and/or
surfactant molecules is a privileged option (Röling et al. 2002; Xia et al. 2006; Rodríguez-
Blanco et al. 2010). In natural oil biodegradation systems, hydrocarbonoclastic bacteria
exhibit a high mineral nutrient dependency under conditions of carbon excess such as in oil
spill scenarios (Smith et al. 1998). The biostimulation by nutrient addition is now the most
commonly used strategy to favor bacterial petroleum elimination. However several studies
underlined that its effectiveness depends on uncontrolled abiotic and biological factors, which
remain underestimated in bioremediation assays (Atlas 1995).
Grazing by heterotrophic nanoflagellates (HNF, size ranging 2-10 μm) and viral-
mediated lysis (also called ―top-down‖ control) have both been assumed to drive bacterial
abundance, diversity and activity in natural (Suzuki 1999; Weinbauer et al. 2004; Longnecker
et al. 2010) as well as in oil polluted environments (Kota et al. 1999; Danovaro et al. 2003).
Nevertheless, simultaneous estimates of the effects of grazing and lysis on bacterial
communities involved in oil-biodegradation remain relatively rare. The few available data so
far show that both HNF and viruses could survive during oil pollution, increase their
abundance in eutrophic and/or oil polluted zones, thereby shaping bacterial abundances
(Weinbauer et al. 1993; Wilhelm et al. 1999; Gertler et al. 2009). In addition, high
abundances of HNF and viruses in nutrient rich areas have raised the idea that top-down
control not only impacts bacterial abundances but also bacterial community structure (Jurgens
et al. 1999; Pernthaler 2005; Bouvier et al. 2007), as proposed by several examples of host-
specificity (Gonzalez et al. 1990; Jurgens et al. 1999; Weinbauer et al. 2004). Abundant
species are more likely to be exposed to predation than rare species because of encounter
probability, resulting in drastic changes in bacterial community structure. This theory has
been established as the ―killing the winner‖ in which the renewing and the maintaining of the
bacterial diversity and metabolic capacities reveal the positive effect of the predation
(Thingstad et al. 1997; Thingstad 2000; Beardsley et al. 2003). The impact of predation on
bacterial activity is more contrasted. On one hand, predation prevents bacteria to enter the
stationary phase and thus would maintain the global metabolic activity (del Giorgio et al.
1996). On the other hand, predation of the most active bacteria would select some dormant or
less active cells, thereby decreasing the activity of the total bacterial community (Hahn et al.
2001). Except for some studies that reveal HNF increasing the remineralization of some
polycyclic aromatic hydrocarbons (Mattison et al. 2005; Tso et al. 2006), the actual impact of
HNF or viruses on bacterial oil degradation has to date been largely ignored. Furthermore, the
concomitant effects of viruses and protozoa on bacterial communities are even more difficult
to assess notably because they sometimes compete for the resource in bacteria (Miki et al.
2008) and because viruses can also infect protozoa (Pernthaler 2005), which adds a level of
difficulty by studying interactions. Top-down control of bacteria by HNF and viruses in
aquatic environments is essential to understand, especially in oil polluted seawaters that are
complex and poorly understood and where biological mediation might be used to fix
anthropogenic ecological disasters in particular. Special attention should be focused on the
interactions between bacteria and their predators in oil contaminated microbial assemblages
for a better appreciation of bioremediation assays.
In most marine environments, hydrocarbonoclastic bacteria (HCB) are present in low
abundance when carbon sources are in a steady-state (Yakimov et al. 2007). However, in oil
pollution scenario, when petroleum is toxic for most other non-degrading bacteria, HCB are
able to grow rapidly and ultimately dominate the bacterial community (Head et al. 2006),
representing a natural way to ―clean-up‖ polluted ecosystems (Yakimov et al. 2007). Since the
development of culture-independent 16S rDNA-based methods, numerous studies have
monitored both, active and total fractions of the bacterial community after the addition of oil
(Rodríguez-Blanco et al. 2010). Generally, the oil pollution and eventually bio-stimulation
induce radical shifts in the community accompanied by a reduction of the diversity and a
selection of oil-degrading bacteria (Head et al. 2006). Some studies have even investigated the
composition of bacterial communities involved in oil-degradation and have retrieved
Alcanivorax (Yakimov et al. 1998), Cycloclasticus (Dyksterhouse et al. 1995), Marinobacter
(Gauthier et al. 1992), Neptunomonas (Head et al. 1999), Oleiphilus (Golyshin et al. 2002)
and Oleispira (Yakimov et al. 2003) as typical genera of hydrocarbonoclastic bacteria.
To evaluate the effect of both HNF grazing and viral infection on abundance,
community structure and activity of bacteria involved in diesel-degradation, we designed a
diesel mesocosm experiment in which the classical nutrient limitation observed in oil polluted
systems was excluded. Bacterial abundance was monitored by flow cytometry and bacterial
activity was estimated by bacterial production and ectoenzyme activity measurements. The
highly sensitive and reproducible capillary electrophoresis single strand conformation
polymorphism (CE-SSCP) technique (Ghiglione et al. 2005) enabled us to monitor the
temporal changes of both total (based on 16S rDNA) and active (based on 16S rRNA)
bacterial community structure over the time course of the incubation while the high efficient
167 Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de pétrole
pyrosequencing technique allowed the identification of bacteria to the genus level that were
present at each critical point of the experiment. Complementary grazing experiments together
with viral abundance and viral-induced bacterial mortality estimates enabled us to evaluate
the impact of HNF and viruses onto bacteria involved in the degradation of pollutants. To the
best of our knowledge, this is the first study that examines simultaneous effects of HNF and
viruses onto bacteria in a nutrient non-limited, diesel-polluted assay.
Materials and Methods
Mesocosm design
Surface seawater was collected from the bay of Banyuls-sur-Mer (North-western
Mediterranean Sea) in March 2009 into clean, acid-washed 20 L polycarbonate bottles. The
seawater was filtered through a 50-µm nylon membrane to remove larger organisms and
poured into two 400 L resin tanks. One of those tanks served as the control mesocosms (no oil
was added to the surface seawater) while the other served as the polluted treatment (50 mL of
diesel were added). Due to the toxicity of the diesel substance and the resulting steam of
hydrocarbon and hazardous waste water produced, we decided to limit this study to a single
polluted large-scale mesocosm accompanied by an unpolluted control. Both mesocosms were
kept in the dark at in situ temperature (16°C) and incubated for 14 days. Small aquarium
pumps were installed to ensure that the mesocsom tanks were continuously mixed throughout
the incubation period. The nitrogen and phosphorus inorganic nutrients (NO3, NO2, NH4,
PO4) were daily quantified and adjusted to a constant environmental concentration in each
mesocosm in order to avoid nutrient-limitation. Samples for nutrients were collected into
polyethylene flasks in duplicate, immediately poisoned with HgCl2 (10 mg L-1
) and stored at
4°C in the dark until further analyses on a Bran Luebbe III autoanalyser according to Tréguer
et LeCorre (1975). Measurement accuracy was ±0.05, ±0.05, ± 0.02, and ±0.02 µM for
nitrates, silicates, ammonium, nitrites and phosphates, respectively.
Bacterial abundance
Total bacterial counts were determined by flow cytometry (Lebaron et al. 1998).
Briefly, 2 mL seawater samples were fixed with 2% formaldehyde for at least 1 h at 4°C. A 1
mL sub-sample was incubated with SYBR Green I (final concentration 0.05% [v/v] of the
commercial solution) for at least 15 min at 20°C in the dark and analysed with a FACS
Calibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) equipped with an air-cooled Argon
laser (488 nm, 15 mW). Stained cells were enumerated according to their side-angle-scattered
light (SSC) and induced green fluorescence light (GFL) collected through a 530 ± 30 nm
bandpass filter. Yellow–green fluorescent beads (1-μm diameter, Polysciences) were
systematically added to each analyzed sample to normalize SSC and GFL emission. Data
acquisition and analysis were conducted using the software Cell-Quest (Becton Dickinson).
Acquisition was triggered by GFL. The volume analyzed and the subsequent estimation of
169 Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de pétrole
cell concentrations were determined by measuring the remaining volume of sample and
subtracting it from the initial volume. Sheath fluid was seawater filtered through a 0.22 μm
pore size membrane.
Nucleic acid extraction, 16S PCR amplification and CE-SSCP analysis
Samples for bacterial diversity analysis were taken daily during the course of the
experiment. One liter of seawater was filtered on 0.2 µm-pore-size filter (47 mm, PC,
Nucleopore) and frozen until nucleic acid extraction. DNA and RNA extractions and 16S
cDNA synthesis were performed as previously described (Ghiglione et al. 2009). Both DNA
and cDNA served as a template for PCR amplification of the variable V3 region of the 16S
rDNA using w49F and fluorescently 5‘-labeled with phosphoramidite (TET, Eurogentec)
w34R primers according to Ghiglione et al. (Ghiglione et al. 2005). CE-SSCP and analysis of
the electropherograms were performed as described in a previous paper (Ghiglione et al.
2008). All peaks were checked manually for correct retention time (i.e. 1 OTU, ±6 retention
time AU) and shape. Electrophoregrams were transferred to the SAFUM software (Zemb et
al. 2007) to render a profile of fluorescence intensity as a function of retention time per
sample. It allowed the comparison of CE-SSCP profiles based on the presence and intensity
of each individual peak and analysis using indirect multivariate analysis. Similarity matrices
based on Bray-Curtis distances and ordination analyses along with their corresponding
dendrograms were generated by the unweighted pair group method using average linkages
(UPGMA) by using the PRIMER 5 software (PRIMER-E, Ltd., UK).
Pyrosequencing analysis
Bacterial tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP) was performed as
described previously using Gray28F 5‘TTTGATCNTGGCTCAG and Gray519r 5‘
GTNTTACNGCGGCKGCTG (Dowd et al. 2008). Initial generation of the sequencing
library was accomplished by a one-step PCR with a total of 30 cycles, a mixture of Hot Start
and HotStar high fidelity taq polymerases, and amplicons originating and extending from the
28F for bacterial diversity. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing analyses utilized
Roche 454 FLX instrument with Titanium reagents, titanium procedures performed at the
Research and Testing Laboratory (Lubbock, TX) based upon RTL protocols.
Metabolic bacterial activity
Both intra- (heterotrophic prokaryotic production, henceforth referred to as BP for
―bacterial production‖) and extra-cellular (exoenzymatic aminopeptidase) bacterial activities
were measured during the course of experiment. The results are expressed according to the
activity per cell.
Bacterial production was estimated by measuring 3H-leucine (a precursor for proteins)
incorporation rates into proteins (Kirchman et al. 1985; Chin-Leo et al. 1988), using the
centrifugation method (Smith et al. 1992) in 2 mL microtubes, and thus allows estimating
biomass synthesis. Triplicated 1.5-mL samples and a trichloracetic acid (TCA) killed control
were spiked with a mixture of [4,5 3H] leucine solution (Perkin Elmer, specific activity of
115.4 Ci mmol-1
) and non-radioactive leucine at final concentrations of 16.2 and 6.7 nM,
respectively. This concentration was experimentally determined to be saturating. All samples
were incubated 2 hours in the dark at the in situ temperature. Previous experiments had shown
leucine incorporation to be linear over these time periods. The reaction was terminated with
TCA (final concentration 5%) and samples were added bovine serum albumin (final
concentration of 100 mg L-1
) to improve protein precipitation. A first centrifugation run was
conducted at 13,200 rpm for 15 minutes. The supernatant was discarded, and 0.5 mL of a 5%
TCA solution were added to all samples before the second and centrifugation run conducted
in similar conditions. After removal of the supernatant, 0.5 mL of a 70% ethanol solution
were added. This step was followed by a centrifugation run at 13,200 rpm for 10 minutes. The
supernatant was removed and 2 mL of PCS scintillation cocktail (GE Healthcare) were added
per tube. Radioactivity was counted on a tri-CARB 1500 Packard liquid scintillation counter.
Quenching was corrected by internal standard and control counts were subtracted. The mean
coefficient of variation of triplicated measurements was 3%. Cell-normalized leucine
incorporation rates (BP) were calculated by dividing bacterial production rates by cell
abundance.
Ectoenzymatic aminopeptidase activity (AMPase) was measured using L-leucine-
7amido 4 methyl coumarin (Leu-MCA) as a fluorometric model substrate, according to
Hoppe‘s protocol (Hoppe 1983). A 8 mM stock solution was prepared in methycellosolve and
stored at −20°C. For triplicate measurements, 390 µL samples were supplemented with 10 µL
of the fluorogenic substrate (200 µM final concentration) in 48-well sterile microplates. This
analogue substrate concentration of Leu-MCA was representative of saturating concentration;
this was verified with calibration kinetics during the mesocosm experiment where a large set
of concentrations (from 0.1 to 250 µM) and times (from 1 to 10 h) were tested (data not
shown). Incubations were run in the dark in thermostated incubators reproducing in situ
171 Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de pétrole
temperature during 5 h. Boiled water blanks were run to check for abiotic activity. The
reaction was stopped using 50 µL of SDS 20% and samples were stored at -20°C until
fluorescence measurement. Release of the product of AMPase activity (MCA) was followed
by measuring the increase of fluorescence at 365 nm excitation wavelength and 450 nm
emission after an addition of 550 µL of a borate buffer (pH=11) with a microplate
spectrofluorometer (1420 Multilabel counter, VICTOR3, PerkinElmer) calibrated with
prepared standards of MCA solution diluted in <0.2-μm filtered seawater.
Hydrocarbon analysis
Oil hydrocarbon composition was determined in the mesocosm in which the diesel
was added. We measured the concentrations of aliphatic hydrocarbons (AHs) and polycyclic
aromatic hydrocarbons (PAHs). AHs consist of a series of resolved compounds, i.e the sum of
a series of n-alkanes (linear hydrocarbon chains) and 2 isoprenoids, pristane and phytane.
Concerning PAHs, we determined the concentrations of 16 priority compounds listed by the
European Union and the US Environmental Protection Agency. One liter of mesocosm total
water was sampled at time zero, 3, 8 and 12 days after diesel addition and treated like
dissolved water according to Guigue et al. (2011). Briefly, hydrocarbons were extracted by
liquid-liquid extraction. Extracts were then purified on silica column to separate AHs from
PAHs. Deuterated standard mixtures were introduced prior to extraction to assess the
recoveries of analytical procedures and to perform quantization accuracy. All solvents were of
organic trace analysis quality (Rathburn, Interchim). AHs and PAHs were analyzed in a gas
chromatograph-flame ionization detector (GC-FID) (AutoSystem XL, Perkin Elmer, USA)
equipped with a HP-5 column (25 m x 0.32 mm x 0.52 µm, J&W Scientific, Agilent
Technologies, USA). To distinguish between physical removal and biodegradation,
hydrocarbons concentrations were normalized relative to pristane, a known biodegradation-
resistant compound present in petroleum.
Viral abundance
Viruses were enumerated by epifluorescence microscopy using the SYBR Green
method (Noble et al. 1998). One mL of preserved seawater samples (2% glutaraldehyde final
concentration, stored at 4°C) were filtered under subdued light onto 0.02 µm Anosdisc filters
(Whatman®). When filters were dry, they were removed from the frits (with vacuum still on),
carefully placed face up on a drop of diluted SYBER Green in a clean polysterene Petri dish
and incubated for 30-45 min in the dark at room temperature. After, the excess stain was
removed from the filter by softly dabbing its back on a Kim Wipe® and filters were mounted
on microscope slides and covered with a drop of 50% glycerol, 50% phosphate buffered
saline (PBS, 0.05 M Na2HP04, 0.85% NaC1, pH 7.5) with 0.1 % p-phenylenediamine (Sigma
Chem. Co., made fresh daily from frozen 10 % aqueous stock).
Phage infected bacteria
Samples for the determination of viral induced bacterial mortality (VIBM) were
collected at the same time when a grazing experiment was carried out from each mesocosm.
30 mL seawater samples were preserved with glutaraldehyde (EM grade; 2% final
concentration) and stored in sterile polypropylene centrifuge tubes at -20°C. Subsequently,
the preserved samples were centrifuged for 30 min at 11°C at 25 000 rpm (SW 28 rotor) for
transmission electron microscopy. Each pellet was transferred onto 300 mesh electron
microscope grids (with carbon coated Formvar film), stained for 10s with 0.5% uranyl
acetate, destained 3 times 10s in purified water (Milli-Q®
, Millipore), air-dried and analyzed
under a transmission electron microscope at 25 000 to 50000 X magnification at an
accelerating voltage of 80keV. In each sample, between 600 and 1000 prokaryotes in
randomly chosen microscopic fields were examined for the enumeration of infection.
Prokaryotes were scored as infected when they contained at least 5 intracellular viruses. In
order to determine VIBM, the frequency of infected cells (FIC) was estimated from the
frequency of visibly infected cells (FVIC) applying the conversion factors of Proctor et al.
(1993) with the model of Binder (1999), assuming that infected and uninfected cells are
grazed equally.
Heterotrophic nanoflagellate (HNF) abundance
For the analysis of the HNF, 50 mL of seawater were fixed with glutaraldehyde (1%
final concentration) and stored in the dark at 4°C. Within < 10 days, those samples were
stained with 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) at a final concentration of 0.01%, and
filtered on black polycarbonate filters (0.8 µm) supported by 0.45 µm cellulose filters. The
polycarbonate filters were then mounted on slides and stored at –20°C in the dark until
analysis. They were examined at 1000 X magnification with an epifluorescence microscope
(Olympus Provis AX70).
Grazing experiment
173 Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de pétrole
Grazing upon heterotrophic bacterial assemblages was estimated using the seawater
dilution technique (Landry et al. 1982). This approach had been chosen since it involves
minimal manipulation of seawater samples, does not require the use of radioisotopes, and
measures grazing on natural bacterial population. Grazing experiments were carried out with
seawater from both, the control (at T0, T3, T5, T8, and T12) and the diesel amended (at T0,
T3, T10, and T14) mesocosm. 15 L of seawater was sampled from each mesocosm by
siphoning and collected into acid-washed 20 L polycarbonate carboys. Immediately after
collection, the carboys were transferred to a temperature-controlled room (adjusted to the in
situ temperature of the mesocosm tanks) where subsequent incubations were carried out. In
there, nearly half of the collected seawater was kept while the other half was filtered through a
filter capsule (0.8/0.2 µm; Pall Life Science) to obtain filtered seawater. Subsequently,
different proportions of unfiltered (<50 µm) and filtered (0.2 µm) seawater were prepared
(ratios of filtered to unfiltered seawater: 100, 75, 50 and 25%) and distributed into 1 L
polycarbonate bottles (triplicates per dilution). Bottles were incubated for 24h at 16°C, under
a 12:12 h light/dark cycle and rotated end over end at 0.5 rpm in order to keep predators and
prey in suspension. Samples to estimate prey (bacteria) and predators (HNF) abundances were
taken from each bottle at the beginning (h0) and end (h24) of the incubation and samples were
treated as described above. Grazing rates of HNF on bacteria were calculated using the
exponential growth model as described in Landry and Hasset (1982). The instantaneous rate
coefficients of HNF grazing (g) and bacterial growth (k) were obtained from the linear
regression of the apparent growth rate (l/t*ln (CT/C0) = k-g) plotted against the dilution factor.
The estimated k and g values were subsequently used to calculate the percentage of potential
bacterial production removed by the HNF following the equations provided in Verity et al.
(2002).
Results
Successive changes in bacterial, HNF and viruses abundances
In both mesocosms, the evolution of bacterial, HNF and viral abundances displayed
oscillations characterized by two different phases. The first phase (that we term phase A) was
marked by an increase in bacterial abundances from 4.38 105 to 1.17 10
7 cell mL
-1 in the
polluted over the first 7 days and 4.38 105 to 4.36 10
6 cell mL
-1 in the control mesocosm over
the first 4 days of the incubation period (Fig. 1A). During this phase the abundances of HNF
and viruses were at their minimum. The second phase (phase B) showed first a simultaneous
increase of HNF and viruses together with a decrease in bacteria that was subsequently
followed by a maximum of HNF (5.63 104 and 9.1 10
3 cell mL
-1 at T11 and T10 in polluted
and control respectively) and viruses (4.43 108 and 5 10
7 units mL
-1 in polluted and control
respectively) along with a minimum of bacterial abundance. Afterwards, HNF and viral
abundances diminished while bacterial abundances increased anew (Fig. 1A).
Figure 1 : Evolution of abundances of bacteria, HNF and virus along the experiment (A)
together with cell-normalized bacterial production and aminopeptidase extracellular activity
(B).
175 Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de pétrole
Overall, at any time of the experiment, the abundances of bacteria, HNF and viruses
were i) higher and ii) peaked later in the polluted compared to the control mesocosm (T5 and
T7 for bacteria, T10 and T11 for HNF and T10 or T14 for viruses in control and polluted,
respectively) (Fig. 1A).
Evaluation of HNF and viruses predation rates
At the beginning of the experiment, the virus-to-bacterium ratio (VBR) was 24.5
(Table 1). During the incubation period, the evolution of the VBR was similar in both
mesocosms, but the ratio was always higher in the polluted than in the control. The VBR
decreased until T8 in the polluted (11.66) and T5 in the control (4.32) before peaking at T10
in the polluted (232.36) and T8 in the control mesocosm (178.38). The frequency of infected
cells (FIC) followed a similar trend (Table 1) and peaked at the exact same days of the
experiment as described for the VBR. Only a slight difference in FIC between the starting day
and T8 was observed in the control (from 0.04 to 0.05), whereas FIC increased about 10-fold
in the polluted mesocosm between T0 and T10 (from 0.04 to 0.4). Consequently, the
maximum percentage of bacterial production removed due to viral lysis (VIBM) was 77.73%
at T10 in the polluted compared to only 8.11% in the control mesocosm at T8 (Table 1).
Table 1: Rates of the impact of virus and HNF on bacterial abundance and production
estimated by grazing experiment and virus microscopic counting.
The grazing impact on bacterial production was always less compared to the
percentage of bacterial production removed by viruses in both mesocosms (Table 1). Only a
maximum of 2.9% (T5) and 1.7% (T10) of the bacterial production was removed by grazing
in the control and polluted mesocosms, respectively (Table 1). Thus, viral lysis affected ~ 3
times more the bacterial production in the control and ~ 45 times more in the polluted
mesocosm than HNF grazing.
Cell-normalized bacterial activity and diesel degradation
Bacterial production (BP) was always approximately 5-fold higher than the
ectoenzymatic aminopeptidase activity (AMPase) but they showed similar trends in both
mesocosms (Fig 1B). After a slight increase of the activity in the early stage of the experiment
(BP around 2 10-18
mol Leu cell-1
h-1
and AMPase around 10 10-17
mol Leu cell-1
h-1
before
the day 2), the intra- and extra-cellular activities were at their lowest level until day 9 in the
polluted mesocosm (BP at 1.01±0.41 10-18
mol Leu cell-1
h-1
, n=7 and AMPase at
mean=1.46±0.95 10-17
mol Leu cell-1
h-1
, n=7) and day 6 in the control (BP at 4.3±1.55 10-19
mol Leu cell-1
h-1
, n=4 and AMPase at mean=2.04±0.73 10-17
mol Leu cell-1
h-1
, n=4) (Fig.
1B). The maximum of specific bacterial activity peaked during the same days when HNF and
viruses show their maximum abundances in both mesocosms (Phase B, Fig. 1). This
maximum was obtained at day 10 for the AMPase (3.22 10-16
mol Leu cell-1
h-1
) or day 11 for
the BP (7.3 10-18
mol Leu cell-1
h-1
) in the polluted mesocosm and day 8 for the control (BP at
9.36 10-18
mol Leu cell-1
h-1
and AMPase at 4.6 10-16
mol Leu cell-1
h-1
). Finally, the specific
bacterial activity decreased at the same time as the HNF and viral abundances (Fig. 1).
The diesel was continuously degraded along the mesocosm experiment. The
biodegradation rate of aliphatic hydrocarbons (2.64 mg l-1
at time zero) was constant from the
beginning to the end of the experiment (30.11 µg L-1
day-1
). This degradation represented a
total of 204 mg n-alkanes degraded, then 2.13 mg L-1
remained after 17 days of incubation.
The biodegradation rate of PAHs (64 µg L-1
at time zero) was also constant from the day 3 to
the end of the experiment (0.94 µg L-1
day-1
), for a total degradation of 6.4 mg and 48 µg l-1
remaining after 17 days of incubation.
Evolution of total (16S rDNA) and active (16S rRNA) bacterial community structure
Bacterial community structure from control and polluted mesocosms were dissimilar
(data not shown) but their evolutions showed similar trends during the time course of the
experiment (Fig. 2). During phase A, bacterial community structures were completely
transformed in both mesocosms (Fig. 2 and 3). This change was accompanied by a decrease in
both CE-SSCP and pyrosequencing OTUs that was more marked in the polluted mesocosm
(36 peaks detected in CE-SSCP profile and 795.2 for the Chao1 at T0 to 11 and 391.2 at T7 in
177 Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de pétrole
the polluted and, 20 and 709.1 at T5 in the control with CE-SSCP and pyrosequencing
techniques respectively) (Fig. 3).
Figure 2: UPGMA dendrograms generated from the DNA and RNA-based CE-SSCP patterns
of bacterial communities originated from control or polluted mesocosm. Time series are
indicated by Tx samples.
First clusters formed by samples from T1 to T9 (both total and active fractions) in the
polluted mesocosm or from T1 to T6 for the total fraction and from T1 to T5 for the active
fraction of the control represented to the phase A of the experiment (Fig. 2). Those samples
corresponded to the increasing period of bacterial abundance in each mesocosms (Fig. 1A).
During phase B (decrease of bacterial abundance together with HNF and virus increase) the
bacterial community structures changed radically between T9 and T10 in the polluted
mesocosm and between T6 and T7 in the control (Fig. 2 and 3). This second phase was also
marked by an increase in the number of both detected CE-SSCP (from 11 to 22 between T7
and T10) and pyrosequenced OTUs (Chao1= 391.2 and 530.8 at T7 and T10 respectively) in
the polluted mesocosm (Fig. 3A and Table 2) and a clear change in the most abundant OTUs
in the polluted mesocosm as well as in control (Fig. 3A and 3B). Last, the community
structures in both polluted and control evolved few until the end of the experiment (Fig. 2).
Figure 3: 16S rRNA bacterial analysis in initial seawater (Time 0), Control after 5 and 8 days
and polluted mesocosm after 7 and 10 days of incubation. A) DNA-based and RNA-based
CE-SSCP profiles, B) Taxonomic distribution (Genus_specie) for tags represented at least 1%
of total community. The remaining tag sequences are grouped in ―others‖.
179 Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de pétrole
Table 2: Patterns of bacterioplankton community structure
of 16S rRNA tag sequences from control and polluted
mesocosms.
Figure 4: Rarefaction
curves of tag sequences.
Bacterial community composition
The bacterial community composition was determined from DNA samples by
pyrosequencing at the critical points of the experiment: T0 (natural seawater), T7 and T10 in
the polluted and T5 and T8 in the control that corresponded to the maximum and minimum in
bacterial abundances. Among the samples, we found 16 key OTUs that evolved differently
during the incubation depending on the treatment and the two phases of the experiment. First
of all, the initial bacterial community of environmental seawater was mainly composed of
Alphaproteobacteria (70%) that were dominated (54.9%) by the Pelagibacter genus (Fig 3B).
This OTU completely disappeared in both mesocosms after the beginning of the experiment.
It was replaced by the Vibrio Gammaproteobacteria with percentages that represented up to
66.8% and 22.3% of the bacterial community at the maximum bacterial abundance in the
polluted and the control mesocosms, respectively. Despite its dominancy, this OTU was in
turn eliminated during the phase B (Fig. 5). Our mesocosm experiment was also characterized
by some OTUs that increased proportionally in the control but not in the polluted mesocosm
during phase A and that decreased during phase B. Such OTUs belonged to the classes of
Alphaproteobacteria or Flavobacteria with Flabobacterium, Roseobacter, Polaribacter,
Ruegeria and Cellulophaga genera contributing 19.4%, 18.6%, 7.7%, 4.2% and 3.2% in the
control at T5. Those OTUs formed the set of OTUS ―A‖. Another group of OTUs represented
by the Sulfitobacter, Roseovarius and Loktanella genera (set of OTUs ―B‖) belonging to the
Alphaproteobacteria class increased only a little during phase A, but became particularly
abundant in the control mesocsom during phase B with relative abundance of 30.1%, 23.9%
and 7.2% respectively (Fig. 3B). On the contrary, the group of Gammaproteobacteria was
composed of Pseudoalteromonas, Phaeobacter and Alteromonas (set of OTUs ―C‖)
representing respectively 4.8%, 6.4% and 1.9% of the total community. Group C was only
predominant during phase A in the polluted mesocosm and maintained or alternatively
decreased during the second phase (Fig. 5). Finally, a last set of OTUs (―D‖) was formed by
the Percisivirga flavobacteria, and the two Gammaproteobacteria Oleispira and
Methylophaga that were the only genera being mostly found in the polluted mesocosm during
phase B with 42.3%, 13.6% and 7.6% of the total community, respectively (63% of the
community, Fig 3B and Fig. 5).
Figure 5: Frequency of individual tag sequences for some particular genera along the
experiment.
181 Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de pétrole
Discussion
Impact of pure top-down control on bacterial abundance
The effect of diesel addition under constant concentration of inorganic nutrients led to
a ten-fold increase in bacterial abundance in less than seven days (2-fold increase in five days
in the control, Fig 1A). During this first phase (Phase A), the peak of bacterial abundance was
observed two days later in the polluted mesocosm (T7) compared to the control (T5). This
might be attributable to the much higher and longer increase of the bacterial abundance in the
polluted mesocosm compared to the control (Fig. 1A) than to a delay in the response of
bacteria to diesel addition (the bacterial abundance at T5 was approximately the same in
control and polluted mesocosms). This was in agreement with previous biostimulation studies
in which new carbon sources together with inorganic nutrients highly stimulated bacterial
abundance (Kasai et al. 2002; Delille et al. 2009). In a second phase (Phase B), bacterial
growth was stopped as a result of increasing abundances of HNF and viruses (1-day delayed
in the polluted mesocosm compared to the control) which were 6-fold higher in the polluted
compared to the control mesocosm (Fig. 1A). The rapid increase in HNF and viruses led to a
drastic decrease of the bacterial abundances to concentrations that were similar to those found
at the beginning of the experiment. While HNF abundances reached a maximum on day 11 in
the polluted mesocosm, viruses still showed a slight increase until the end of the experiment
(14 days) (Fig. 1A). Such succession in bacterial, HNF and viral peaks of abundance are
described as a classical prey-predator cycle (Pernthaler 2005). It was clearer in the diesel
amended treatment, suggesting a pivotal role of HNF and/or viruses in controlling bacterial
concentration during oil pollution scenarios (Fig. 1A). It is well known that HNF and viruses
represent one of the main forces driving bacterial abundances in marine ecosystems (Fuhrman
et al. 1995; Zhang et al. 2007) and their pivotal role in oil polluted environments has already
been underlined (Kota et al. 1999; Danovaro et al. 2003). Nevertheless, only few studies have
experimentally evaluated the effect of grazing on bacteria under oil-degradation conditions
(Dahl et al. 1983; Bak et al. 1987) and only few studies monitored viruses along with bacteria
and HNF in a unique mesocosm experiment (Ohwada et al. 2003; Toyoda et al. 2005).
Toyoda et al. (2005) observed an increase in the number of bacterial cells after the addition of
Bunker-A oil or kerosene that was followed by a propagation of either HNF or viruses
according to the type of oil. Our experiment is thus the first to reveal comparable amplitude in
the development of HNF and viruses in oil-polluted environment.
Although both, HNF and viruses increased in a response to the increase of bacterial
cells, our grazing experiments revealed that HNF were affected few the bacterial assemblages
(maximum of 1.7% at T10 and T14 in the polluted mesocosm and 2.9% at T5 and T12 in the
control, Table 1). In contrast, a much larger fraction of bacterial production (maximal 77.7%
in the polluted and 8.1% in the control) was removed by viral lysis (~45 times more in the
polluted and 6 times more in the control, Table 1). The top-down control was clearly exerted
by viruses, which thereby were responsible for a high turnover in the bacterial community and
in particular when diesel was added. Even though viruses have previously been identified as
most abundant ―life forms‖ in aquatic systems and important agents of bacterial-mortality
besides phagotrophic protists (Wommack et al. 2000), our results are original because data
about the impact of viruses on bacteria in oil-polluted ecosystem are extremely rare. Some
studies attempted to explain same kind of virus prevalence in eutrophic systems (Weinbauer
et al. 1993; Wilhelm et al. 1999). For example, Williamson et al. (Williamson et al. 2002)
found that in 22% of their microcosm experiments, viruses could increase after inorganic
phosphate enrichment, the high nutrients quantity stimulating directly viral multiplication.
Another explanation could been found in some studies underlining the induction of lytic cycle
in lysogenic bacteria by some common organic pollutants like PAH (Jiang et al. 1996;
Cochran et al. 1998). Indeed, Bunker C fuel oil, phenanthrene, naphthalene and pyrene were
characterized as agents inducing natural bacterial communities capable of increasing viral
direct counts from 129% to 345% of the non-induced control (Jiang et al. 1996). Finally, the
presence of viruses itself could be negative for flagellates and allow viruses to take the
advantage in their competition relationship for bacterial preys because it seems highly
probable that viruses can also infect protozoa (Pernthaler 2005). The immediate response of
both HNF and viruses to the increase of bacteria stimulated by the diesel addition, and the
high extent to which viruses control bacterial strongly recommends that viral lysis as one of
the possible bacterial loss processes must be considered in future oil biostimulation assays.
Impact of pure top-down processes on bacterial activity
Metabolic bacterial activity was also impacted by HNF and virus predation. Both cell-
normalized bacterial production (BP) and the aminopeptidase activity (AMPase) were at their
minimum level during the increasing phase of bacterial abundance (phase A). Bacterial
activity was multiplied 20-fold for the BP and 16.5-fold for the AMPase in polluted
mesocosms when bacterial abundance decreased under predation pressure (T7 to T11, Fig. 1).
Grazing and viral lysis often contribute to the release of free enzymes in natural waters
183 Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de pétrole
(Karner et al. 1994; Bochdansky et al. 1995). AMPase may have been overestimated in the
present mesocosm experiment because of free enzymes released in the seawater through lysis
and grazing that could have remained active even if they were not attached to bacteria during
this period. However, this observation did not alleviate the renewal of cell-normalized
bacterial activity during the high predation episode as the BP (an intra-cellular activity)
followed the same tendencies. Studies about the impact of predation on single-cell bacterial
activity in seawater are relatively rare (Hahn et al. 2001) and totally inexistent in oil polluted
context. Moreover, viruses and HNF are not considered equitably for this question. The few
available data showed contrasted results: some authors found that bacteria escape grazing
either by reducing their size and activity, or their metabolic activity only (del Giorgio et al.
1996) while others showed that the grazing increased with cell-normalized activity (Šimek et
al. 1990; Posch et al. 1999). We observed in both tanks a grazing and lysis-mediated increase
in bacterial activity between T5 and T9. This increase could be explained by two mechanisms.
Firstly, the predation would reduce the intra- and inter-species bacterial competitions (by
notably the ―killing the winner‖ model) that would allow a better supply of carbon, nitrogen
and phosphorus per cell and would increase the specific bacterial activity (Hahn et al. 1999;
Posch et al. 1999). Secondly, as in our experiment, the nutrient concentration was maintained
at a natural in situ level, bacterial communities should not have been limited in nitrogen, and
phosphorus nutrients. However, we suggest that grazing and lysis-resistant bacteria would
have benefited of the extremely labile molecules (sterols, fatty acids, amino acids…) liberated
by phagotrophes and lysed cells. Indeed, Middelboe et al. (2003) showed that viral lysis was a
source of labile organic matter that bacteria could easily utilize. Certainly because of this
higher metabolic bacterial activity, the activity of diesel degradation was maintained during
the predation episode. The measurement of diesel compounds along the experiment showed
that both n-alkanes (most degradable hydrocarbons that compose the majority of the
petroleum) and PAH (polycyclic aromatic hydrocarbon that compose the less degradable
fraction of the petroleum) were degraded continually during the incubation with no increase
or decrease of the degradation rate at any moment. As some studies have shown that predation
could negatively impact the oil biodegradation (Kota et al. 1999) the initial hypothesis of the
present work could have been that HNF and viruses predation would have a repercussion on
bacterial activity and diesel elimination. However, as in other studies demonstrating the
positive effect of predation in alkylbenzenes (Mattison et al. 2005) or phenanthrene
mineralization experiment (Tso et al. 2006), the degradation of hydrocarbons was not
impacted by the predation in our experiment. One of the most plausible hypothesis for
explaining such results could be that the liberation of labile organic matter by phagotrophic
protozoan and lysed bacteria may have allowed a renewing in the bacterial activity that may
have promoted the hydrocarbon degradation. The improvement of the degradation of
refractory organic matter by addition of easily degradable product is well known as ―priming
effect‖ in soil studies (Fontaine et al. 2003). However, until now, this effect was not really
investigated in aquatic environments. Recently, Guenet et al. (2010) examined a large amount
of studies showing indirectly ―priming effect‖ in seawater experiment and suspected this
effect to be prevalent in aquatic environments (Guenet et al. 2010). We suggest that such
mechanisms could be particularly important in the biodegradation of recalcitrant hydrocarbon.
Impact of pure top-down control on bacterial community structure
Overall, the addition of diesel and the effect of predation were the two factors driving
the bacterial community structure. The natural seawater collected at the beginning of the
experiment was mostly composed of Alphaproteobacteria (70%, data not shown) from the
Pelagibacter genus (58.18%), that has been identified as the most abundant bacterium in the
marine environment (Morris et al. 2002). Despite its prevalence, this genus did not survive to
the effects of petroleum that generally promotes only the few members of the bacterial
community that are capable to metabolize the hydrocarbons (Cappello et al. 2007) and/or
confinement, that has been previously recognized to alter bacterial community structure (Agis
et al. 2007). As in previous studies, this initial change was accompanied by a diminution of
the number of OTUs (Bordenave et al. 2007) that was visible, for the first time in our
experiment, with a pyrosequencing analysis (399 at T0 to 209 at T7 in the polluted
mesocosm, Table 2). The specific negative effect of petroleum was observed in the
contribution of Flavobacterium, Ruegeria, Roseobacter, Polaribacter and Cellulophaga
genera (set of OTUs A) that decreased during phase A only in the polluted mesocosm (Fig. 5).
After the reduction of species richness, the bacterial community little evolved (Fig. 2).
Bacterial multiplication led to the dominance of Vibrio-like OTU that reached 76.35% and
28.35% of the total community in the polluted and control mesocosm, respectively (Fig. 3B).
In the present mesocosm study, these bacteria clearly benefited from the confinement of the
seawater, the nutrient addition and the high carbon quantity available especially in the
polluted tank (Beardsley et al. 2003). Phase A was also marked by the increase in the
percentage of some specific OTUs in each mesocosm. In the polluted mesocosm, the most
represented OTUs were the Pseudoalteromonas, Phaeobacter and Alteromonas genera (set of
OTUs C), that certainly took advantage of the diesel addition (Al-Mallah et al. 1990; Hedlund
185 Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de pétrole
et al. 2006; Gertler et al. 2009). In both mesocosms, the dominant OTUs and particularly the
Vibrio genus exhibited low cell-normalized activity when bacterial abundances reached their
maximum (Fig. 1). However the active bacterial community structures (RNA-based CE-SSCP
profiles, Fig. 3A) were relatively similar to the total bacterial community structures (DNA-
based CE-SSCP profiles, Fig. 3A). This implied that despite their low metabolic activity, the
OTUs that were the most active were the dominant OTUs among the communities. Our
results reinforce the hypothesis according to which the addition of oil together with the
confinement effect induced a redistribution of the bacterial community structure by an
increase in active opportunist bacteria and an inactivation of other sensitive bacteria (Head et
al. 2006; Bordenave et al. 2007; Cappello et al. 2007; Coulon et al. 2007).
Most abundant and active OTUs were radically removed due to the high predation
pressure starting during phase B. Indeed, from day 7 in the polluted treatment and the day 5 in
the control treatment, the simultaneous increase of HNF and virus abundances not only
crashed the bacterial abundances down (Fig. 1) but also modified substantially the bacterial
community structure (Fig. 2 and 3). This change was first notable in the active fraction (RNA-
based) of the bacterial community that has previously been shown to be more sensitive to
variations (Moeseneder et al. 2001). Some abundant, ‗predation-sensitive‘ bacteria such as the
Vibrio genus in both mesocosms together with OTUs from the set of OTUs A in the control
and some OTUs from the set of OTUs C in the polluted mesocosm disappeared under the high
predation pressure (Beardsley et al. 2003). Without those OTUs, the bacterial community
diversified and the total number of OTUs increased (Thingstad 2000; Beardsley et al. 2003)
resulting in a richer bacterial diversity. Predation was thus a diversification factor of the
bacterial community, in particular in the context of diesel pollution. Here, we present the first
evidence of the parallel effects of HNF and viruses on the bacterial community structure in an
oil-polluted approach. Viral lysis was clearly the top-down process controlling bacteria in our
experiment. This might on the one hand be explained by the host-specificity of aquatic viruses
and on the other hand by the ―killing the winner‖ theory in which protists and viruses impact
preferentially the most abundant bacteria (Thingstad 2000; Beardsley et al. 2003). Since the
encounter between a virus or a protist and its host is unpredictable, the probability of
encounter is as larger as the host population is abundant, thus predominant bacterial groups
are preferentially predated (Thingstad et al. 1997). Previous studies have shown that a
moderate top-down control is fundamental for shaping and maintaining natural bacterial
diversity, even in oligotrophic systems (Weinbauer et al. 2004; Corno et al. 2008). We
suggest that this might be particularly important in oil polluted systems where the
conservation of high metabolic capacities of a complex bacterial community is crucial for the
degradation of complex mixtures of hydrocarbons such as diesel (Van Hamme et al. 2000).
The diversification effect of predation presented in this study presents the first evidence of the
specificity of viruses for particular bacterial genera and its positive on the diversity richness
of the bacterial community.
Since the most abundant OTUs were removed by predation, the ―predation-resistant‖
bacteria that were of minor importance in terms of their contribution when maximal bacterial
abundances were obtained became proportionally dominant after the predation episode. In
addition, the major OTUs of the total community (DNA-based CE-SSCP profile) were not the
most represented OTUs in the active fraction (RNA-based CE-SSCP profile) and we
suspected that it was highly probable that such predation-resistant bacteria presented low
metabolic activity, what in turn might explain their resistance to predation (Lenski 1988;
Middelboe 2000). In the control mesocosm, this might be the case for the genus Sulfitobacter
(32.25%, Fig. 3B) that can be expected in seawater originating from the Banyuls-sur-Mer bay
enriched with inorganic nutrients as this was the way it was isolated several years ago (Pukall
et al. 1999). The present result improved our understanding on this genus by underlining its
predation-resistance capacity under mesocosm conditions. Bacteria of the genera Roseovarius
and Loktanella (set of OUT B) also demonstrated that their resistance against predation and
increased in the control. The predation-resistant bacteria in the polluted mesocosm were
different as they were composed by OTUs from the set of OTUs D, Percisivirga (49.55%),
Oleispira (16.77%) and Methylophaga (9.17%) genera (Fig. 3B). Interestingly, Percisivirga is
not an attested hydrocarbon-degrading bacterium, but might have instead benefited from the
high quantity of organic compounds liberated by the degradation of diesel in the Phase A
and/or lysis and grazing (Fuhrman et al. 1995; Cottrell et al. 2000; Kirchman 2002).
Furthermore, the pyrosequencing analysis revealed that some OTUs such as from the genera
Phaeobacter and Roseobacter did not change significantly in the polluted mesocosm (Fig.
3B). We assume that these bacteria may have been quite sensitive to predation because if they
had resisted, their proportion would have increased among the community as it was shown for
the genus Percisivirga. On the contrary, some different OTUs associated with Oleispira and
Methylophaga appeared after the predation episode. As the active fraction of the bacterial
community was dominated by few OTUs that were not well represented in the total
community, the high cell-normalized activity would have been assumed by such non-
dominant OTUs. They not only resisted to the predation but also proliferated when bacterial
abundance, and consequently the competition between species, was lower. Bacteria of the
187 Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de pétrole
genus Oleispira are obligate hydrocarbonoclastic bacteria and have previously been shown to
be involved in the degradation of diesel (Golyshin et al. 2010) and also, the Methylophaga
genus, a methylotrophic bacteria has been detected in previous hydrocarbon degradation
experiment (Yakimov et al. 2004; Redmond et al. 2010). It is highly probable that both could
have benefited from the decomposed molecules coming from the diesel degradation. The
presence of those two genera showed that part of the oil-degrading bacteria are able to survive
and even become dominant under high HNF and virus predation pressure, revealing their high
potential in oil-contaminated environments and biostimulation assays. A particular attention
should be paid to such predation-resistant oil-degrading bacteria in oil-polluted environments.
Conclusion
The present study shows that viral-mediated bacterial mortality induces the
diversification of the bacterial community together with an increase of the bacterial metabolic
activity, thereby maintaining the diesel biodegradation at a constant level. Thus, the viral lysis
as a loss process has a strong impact on bacterial communities (on both abundance and
community structure) but this effect could not disturb the diesel biodegradation and allow a
renewing in the bacterial community. Our integrative study shows that the entire microbial
loop should be systematically considered in biostimulation assays to better adapt strategies of
bioremediation to specific environments.
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195
IDENTIFICATION DES BACTERIES HAP-DEGRADANTES
MARINES PAR STABLE ISOTOPE PROBING
CHAPITRE 5
197 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.
Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes
marines par Stable Isotope Probing.
1. Préambule
Une des difficultés majeures dans les études de bioremédiation est notre capacité à
identifier les bactéries responsables de la dégradation des hydrocarbures. Tout l‘intérêt des
approches de biostimulation est d‘arriver à augmenter l‘activité des bactéries
hydrocarbonoclastes, mais encore faut-il pouvoir les distinguer parmi la communauté
bactérienne totale. Dans le cas où cela n‘est pas possible, les stratégies de biostimulation
reviennent à ajouter en aveugle des substances de concentrations et compositions
extrêmement variables sans avoir la garantie de l‘effet positif escompté sur les bactéries
hydrocarbonoclastes et avec des effets potentiellement non désirés sur l‘ensemble de la
communauté bactérienne. Il est donc primordial de connaitre les cibles de la biostimulation
pour garantir un résultat positif de celle-ci.
D‘un point de vue plus fondamental, l‘identification des bactéries hydrocarbonoclastes
permet également de mieux comprendre le phénomène d‘élimination des hydrocarbures en
milieu marin. De manière générale, l‘attribution de fonctions particulières à certains groupes
bactériens spécifiques est un enjeu primordial de l‘Ecologie microbienne.
L‘approche traditionnelle pour isoler et étudier les bactéries responsables de fonctions
particulières dans l‘environnement est la culture cellulaire. Mais cette méthode présente un
inconvénient majeur, puisqu‘elle ne permet de révéler la diversité de moins de 1% des
bactéries marines. Malgré ses nombreux avantages pratiques, elle n‘est donc absolument pas
adaptée à l‘étude des communautés bactériennes hydrocarbonoclastes naturelles. Récemment
des alternatives à la culture ont été trouvées. C‘est notamment le cas des méthodes de
radiographie, présentées en introduction. Les approches de méta-génomique, transcriptomique
et protéomiques sont également d‘une grande utilité dans l‘étude des communautés
bactériennes. Mais une des méthodes privilégiées pour aborder spécifiquement cette question
est depuis quelques années le marquage de l‘ADN des communautés bactériennes d‘intérêt
par des isotopes stables ou « DNA-Stable Isotope Probing » (DNA-SIP). Cette technique a été
mise au point et largement employée dans les études du sol depuis une dizaine d‘années.
Paradoxalement, elle a été très peu utilisée pour l‘étude des communautés bactériennes
marines. Cela s‘explique d‘abord par les divergences d‘approches entre l‘Ecologie terrestre et
l‘Ecologie marine mais aussi et surtout par la difficulté d‘appliquer la technique en milieu
liquide. Pourtant cette avancée méthodologique semblait particulièrement prometteuse pour la
découverte de bactéries hydrocarbonoclastes en milieu marin. Des études sur les bactéries
méthylotrophes marines impliquant le DNA-SIP ayant ouvert la voie avec succès, il restait à
tester la méthode pour l‘étude des bactéries hydrocarbonoclastes. Nous présentons donc ici (i)
un chapitre de livre sur le principe général de la méthode et ses implications en guise
d‘introduction et (ii) une première étude de DNA-SIP en milieu marin pour l‘identification
des bactéries phénanthrène-dégradantes (une molécule indicatrice de pollution pétrolière
particulièrement surveillée par l‘agence de protection environnementale). L‘expérience de
DNA-SIP a été réalisée sur trois échantillons naturels provenant d‘environnement ayant des
niveaux de pollution pétrolière différents. L‘analyse des fractions d‘ADN enrichies en 13
C a
montré que quelle que soit l‘origine de l‘échantillon, Cycloclasticus sp. était toujours retrouvé
majoritairement après l‘ajout de phénanthrène. Par contre, d‘autres genres majoritaires moins
dominants (1% de la fraction 13
C) étaient spécifiques de chaque environnement échantillonné.
Ces résultats suggèrent que certaines bactéries opportunistes soient particulièrement
compétitives pour la dégradation des hydrocarbures quel que soit l‘origine du site considéré
en Méditerranée NO, tel que Cycloclasticus sp. qui est d‘ailleurs retrouvé dans de très
nombreux sites pollués, alors que d‘autres sont au contraire spécifiques de certaines
conditions environnementales.
Figure 27 : Photo des erlenmeyers ayant servis à l’incubation des bactéries avec le phénanthrène marqué
au 13
C durant l’expérience de DNA-SIP. Les erlenmeyers les plus jaunes sont ceux dans lesquels les
bactéries hydrocarbonoclastes se sont développées.
199 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.
2. Chapitre de livre: Monitoring of oil-degrading bacteria by stable isotope probing.
Multi-author publication project on the Encyclopedia of Aquatic ecotoxicology (Férard, J.F.
and Blaise, C., editors.
List of authors : Caroline Sauret1,2
and Jean-François Ghiglione1,2
1-CNRS, UMR 7621, LOMIC, Observatoire Océanologique, F-66651, Banyuls/mer, France
2-UPMC Univ Paris 06, UMR 7621, LOMIC, Observatoire Océanologique, F-66650,
Banyuls/mer, France
Note pour le lecteur: les mots en bleu sont définis dans le glossaire à la fin de ce chapitre de livre.
Definition
Utilization of new molecular techniques for the identification of oil-degrading bacteria
Matching bacterial taxa with specific metabolic capacities in natural environments remains
one of the biggest challenges for microbial ecologists. Stable Isotope Probing (SIP) coupled
with uncultured-based molecular biology techniques is a new powerful approach allowing the
identification of a microbial consortium actively involved in specific biogeochemical
processes, such as hydrocarbon biodegradation. This method relies on the uptake of stable
isotope-enriched substrates (13
C-phenanthrene or a mix of 13
C-petroleum hydrocarbons, for
example) by microorganisms able to metabolize and incorporate these substrates into their
cellular components (DNA, RNA, polar lipid derived fatty acids, amino acids and protein)
with minimum disturbance for microorganisms. Separation of isotope-enriched DNA or RNA
(heavy) from others (light) is performed by density gradient ultracentrifugation after nucleic
acid extraction and the phylogenetic affiliation of heavy nucleic acid sequences reveals the
composition of the hydrocarbonoclastic microbial community.
Historical overview
The ultimate degradation of complex petroleum hydrocarbons in the environment
mainly depends on the complementary metabolic capabilities of different hydrocarbonoclastic
bacteria (Head et al. 2006). For a long time, the difficulty for microbial ecologists to
discriminate microbes responsible for in situ oil-biodegradation processes has been hampered
by the high complexity of microbial assemblages and the limitations of culture-based
identification methods. The cultivation of microorganisms is still a very useful technique for
the discovery of new hydrocarbonoclastic bacterial strains (Prince 2005; Rodriguez-Blanco et
al. 2010b) but remains clearly incomplete since it allows the identification of only 0.1 to 1%
of the total bacterial community (Giovannoni et al. 1990). The appearance of polymerase
chain reaction (PCR)-based molecular approaches (16S rRNA gene or functional gene-based
methods) from in situ DNA extracts has allowed to shunt culture-dependent biases to explore
the spatial and temporal variation of microbial assemblages in soil (Ranjard et al. 2003) as
well as in seawater (Ghiglione et al. 2005; Ghiglione et al. 2007; Ghiglione et al. 2008; Lami
et al. 2009). With these approaches, links between changes in bacterial community structure
and oil-biodegradation have been demonstrated (Rodriguez-Blanco et al. 2010a). However,
direct identification of hydrocarbonoclastic bacteria was not feasible by using classical
molecular methods. Hanson et al. (1999) first revealed toluene-degraders identity from in situ
soil samples by using stable isotope probing (SIP) with 13
C-toluene labeled substrates.
Originally developed by Meselson and Stahl (1958) to demonstrate the semi-conservative
mechanism of DNA replication, SIP technique has received a growing interest in the last ten
years because of its potential to be coupled with new molecular methods to identify organisms
involved in the metabolism of a given substrate. Until now, the technique has been principally
used in soil and sediment, whereas studies in seawater are scarce (Neufeld et al. 2008).
Several authors suggested that SIP coupled with new metagenomic tools is leading to major
progress in microbial ecology for its potential to reveal new diversity-function relationships of
uncultivated microorganisms (see Chen and Murrell 2010 for a review).
Protocol
Nucleic acid-stable isotope probing (NA-SIP) first consists in setting up a microcosm
or an in situ incubation of an environmental sample with a stable isotope-labeled molecule
(see Fig. 1 for a global view of SIP protocol). The stable isotope can be 13
C, 15
N, 2H,
18O but
the carbon atom is the most commonly used in oil-degradation NA-SIP studies since it is the
most important element in hydrocarbons and nucleic acids. An important step concerns the
incubation period with the labeled substrate that should be optimized for sufficient
intracellular stable-isotope incorporation but not too long to avoid unspecific incorporation by
cross-feeding. Incubation time is comprised between a couple of hours and 2 months
according to the hydrocarbonoclastic capacity of the environmental sample and the
201 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.
bioavailability of the substrate. The success of the experiment is improved by the utilization
of totally labeled substrate (i.e. stable isotope enrichment of all carbon atoms). Separation of
heavy and light nucleic acids is performed in cesium chloride (for DNA recovery) or cesium
trifluoroacetate (for RNA recovery) by isopycnic ultracentrifugation step (from 10 to 90
hours) using vertical, near-vertical and more occasionally fixed-angle rotors. Before
ultracentrifugation, extracted DNA or RNA can be systematically spiked with a marker (such
as Escherichia coli DNA or RNA if this species is not present in the environmental sample) as
a control for the ultracentrifugation separation efficiency of labeled and unlabeled-nucleic
acids. Recovery of light and heavy bands can be performed by different methods. Some
operators localize the two bands by ethidium bromide incorporation and observation with a
trans-illuminator for direct sampling of the bands. Others retrieve fractions of the gradient by
pricking the bottom of the centrifuge tube with a needle or by successive pipetting on the top
of the tube. Then classical DNA or RNA quantification allows the recovery of the light and
heavy nucleic acid fractions. In both cases, a purification step eliminates cesium chloride
(CsCl) from DNA or cesium trifluoroacetate (CsTFA) from RNA for subsequent analysis. A
large panel of molecular techniques can be used to identify the hydrocarbonoclastic bacteria
from the purified stable isotope labeled-DNA or -RNA. All of them are based on PCR or
reverse transcription-PCR amplification of the 16S rRNA gene of the heavy fraction of DNA
or RNA, respectively. Difference in the nucleic acid composition of labeled DNA or RNA can
be observed by classical molecular fingerprinting methods such as DGGE (Röling et al.
2002), CE-SSCP (Rodríguez-Blanco et al. 2009), ARISA (Maron et al. 2005) or T-RFLP
(Bordenave et al. 2007) coupled with the taxonomic identification of bands or peaks. A better
picture of the diversity with a better coverage can be obtained by clone library (Giovannoni et
al. 1990) or by the new massively parallel pyrosequencing technology (Rogers and Venter
2005).
A comprehensive view of the experiment requires that several parameters be measured
before and/or during the course of incubation (Fig. 1). First, the assimilation of the substrate is
followed by chemical analysis such as gas chromatography coupled with a mass spectrometer
(GC/MS) or by a remineralization experiment following the decrease of 14
C-labeled substrate
by radiorespirometry with a liquid scintillation analyser (LSA) (Singleton et al. 2006). Such
analysis gives indication about the amount of labeled substrate degraded during the course of
the experiment and about the optimal substrate concentration and optimal time for NA-SIP
incubation. Second, the evolution of total bacterial abundance is often followed by
microscopy counting in order to determine a minimal bacterial abundance for DNA
extraction. Eventually, the quantification of hydrocarbonoclastic microorganisms can be
performed in parallel by using the most probable number (MPN) method based on the
incubation of replicated cultures across several serial dilution steps with the substrate (Delille
et al. 2009). A more precise estimation can be done by real-time PCR (if specific PCR
primers are available), a quantitative method for the determination of copy number of genes
involved in the transformation of the substrate (Singleton et al. 2006).
Figure 1: Typical procedure of stable isotope probing for monitoring oil-degrading bacteria.
See references: Neufeld et al. (2007) and Whiteley et al. (2007) for complete DNA and RNA-
SIP protocols, respectively.
203 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.
Applications
Stable isotope probing requires no foreknowledge about the studied microorganisms,
no cultivation step and minimizes the disturbance of the microbial population. It is not a
complicated technique to implement and it offers many advantages. Even if we focus herein
on its evident application to monitor oil degraders in situ, it can be applied to many other
topics, as long as labeled substrates are available and can be incorporated by bacteria. Until
now, NA-SIP has been successfully employed to explore soil or sediment bacterial
communities (Table 1) but its use in marine environment has only been performed to explore
active marine methylotrophs (Neufeld et al. 2008). The identification by NA-SIP of marine
bacteria able to degrade recalcitrant hydrocarbons such as polycyclic aromatic hydrocarbons
(PAH) with more than four rings is in process (Ghiglione, personal communication).
DNA-SIP analysis is undertaken with a range of 250 ng to 10 µg of DNA per milliliter
of CsCl. High concentrations of loaded DNA allow easier visualization/recovery of heavy and
light bands and allow further investigation by a wide range of molecular analysis methods. It
enables the monitoring of oil degraders within the entire bacterial community based on their
16S rRNA genes affiliation. RNA-SIP can offer the same sequence-based phylogenetic
resolution as DNA-SIP. Its main advantage is reduction of incubation time due to its faster
synthesis, which is of particular interest for natural samples containing active but non
replicating cells or with low bacterial growth rates. It increases the sensitivity of the technique
by labeling more efficiently and rapidly the RNA biomarkers (up to 6.5 times faster,
Manefield et al. 2007). However, RNA-SIP is limited to a maximum loading of 500 ng of
RNA per mL of CsTFA, a sufficient concentration for the 16S rRNA analysis that constitutes
the major fraction of the RNA, albeit more laborious for mRNA-based analysis. Such a
constraint complicates its recovery and its analysis making the labeled-transcriptome
exploration relatively complicated at this time, even if it represents an exciting challenge for
the future (Dumont et al. 2005). Only one study thus far has managed to partially reveal the
transcriptome of hydrocarbonoclastic bacteria in a polyaromatic hydrocarbon-contaminated
environment by using an mRNA-SIP approach (Huang et al. 2009). Advance information on
the succession of populations using the labeled substrate can be obtained by coupling the
advantages of the use of DNA- and RNA-based SIP, as proposed by Lueders et al. (2004) and
Manefield et al. (2007).
Table 1: Overview of studies using DNA/RNA-SIP for identification of active hydrocarbon-degraders.
Substrate Environment Biomarker Phylogenic groups identified Biomarker analysis Additional study features Reference
13C-naphthalene
PAH-contaminated
sediments DNA Polaromonas vacuolata T-RFLP
Discovery of a bacterium hosting a naphthalene dioxygenase
gene Jeon et al. 2003
13C-naphthalene
13C-caffeine
13C-phenol
13C-glucose
Agricultural experimental
soil DNA Pseudomonas, Acinetobacter and Variovorax T-RFLP
Use of a mix of 13C-labeled compounds minimizing
microbiological artifacts caused by nutritional disturbance
Padmanabhan et al.
2003
13C-benzoate Sediment DNA
No identification
(Study of the activity of benzoate-utilizing
denitrifying population)
T-RFLP Use of Archaeal carrier DNA in the density gradient
reducing labeling incubation time Gallagher et al. 2005
13C-naphthalene
13C-phenanthrene
Bioreactor treating PAH-
contaminated soil DNA Acidovorax, Pseudomonas and Ralstonia DGGE
Use of DNA from E. coli K-12 as an indicator of separation
efficiency of 12C and 13C-DNA during ultracentrifugation Singleton et al. 2005
13C-naphthalene
13C-glucose
Soil DNA Acidovorax, Pseudomonas and Intrasporangium Real-time-T-RFLP Adaptation of a quantitative assay for linking microbial
community function (Q-FAST) and structure T-RFLP Yu and Chu 2005
13C-methane Forest soil DNA Methylocystis
Cloning in bacterial artificial
chromosome plasmid
Methane mono-oxygenase operon revealed by metagenomic
tools Dumont et al. 2006
13C-benzene
Gasoline-contaminated
groundwater RNA Azoarcus DGGE
Supplementation by 13C-benzene and an electron acceptor
(benzene degradation under denitrifying conditions) Kasai et al. 2006
13C-pyrene Bioreactor treating soil DNA Sphingomonas, β and ϒ-Proteobacteria DGGE and real-time PCR
Use of DNA from E. coli K-12 as an indicator of separation
efficiency of 12C and 13C-DNA during ultracentrifugation Singleton et al. 2006
13C-benzene Coal gasification soil DNA
Deltaproteobacteria, Clostridia and
Actinobacteria T-RFLP and real-time PCR
Evidence of a novel clade of Gram-positive iron-reducers in
anaerobic benzene degradation Kunapuli et al. 2007
13C-phenanthrene
13C-pyrene
Bioreactor treating soil DNA Acidovorax DGGE and real-time PCR Mixture of 13C-substrates Singleton et al. 2007
13C-methane Acidic peatlands DNA Methylocystis and Methylocella/Methylocapsa
DGGE and MDA for a fosmid
metagenomic library Discovery of a methanol dehydrogenase Chen et al. 2008
13C-pyrene PAH-contaminated Soil DNA β and ϒ-Proteobacteria DGGE SIP coupled with biostimulation assays Jones et al. 2008
13C-benzoate Agricultural soil RNA
Pseudomonas, Bacillus, Acinetobacter,
Variovorax and Burkholderia DGGE Resource availability influence on bacterial diversity
Langenheder and
Prosser 2008
13C-benzoic acid Agriculture soil DNA Burkholderia
T-RFLP, real-time PCR,
isolation/cultivation
Use of MPN-PCR technique to quantify a close relative of
the species Burkholderia
Pumphrey et al.
2008
13C-benzene
BTEX-contaminated
Groundwater RNA Acidovorax and Malikia DGGE
Comparison between community fingerprinting technique
and SIP
Aburto and Ball
2009
13C-toluene
BTEX-contaminated
aquifer RNA Desulfocapsa T-RFLP Combination of in situ microcosm and SIP technique Bombach et al. 2009
13C-benzene Coarse sand DNA
Cryptanaerobacter/Pelotomaculum
ξ-proteobacteria T-RFLP
Relationship between methane production and benzene
degradation Herrmann et al. 2009
13C-naphthalene Groundwater RNA Pseudomonas Acidovorax
DGGE and FISH-Raman
microspectroscopy mRNA analysis Huang et al. 2009
13C-toluene Agricultural soil DNA Organism belongs to the candidate phylum TM7 T-RFLP Identification of a novel toluene-degrading bacterium Luo et al. 2009
13C-benzene Lotus field soil DNA Hasda-A DGGE and real-time PCR
Putative identification of a novel benzene-degrading
bacterium Sakai et al. 2009
13C-toluene BTEX-contaminated soil DNA Polaromonas T-RFLP and real-time PCR First Polaromonas strain growing on toluene Sun et al. 2010
13C-xylene Groundwater DNA Ramlibacter, Paenibacillus and Bacillus T-RFLP Identification of novel m-xylene degrading bacteria Xie et al. 2010
205 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.
Conclusion/prospective
Stable Isotope Probing is a powerful technique to open the ―microbial black box‖ by
matching diversity of bacteria and their hydrocarbonoclastic function in natural environments.
SIP technique offers a large potential in terms of prospects. For example, a modification of
SIP technique enabled the identification of active predators of stable isotope labeled
Prochlorococcus and Synechococcus (the two most abundant marine cyanobacteria) in
surface waters of the Pacific Ocean (Frias-Lopez et al. 2008). This assay opens up the field of
exploring the diversity of bacterial predators responsible for ―top-down‖ control of
hydrocarbonoclastic bacteria during oil spill pollution events (Kota et al. 1999).
Limitation of resources known as ―bottom-up control‖ has also received very little
attention thus far in SIP studies. Nutrient resources have a direct effect on oil-biodegradation
processes by limiting hydrocarbonoclastic bacterial activities (Atlas et al. 1972) and addition
of nutrients has been successfully used to improve oil degradation in natural environments.
However, very few studies have addressed the question of which bacteria were responsible for
such biostimulation. Kasai et al. (2006) showed that supplementation of groundwater with
13C-benzene together with or without nitrate as electron acceptor resulted in a selection of a
phylotype affiliated with the genus Azoarcus, a denitrifying bacterium able to degrade
benzene only when nitrate was added. In contrast, Jones et al. (2008) found that pyrene-
degrading bacterial diversity remained unchanged under nitrogen amended conditions in an
aged PAH-contaminated soil, even if biostimulation increased the rate of pyrene degradation.
Further comparison between species labeled by 13
C-hydrocarbon, or nutrients + 13
C-
hydrocarbon should be conducted for a better identification of nutrient-limited bacteria in oil
biodegradation processes.
Another promising prospect can involve detection of rare species and that of novel
enzymes and bioactive compounds by coupling DNA-SIP with new metagenomic approaches.
To our knowledge, pre-screening of the metagenomic library based on hydrocarbon substrate
incorporation has never been tried, even if this approach has already been used for
polychlorinated biphenyl (PCB) degrading-bacteria identification (Sul et al. 2009). The
application of SIP and metagenomic tools is largely conceivable to investigate
hydrocarbonoclastic bacterial genes such as PAH dioxygenase (Cebron et al. 2008) especially
because of the recent improvement of the sequencing technique with massively unparallel
pyrosequencing technologies (Rogers and Venter 2005). Coupling SIP and metagenomics
holds promise for extending the SIP application tool-box to expand discoveries in the
exploration of functional microbial communities.
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ARISA : automated ribosomal intergenic space analysis
BTEX: benzene, toluene, ethylbenzene and xylene
CE-SSCP: capillary electrophoresis - single strand conformation polymorphism
CsCl: cesium chloride
CsTFA: cesium trifluoroacetate
DGGE : denaturing gradient gel electrophoresis
DNA : desoxyribonucleic acid
FISH: fluorescent in situ hybridization
GC/MS : gaz chromatography / mass spectrometer
LSA : liquid scintillation analyzer
MDA: multiple displacement amplification
MPN : most probable number
mRNA : messenger ribonucleic acid
NA-SIP : nucleic acid-stable isotope probing
PAH: polycyclic aromatic hydrocarbon
PCB: polychlorinated biphenyl
PCR : polymerase chain reaction
PLFA: phospholipid fatty acid
RNA : ribonucleic acid
SIP: stable isotope probing
16S rRNA: 16S ribosomal ribonucleic acid
T-RFLP : terminal-restriction fragment length polymorphism
Specific glossary of the book chapter
16S rRNA gene A gene that encodes for the ribosomal RNA of the small sub-unit
of the ribosome involved in the translation of messenger RNA
sequences into amino acid chains in prokaryotes. This gene is
universally present but sufficiently variant to allow comparison
among all bacterial taxa. Many molecular tools are based on its
phylogenic resolution capacity.
Bacterial taxon
(plurial: bacterial taxa)
A population, whether named or not, of organisms which are
usually inferred to be phylogenetically related and having
characters in common which differentiate the unit (e.g. a
geographic population, a genus, a family, an order) from other
such units. A taxon encompasses all included taxa of lower rank
and individual organisms. Today, bacterial taxa are largely
defined by their 16S rRNA gene sequence variations.
Biostimulation Modification of an environment carried out to stimulate
indigenous bacteria capable of degrading pollutants. This can be
done by addition of various limiting nutrients or electron
acceptors, such as phosphorus, nitrogen, oxygen, or even carbon
sources.
Cross-feeding Synthrophic interaction in which an organism depends on or
benefits from one or more growth factors or nutrients provided by
another organism.
Cultivation Refers to various methods for multiplying microbial organisms by
letting them reproduce in predetermined culture media under
controlled laboratory conditions. It allows isolating organisms
from a complex environmental sample and maintaining them in
pure culture.
Density gradient A solution in which the concentration of solute is lowest at the top
and gradually becomes denser towards the bottom.
Molecular
fingerprinting methods
Methods that give a snapshot of the entire microbial community at
once, by differential electrophoretic migration on agarose or
polyacrylamide gels, which depend on their size fragments (T-
213 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.
RFLP, ARISA, LH-PCR) or sequence variations (DGGE, CE-
SSCP). The result is a profile (fingerprint) of the community
structure that can be compared to other samples treated in the
same way.
Hydrocarbon
biodegradation
Total or partial decomposition of hydrocarbons by biological
processes, which results in a minor loss of functional groups,
fragmentation into components, or in a complete degradation to
CO2 and minerals. Hydrocarbon biodegradation is mainly
performed by bacteria.
Hydrocarbonoclastic Refers to the ability of certain microorganisms to metabolize one
or several hydrocarbons.
Metabolic capacities All chemical reactions carried out in aid of specific enzymes
within a cell.
Metagenomics Studies that aim to characterize the partial or entire genomes of
whole communities of organisms rather than individual species.
Microbial consortium Physical association of two or more different microorganisms
interacting through the exchange of signals and molecules.
Molecular approaches Methods based on the exploration of genetic material pools (gene
structure and function), by opposition to culture-based methods.
Most probable number
(MPN)
A method for quantifying a functional group out of a total
bacterial community. This method is based on the
dilution/extinction cultivation technique with a particular substrate
and results are given by using a correspondence table giving the
most probable number of bacteria able to grow on this substrate.
Phylogenetic affiliation Positioning an organism on the basis of its evolutionary distance
to the closest related microorganism using their gene sequence
homologies (16S rRNA genes in general).
Polymerase chain
reaction (PCR)
A molecular technique using a polymerase enzyme to
exponentially amplify a DNA fragment until thousands or even
millions of copies of the sequence. PCR is the basis of a wide
range of genetic analyses avoiding limitations in DNA quantities.
Pyrosequencing A massively parallel DNA sequencing method based on the
sequencing-by-synthesis principle, which relies on efficient
detection of the sequential incorporation of natural nucleotides
during DNA synthesis. Due to the short read length generated by
the 454 platform and in order to increase sequencing capacity,
new strategies for exploring microbial diversity by 16S
pyrosequencing are currently being developed. While the first
generation 454 Life Sciences apparatus (GS20) provided up to 25
megabases of data in a single run with an average read length of
100 base pairs (bp), the new GS FLX Titanium provides up to 400
megabases of data in a single run with an average read length of
400 bp. The widespread availability of 454 pyrosequencing, a
technology roughly an order of magnitude less expensive than
classical Sanger sequencing in terms of cost per base, has changed
the landscape of genomics.
Real-time PCR
(quantitative PCR):
A technique used to amplify and simultaneously quantify a
targeted DNA molecule as absolute number of copies or relative
amount when normalized to DNA input or additional normalizing
genes. The procedure follows the general principle of a
polymerase chain reaction. Its key feature is that the amplified
DNA is detected as the reaction progresses in real time, a new
approach compared to standard PCR, where the product of the
reaction is detected at its end.
Stable isotope-labeled
molecule
A non-radioactive natural or synthesized stable molecule
containing one or several atoms enriched in one or several
neutrons. Different isotopes of the same element have nearly the
same chemical characteristics and therefore behave almost
identically in biology. The mass difference, due to a difference in
the number of neutrons, leads to a partial separation of the light
isotopes (unlabeled molecules) from the heavy isotopes (labeled
molecules) during physical processes such as ultracentrifugation.
215 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.
3. Article 4: Dominance of Cycloclasticus sp. as key phenanthrene degrader in
pristine and chronically oil polluted coastal seawaters revealed by DNA-stable
isotope probing and massive pyrosequencing.
List of authors: Caroline Sauret1,2
, Gilles Vétion1,2
, Catherine Guigue3, Jean-François
Ghiglione1,2
(1) CNRS, UMR7621, Laboratoire d'Océanographie Microbienne LOMIC, F-66651 Banyuls-
sur-Mer, France;
(2) UPMC Univ Paris 06, UMR 7621, Observatoire Océanologique, F-66651 Banyuls-sur-
Mer, France;
(3) Centre d'Océanologie de Marseille, Campus de Luminy, 13 288 Marseille Cedex 9,
France
Correspondence:
Jean-François Ghiglione
CNRS, UPMC Univ Paris 06, UMR7621, Laboratoire d'Océanographie Microbienne LOMIC,
Avenue Fontaulé, F-66651 Banyuls-sur-Mer, France. Tel.: +33 4 68 88 73 16; fax: +33 4 68
88 73 98
E-mail address: [email protected] (J.F. Ghiglione)
Running title: Identification of phenanthrene-degrading bacteria in seawater by SIP.
Keywords: Stable Isotope Probing, seawater, Cycloclasticus, pyrosequencing
Abstract
We present here the first study combining DNA stable isotope probing and massive
parallel pyrosequencing to identify pelagic phenanthrene-degrading bacteria in three coastal
sites of the NW Mediterranean Sea with various pollution levels. Analysis of natural seawater
and 13
C-enriched versus 12
C-bacterial communities revealed that one week incubation with
phenanthrene induced a decrease in bacterial richness together with the emergence of specific
phenanthrene-degrading bacteria that were rare or not detectable in the initial sample.
Cycloclasticus sp. was systematically found in the three environments to be dominant in the
13C fraction, revealing its pivotal role in phenanthrene biodegradation in the NW
Mediterranean Sea. We also found other dominant genus of phenanthrene-degraders (> 1% of
the community) such as Oceanibaculum, Paracoccus, Atleromonas and Sneathiella, but their
repartition were more site specific, suggesting an influence of the pollution history of the site.
217 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.
Introduction
Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) are one of the most hazardous substances of
petroleum. Because of their potential carcinogenicity and mutagenicity (ATSDR, 1995), the
Environmental Protection Agency (EPA) has classified many high-molecular-weight PAHs
(4-6 benzene rings) in its observation priority pollutant list. PAH mostly result of fossil fuel
combustion as by-products of industrial processing (Cerniglia 1992). The sources of
contamination by PAHs in natural environment are numerous (natural oil seeps, refineries
pollution, accidental of volunteer spills from tankers) and the high quantities of PAH in some
industrialized areas represents a real problem for human health (Thakker et al. 1985). Their
elimination could be achieved by physical processes like volatilization, photo-oxidation and
chemical oxidation but the better way to clean up PAHs contaminated sites is the microbial
biodegradation (Andreoni et al. 2009). Nevertheless, more PAHs present high-molecular-
mass more they are hydrophobic and have the tendency to adsorb to organic materials
(Gauthier et al. 2003). In consequence, they present low bioavailability for bacteria and
remain particularly persistent in natural environments (Hughes et al. 1997). Since several
years, a privileged way to improve the natural biodegradation of PAH has consisted to
biostimulate the indigenous hydrocarbonoclastic bacteria by nutrients addition. However,
even if this technique has proven its efficiency, it can remain uncertain because of our
ignorance of natural system functioning and bacteria involved in PAH biodegradation in
particular. For a long time, the difficulty to discriminate microbes responsible for in situ
PAH-biodegradation has been hampered by the high complexity of microbial assemblages
and the limitations of culture-based identification methods. Indeed, in a research effort, many
PAH degrading bacterial strains have been isolated from various environments (Juhasz et al.
2000; Rodriguez-Blanco et al. 2010) but it is highly probable that a large part of PAH
metabolism capabilities of natural assemblages remains ignored as the cultivation methods
allow the isolation of only 0.1% to 1% of bacterial communities in marine environments
(Giovannoni et al. 1990). In the last years, the 16S rRNA PCR-based molecular methods have
given access to molecular compositions of bacterial communities involved in PAH
degradation by shunting culture-dependent biases with relatively high success (Andreoni et al.
2004; Chang et al. 2007; Chang et al. 2010; Niepceron et al. 2010). In this studies some
variations in bacterial community structure have been attributed to PAH contamination.
However, the affiliation of PAH-metabolism to specific bacterial species was not feasible by
using such classical methods. Recently, the use of stable-isotope probing (SIP) to soil and
sediment in PAH-degradation studies has considerably facilitated the identification of PAH-
degrading microorganisms (Hanson et al. 1999; Singleton et al. 2005). New micro-organisms
have for example been found in naphthalene, phenanthrene or pyrene enriched bioreactor
treating soil (Singleton et al. 2005; Singleton et al. 2006). Moreover, recently the new high-
throughput pyrosequencing method has allowed a better identification of PAH-degrading
bacteria in previous soil biodegradation study by capturing the largest amount of available
genetic resources present in the sample avoiding cloning biases (Dos Santos et al. 2011;
Singleton et al. 2011). The coupling of SIP and pyrosequencing has also proved its efficiency
in the exploration of nitrogen-incorporating bacteria in petroleum-contaminated arctic soils
and anthracene-degrading bacteria (Bell et al. 2011; Jones et al. 2011). But surprisingly, the
labeling with stable isotope has been employed in seawater only for the identification of one-
carbon compounds degraders (Neufeld et al. 2007). The potential of such method in the
identification of PAH-degraders in seawater is high and this field of investigation remains
totally opened. Moreover, even if PAH-degrading bacteria are ubiquitous in natural
environment (Leahy et al. 1990; Yakimov et al. 2007), their representativeness and
composition is probably variable between contrasted sites. The PAH addition on either
pristine or oil-acclimated bacterial communities could give complementary results in SIP
study according to their metabolic capacities (Pelz et al. 2001). Except for some studies as in
denitrifying aquifer or sediments (Pelz et al. 2001; Gallagher et al. 2005), this way of
investigation has also been poorly explored.
We designed a DNA-SIP experiment with 13
C-phenanthrene in three contrasted
seawaters originated from sites submitted to various level of PAH pollution. The
identification of phenanthrene-degrading and non-degrading bacterial communities was
realized by the recent FLX pyrosequencing technology. This study consists in the first
revelation of PAH-degrading bacteria in surface seawater environment by stable-isotope
probing.
219 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.
Materials and methods
Sample collection
Seawater samples were collected from the North Western Mediterranean Sea (France) at i) the
SOLA station (42° 31‘ N, 03° 11‘ E) located in Banyuls-sur-mer bay in January 2010, ii) the
Fos-sur-Mer gulf (43°24‘' N, 04°59‘ 'E) and iii) the SOFCOM station (observation station of
the Frioul island for the oceanographic center of Marseille, 43°14‘ N, 05°17‘ 'E) in June 2010.
The Banyuls-sur-Mer bay and the SOFCOM station were considered to be pristine sites
whereas the Fos-sur-Mer gulf was chosen as a chronically oil contaminated site, as it is
bordered by coastal oil refineries and characterized by a heavy tanker traffic transporting
crude and refined oil (Le Dréau et al. 1997). For the three experiments, seawater was filtered
on 2µm (47mm, PC Nucleopore) in order to remove larger microorganisms and high-size
particles. Some sub-samples were sampled for initial bacterial abundance counting (see
below) and 5L were filtered on 0.2µm (47mm, PC Nucleopore) for an initial DNA extraction.
One liter was also filtered on 0.2µm and autoclaved 1h at 110°C to prepare the abiotic
control.
Labeling bacteria with phenanthrene stable isotope
Three stock solutions were prepared in dichloromethane at 100, 10 and 1mg mL-1
. The 13
C14-
phenanthrene (99% atom 13C, Sigma-Aldrich) was also prepared in dichloromethane at 10
mg mL-1
concentration. All the experiments were done in pre-calcined 500 mL Erlenmeyer
flasks. Flasks were prepared in sterile condition for three 12
C-Phe (Sigma-Aldrich)
concentration (100, 10 and 1mg L-1
), for 13
C-Phe (99% atom 13
C, Sigma-Aldrich) at 10 mg L-
1, for a biologic control without Phe and for an abiotic control with 10mg L
-1 12
C-Phe. A total
of 25 flasks were necessary for the time series, i.e.day zero, day 3, day 7, day 14, day 21 and
day 28. When dichloromethane from Phe solutions was totally evaporated, flasks were filled
with 250 mL 2µm-filtered seawater and hermetically sealed with Teflon caps. One flask of
each Phe concentration was sacrificed for initial Phe measurement. The rest was incubated in
a dark and in situ temperature under 300 rpm magnetic agitation. At each incubation time,
sub-samples were collected for bacterial counting, the flasks were then frozen until Phe
extraction or the seawater was filtered on a 0.2 µm pore-size filter (47mm, PC nucleopore) for
DNA extraction. The 13
C-Phe enriched flasks were stopped after seven days of incubation.
Phenanthrene quantification
The quantification of in situ phenanthrene and total PAH concentration was performed
according to Guigue et al. (2011). Briefly, dissolved PAHs present in the fraction < 0.7 µm
were extracted from seawater by liquid-liquid extraction with CH2Cl2 (3 x 50 ml per liter).
Organic extracts were then purified on silica to isolate the PAHs fraction. Deuterated standard
mixtures were introduced at different stages of the protocol and used as surrogates to assess
the recoveries of analytical procedures and to perform quantitation accuracy. All solvents
were of organic trace analysis quality (Rathburn, Interchim). PAHs fraction were analyzed by
gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS) (TraceISQ, ThermoElectron) equipped with
a TR-5 MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 µm, Thermofisher) and operating at an
ionization energy of 70 eV for a m/z range of 50-400, using hydrogen as carrier gas at a flow
rate of 1.2 mL min-1
. Compounds were identified by reference to the analysis of standard
mixtures (04071, Fluka and 47543-U, Supelco among others). Blanks were run by analysing
solvents. All concentration values were blank and recovery corrected. The concentrations of
17 parent PAHs were determined, namely naphthalene (Naph), acenaphtylene (Acy),
acenaphtene (Ace), fluorene (Flu), dibenzothiophene (DBT), phenanthrene (Phe), anthracene
(Ant), fluoranthene (Flt), pyrene (Pyr), benzo[a]anthracene (BaA), chrysene (Chr),
benzo[b]fuoranthene (BbF), benzo[k]fuoranthene (BkF), benzo[a]pyrene (BaP),
dibenzo[a,h]anthracene (DBA), benzo[g,h,i]perylene (BP) and indeno[1,2,3-cd]pyrene (IndP).
For the Phe degradation experiment, the Phe extraction was performed first adding a pyrene
solution as a co-extraction standard, previously prepared as Phe. Both aromatic hydrocarbons
were extracted in 20mL dichloromethane in cold conditions. After evaporation of the solvent
in 45°C speed-vac, hydrocarbon powder was re-suspended in ultra-pure toluene solvent.
Extracts were injected at 300°C in a gaz chromatographic capillary column (VF-5ms, Varian)
which was coupled with a mass spectrometer (GC-MS Varian 2100T). The migration
program consisted to 1 min at 60°C, an increase phase at 5°C min-1
and 45 min at 200°C. The
molecules were quantified according to standard calibration solutions of pyrene and Phe. The
simultaneous quantification of Phe and pyrene provided the extraction yield that was always
under 80% of recuperation. The quantification in abiotic controls allowed the estimation of
the physical disappearance of Phe during the incubation time of the experiment.
Bacterial abundance
Total bacterial counts were determined by flow cytometry according to Ghiglione et al.
(2005). Briefly, 2 mL seawater samples were fixed with 2% formaldehyde for at least 1 h at
221 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.
4°C. A 1 mL sub-sample was incubated with SYBR Green I (final concentration 0.05% [v/v]
of the commercial solution) for at least 15 min at 20°C in the dark and analysed with a FACS
Calibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) equipped with an air-cooled Argon
laser (488 nm, 15 mW). Stained cells were enumerated according to their side-angle-scattered
light (SSC) and induced green fluorescence light (GFL) collected through a 530 ± 30 nm
bandpass filter. Yellow–green fluorescent beads (1-μm diameter, Polysciences) were
systematically added to each analyzed sample to normalize SSC and GFL emission. Data
acquisition and analysis were conducted using the software Cell-Quest (Becton Dickinson).
Acquisition was triggered by GFL. The volume analyzed and the subsequent estimation of
cell concentrations were determined by measuring the remaining volume of sample and
subtracting it from the initial volume. Sheath fluid was seawater filtered through a 0.22 μm
pore size membrane.
Nucleic acid extraction
The procedure used for extraction of chromosomal DNA was a modification of that described
by (Fuhrman et al. 1988). This procedure employs an enzymatic and detergent-based lysis,
which is a relatively gentle method that avoids excessive shearing of DNA, produces DNA of
suitable quality for PCR and reduces the risk of chimera formation during PCR (Madrid et al.
2001). The frozen 0.22 μm pore-size filters were cut with sterilized scissors into small strips
and vortexed briefly in 840 μL of alkaline lysis buffer (50 mM Tris hydrochloride pH 8.3, 40
mM EDTA, 0.75 M sucrose). Cell lysis was accomplished by an initial incubation for 45 min
at 37°C after adding 50 μL of freshly prepared lysosyme solution (20 mg mL–1
), and a second
incubation at 50°C for 10 min after adding 100 μL of 10% sodium dodecyl sulfate and 10 μl
of proteinase K (20 mg mL–1
). The lysate was extracted with an equal volume of
phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) and with an equal volume of
chloroform:isoamyl alcohol (24:1). The nucleic acids were precipitated with 1 volume of
isopropanol at –20°C overnight, rinsed with 70% ethanol before resuspending in TE buffer
(10 mM Tris, 1 mM EDTA). The molecular size and the purity of the DNA were analysed by
agarose gel electrophoresis (1%) and the DNA was precisely quantified by the Quant-iTTM
Picogreen® dsDNA kit (Invitrogen) according to manufacturer recommendations.
DNA-SIP gradient fractionation
The preparation of gradient was performed at 20°C. From each sample, 1-2 µg of total
extracted DNA was mixed with TE buffer until 540 µL total volume. 4.7 mL of a cesium
chloride (CsCl) solution prepared in sterile TE at 1.80 g mL-1
were added to the DNA
solution. The density was precisely adjusted to 1.715 g mL-1
by successive addition of TE or
CsCl stock solution. The final mix was loaded in 4.9 mL Opti-seal polyallomer
ultracentrifuge tubes (Beckman Coulter) with sterile syringe and needle avoiding bubbles.
The tubes were centrifuged 40h at 20°C and 44500rpm (180000 gav) in a Vti 65.2 vertical
rotor (Beckman Coulter). Gradient were fractionated into ~200 µL fractions by replacing the
gradient by sterile water and collecting fractions by the bottom of the tubes with minimal
disturbance (Lueders 2010). DNA was then quantified in each fraction by Quant-iTTM
Picogreen® dsDNA kit (Invitrogen). The fractions containing heavy or light DNA were
purified with the Geneclean Turbokit (MPbio) according to manufacturer instructions then re-
suspended in ultra-pure water and stored at -80°C until analysis.
Pyrosequencing analysis of light and 13
C-enriched DNA
Initial seawater together with heavy and light DNA fractions of the SIP experiment
were analyzed by pyrosequencing. Bacterial tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing
(bTEFAP) was performed as described previously using Gray28F
5‘TTTGATCNTGGCTCAG and Gray519r 5‘ GTNTTACNGCGGCKGCTG (Dowd et al.
2008) amplifying 400bp of the V6 region of the 16S rRNA gene. Initial generation of the
sequencing library was accomplished by a one-step PCR with a total of 30 cycles, a mixture
of Hot Start and HotStar high fidelity taq polymerases, and amplicons originating and
extending from the 28F for bacterial diversity. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing
analyses utilized Roche 454 FLX instrument with Titanium reagents, titanium procedures
performed at the Research and Testing Laboratory (Lubbock, TX) based upon RTL protocols.
Sequences were processed and analyzed using the Qiime software (Caporaso et al. 2010).
Briefly, samples were denoised using the Ampliconnoise program and checked for chimeras
using Perseus (Quince et al. 2011). The resulting clean sequences were clustered using into
Operational Taxonomic Units (OTUs) at a 97% sequence identity level using the Uclust
algorithm (Edgar 2010). A representative sequence from each OTU was classified using the
RDP classifier (Wang et al. 2007) using the Greengeenes training set. Phylogenetic trees used
for Unifrac (Lozupone et al. 2005; Lozupone et al. 2007) analysis was constructed using
FastTree (Price et al. 2009 ) using sequences that had been aligned with PyNAST (Caporaso
et al. 2010 ) and filtered using the lanemask.
223 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.
Results and discussion
Methodological considerations for SIP seawater experiment
The lack of complete understanding regarding the full breadth of hydrocarbon-
degrading species and their ecological functioning in PAH removal from contaminated waters
was recently underlined (Gutierrez 2010; Gutierrez 2011). These authors proposed the use of
DNA-based SIP to identify marine bacterial PAH-degraders. So far, only studies on
methylotrophic bacteria have used this technique in seawater (Neufeld et al. 2007; Neufeld et
al. 2008). Nucleic-acid-SIP (NA-SIP) dealing with bacterial communities degrading
petroleum compounds generally incubated 0.1-10 µmol of enriched-substrate with one gram
or milliliter of soil or sediments in tens grams containing flasks during from 3 to 86 days, but
more generally during one to two weeks (Lueders 2010). As the bacterial abundance in such
environments is around 108-10
9 cells per gram, the quantities of natural sample and enriched
molecule is largely sufficient to obtain completely labeled NA. Most of the time, authors
obtained several micrograms of total NA after 13
C-pulse that comprise a majority of
unlabelled NA and a minor quantity of labeled molecule that was considered as representative
of expected in situ concentrations. According to our own experiment and previous study, it
seemed more complicated to obtain such result from seawater environment (Neufeld et al.
2007). In our study, we first performed a Phe degradation kinetic to estimate the optimal
concentration of Phe and the optimal incubation time in order to obtain enough 13
C-enriched
DNA in a minimum amount of time to avoid cross-feeding (Lueders 2010). In order to allow
a sufficient labeling, we added 10 mg L-1
of 13
C-Phe, which is 10 to 100 times more than
generally used in simulation of Phe addition by oil spills (Castle et al. 2006; Teira et al. 2007).
It permitted to obtain 1.3 to 10µg of DNA, out of 2 to 5 106 bacterial cells mL
-1 in 7 days, a
quantity that allowed an optimal separation of heavy and light DNA fractions. However,
among this quantities we found an higher concentration of 13
C-DNA compared to 12
C-DNA
(data not shown) whereas it should have been the opposite. Neufeld et al. (2007) found similar
results after 6 days exposition of 5 mmol of 13
CH3OH in 4L seawater, where DNA was almost
entirely composed of 13
C-DNA. This evolution of bacterial community composition under
substrate amendment is not really a problem as it is representative of what could append in
natural environments under sudden input like oil spill for example. The use of SIP for the
investigation of specific biogeochemical processes in natural seawater is promising and the
success of seawater SIP studies would reside in the improvement of experimental design, but
for the moment as some other authors, we believe that such cultivation-independent methods
of identifying specific degraders in complex systems are inherently much less biased than
isolation on plate media (Singleton et al. 2006).
Bacterial community dynamic under phenanthrene pollution and taxonomic identification
Pelagibacter genus was the major group at the beginning of the experiment with 71.6,
64.0 and 64.8% of the total communities in FOS, SOFCOM and BANYULS, respectively
(Fig. 1). The other species never exceeded 10% of total communities. After 7 days incubation
with Phe, we observed a radical shift in thebacterial community structures in the three sites
that led to the disappearance of Alphaproteobacteria (especially Pelagibacter) and
Bacteroidetes together with the dominance of Gammaproteobacteria and more specifically
the Cycloclasticus genus in all 13
C-enriched fractions (Fig. 1). Castle et al. (2006) also found
that 3 days after the naphthalene exposure, both Alphaproteobacteria and Bacteroidetes
became undetectable with fluorescent in situ hybridization (FISH). Teira et al. (2007)
proposed that this significant decrease was due to the toxicity of hydrocarbon chemicals. Such
hypothesis was reinforced by the results from Labbé et al. (2007) who revealed that
Alphaproteobacteria was twice higher in pristine than in hydrocarbon-contaminated Alpine
soils. On the contrary, Gammaproteobacteria have already been identified as major group in
confined seawaters (Eilers et al. 2000; Beardsley et al. 2003) and most of aerobic
hydrocarbon-degrading bacteria belong to Gammaproteobacteria group (Head et al. 2006).
Ellers et al. (2007) showed that the relative abundance of Alteromonadaceae, an important
member of the Gammaproteobacteria could significantly increase after water enclosure in
mesocosms. In our experiment, Glaciecola, an Alteromonadaceae, was predominant in the
non-enriched fractions of the three bacterial communities. This genus has already been found
in oil contaminated sites (Brakstad et al. 2008) and can even degrade the tetradecane
(Yakimov et al. 2004), but did not metabolized the Phe in our experiment. Many studies have
investigated the bacterial community composition in oil contaminated sites (Yakimov et al.
2004; Brakstad et al. 2005; Brakstad et al. 2008). It is tempting in such case to allocate a
hydrocarbon-degradation function to the key members of the community, making the
hypothesis that if there are predominant over the bacterial community, it could be because of
their selective advantage for the hydrocarbon resource. However, our results demonstrate that
some genera such as Glaciecola could be well represented in a total bacterial community
subjected to toxic compounds, but without being involved in its degradation. This observation
suggests that some genera can be unaffected by the hydrocarbon toxicity and second could
225 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.
benefit of the ambient conditions, representing a serious competitor to hydrocarbon-degrading
bacteria for the nutrients resources for example (Smith et al. 1998).
Table 1: Caracteristcs of SIP samples (bacterial abundance, PAH quantities in situ and during
the experiment) and summary of tag sequencing. The number of reads for tag sequencing
listed was the total number generated. All of the diversity statistics for tag sequencing are
reported following clustering of this data set at a distance of 0.03 and re-sampling to the
sample with the lowest number of reads (3715 tags). Richness indexes (Chao1 and ACE)
were calculated at the 3% difference level between 16S rRNA gene fragments.
Cycloclasticus genus as a key PAH-degrading bacteria in marine environments
While the initial seawaters contained no detectable member of the Cycloclasticus
group, this genus represented 56.6, 88.6 and even 99.0% of total Phe-degraders (13C-enriched
fractions) after one week incubation in FOS, SOFCOM and BANYULS respectively (Fig. 1).
The dominance of Cycloclasticus was accompanished with a drastic decrease in bacterial
richness after phenanthrene addition (from more than 345 to less than 106 species in the three
environments, as estimated by Chao1). A decrease in bacterial richness together with a strong
selection of hydrocarbon-degrading bacteria is a classical trend after hydrocarbon exposure
(Röling et al. 2002; Castle et al. 2006). Both qualitative (fingerprint) and quantitative methods
(FISH and qPCR) have been employed to explore the structural changes that occur in natural
marine bacterial communities after oil pollution (Denaro et al. 2004; Yakimov et al. 2004;
Castle et al. 2006; Coulon et al. 2007; McKew et al. 2007). However, until now, very few
studies have investigated the dynamic of bacterial communities under oil pollution by the
massively parallel pyrosequencing (Dos Santos et al. 2011) or coupled this technique to SIP
experiments (Bell et al. 2011; Jones et al. 2011). By using this high-throughput sequencing,
we could reveal 40-64% of the total diversity in all samples meaning that even with this
efficient method, half of the community diversity could be not sampled (Table 1). Muyzer et
al. (1993) and Casamayor et al. (2000) indicated that only the species which make up >1% of
the total cell number could be detected with actual PCR-dependent methods and taxa that
comprise <0.1% were difficult to retrieve. This actual limitation explained why we could not
found the PAH-degraders and the Cycloclasticus genus in particular in the initial seawater.
This observation also demonstrate that the ―seed bank‖ theory is particularly well adapted to
hydrocarbonoclastic bacteria (Pedrós-Alió 2006). Indeed, our results revealed that some key
members of the PAH-degrading community belonging to the ―seed bank‖ were opportunistic
species that grew under appropriate conditions becoming the ―core species‖ in oil polluted
environments. SIP coupled with new pyrosequencing technologies is the only technique to
study the dynamic of key members of the in situ community able to respond to oil pollution
and permits a better evaluation of their potential in natural conditions (Dumont et al. 2005).
The Cycloclasticus dominancy in the three 13
C-enriched fractions was not surprising and
reinforced the general observations made on this key genus for the PAH natural removing.
Cycloclasticus bacteria was first isolated in 1995 for the degradation of numerous low-
molecular-weight PAH such as naphthalene, alkyl naphthalene, biphenyl, phenanthrene,
fluorine and anthracene (Dyksterhouse et al. 1995). This genus cannot grow on classical sugar
and amino acids like lactate, alanine, proline, glucose and fructose, which makes it, a
preferential hydrocarbon-degrading bacteria. It was demonstrated that this genus degrades
more efficiently C1-2 alkyl aromatic hydrocarbons than some other PAH-degrading bacteria
such as Marinobacter, Pseudomonas and Sphingomonas (Kasai et al. 2002), a capacity that
could explain its systematic dominance in PAH-contaminated sites. Numerous papers have
identified the Cycloclasticus genus has as a key member of the PAH-degradation in various
environments (Geiselbrecht et al. 1996; Kasai et al. 2002; McKew et al. 2007) accounting
even for up to 25% of the total bacterial populations in severely oil-polluted waters
(Maruyama et al. 2003; Harayama et al. 2004). Like in our experiment, Teira et al. (2007)
observed a quick response of bacteria belonging to the genus Cycloclasticus after PAH
addition, reaching a maximum abundance in about 3 days. This genus was also retrieved in
pyrosequencing datas after a simulated oil spill in pristine mangrove sediments and was
227 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.
proposed as an PAH-pollution indicators (Dos Santos et al. 2011). All those observations
make Cycloclasticus a primordial group in the natural elimination of low-molecular-weight
PAHs. We demonstrated here for the first time the potential of this dormant bacterium in
natural seawater by Stable Isotope Probing and confirmed its prevalence in various PAH-
contaminated marine sites.
Figure 1: Taxonomic distribution (Class_Order_Family_Genus) of re-sampled tag sequences
from initial seawaters, 12
C- and 13
C-SIP fractions in the three contrasted sites. NA are for
Non-attributed sequences. OTUs representing less than 1% of the total community are
grouped in ―others‖.
Importance of seawater origin in the response of phenanthrene degrading bacterial
communities.
Differences between the three environments were also found in their bacterial
community composition. Initial bacterial community was richer in the BANYULS station
than the two others (380, 177 and 150 detected OTUs in BANYULS, FOS and SOFCOM
respectively, Table 1). Phe addition resulted in a drastic decrease of bacterial richness except
in the FOS station where an increase in the number of observed OTUs was found for the
background community fraction. FOS was the most diversified site after Phe exposure
(Simpson = 0.92 and 0.53, 0.34 and 0.21 or 0.54 and 0.02 for 12
C and 13
C fraction in FOS,
SOFCOM and BANYULS sites respectively), suggesting a less dramatic effect of the PAH on
the bacterial community than in other seawaters. In this site, phenanthrene non-degrading
bacteria probably resisted to the toxic effects of hydrocarbon chemical because of their
chronicle exposition to petroleum and were able to grow in confined conditions (see Sauret et
al. submitted).
Moreover, if the most dominant OTUs were the same in the three environments
(Glaciecola in the 12
C fractions and Cycloclasticus in the 13
C fractions), other dominant
species (>1% of the total community) were different between sites, revealing some site
specific organisms. Phenanthrene-degraders belonging to Oceanibaculum and Paracoccus
were mostly found in SOFCOM site whereas Alteromonas and Sneathiella were mostly
retrieved in FOS seawater. 13
C-enriched dominant bacterial community from BANYULS was
totally dominated by the Cycloclasticus genus. Alteromonas is an attested hydrocarbon-
degrader. Recently, the complete genome of the PAH-degrading bacterium Alteromonas sp.
strain SN2 was sequenced (Jin et al. 2011). Alteromonas intervened also in the PAH-
degrading bacterial community from deep sea sediments of the middle Altantic Ridge (Cui et
al. 2008) or Indonesian seawater (Harwati et al. 2007). Paracoccus is also known for utilizing
hydrocarbons as a carbon source. This genus was even associated with gravel particules in
Arabian Gulf coasts for the degradation of petroleum (Radwan et al. 2010). Thus, their
presence in our Phe-degrading bacterial communities was not surprising. Oceanibaculum has
already been found in a PAH-polluted hydrothermal field sediment (Lai et al. 2009; Dong et
al. 2010) and Sneathiella has even been identified in an oil reservoir in the North sea (Bødtker
et al. 2009) but, until now, such bacteria have never been recognized as PAH-degraders. We
showed here their capacity to metabolize the phenanthrene or its by-products. Our result
showed that even under the same conditions, some bacterial genus selected for the Phe
degradation where different in each environment, revealing the specificity of particular
bacteria for specific environmental conditions.
Conclusion
We showed in the present study that the Stable Isotope Probing technique is adaptable to the
exploration of PAH-degrading marine bacteria. Such technique is promising to improve our
understanding on oil elimination natural process in aquatic environments.
229 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.
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237 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.
DISCUSSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES
CHAPITRE 6
239 Chapitre 6 : Discussions générales et perspectives
Chapitre 6 : Discussions générales et perspectives
En se basant sur les résultats originaux des travaux exposés dans les chapitres précédents,
ce dernier chapitre a pour objectif de discuter et d‘envisager des perspectives réalistes autour
de 4 questions fondamentales qui ont été abordées dans cette thèse.
1. Quelle est l‘importance de la richesse bactérienne spécifique dans la biodégradation
des hydrocarbures ?
D‘après les nombreuses études décrites dans la bibliographie, nous savions avant
d‘entamer ce travail de thèse que le pétrole avait un impact sur la structure des communautés
bactériennes marines. C‘est donc sans surprise que cet impact a été retrouvé à la fois dans
l‘étude in situ (Chapitre 2) et dans les expériences en laboratoire présentées dans ce manuscrit
(Chapitres 3, 4 et 5). Nos travaux ont permis de démontrer statistiquement que dans
l‘environnement, le pétrole est un facteur qui contribue significativement à la structuration des
communautés bactériennes. Lors de déversement soudain, le pétrole fait disparaitre les
groupes bactériens sensibles à sa toxicité et stimule les bactéries hydrocarbonoclastes,
induisant un fort changement de structure de communauté. Ces observations soutiennent
l‘idée que la plasticité métabolique des communautés bactériennes contribue à la mise en
place d‘un consortium bactérien performant pour la dégradation des hydrocarbures. Toutefois
s‘il est relativement aisé d‘observer les changements de structure de communauté et/ou de
diversité bactérienne après un apport de pétrole, il est en revanche plus complexe de
déterminer à quel point la diversité bactérienne influence en retour l‘efficacité de
biodégradation. Des pistes de réponses ont pu être obtenues par l‘expérience que nous avons
effectuée en microcosme (Chapitre 3). En testant expérimentalement l‘effet de l‘historique de
pollution d‘un site sur la réponse des communautés bactériennes à un apport de pétrole, nous
avons pu voir qu‘un assemblage bactérien subissant des pollutions chroniques s‘adaptait plus
rapidement aux hydrocarbures, les dégradait plus vite et était plus performant dans le
métabolisme des composés les plus complexes par rapport à une communauté n‘ayant jamais
était confrontée à une pollution pétrolière. Supposant que cette communauté bactérienne
possédait déjà en grand nombre de bactéries hydrocarbonoclastes avant la pollution, nous
avons pu en déduire que la diversité bactérienne était un facteur clé dans la dégradation des
pétroles. Les expériences en microcosmes et mésocosmes ont également montré que la
communauté bactérienne voyait sa richesse diminuée après ajout de pétrole, sans qu‘il n‘y ait
d‘influence sur les taux de dégradation des hydrocarbures (Chapitres 3 et 4). Nous avons vu
également dans le chapitre 5 que la richesse des bactéries capables de dégrader certains
hydrocarbures était très réduite (dominance très nette de Cycloclasticus sp. dans la
dégradation du phénanthrène, par exemple). A ma connaissance, il n‘existe pas à ce jour
d‘étude publiée ayant estimé expérimentalement un niveau de richesse minimum d‘une
communauté bactérienne naturelle pour la dégradation des hydrocarbures.
Pour cela, il conviendrait de tester la capacité de dégradation des hydrocarbures de
plusieurs assemblages bactériens possédant des niveaux de richesse différents. Cette question
fondamentale a déjà été explorée à partir de consortia bactériens de niveaux richesse variables
reconstitués expérimentalement en mélangeant plusieurs souches bactériennes cultivables
(McGrady-Steed et al. 1997). Néanmoins ce type d‘expérience se heurte à un problème
majeur à savoir la représentativité des souches cultivables choisies par rapport à des
communautés naturelles complexes. Nous proposons ici une alternative à travers une
expérience préliminaire en guise de perspectives d‘étude et nous en exposons ici le principe et
les premiers résultats. La méthode que nous avons choisi consiste à manipuler artificiellement
la richesse d‘une communauté naturelle en utilisant la méthode de « dilution-extinction »
(Gomez et al. 2004) et à tester sa capacité de dégradation d‘un HAP modèle, le phénanthrène.
Figure 28 : Principe général de l’expérience de dilution-extinction.
Une condition requise à cette étude était d‘obtenir des cultures d‘eau de mer présentant des
richesses spécifiques en bactéries naturelles de plus en plus faibles, mais dont les biomasses
241 Chapitre 6 : Discussions générales et perspectives
étaient identiques. Nous avons donc dilué de l‘eau de mer prélevée dans la baie de Banyuls
sur mer en deux phases successives et attendu que les bactéries se développent jusqu‘à une
même concentration dans toutes les dilutions pour ajouter du phénanthrène dans l‘ensemble
des microcosmes (Fig. 28). Avant et après incubation avec l‘hydrocarbure, une analyse de
structure de communauté a été réalisée par CE-SSCP, l‘abondance bactérienne a été mesurée,
la concentration en phénanthrène dosé et des mesures d‘activités ectoenzymatiques
bactériennes ont été réalisées avant l‘ajout du phénanthrène (l‘ensemble des protocoles
utilisés dans cette expérience ont été présentés dans les précédentes études).
Nos résultats ont montré tout d‘abord que quel que soit le niveau de dilution, il était
possible d‘obtenir des cultures ayant une abondance bactérienne du même ordre de grandeur
(entre 1 et 4.106 cellules.mL
-1) dans un intervalle de temps relativement court. Ensuite
l‘objectif de diminution artificielle de la richesse par dilutions successives mesuré par le
nombre de pics CE-SSCP a été partiellement atteint. Si la diminution de diversité était
évidente pour la première étape de dilution, la deuxième étape n‘a pas permis d‘atteindre
l‘extinction et il serait nécessaire de reproduire cette expérience en faisant une troisième étape
de dilution de manière à obtenir un nombre minimum d‘espèces (mesuré cette fois par une
analyse plus poussée en pyroséquençage massif). Néanmoins, les premières estimations de
mesure d‘activités enzymatiques extracellulaires cellule-spécifique ont montré que l‘activité
métabolique des communautés bactériennes de richesse différente étaient différentes, comme
le montre la figure 29. Par exemple l‘échantillon naturel présentait une activité extracellulaire
de type aminopeptidase élevée et lipase très faible. La dernière dilution, de richesse plus
faible, présentait au contraire une activité aminopeptidase faible et lipase élevée (Fig. 29).
Figure 29 : Mesures d’activités enzymatiques extracellulaires dans les 11 dilutions différentes. Protocole
indiqué dans l’article 3 de ce manuscrit.
Nos résultats ont également montré une baisse de la richesse après l‘ajout du
phénanthrène dans les différentes cultures, correspondant à l‘effet classique des hydrocarbures
sur les communautés bactériennes marines (Fig. 30).
Figure 30 : Evolution des profils CE-SSCP dans les différentes dilutions successives, avant et après ajout
de phénanthrène. En rouge, sont représentés les nombres de ribotypes détectés dans chaque profil. Ce
nombre diminue au cours de dilutions et diminue encore dans chaque dilution après ajout de
phénanthrène.
Malheureusement, le dosage du phénanthrène pour l‘estimation de l‘activité de
biodégradation de ce composé n‘a pu être réalisé correctement et n‘a pas permis de conclure
sur l‘effet de la diminution de la richesse sur la dégradation des hydrocarbures. Néanmoins,
l‘expérience de dilution envisagée ici présente un certain nombre de résultats encourageants.
Au-delà de son originalité, la technique de dilution/extinction semble être appropriée pour
reconstituer artificiellement un gradient de richesse bactérienne, même si certaines
améliorations dans le protocole expérimental doivent encore être apportées. Ces résultats
243 Chapitre 6 : Discussions générales et perspectives
montrent pour l‘instant que les activités testées sont sensibles à cette diminution de richesse.
Plusieurs perspectives à ce travail sont donc envisagées. Il faudra tout d‘abord répéter cette
expérience pour estimer la reproductibilité des résultats obtenus en effectuant une analyse
plus poussée de la diversité bactérienne à l‘aide de la technique de pyroséquençage et bien sûr
doser l‘activité de dégradation du phénanthrène qui a fait défaut dans nos tests préliminaires.
En cas de résultat positif, l‘expérience pourrait être réalisée à partir de communautés
naturelles provenant d‘autres environnements, y compris des environnements chroniquement
pollués. Des résultats différents en terme de lien entre « diversité » et « fonction » pourraient,
en effet, être trouvés tel que nous avons pu le mesurer dans le chapitre 3 de ce manuscrit.
2. Comment améliorer la bioremédiation des hydrocarbures ?
A la fois par le passé et dans l‘étude présentée dans ce manuscrit, il a été montré que les
communautés bactériennes naturelles étaient souvent limitées par les ressources en nutriments
inorganiques. Une des méthodes actuellement privilégiée pour la remédiation des
hydrocarbures est la biostimulation des communautés bactériennes autochtones par l‘ajout de
sels nutritifs. Au cours de notre étude en microcosmes, nous avons pu voir que la
biostimulation permettait à certains groupes bactériens d‘être plus actifs, qu‘elle permettait
d‘augmenter l‘abondance bactérienne et que la dégradation des hydrocarbures en était
accélérée (Chapitre 3). Cette étude a également révélé que la biostimulation n‘affranchissait
pas seulement les bactéries de la limitation par les ressources nutritives mais induisait
également des changements de structure de communauté. Cette observation vient renforcer
l‘hypothèse que l‘ajout de sels nutritifs stimule certains groupes bactériens et pas d‘autres en
fonction de leur besoins métaboliques respectifs. Cet effet variable de la biostimulation sur les
différents groupes bactériens aurait pour effet de rendre plus compétitifs les groupes
initialement limités par les ressources inorganiques, phénomène qui serait à l‘origine des
changements de structure de communauté. Ce constat soulève notre difficulté à prédire les
effets de la biostimulation sur les assemblages bactériens, le problème de la reproductibilité
dans les résultats et donc l‘efficacité et la fiabilité de la méthode. Cette contrainte est d‘autant
plus valable dans le cas des biostimulants/bioemulsifiants car leurs effets sur les
communautés bactériennes semblent encore plus difficiles à prévoir en raison de la diversité
et de la complexité des molécules employées. Dans notre étude, le biostimulant utilisé a eu à
peu près les mêmes effets sur les communautés bactériennes et la dégradation des
hydrocarbures que les nutriments inorganiques. Toutefois, ce résultat n‘empêche pas que le
phénomène de stimulation des bactéries par ajout de biostimulant fasse intervenir des
mécanismes tout autres que dans le cas des nutriments. Comme cela a été évoqué en
introduction, il est probable que ce type de molécules organiques composées de carbone,
d‘azote et de phosphore offrent aux bactéries des sources de nutriments facilement
dégradables, induisant chez elles un regain d‘activité et par voie de conséquence une
meilleure dégradation des hydrocarbures. Mais ce « priming effect » n‘est encore qu‘à l‘état
d‘hypothèse. En raison de notre manque de connaissances sur le sujet, la méthode de
biostimulation par les nutriments inorganiques d‘abord mais surtout par les molécules
organiques complexes comme les biostimulants/bioémulsifiants souffre de son manque de
reproductibilité dans les résultats et son manque de spécificité pour chaque environnement
pollué.
Pour trouver des solutions à cette contrainte, plusieurs pistes sont envisageables. D‘abord,
une étude plus approfondie des communautés bactériennes biostimulées devrait permettre de
mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans la stimulation de certains groupes
bactériens, paramètre qui fait cruellement défaut dans les nombreuses études qui se sont
penchées sur cette question. Il s‘agirait d‘identifier clairement les espèces bactériennes
répondant favorablement à l‘ajout de nutriments et celles qui sont insensibles à ce type de
traitement.
Ensuite, il a été remarqué que lors de catastrophes pétrolières comme celle de l‘Exxon
Valdez, les produits employés pour la biostimulation sont généralement des mélanges de
molécules (ex : Inipol EAP22) qui en raison de leur complexité peuvent présenter des niveaux
d‘efficacité variables. Une des raisons pouvant expliquer cela est le manque de connaissances
de leur impact sur les communautés bactériennes elles-mêmes. Si leur effet sur la
biodégradation est largement testé, leur impact, en terme de toxicité notamment, sur les
microorganismes est largement ignoré. Des expériences intégrées (suivi de l‘abondance, de la
diversité et de l‘activité bactérienne) avec ce type de produits commerciaux devraient être
testées pour un meilleur emploi dans les stratégies de biostimulation.
Enfin, il existe généralement un paradoxe entre les essais de biostimulation et le processus
de biodégradation. Comme cela a été souligné en introduction, la biodégradation des
hydrocarbures est un processus qui peut être long et qui se fait en plusieurs étapes selon
l‘alternance de différents groupes bactériens possédant des métabolismes variables. Or la
plupart du temps, la biostimulation se fait selon un ajout unique d‘une grande quantité de
nutriments et/ou bioémulsifiants juste après le déversement de pétrole. Cette méthode soulève
deux problèmes. Tout d‘abord, par notre manque de connaissance sur les doses de nutriments
à appliquer, un tel ajout pourrait dans certain cas induire le développement excessif du
245 Chapitre 6 : Discussions générales et perspectives
phytoplancton et conduire à une eutrophisation du milieu. D‘autre part, il est probable que la
biostimulation profite aux bactéries initialement sélectionnées par les hydrocarbures, que les
sels nutritifs s‘épuisent rapidement et que finalement la biostimulation n‘ait qu‘un effet
temporaire et ne favorise la biodégradation que des composés les plus facilement dégradables.
Il serait donc intéressant de tester les effets de la biostimulation par ajouts successifs de
quantités de nutriments adaptées aux besoins de la communauté bactérienne
hydrocarbonoclaste. Comme cela a été fait dans l‘expérience en mésocosmes présentée dans
le chapitre 4, il s‘agirait de doser à intervalle réguliers les quantités d‘azote et de phosphore
contenues dans le milieu et d‘ajuster leurs concentrations à des niveaux optimaux.
3. Quel est l‘impact du « top-down » sur la biodégradation des hydrocarbures et sa
relation avec le contrôle de type « bottom-up » ?
Une des originalités de ce travail de thèse a été d‘étudier l‘impact des facteurs de type
« top-down » sur les communautés bactériennes marines impliquées dans la dégradation des
hydrocarbures, une question très peu abordée dans la littérature. Notre étude a révélé que la
prédation par les protozoaires et la lyse virale jouaient un rôle important dans la structuration,
l‘abondance et l‘activité des communautés bactériennes impactées par le pétrole. Dans nos
conditions, les virus étaient largement responsables de cet effet « top-down », suggérant qu‘ils
étaient davantage capables de résister aux effets toxiques du pétrole que les protozoaires. Un
tel effet des virus sur les bactéries aurait pu être un frein à la biodégradation des
hydrocarbures. Au contraire, les virus se sont révélés être à l‘origine d‘un renouvellement
dans la communauté bactérienne et d‘une stimulation de son activité. Cela a permis une
dégradation constante des hydrocarbures indépendamment des variations importantes
d‘abondance bactérienne. Ce premier résultat devra être répété par d‘autres études similaires.
Dans notre expérience, compte tenu du manque d‘informations sur le sujet, nous avions
choisi d‘évaluer l‘effet du « top-down » seul, sans interférence avec les autres paramètres sur
les bactéries de manière à le caractériser plus facilement. Toutefois, dans l‘environnement, les
communautés bactériennes sont influencées par une multitude de paramètres qui agissent tour
à tour ou simultanément et la prédation par les protozoaires ou la lyse virale font partie
intégrante de ce jeu de facteurs environnementaux (voir chapitre 1). Dans les stratégies de
bioremédiation, ces facteurs ne peuvent pas être considérés séparément. Une des principales
interactions à appréhender serait d‘évaluer la part relative du contrôle des communautés
bactériennes par le « top-down » et le « bottom-up ». En effet, dans la mesure où les virus
sont capables de diminuer drastiquement l‘abondance bactérienne, induire des
bouleversements dans la structure des communautés et stimuler l‘activité des bactéries, la
réussite des essais de biostimulation pourrait largement dépendre de ce paramètre. Quelques
éléments de réponse ont été apportés dans l‘étude en microcosme présentée dans le chapitre 3.
Dans cette étude, la biostimulation a d‘abord permis une meilleure dégradation des
hydrocarbures par rapport à la condition sans ajouts d‘agents stimulants. Ensuite, bien que les
protozoaires aient limité l‘abondance bactérienne, aucun changement de structure de
communauté dans les microcosmes enrichis en sels nutritifs ou bioémulsifiant n‘a pu être
attribué à la prédation. Par contre, une légère baisse dans la dégradation des hydrocarbures a
été relevée lorsque l‘abondance des prédateurs était maximale, révélant l‘impact
potentiellement négatif du « top-down » dans les essais de biostimulation.
Pour évaluer concrètement quel est l‘effet de la prédation et de la lyse virale dans
l‘efficacité de la biostimulation sur la dégradation des hydrocarbures il faudrait mettre en
place une expérience en condition contrôlée en testant différentes combinaisons de conditions
par élimination des protozoaires et virus (utilisation de sacs à dialyse permettant d‘éliminer
tour à tour les microorganismes indésirables selon un système de filtration différenciel) et
ajout de sels nutritifs ou d‘autres molécules biostimulantes. Voici une combinaison qui
pourrait être réalisée sur des microcosmes de volume moyen (environ 50L). L‘expérience
consisterait à comparer des conditions avec l‘effet du « top-down » seul, l‘effet du « bottom-
up » seul, les deux ou aucun, avec ou sans pétrole (Tableau 11).
Microcosmes contrôles Microcosmes pollués par le pétrole Témoin abiotique
Eau de mer pré-filtrée sur 10µm Oui Oui Oui mais stérile
Pétrole Non Oui
Protozoaires et virus Non Oui Non Oui Non Oui Non Oui Stérile
Sels nutritifs ou bioémulsifiant Non Non Oui Oui Non Non Oui Oui Stérile
Tableau 11 : Conditions proposées pour la mise en place d’une expérience visant à tester l’impact du
« top-down » sur l’efficacité des approches de biostimulation.
Le protocole général serait du même type que celui qui a été mis en place dans l‘expérience
du chapitre 4 (mésocosmes). Il s‘agirait de suivre l‘évolution de l‘abondance bactérienne au
cours de l‘incubation, les changements de structure de communauté au moins, la diversité
bactérienne par pyroséquençage, éventuellement l‘activité bactérienne par mesure de
production bactérienne, et surtout doser les hydrocarbures pour suivre la biodégradation en
relation avec le dynamisme des différents compartiments microbiens. De cette façon, il serait
247 Chapitre 6 : Discussions générales et perspectives
possible de savoir si l‘efficacité de la biostimulation dépend en partie des effets du « top-
down » sur les bactéries, encore une fois dans le but de comprendre et d‘améliorer les
stratégies de bioremédiation. Des analyses multivariées directes permettraient de valider
statistiquement les hypothèses proposées dans ce type d‘étude, en appliquant la notion de
partition de la variance des analyses canoniques de correspondance (CCA variation
partitioning) pour les facteurs « bottom-up » et « top-down ».
4. Comment caractériser les assemblages microbiens impliqués dans la dégradation du
pétrole ?
Comme alternative à la culture, nous avons vu qu‘il était possible de réaliser des
expériences de Stable Isotope Probing couplées aux nouvelles méthodes de séquençage pour
identifier les bactéries hydrocarbonoclastes marines. L‘adaptation de cette technique au milieu
liquide, telle qu‘elle a été présentée dans le chapitre 5 ouvre la porte à de nombreuses
applications.
Nous avons par exemple souligné la pertinence de la prise en compte du contrôle de type
« top-down » tout au long de ce manuscrit. Le DNA-SIP pourrait être un outil extrêmement
utile dans cette recherche. Comme cela a été fait avec des cyanobactéries (Frias-Lopez et al.
2008), il serait possible d‘incuber de l‘eau de mer contenant bactéries, protozoaires et virus
avec un hydrocarbure marqué au carbone 13. Les bactéries incorporeraient l‘isotope stable,
les protozoaires et les virus se « nourriraient » de ces bactéries marquées et seraient à leur tour
enrichis en 13
C. L‘analyse simultanée de la diversité bactérienne (gène de l‘ARNr 16S), de
celle des protozoaires (gène de l‘ARNr 18S) et de celle des virus (gènes de polymérases)
révélerait à la fois la diversité des bactéries hydrocarbonoclastes (spécifiques du substrat
utilisé) mais aussi l‘identité des prédateurs de ces bactéries. Par comparaison avec les
protozoaires et virus non marqués, il serait possible de savoir si les prédateurs sont
spécifiques de leur proie ou non.
Une deuxième application possible serait la recherche de bio-indicateurs de pollution
pétrolière en utilisant un jeu d‘amorces spécifiques des bactéries retrouvées dans la fraction
enrichie en 13
C. Le DNA-SIP donne accès à un grand nombre de séquences de bactéries
hydrocarbonoclastes en une seule analyse. Or la création d‘amorces spécifiques se heurte
toujours au problème de limitation en séquences disponibles. Même en prenant les séquences
des bactéries hydrocarbonoclastes cultivables et des séquences environnementales provenant
de milieux pollués, le nombre de séquences reste limité, comme on l‘a vu dans l‘emploi de la
q-PCR dans l‘étude in situ (chapitre 2). Se pose alors le problème de la trop grande spécificité
des amorces dessinées ou alors de leur manque de spécificité en raison de la difficulté à
identifier les bactéries hydrocarbonoclastes dans l‘environnement. Le DNA-SIP couplé au
pyroséquençage pourrait fournir rapidement un nombre très important de séquences
spécifiques de la fonction ciblée. La création d‘amorces en serait alors grandement facilitée. Il
faudrait tester des amorces ciblant une région du gène de l‘ARNr 16S propre à certaines
bactéries hydrocarbonoclastes, sans garantie que cela puisse fonctionner, ou des amorces
spécifiques de gènes de dégradation des hydrocarbures, approches qui auraient certainement
plus de succès.
Enfin, une perspective particulièrement prometteuse consisterait à coupler le DNA-SIP à la
métagénomique pour l‘étude des communautés bactériennes hydrocarbonoclastes. La
métagénomique a déjà révélé l‘immense diversité génétique des communautés microbiennes
complexes en milieu marin (Venter et al. 2004). Néanmoins, avec l‘approche de séquençage
à haut débit (« shotgun »), il n‘est pas toujours possible de relier les gènes aux
microorganismes identifiés taxonomiquement en raison de la complexité des assemblages et
le manque de génomes existants comme base pour l‘assemblage des contigs. Dans une
expérience de DNA-SIP, les métagénomes enrichis en isotope lourd seraient présélectionnés
pour une fonction particulière. Ainsi les gènes d‘intérêt pourraient être récupérés à partir de
bibliothèques métagénomiques réduites, ce qui augmenterait considérablement la possibilité
de relier l‘information génétique à des espèces microbiennes distinctes. Une telle approche a
déjà été tentée avec succès pour l‘étude des bactéries dégradant les PCB (Sul et al. 2009). Les
auteurs ont réussi à construire une banque de 1568 cosmides à partir de la fraction ADN
enrichie en 13
C. Cette banque a permis de découvrir des gènes fonctionnels provenant de
microorganismes capables de métaboliser les PCB non cultivés à ce jour. Le couplage des
approches de métagénomique avec la méthode du DNA-SIP permettrait d‘accéder à une
meilleure caractérisation des bactéries hydrocarbonoclastes au sein des communautés
naturelles et de découvrir de nouvelles voies métaboliques pour la dégradation des
hydrocarbures.
249 GLOSSAIRE
GLOSSAIRE
Allochtone : Se dit d‘une ressource qui provient de l‘extérieur du milieu étudié.
Bioaugmentation : addition de microorganismes dans des sites pollués pour favoriser
l‘élimination des composés toxiques.
Biodégradation : dégradation partielle ou totale d‘une molécule sous l‘action
biologique d‘organismes tels que les bactéries.
Bioremédiation : Utilisation d‘organismes comme les plantes ou les bactéries pour
faciliter l‘élimination des substances toxiques dans les environnements pollués.
Biostimulation : addition de sels nutritifs ou agents capable de stimuler l‘activité
bactérienne dans des sites pollués pour favoriser l‘élimination des composés toxiques.
Chao 1 : Test statistique non-paramétrique qui permet d‘obtenir la richesse en espèces
d‘un environnement.
Diversité : Distribution des individus ou biomasses selon des espèces définies à un
moment donné, dans un écosystème donné.
Dynamique de communauté : Variations de taille et de composition des
communautés qui résulte de l‘effet de plusieurs forces (comme les changements de
climat, les ressources en sels nutritifs, la prédation, etc…) capables de contrôler et
réguler les communautés durablement.
Ecotoxicologie : branche de la toxicologie qui étudie les effets toxiques provoqués par
les substances naturelles ou les polluants d‘origine synthétique sur les constituants des
écosystèmes animaux, y compris l‘homme, végétaux et micro-organismes, dans un
contexte intégré (Truhaut, 1977).
Equitabilité (Eveness) : composante de la diversité qui considère la distribution des
espèces dans un échantillon.
Hydrocarbonoclaste : adjectif faisant référence à certains organismes tels que les
bactéries pouvant dégrader les hydrocarbures.
Hydrocarbures : Composés organiques comprenant uniquement des atomes
d‘hydrogène et de carbone.
Kérogène : substance intermédiaire entre la matière organique et
les combustibles fossiles ; à ne pas confondre avec le Kérosène qui est un mélange
d'hydrocarbures contenant des alcanes de formule chimique allant de 10 à 14 atomes
de carbone et issu du raffinage du pétrole.
Microcosme/mésocosme : Système d‘incubation en laboratoire plus ou moins
complexe, construit pour simuler les conditions environnementales.
Minéralisation : transformation des composés organiques en formes inorganiques
(minéraux), le plus souvent sous forme de dioxyde de carbone, ammoniac et acide
phosphorique.
Operational Taxonomic Unit (OTU) : désigne des taxa partageant des caractères
(morphologiques, génétique,…) communs.
Pétrole : huile naturelle, généralement de densité inférieure à 1, composée de milliers
de composés essentiellement de type hydrocarbures. Sa provenance et son degré de
raffinage déterminent sa composition, sa couleur (du noir goudronneux au transparent)
et son utilisation.
Pollution : dégradation de l‘environnement par des substances naturelles, chimiques
ou radioactives, des déchets, ou des nuisances diverses (biologiques, lumineuses,
thermiques, sonores, etc.). Bien qu‘elle puisse avoir une origine entièrement naturelle
(éruption volcanique, par exemple), elle est principalement liée aux activités
humaines.
Prédation : mode de nutrition qui consiste à s‘emparer d‘une proie animale ou
végétale pour l‘ingérer et se nourrir de sa substance.
Phénanthrène : hydrocarbure aromatique polycyclique composé de trois cycles
benzéniques, relativement soluble dans l‘eau et biodégradable, que l‘on trouve dans le
pétrole brut. Le phénanthrène peut prendre plusieurs formes selon son degré de
substitution par des groupes alkyles.
Polluant : substance en quantité anormale dans l‘environnement, la plus part du temps
issue de l‘activité humaine, à l‘origine de la dégradation de l‘air, de l‘eau ou de la
terre, généralement toxique pour la faune et/ou la flore.
Richesse : composante de la diversité qui considère le nombre total d‘espèces
présentes dans un échantillon.
Surfactant : Agent tensio-actif permettant de réduire la tension de surface entre deux
liquides comme par exemple un émulsifiant favorisant le mélange pétrole-eau.
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283 ANNEXE
ANNEXE
Activité d’enseignement
2009 et 2010 : Participation à des enseignements du MASTER des sciences et technologies de
l‘UPMC.
Unité d‘enseignement FLUMECO : Fonctionnement des écosystèmes côtiers Méditerranéens
(Master 2, spécialité OEM) proposé à l‘Observatoire Océanographique de Banyuls.
6h de conférence, 60h de TP/TD sur le thème de l‘impact des hydrocarbures pétroliers sur les
communautés bactériennes marines.
Missions scientifiques
1. JEST: 15 jours : Lagune de Terminos (Mexique)
Projet: Joint Environmental Study of Terminos lagoon: Cycles hydro-biogéochimiques,
transferts et impacts écotoxicologiques
Responsable du projet: Christian GRENZ, CNRS, IRD, Mexico
2. IBISCUS: 2 fois 15 jours: Baie de Marseille (France)
Projet : Indicateurs biologiques et chimiques de contaminations urbaines en milieu marin.
Responsable du projet : Madeleine GOUTX, CNRS, Marseille
3. CASCADE: 3 semaines sur le N/O Atalante : Golfe du Lion (France)
Projet: Cascading, Storm, Convection, Advection, and Down-welling Events
Responsable du projet : Xavier Durrieu de Madron, CNRS-UPVD, Perpignan
Communications scientifiques, congrès et séminaires
1. Congrès de l‘Association francophone d‘écologie microbienne (AFEM). Lyon,
France, 2009.
Poster : Influence de la récurrence des pollutions sur la réponse des communautés
bactériennes et nanoeucaryotes marines au pétrole et à la biostimulation.
2. Doctoriales organisées par l‘UPMC en partenariat avec le CEA. Gig-sur-Yvette,
France, 2009.
Les Doctoriales consistent à découvrir par la pratique les enjeux de l‘innovation et de la
création d‘entreprise. Durant 5 jours en séminaire résidentiel, 60 doctorants de tout horizon
disciplinaire, répartis en groupes, développent une « idée innovante » en la transformant en un
projet de création d‘entreprise. À la fin du séminaire, chaque groupe présente son projet
devant un jury de professionnels de l‘innovation et de l‘entreprise.
3. Congrès Biomicroworld. Lisbonne, Portugal, 2009.
Communication orale: Influence of predation by flagellates on the bacterial response to crude
oil input in unpolluted oligotrophic and chronically oil-polluted mesotrophic Mediterranean
sites.
4. Rencontres exobiologiques pour doctorants (RED‘10). Teich, France, 2010.
Ces rencontres s'adressent à tout étudiant français ou francophone préparant une thèse en
Sciences de la Terre et de l'Univers, Sciences Chimiques, Sciences de la Vie, Bioinformatique
ou Épistemologie, et désirant acquérir une formation interdisciplinaire en exobiologie afin de
compléter sa formation initiale et de pouvoir aborder les questions touchant aux origines de la
vie sur Terre, à son évolution et à sa distribution dans l‘Univers.
5. Congrès FEMS microbiology. Genève, Suisse, 2011.
Poster: Underestimated role of flagellates and viruses predation (top-down control) on oil-
degrading bacterial communities under biostimulation conditions
285 ANNEXE
Poster AFEM (2009)
Poster FEMS (2011)
287 ANNEXE
Titre : Ecologie des communautés bactériennes marines soumises à une pollution pétrolière:
influence des facteurs environnementaux, de la prédation et de la récurrence des pollutions.
Résumé : Les catastrophes pétrolières, comme celle survenue récemment dans le Golfe du
Mexique, marquent invariablement l‘attention du public. Malgré les réglementations
gouvernementales instaurées à la suite de ces accidents, plusieurs centaines de millions de tonnes
de pétrole continuent d‘être déversées chaque année dans les Océans de manière volontaire ou
accidentelle, présentant des risques majeurs pour la santé humaine et l‘environnement. Parmi les
méthodes employées pour la remédiation des hydrocarbures, la biostimulation des bactéries
hydrocarbonoclastes par ajout de nutriments est une approche privilégiée. La réussite de cette
méthode nécessite une connaissance la plus complète possible des microorganismes en jeu et des
facteurs environnementaux qui les influencent. Dans ces travaux de thèse, nous avons tout
d‘abord évalué in situ l‘importance relative du pétrole parmi d‘autres facteurs physico-chimiques
sur la structuration des communautés bactériennes totales et actives ainsi que sur l‘abondance des
bactéries hydrocarbonoclastes en milieu portuaire chroniquement soumis à des pollutions
pétrolières. Dans un second temps, une étude en conditions contrôlées simulant une pollution
accidentelle nous a permis de démontrer que les caractéristiques d‘un site, précédemment soumis
ou non à une pollution chronique, ont une influence directe sur la cinétique de réponse des
communautés bactériennes et leur capacité à dégrader un pétrole complexe en condition de
biostimulation. Une attention particulière a également été portée sur l‘effet des facteurs de
régulation des communautés bactériennes de type « top-down » (prédation par les protozoaires et
lyse virale) sur la biodégradation des hydrocarbures, révélant notamment un rôle prépondérant des
virus dans le contrôle des communautés bactériennes impactées par le pétrole. Enfin, l‘adaptation
au milieu marin d‘une méthode récente de marquage des ADN par isotopes stables (DNA-Stable
Isotope Probing) couplée au pyroséquençage nous a permis de décrire précisément la diversité des
bactéries associées à la dégradation du phénanthrène, révélant la dominance de Cycloclasticus sp.
dans les sites étudiés.
Mots clés : Diversité bactérienne, pétrole, biostimulation, prédation, lyse virale, DNA-SIP
Title: Ecology of oil-impacted marine bacterial communities: influence of environmental factors, predation and recurrence of oil pollution.
Abstract: Oil spills such as the recent disaster in the Gulf of Mexico are always dramatic for the
public opinion. Despite governmental rules, hundreds of millions tons of petroleum enter
voluntary or accidentally the oceans every year, causing major risks for human safety and
environment. Among the techniques available for the remediation of the pollution, biostimulation
of hydrocarbonoclastic bacteria by nutrient addition is a privileged approach. The success of this
method requires a complete knowledge of the microorganisms involved and of the environmental
factors controlling them. In the present work, we first evaluated in situ the relative importance of
petroleum among other physico-chemical parameters in the total and active bacterial community
structure and on the abundance of hydrocarbonoclastic bacteria in chronically polluted coastal
seawaters. Second, we simulated an oil spill under controlled laboratory condition revealing that
the recurrence of oil pollution had an effect on the kinetic of bacterial response to the oil input and
on the biodegradation processes under biostimulation conditions. A particular attention was paid
on the ―top-down‖ effect (protozoan predation and viral lysis) on hydrocarbon biodegradation,
revealing the dominance of viruses in the control of oil impacted bacterial communities. Finally,
the adaptation of the DNA-Stable Isotope Probing method for marine systems coupled with
massive parallel pyrosequencing allowed us to describe precisely the bacterial diversity associated
with phenanthrene biodegradation, revealing the prevalence of Cycloclasticus sp. in our studied
sites.
Keywords: Bacterial diversity, petroleum, biostimulation, predation, viral lysis, DNA-SIP