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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyNFCEyN--INTIINTI

Materia de Especialización CEBI_E11

RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE MACROMOLÉCULAS

Docente a cargo: Mariano GRASSELLI

CEBI_E11_8 : CII y CAf

Métodos adsortivos

• Capacidad concentradora

• Capacidad de muestra ilimitada (teórico)

• Elución modificable por la composición del

buffer

• Volumen de separación ilimitado (teórico)

Cromatografía de intercambio ionico, afinidad, pseudo afinidad, hidrofobica, etc.

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Los parámetros importantes en una separación cromatográfica

• El tipo y calidad de la matriz

cromatográfica

• El buffer

• El volumen de muestra

• Las dimensiones de la columna

Cromatografía de Intercambio Iónico (CII)

• Es la técnica cromatográfica más usada

industrialmente

• Tiene alto poder de resolución

• Tiene alta capacidad de adsorción de muestra

• Separa las biomoléculas en base a su carga neta.

• las macromoléculas biológicas, como ser las

proteínas, poseen muchas cargas (+) y (-) debido a

las cadenas laterales de aminoácidos (aa)

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Equilibradoy siembra

Absorción Elución

1) Tipo de intercambiador según su carga

2) Tamaño de poro interno

3) Tamaño de partículas

4) Capacidad

Características del intercambiador iónico

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Grupos funcionales mas comunes

De cargas positivas:

Intercambiador de aniones (o Intercambiador catiónico)

• Aminas cuaternarias (R3N+-) que tienen un pK>14

• Aminos secundarias/aminas terciariaspK entre 8 y 11


De cargas negativas: Intercambiador de cationes (o Intercambiador aniónico)

•Sulfónico (-SO3-) tienen pK<1

•Acidos débiles (ej. Ac. Carboxílico) pK entre 4 y 6


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Grupo funcional pK característica descripción

Grupo TMAE >13 Básico fuerte Trimetil amonioetil-

Grupo DEAE 11 Básico débil Dietilamino etil-

Grupo DAME 8-9 Básico debil Dimetilamino etil-

Grupo COOH 4,5 Acido débil carboxi

Grupo SO3 <1 Ácido fuerte sulfonico

Grupo SE <1 Ácido fuerte Sulfoetil-

Otros grupos funcionales


Características de los Intercambiadores débiles

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Xerogeles (dextrano y celulosa), son mecánicamente frágiles.

Tamaño de poro interno


www.pall.comBiosepra matrices cerámicas con hidrogeles

www.gelifesciences.comSepharosa mayor proveedor de matrices cromatogr

www.biaseparations.comColumnas monolíticas

Proveedores matrices industriales

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Tamaño de partículas

• Elegir las matrices de mayor tamaño

mientras no afecte la resolución

(especialmente p/ columnas industriales)

• Importante para operaciones en batch


Tamaño de partícula vs Resolución

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Capacidad iónica nominalNúmero de mEq de una sustancia (generalmente un ion pequeño) que pueden unirse por gramo o ml de matriz. Está relacionada al número total de cargas que porta la matriz y se obtiene por titulación de la misma.

Capacidad máxima estática (Qmax)Cantidad real de proteína de interés que puede unir 1 gramo ó 1 ml de intercambiador en condiciones de equilibrio.

Se determina a través de la isoterma de Langmuir.


Características de las proteínaspropiedades de los aminoácidos que la constituyen

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Durante la aplicación de la muestra es MUY IMPORTANTE que:

– la matriz cromatográfica

– la macromolécula

contengan un exceso de cargas(las proteínas por lo menos +/- 1 unidad respecto del pI ).

Un exceso de concentración de sales causa el apantallamiento de las cargas superficiales

– baja fuerza iónica Menor de 50 mM de concentración de sales

y/o la conductividad no sea mayor de 5 mS/cm (miliSiemmens/cm).

Hay 2 factores que afectan la absorción de las macromolmacromolééculasculas a un intercambiador iónico:

• Son moléculas aniónicas o catiónicas multivalentes por tener una secuencia específica de aa y un plegamiento determinado.

• En general tienen grupos ácidos o bases débiles => cambian de carga con el pH

Como caracterizarlas?

Punto IsoeléctricoΣΣΣΣ q+ = ΣΣΣΣ q-

pH donde la proteína tendrá la carga neta cero

Características de las proteínas

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COO-

NH3+

pH > pI => defecto de protonesCOO-

NH2

pH < pI => exceso de protonesCOOH

NH3+


+

_

Carga neta de la proteína

4 5 6 7 8 9 pH

Curva de titulación de una proteína


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Enfocado

Cátodo (-)

3 pH 10

Ánodo (+)

Ánodo (+)

Cátodo (-)

Ánodo (+)

Cátodo (-)

Siembra de la muestra

Electroforesis

Isoelectroenfoque de una muestra compleja=> se pueden obtener varias curvas simultáneamente

Isoelectroenfoque

Puntos Isoelectricos de promedio del total de proteínas para diferentes reinos


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Se describe con una isoterma de adsorción

Interacción Proteína-MatrizIsotermas de adsorción

y = cc en equilibrioq =capacidad adsorción

+++ +

+++

+++

+ ++

+++ +

+++

+++

+ ++

-- +++ +

+++

+++

+ ++

+++ +

+++

+++

+ ++--

--

-- ----------

-------- ----

Isoterma de Langmuir

Fue desarrollada para explicar la adsorción de

N2 a un sólido

q = Q max . y

Kd + y

1/q = (Kd / Q max .y) + (1/Q max)

Pendiente= Kd / Qmax

Ordenada= 1/Qmax

Qmax = capacidad máxima estática

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Parámetros de la isoterma de Langmuir

Kd

Qmax

Qmax

Valores estándar en CII

• Qmax

– Entre 10 y 100 mg de proteína / ml matriz

• Kd

– Entre 0.1 y 1 mg de proteína / ml muestra

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En cuanto a la técnica usada para poner en contacto el intercambiador con la muestra, puede ser de 2 tipos:

Batch- Menores requerimientos de equipamiento

- Dificil de estandarizar y reproducir

- Pérdida de matriz cromatográfica

Columna- Resistencia mecánica de las matrices

- Problemas con la viscosidad

- Mejores condiciones sanitarias

Modo de trabajo

• Es el modo mas utilizado para purificar

grandes cantidades de proteína

• Permite obtener el mejor nivel de

pureza con mas eficiencia y mejor

probabilidad de daño a la muestra

• Es el método estándar en la industria

Farma

Cromatografía en columna

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• Realizada a presión atmosférica o baja presión

(0-5 atm sobre presión)

• Realizada a alta presión (HPLC, 500-2000 psi o 30-130 atm)

Cromatografía en columna

ÄKTA

Etapas de una cromatografía adsorptiva

Equilibrado

Adsorción

Lavado

Elución

Regeneración

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Condiciones estándares para evaluación de una CII en columna

1. Preequilibrado con 3 VC (1M buffer)

2. Equilibrado con 3 VC (50 mM buffer)

3. Carga de muestra

4. Lavado con 4 VC

5. Elución con gradiente en 10-20 VC

6. Limpieza con 2 VC de 0.1 M NaOH

7. Limpieza con 4 VC de 1 M NaOH

• Debilitar la interacción electrostática

– Aumento de la fuerza iónica• Apantallamiento

– Típicamente hasta 0,5 ó 1 M

– Cambio de pH• Elimina la carga de

– La proteína

– La matriz cromatográfica (solo en los casos de intercambiadores débiles)

Formas de elución

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Gradiente continuola composición del eluyente (pH, fuerza iónica, o ambos) va variando continuamente durante el proceso de elución.

Se requieren entre 10 a 20 VC para una buena separación.

Gradiente en etapasSe eluye con soluciones de distinta fuerza iónica, pH ó ambos en forma secuencial.

Con 3-5 VC se eluye todo el pico desorbido

Formas de elución

Método de selección rápida de condiciones

Selección de pH

Selección de Molaridad

Determinación de la capacidad

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• El ligando debe estar disponible comercialmente (y ser económico)

• El ligando debe poder ser inmovilizado a una matriz cromatográfica y conservar la afinidad

• La fuerza de unión debe ser moderada

• KD ideal : 10-5 y 10-8 M (0,5 g/L a 5 mg/L para proteína de 50 kDa)

Cromatografía de afinidad

Interacción específica

Proceso cromatográfico de afinidad

Ligando Proteína

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Cromatografía de afinidad

• Purificar sustancias de mezclas complejas

• Separación de formas nativa y desnaturalizada

• Remover pequeñas cantidades de proteínas de una gran cantidad de contaminantes

Brazo espaciador

Impedimento estérico:

Crítico en sistemas de afinidad

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Elución en sistemas de afinidad

Caso Ideal: no hay modificación de la estructura de la dupla (solo pérdida de la afinidad)

Cambio de conformación del ligando y/o producto (temporaria)

Desplazamiento con análogo del producto

Desplazamiento con análogo del ligando

Clasificación de las cromatografías de pseudo-afinidad

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Proteinas con una o poly-Histidinas superficialesIDA-cobre

kinasas, ciclasas and fosfatasas reguladas por Calmodulina

Calmodulina

region Fc de las immunoglobulinasProteina A

Factores de crecimiento, citokinas, factores de la coagulación

Heparina

Albumina, PrealbuminaCibacron Blue Dye

Proteasas como protrombina, kalikreina, clostripainaArginina

Enzimas con NAD cofactor y kinases ATP dependiente

AMP

EspecificidadLigando

Problemas con ligandos naturales

• Deben ser purificados

• Pueden tener contaminantes (ADN, virus...)

• Variabilidad entre lotes

• Químicamente lábiles

• Baja capacidad de adsorción

• Ciclo de vida limitado (por CIP y esterilización)

• Costo elevado

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Inmovilización de heparina

Purificación de Antitrombina III con Heparin-Sepharose

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Proceso industrial con Heparin-Sepharose

Proceso industrial con Heparin-Sepharose

Análisis

•Cantidad de proteína inicial

•Cantidad de proteína recup

•% de proteína recuperada

•Capacidad max de la matriz

1200 L * 50 g/L = 60.000 g

400 g

400 g / 60.000 g % < 1%

400 g / 0,85 / 113 L = 4,2 g/L

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Ligandos para Inmunoglobulinas

Proteínas (recombinantes) bacterianas obtenidas de Streptococcus (G) y Staphylococcus (A) con capacidad de unión especifica del fragmento Fc de las IgGs.Ambas proteínas fueron modificadas para aumentarles la estabilidad química, a proteasas y eliminar sitios de unión a albúmina (proteína G).

Species Affinity for Protein A* Affinity for Protein G Human + + + + + + + +

Rabbit + + + + + + +

Guinea Pig + + + + + +

Pig + + + + + +

Horse + + + + + +

Cow + + + + + +

Mouse + + + + +

Hamster + + +

Sheep ± + +

Rat ± + +

Goat – + + +

Chicken – ±

Dog + + + +

Cat + –

Monkey + + + + + + +

Comparación en la adsorción de IgG policlonal

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Lectinas

Proteínas con capacidad de reaccionar reversiblemente con glúcidos

Eluyen por gradiente salino o sustancia competitiva

(ej α-D-metilglucosido)

Con A (Concanavalina A) tetramerica-metaloproteina

especificidad por α-D-manopiranosidos, α-D-glucopiranosidos y azucares

relacionados (requiere hidroxilos en C-3, C-4 y C-5)

Lectina Lentil

especificidad por α-D-manosa, α-D-glucosa

(soporta 1% DOC)

Lectina de Germen de trigo

especificidad por N-acetil-glucosamina

Lectina de Helix pomatia

especificidad por α-D-N-acetil-glucosamina (para separación de Linfocitos

T)

Lisina

Purificación industrial de plasminógeno

Eluyente

El ácido ε-amino caproico es un potente inhibidor de la activación del plasminógeno en plasmina

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Benzamidina

• Inhibidor sintético de proteasas• Ligando de afinidad para Tripsina y serino-proteasas tipo tripsina (urokinasa, prekalikreina)• También para hacer cromatogr negativa (remover proteasas)

Cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC)

IDA

NTA

Interacción con Cu2+

Interacción con Ni2+

Más conocido y utilizado => interacción con imidazol

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Diferentes tipos de quelantes

Selectividad del IMAC

• El ión metálicoCu2+, Ni2+,Zn2+, Co2+ tienen preferencias por complejos con N

Al3+, Ca2+, Fe3+, Yb3+ tienen preferencias por complejos con O (carboxilatos y fosfatos)

• La estructura química del quelante

• El brazo espaciador

• La densidad de ligando

• La concentración salina del buffer

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Elución

Interferir con la formación del complejo ternario

de manera específica y/o inespecíficamente.

• Agregando un ligando competidor

Ej. Imidazol en el caso de His

• Agregando quelantes de iones de mayor

afinidad

Ej. EDTA

• Modificando el pH

Ej. protonación del N del imidazol de la His

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Sistema de expresión His-tag

Sistema de expresión His-tag

Elución específica Elución inespecífica

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Ventajas del sistema

• La cromatografía se puede realizar en presencia de cloruro de guanidinio-urea (renaturalizacion in situ)

• Algunas proteínas tienen una afinidad excepcional por el ligando y permiten purificar anticuerpos contra ellas.

• Se pueden utilizar detergentes en caso de trabajar con proteínas de membrana

• Se puede utilizar hasta 60% isopropanol como solvente (elimina fácilmente las endotoxinas)

Desventajas

• Perdida del ión de la columna (por una mayor afinidad por la proteína)

• El Cu2+ es un potente catalizador de la oxidación.

• No se pueden usar agentes reductores con IMAC-Cu2+.

• No se puede usar buffer con EDTA

• el Ni2+ es cancerígeno y puede quedar atrapado en el core de las proteínas.

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Secuencia péptido FLAG

Estable a proteasas de E. ColiTyr en 2 entre aa cargados aumenta la probabilidad de antigenicidadElución calcio dependiente (anti-Flag M1), disminución pH o péptido

Eliminación del péptido señal• Enterokinasa se consigue recombinante• Alta actividad/amplio rango de pH/alta especificidad/soporta desnat y detergentes

Colorantes triazínicos como ligandos

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Características

• Entre 50 y 100 colorantes reactivos

• Muy económicos y en cantidad

• Poco purificados

Matrices comerciales

• Blue sepharose

• Red sepharose

Efecto de la fuerza iónica en la adsorciónFluidos biológicos

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Ligando simil Kalikreina

Motivo Phe-132:Tyr-133 de Prot A

refinado por bibliotecas combinatorias

Ligando de unión a Insulina

Ligando a glicoproteínas

Ligando para α1 antitripsina

Ligandos para IgG

Ligandos derivados de los colorantes

Cromatografía covalente

tiopiridina

Ligando alternativo p/ purificación de IgG

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Cromatografía con péptidos

• Una tecnología que promete gran desarrollo en un futuro cercano,

• Grandes perspectivas de uso industrial

• Péptidos de 5 a 8 aa pueden presentar una afinidad comparable a un anticuerpo monoclonal a una proteína de interés.

• El gran inconveniente esta en como encontrar el péptido adecuado (son muy flexibles).

Matrices reactivas

De elección para ligandos de alto PMDe elección para ligandos de bajo PM

Cianato ester

Epóxido

Vinil sulfona

Tresilo

Tiopiridina

Ester de NHS

Epóxido

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Inmovilización con Epóxidos

..

De elección para ligandos de bajo PM

Reactividad:tiol > amino > hidroxilo

HO+

Inmovilización con NHS

Ester reactivo

Ester activado con

N-hidroxi succinimida

De elección para ligandos de alto PM

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Inmovilización con aldehídos

Formación de una base de Schiff

Reactivo

muy tóxico

Reducción

Paso fundamental

para lograr la

estabilización

Inmovilización con carbodiimidasReacción de deshidratación

R-N=C=N-RR-N-C-N-R

H O H

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Cromatografía de inmunoafinidad

Efecto del pH y fuerza iónica

pH 2,6

pH 4,0

Concentración deBSA

0,01 mg/ml

Temp. 25 C

pH 7,6

Sepharose-IgG anti BSA

Condición de

adsorción

Condición de

elución

NaSCN

NaCl

Concentración deBSA

0,01 mg/ml

Temp. 25 C

SCN-

es + caotropico

Efecto del tipo de sal

Sepharose-IgG anti BSA

Cromatografía de inmunoafinidad

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