Caseina Relatorio UEM

UEM Isolamento e identificao da Casena 2015

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Chilengue, Srgio Toms Fernando M.C.Q.Alimentos

RESUMO

A solubilidade das protenas est na dependncia de vrios factores, entre os quais destaca-se a

presena de cargas elctricas em radicais de aminocidos das cadeias peptdicas. O processo de

isolamento e identificao da casena pelo mtodo de precipitao no ponto isoelctrico onde o pH

aproximadamente 4,6 e a 20C, bastante aplicvel em amostras de leite, usando como agente

precipitante cido actico a 10% e ter dietlico-etanol 1:1 para a remoo de gorduras presente na

amostra.

A presente aula laboratorial teve como objectivo principal o isolamento e identificao da casena

no leite fresco (ULTARMEL), onde inicialmente determinou- se a percentagem da casena presente

no leite fresco e por fim fez-se a anlise qumica da casena de forma a evidenciar os testes que

so positivos e negativos na protena.

A massa da casena presente na amostra cerca de 1.61g que corresponde a 3.23%, e o restante

faz parte de outras substncias presentes no leite.

Comparu-se o valor obtido experimentalmente com valor fornecido pela literatura, e fez-se a

devida concluso.


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NDICE

RESUMO ........................................................................................................................................ 1

1. INTRODUO ....................................................................................................................... 3

1.1. OBJECTIVOS...................................................................................................................... 7

1.1.1. Gerais ............................................................................................................................... 7

2. PARTE EXPERIMENTAL ..................................................................................................... 8

2.1. Materiais e equipamentos .................................................................................................... 8

3. PROCEDIMENTOS ................................................................................................................ 9

3.1. Isolamento e Identificao Da Casena ................................................................................ 9

3.2. Anlise qumica da casena .................................................................................................. 9

4. RESULTADOS E INTERPRETAO ................................................................................ 10

4.1. Isolamento e Identificao Da Casena .............................................................................. 10

Anlise qumica da casena ........................................................................................................... 11

5. CONCLUSO ....................................................................................................................... 14

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.......................................................................................... 15


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1. INTRODUO

O leite um alimento de elevado valor biolgico, podendo ser fonte de boa parte das necessidades

dirias de protenas, que tm papel fundamental no organismo humano. (Palma et. All.)

O leite de vacas contm aproximadamente 3,5% de protenas, das quais 2,9% representado pela

casena e 0,6% pelas protenas do soro do leite. Assim, as casenas representam cerca de 80% do

total de protenas do leite bovino, as protenas do soro representam de 15 a 20%, enquanto que as

protenas da membranas dos glbulos de gordura podem chegar prximo de 5% do total. (Filho et

all, 2009).

A casena um grupo de fosfoprotenas especficas do leite as quais se precipitam com acidificao

a pH 4,6 a 20C, enquanto o restante das protenas do leite que no sofrem precipitao so

chamadas colectivamente de protenas do soro, e so classificadas de acordo com a semelhana de

suas estruturas primrias (sequncia de aminocidos), nas seguintes famlias: -S1, -S2, e k-

casenas, representando aproximadamente 80% das protenas totais do leite.

Actualmente existem vrios mtodos de determinao de protenas, dentre quais destacam se os

mtodos espectrofotomtricos, mtodo de precipitao, mtodo de Biureto, mtodo de Kjeldahl e

mtodo por Biureto (analise por grupos).

Mtodo de Kjeldahl

O procedimento do mtodo baseia-se no aquecimento da amostra com cido sulfrico para

digesto at que o carbono e hidrognio sejam oxidados. O nitrognio da protena reduzido e

transformado em sulfato de amnia. Adiciona-se NaOH concentrado e aquece-se para a liberao

da amnia dentro de um volume conhecido de urna soluo de cido brico, formando borato de

amnia. O borato de amnia formado dosado com uma soluo cida (HCI) padronizada. Depois

titular o cido que no reagiu com a amnia, com uma soluo bsica padronizada (NaOH). As

suas vantagens so: boa reprodutibilidade e preciso, mtodo universal e pelo facto de determinar

quantidades muito pequenas. As desvantagens devem se pelo facto de no determinar apenas

protenas, determinando assim toda quantidade de nitrognio presente na amostra que pode ser de

aminocidos e outros componentes que possam ter nitrognio, tambm por ser um mtodo


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demorado (leva no mnimo 2h de operao), utiliza reagentes txicos e tambm pelo facto de usar

vrios graus de converso. (Vicenzi)

Este mtodo consiste em 3 etapas:

1. Digesto da amostra

2. Neutralizao e destilao

3. Titulao

Esquema 1: Reaces envolvidas nas etapas do mtodo de Kjeldahl

Precipitao pela acidificao

Precipitao pela acidificao com cido orgnico ou mineral ocorre a pH 4,6 (ponto Isoelctrico),

a 20C, seguido de centrifugao para a obteno da casena isoelctrica e de soro cido. A casena

isoelctrica poder ser transformada em caseinato pela ressolubilizao em solues de vrios

tipos de base e desidratada em spraydryer. (Sgarbieri, 2005)

Mtodo de biureto

Baseado na observao de que substncias contendo duas ou mais ligaes peptdicas formam um

complexo de cor roxa com sais de cobre em solues alcalinas.


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Este mtodo tem as seguintes vantagens: Ser bastante especfico por no apresentar problemas de

interferentes. simples, rpido e barato. Por envolver uma reao com a ligao peptdica, o

mtodo determina protena, ao contrrio do mtodo de Kjeldahl que determina N total.

Porm ele tem duas desvantagens que so: A necessidade de uma curva de calibrao tomada com

um padro conhecido de protena, por exemplo, uma protena determinada por Kjeldahl. A cor

formada no complexo no idntica para todas as protenas, porm os desvios causados so

menores do que em outros mtodos colorimtricos.

Esquema 2: Reaco de formao de Biureto

Esquema 3: Representao da interaco ligao peptdica e Cu2+

Testes para o reconhecimento de protenas

I. Teste da ninidrina

O teste da ninidrina um teste geralmente usado na identificao de aminocidos, podendo ser

usado de forma qualitativa, em geral para detectar a presena de aminocidos ou de uma forma

quantitativa. Esta reaco usada na deteco de aminocidos por ser caracterstica da funo


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amina primria. A ninidrina um poderoso agente oxidante que reage com - aminocidos, entre

pH 4 e 8, originando um composto prpura-violeta, que no apresenta sempre a mesma intensidade

de colorao. Os aminocidos prolina e hidroxiprolina so excepes pois apresentam colorao

amarela (Filho et all, 2009).

II. Teste de xantoprotena

um teste geralmente usado na identificao da tirosina e triptofano, ou protenas que contenham

estes aminocidos baseados na reaco de nitrao dos anis aromticos pelo cido ntrico

concentrado. Esta reaco caracterstica de grupos R benznicos. Sendo assim, os aminocidos

que possuem uma estrutura com anis aromticos formam derivados nitrosos com colorao

amarela quando sujeitos ao aquecimento com cido ntrico concentrado (Filho et all, 2009).


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1.1.OBJECTIVOS

1.1.1. Gerais

Determinar a quantidade da casena em percentagem por massa na amostra de leite fresco

ULTRAMEL.

1.1.2. Especficos

Isolar e identificar experimentalmente a casena na amostra de leite fresco ULTRAMEL.

Identificar a casena pela anlise qumica, usando vrios testes qumicos.


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2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1.Materiais e equipamentos

Para a determinao da casena, foram utilizado os materiais e equipamentos listados na tabela 1:

Tabela 1: Materiais, equipamento, reagentes e amostra analisada

Materiais

Vareta de vidro Balo de erlenmeyer de 150 mL. Esptula

Pina Papis de filtro (Whatman, 150mm , cat

1113150)

Tubos de ensaio

Equipamentos

Balana analtica (Denver Instrument, XL-610; Max= 610g, e

=0.01g)

Termmetro

Manta elctrica (electromantle, 300W, 50/60Hz, serie 10072015)

Reagentes

Albumina 2% Gelatina 2% Acido actico 10%

Leite fresco NaOH 10% ter dietilico-cetona 1:1

CuSO4 HNO3 (conc) Etanol 95%

Ninidrina Pb2+ como Pb(NO3)2 Leite fresco (Ultramel)

Hg2+ como HgCl2 Na+ como NaNO3


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3. PROCEDIMENTOS

3.1.Isolamento e Identificao Da Casena

1. Em um Erlenmeyer de 250 mL, introduziu-se 50g de leite fresco Ultramel 125 mL de gua

destilada, aqueceu-se o frasco em banho de gua e agitou-se a soluo com uma vareta de

vidro;

2. Quando a temperatura do banho alcanou 40c, valor lido com ajuda do termmetro,

removeu-se o frasco do banho e adicionou-se uma certa quantidade de cido actico 10%

agitando, necessrio para a formao do precipitado. Evitou-se o acrscimo de excesso de

cido actico, de modo a evitar a hidrlise da lactose que resultaria em galactose e glucose;

3. Filtrou-se o precipitado a vcuo e lavou-se com pequeno volume de gua. Em seguida

transferiu-se para um frasco vazio;

4. Adicionou-se 25mL de etanol 95% ao frasco, aps a agitao da mistura por 5 minutos,

deixou-se o precipitado em repouso e em seguida decantou-se o lquido, o qual contm as

gorduras e albuminas para um Bquer;

5. Ao resduo adicionou-se 25 mL da mistura de ter dietlico-etanol 1:1 e aps a agitao da

mistura resultante por 5 minutos, colectou-se o slido por filtrao a vcuo e transferiu-se

para um papel de filtro previamente pesado numa balana analtica, o qual deixou-se a

secar ao ar durante 2 dias. E depois pesou-se a casena seca

3.2.Anlise qumica da casena

a. Teste de Biureto

Colocou-se 15 gotas de cada uma das seguintes substncias em cinco tubos de ensaios limpos e

rotulados:

Gelatina 2%

Albumina 2%

Casena isolada (1- 100mg/mL H2O)


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Em cada um dos tubos adicionaram-se 5 gotas de NaOH 10% e 2 goras de soluo de CuSO4 com

agitao.

b. Teste de ies de metais pesados

Colocou-se 2 mL de leite em 3 tubos de ensaio rotulados. Adicionaram-se algumas gotas de cada

uma das solues dos seguintes ies, na seguinte ordem:

Pb2+ como Pb(NO3)2 no tubo 1.

Hg2+como HgCl2 no tubo 2.

Na+como NaNO3 no tubo 3.

c. Teste de xantoprotena

Colocou-se 15 gotas de cada uma das seguintes substncias em cinco tubos de ensaios limpos e

rotulados:

Gelatina 2%

Albumina 2%

Casena isolada (1- 100mg/mL H2O)

A cada um dos tubos, adicionaram-se 10 gotas de HNO3 concentrado com agitao. Aqueceu-se

os tubos em banho de gua quente.

4. RESULTADOS E INTERPRETAO

4.1.Isolamento e Identificao Da Casena

Clculo do teor da casena

Dados

Peso da amostra W1 = 50.09g


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Peso do papel de filtro vazio W2 = 3.70g

Peso do papel de filtro com a casena seca W3=5.32g

Frmula e resoluo

% =3 2

1 100

% =5,32 3,70

50,09100% = 3.23%

A partir do resultado obtido pode se considerar que em 50.09g da amostra de leite analisada,

existem 3.23% da casena e 97.77% de outros coinstituentes como carbohidratos, sais minerais

lpidos fibras e outros nutrientes. Tambm pode se constatar que em 50.09 gramas, cerca 1.61

gramas corresponde a casena e 48.39 gramas de outros nutrientes. De acordo com Nicolini, 2008,

a quantidade de casena no leite fresco deve ser de 3%, porm o valor obtido da casena (3.23%),

pode ser explicado pelo facto de ocorrido erro durante a pesagem da casena.

Anlise qumica da casena

1. Teste de biureto

Soluo testada Cor Observada Resultado

Gelatina Azul carregado Negativo

Albumina

Prpura-violeta Positivo

Casena isolada Azul Negativo


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2. Teste de ies de metais pesados

Soluo testada Observao Resultado

Pb(NO3)2 Formao do precipitado Positivo

HgCl2 Formao do precipitado Positivo

NaNO3 No formou precipitado Negativo

3. Teste de xantoprotena

Soluo testada Cor Observada Resultado

Gelatina Incolor Negativo

Albumina

Amarelo claro Positivo

Casena isolada Precipitado amarelo Positivo

No teste de biureto, a soluo da albumina inicialmente possua uma cor turva, e aps a adio da

soluo de sulfato de cobre a soluo apresentou uma nova colorao prpura-violeta que mostra

a presena de protenas com uma sequncia de aminocidos, e que possui grupos solveis em

solues salinas.


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No teste de ies de metais pesados, no primeiro tubo onde continha a soluo de Pb(NO3)2, ocorre

a formao de precipitado, e na soluo Hg(NO3)2 h formao de precipitado gelatino, o que

mostra a presena de metais pesados e na soluo NaNO3 no houve a formao de precipitado,

mostra-nos ausncia de metais leves como o sdio.

No teste de xantoprotena, com a adio do HNO3 no houve mudana nenhuma, posteriormente

aquecidos os tubos de ensaio ocorrera mudanas de cor em dois tubos de ensaio contendo solues

de albumina e casena que houve tambm a formao de precipitado. A colorao das solues

mostrou-nos a presena de aminocidos com anis aromticos a citar: triptofano, histidina,

perolina, fenilalanina e hidroxipirolina.


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5. CONCLUSO

Neste trabalho laboratorial, foi possvel isolar a casena do leite fresco, 3.23% foi o valor obtido e

mostra se satisfatrio, pois a quantidade da casinha no leite fresco deve ser 3% ou aproximado. O

mtodo usado no especfico para o isolamento da casena, pois neste processo pode se isolar

algumas protenas com caractersticas similares a da casena bem com algumas gorduras.

Com relao ao teste de anlise qumica da casena conclui-se que possvel determinar a presena

de metais pesados no leite fresco, de protenas e presena de aminocidos com anis aromticos

em soluo com o auxlio de alguns testes qumicos conhecidas, bem como a natureza de alguns

aminocidos presentes nestas protenas. possvel identificar as protenas como molculas

carregadas e reconhecer os factores ligados a solubilidade das protenas em gua.


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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Filho, F. R.; Freitas, W. R.; Lima, R. S.; Da Silva, M. S.; Lima, R. T.; Souza, H. B.; Lima,

V. A. (2009). Avaliao do Teor de Casena e Albumina no Leite de Vacas da Raa

Girolanda. Revista Brasileira deTecnologia Agroindustrial. ISSN: 1981-3686. Vol.. 03

(01). 42-48pp.

Palma,J.K., Andrade. A.A., Marsico. E. T., Semaan. F. S., Marques. F. F., Netto. A. D. P.,

Comparao entre mtodos clssicos para determinao de protenas em soro de leite

bovino. Sociedade Brasileira de Qumica (SBQ).

Nicolini, C.(2008). Leite em p. Tese de Bacharelado em Qumica de Alimentos da

Universidade Federal de Pelotas.

Sgarbieri, V. C. (2005). Review: Structural and Physicochemical Properties of Milk

Proteins. Brazilian Journal Food Technology. Vol.8 (01). 43-56pp

Vicenzi, R. Apostila de Bromatologia. Brasil. pp 28-31.

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