Catabolismul hemului. BilirubinaHemul este combinatia complexa a protoporfirinei IX cu ionul Fe2+. Hemul are rol de grupare prostetica pentru un numar mare de proteine cu roluri variate in sistemele biologice: (i) transportul gazelor respiratorii (hemoglobina, mioglobina), (ii) transportul electronilor (citocromii), (iii) cataliza diferitelor reactii biochimice (peroxidaze, nitric oxid sintaza, catalaza, prostaglandin sintaza etc).Produsul de catabolism al hemului provenit din degradarea hemoproteinelor este bilirubina. Cea mai importanta sursa de bilirubina in organismul uman este reprezentata de hemoglobina. Zilnic se produce o cantitate de aproximativ 4 mg bilirubina/kg corp, din care aproximativ 80 % provine din degradarea gruparii hem din hemoglobina, iar restul de aproximativ 20% rezulta din degradarea hemului celorlalte hemoproteine.Degradarea hemului are loc practic in toate celulele organismului, dar este un proces foarte intens la nivelul celulelor sistemului reticuloendotelial (macrofage) rezidente in splina, maduva hematopoietica si ficat (celule Kupffer).Eritrocitele dupa un interval de aproximativ 120 zile sufera modificari la nivelul membranei celulare, fapt care permite recunoasterea si captarea lor de catre macrofagele din splina, maduva hematopoietica si ficat. Macrofagele din maduva hematopoietica au un rol important in degradarea hemului ce nu a fost incorporat corespunzator in hemoglobina. Hemoglobina eliberata in circulatie prin hemoliza este rapid captata de o proteina specializata numita haptoglobina. Complexul hemoglobina haptoglobina este recunoscut de un receptor specializat exprimat de macrofage. Complexul hemoglobina haptoglobina este endocitat de macrofage, iar hemoglobina este degradata.Catabolismul hemului incepe inainte de desprinderea acestuia de partea proteica a unei hemoproteine. Sub actiunea hemoxigenazei asociate reticulului endoplasmic (hemoxigenaza microzomiala) are loc deschiderea pe cale oxidativa a nucleului porfirinic la nivelul puntii metinice alfa. Procesul necesita prezenta O2, NADPH si a citocromului P450. Intr-o prima faza are loc oxidarea Fe 2+ la Fe 3+ si formarea alfa-hidroxiheminei. Procesul oxidativ continua pana cand nucleul porfirinic este scindat, atomul de carbon al puntii metinice este eliminat sub forma de CO, iar atomii de carbon alfa ai nucleelor pirolice I si II sunt oxidati la grupari carbonil. In cazul degradarii hemoglobinei, structura tetrapirolica lineara care este inca legata de globina se numeste verdoglobina. Compusul tetrapirolic linear desprins de partea proteica se numeste biliverdina (pigmentul verde). Ionii de Fe 3+ eliberati vor fi stocati in citosol sub forma feritinei, iar globina este degradata proteolitic la aminoacizii constituenti care vor intra in fondul metabolic de aminoacizi al organismului.

In citosol, sub actiunea biliverdin-reductazei are loc reducerea biliverdinei la bilirubina (pigment galben). Bilirubina rezultata in reactia anterioara difuzeaza in circulatie. Desi bilirubina are in structura sa grupari polare ionizabile si neionizabile, care ar trebui sa-i confere o puternica hidrosolubilitate, este un compus greu solubil in apa. Acest fapt se explica prin implicarea gruparilor polare in formarea de legaturi de hidrogen intramoleculare, ceea ce impiedica solvatarea acestui compus intr-un mediu apos. Transformarea hemului in bilirubina la nivelul macrofagelor tegumentare poate fi observata cu usurinta urmarind evolutia coloratiei hematoamelor de la rosu catre vioaceu (desaturarea Hb in oxigen), apoi spre verzui (formare de biliverdina) si apoi galben (bilirubina). In plasma, bilirubina se asociaza reversibil la albumina serica. Acest fapt permite pe de o parte mentinerea bilirubinei intr-o forma hidrosolubila, iar pe de alta parte impiedica difuzia bilirubinei in tesuturi. Albumina serica are mai multe locuri de legare a bilirubinei, in situsul principal fiind esentiala prezenta unui rest de Lys.

Capacitatea de legare a bilirubinei la albumina este influentata de pH si este limitata la aproximativ 25 mg. Astfel, in conditiile in care sinteza extrahepatica de bilirubina depaseste capacitatea de transport, excesul de bilirubina difuzeaza in tesuturi cu potentiale efecte toxice. Legarea bilirubinei la albumina poate fi inhibata competitiv de sulfamide, unele antiinflamatoare, substante de contrat, acizi grasi liberi in cantitati mari . In conditiile unei bilirubinemii constant crescute, o fractie minora a bilirubinei se poate lega covalent la albumina (-bilirubina).La nivelul ficatului, bilirubina este preluata de catre hepatocite, iar albumina ramane in circulatie. In hepatocite, bilirubina este complexata de doua proteine citoplasmatice, Y (ligandina) si Z, pentru a se evita iesirea ei din hepatocite sau patrunderea in organitele celulare (fiind demonstrata inhibarea respiratiei mitocondriale). Cel mai important proces hepatic pe care il sufera bilirubina este conjugarea cu acidul glucuronic. Prin conjugare legaturile de hidrogen intramoleculare ale bilirubinei sunt desfacute, ceea ce duce la o crestere considerabila a hidrosolubilitatii. Conjugarea este catalizata de o enzima specializata (UGT1A1) apartinand unui grup mai mare de enzime UDP glucuronil transferazele. Donorul de acid glucuronic este UDP-glucuronatul rezultat din calea acidului glucuronic. Activitatea UGT1A1 este scazuta la nastere, dar incepe sa creasca pe parcursul primelor 10 zile de viata. De asemenea, activitatea UGT1A1 este indusa de o serie de medicamente precum fenobarbital, diazepam, spironolactone si fibrati. Bilirubina exista sub forma de bilirubin-monoglucuronid, predominant in ficat si bilirubin-diglucuronid, predominat in lichidul biliar. Deficienta UGT1A1 este asociata cu hiperbilirubinemie cu blirubina neconjugata cu grade variate de severitate.Bilirubina conjugata este excretata la polul biliar al hepatocitelor cu ajutorul unui transportor specializat, ABCC2 (ATP binding cassette C2) intr-un proces energo-dependent. Acest sistem de transport are o capacitate limitata si prin urmare reprezinta etapa limitanta de viteza a catabolismului hemului. In cazul in care conjugarea bilirubinei depaseste capacitatea acestui trasportor, bilirubina conjugata difuzeaza in circulatie. Prin canaliculele biliare bilirubina ajunge impreuna cu bila in intestin unde sufera o serie de modificari chimice sub actiunea unor enzime produse de flora bacteriana intestinala:

(i) hidroliza legaturilor beta-glicozidice sub actiunea unor beta-glucuronidaze si (ii) reduceri secventiale catalizate de reductaze. Primul produs rezultat in urma reducerii se numeste urobilinogen si este incolor. O fractie minora a acestuia este redusa in continuare la stercobilinogen, de asemenea incolor. Stercobilinogenul si intr-o masura mica urobilinogenul sunt eliminati prin fecale. In contact cu aerul cei doi compusi se oxideaza la stercobilina, respectiv urobilina, compusi colorati. Cea mai mare parte a urobilinogenului este reabsorbit la nivel intestinal, ajunge la ficat prin vena porta si apoi este reexcretat prin bila (circuit hepato-entero-hepatic). O mica parte din urobilinogenul reabsorbit ajunge prin venele suprahepatice in circulatia sistemica si este excretat pe cale renala, in urina (0-4 mg/24 ore). Absenta urobilinogenului in fecale si urina indica obstructia completa a canalului coledoc.

Fig. Formarea si eliminarea bilirubinei (Guyton & Hall)

Dozarea bilirubinei se face in laboratorul clinic prin metoda spectrofotometrica ce are la baza reactia bilirubinei cu acidul diazobenzen sulfonic (metoda van den Bergh). Se obtine un compus colorat cu absorbanta maxima la 530 nm. Extinctia la 530 nm este proportionala cu cantitatea de bilirubina prezenta in proba. Bilirubina conjugata cu acidul glucuronic reactioneaza rapid cu acest reactiv, motiv pentru care se mai numeste bilirubina directa. Bilirubina neconjugata, legata la albumina, reactioneaza foarte lent, deproteinizarea facilitand scaderea timpului necesar reactiei. Aceasta fractie se numeste bilirubina indirecta. In urma adaugarii unui reactiv de deproteinizare vor reactiona cu reactivul diazo atat bilirubina conjugata, cat si bilirubina neconjugata eliberata de pe albumina. Astfel se va obtine bilirubina totala. Prin diferenta intre bilirubina totala si cea directa se afla concentratia bilirubinei indirecte.La un adult clinic sanatos, bilirubina neconjugata are o concentratie de aproximativ 0.2-0.7 mg/dl, in timp ce bilirubina conjugata are o concentratie mult mai mica cuprinsa intre 0.1-0.4 mg/dl. Astfel, bilirubinemia are valori cuprinse intre 1.1 si 1.2 mg/dl. La nou-nascutul la termen, bilirubinemia este semnificativ crescuta fata de adult, avand valori cuprinse intre 2 si 6 mg/dl.Variatiile bilirubinei se pot face in sensul scaderii (hipobilirubinemii) sau cresterii (hiperbilirubinemii) concentratiei de bilirubina. Hipoblirubinemiile sunt extrem de rare, in timp ce hiperbilirubinemiile sunt frecvente si cu o etiologie foarte variata.Icterul este coloratia galbena a tegmentelor, mucoaselor si plasmei datorita acumularii in exces de pigmenti biliari, respectiv datorita cresterii bilirubinei serice totale peste 2 mg/dl. El este un semn de boala si nu o boala, putand fi deseori prima si singura manifestare a unei boli. Clasificarea icterelor:1. Ictere prin formare excesiva de bilirubina sau de hiperproductie:

a. prin hemoliza excesiva (anemii hemolitice)

b. prin eritropoieza ineficace secundara (ex anemie pernicioasa, talasemie, porfirie) sau primitiva

2. Ictere prin suferinta celulei hepatice sau hepatocelulare:

a. prin deficit al transportului bilirubinei din plasma in celula hepatica:

- prin medicamente: rifampicina, neomicina, acidul flavaspidic

- ereditare: boala Gilbert

b. prin deficit de conjugare: - deficit enzimatic ereditar: icterele Crigler Najjar

- insuficienta maturatiei hepatice: icterul neonatal fiziologic

- inhibitie enzimatica: icterul Lucey-Driscoll, icterul neonatal prelungit prin secretia de 3 alfa, 20 beta pregnandiolc. prin defect de eliminare a bilirubinei conjugate: - forme familiale: Dubin-Johnson si Rotor

- forme dobandite: hepatita virala coelstatica, hepatita acuta a acoolicului

d. prin deficite asociate: hepatita epidemica acuta, hepatite cronice, ciroza hepatica.3. Ictere prin defect de eliminare prin caile biliare sau ictere colestatice:a. colestaza extrahepatica litiaza biliara, neoplasm de cap de pancreas, ampulom vaterianb. colestaza intrahepatica angiocolita, colangiocarcinom, ciroza biliara primitiva, etcIcterul fiziologic al nou-nascutului este o stare tranzitorie ce afecteaza aproximativ 50% din nou-nascutii la termen si 80% din copii nascuti prematur, fiind cauzat de imaturitatea sistemului hepatic de captare si de conjugare a bilirubinei. In conditiile unei hiperbilirubinemii severe (>20 mg/dl), bilirubina in exces, nelegata de albumina, poate traversa bariera hematoencefalica, acumulandu-se la nivelul sistemului nervos.Sindromul Gilbert are determinism genetic si se caracterizeaza prin icter de mica intensitate, din cauza deficitului mecanismului de preluare a bilirubinei din plasma in hepatocit.Sindromul Crigler-Najjar de tip 1 este o maladie genetica autozomal recesiva provocata de pierderea totala a activitatii glucuronil transferazei. Este frecventa afectarea sistemului nervos. Maladia este fatala in primele 15 luni de viata, iar transplantul hepatic este obligatoriu pentru a asigura supravietuirea. Sindromul Crigler-Najjar de tip 2 este o maladie genetica autozomal dominanta cauzata de pierderea partiala a activitatii glucuronil transferazei. Pacientii raspund la administarea de inductoare ale activitatii enzimatice hepatice.

In sindromul Lucey-Driscoll, in laptele matern se secreta 3alfa,20 beta preganandiol, cu actiune inhibitoare a glucuronil tranferazei, responsabil de un icter prelungit al nou-nascutului.

Sindromul Dubin-Johnson este o maladie genetica autozomal recesiva determinata de mutatii ce altereaza functionarea transportorului ABCC2. Astfel, bilirubina conjugata nu poate fi transportata corespunzator in canaliculele biliare si difuzeaza in circulatie. Sindromul Rotor este o varianta a sindromului precedent, dar nu este pe deplin caracterizat.Elementele clinice fundamentale in examinarea oricarui bolnav cu icter sunt: culoarea tegumentelor, aspectul scaunului si aspectul urinei. Acestea trebuie integrate in tabloul general al examenului clinic si completate de dozarea bilirubinei serice totale, precum si a fractiunilor bilirubinei directa si indirecta.Icterul se pune usor in evidenta la nivelul sclerei, pe care o coloreaza in galben in intregime, pana la limbul cornean. Prezenta unei coloratii galbene numai in periferie in zona fundurilor de sac conjunctivale, se datoreaza grasimii.In functie de coloratia tegumentelor, se pot descrie urmatoarele tipuri de ictere:- icterul flavinic, in care culoarea galbena se asociaza cu paloarea, caracteristic hemolizei;

- icterul rubiniu, in care culoarea galbena se suprapune celei rozate, normale, descris in hepatite;

- icterul verdinic, caracteristic colestazei, nuanta mai inchisa find datorata unei cresteri mari si pelungite a bilirubinei. Scaunul unui bolnav cu icter poate fi diferit colorat, in functie de prezenta sau absenta urobilinei. In cazul unui icter de hiperproductie (hemolitic) se elimina in intestin multa bilirubina, se formeaza multa urobilina si scaunul este intens colorat, pleiocrom. In cazul imposibilitatii eliminarii bilirubinei in intestin (colestaza), scaunul apare decolorat, similar chitului. Urina poate fi colorata de bilirubina directa (hidrosolubila) sau de urobilina. Ea va aparea, astfel, inchisa la culoare in icterele colestatice (cu cresterea bilirubinei directe) si hipercroma, portocalie in icterele prin hiperproductie (hemoliza), in care se formeaza o cantitate mai mare de urobilina. In colestaza extrahepatica, eliminarea de saruri biliare urinar scade tensiunea superficiala a urinei, care devine spumoasa. Aceasta combinatie de urina inchia la culoare, spumoasa a fost descrisa ca find caracteristica icterelor mecanice si comparata cu berea neagra.Astfel, icterele de hiperproductie sunt ictere flavinice, cu scaun pleiocrom, urina hipercroma si au in sange crescuta bilirubina indirecta. Icterele colestatice sunt verdinice, cu urina inchisa la culoare, spumoasa, scaun decolorat si au crescuta in plasma bilirubina directa. Icterele hepatice, din cauza scaderii numarului si functiei celulelor hepatice, a compresiei cailor biliare intrahepatice prin inflamatie si/sau fibroza, vor avea urina intens colorata, scaunul decolorat si valori crescute atat ale bilirubinei directe, cat si a celei indirecte.