CATEDRA DE BIOQUIMICA LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL

Tecnología Médica Elaborada por:

Prof. Barbara Butendieck A. Prof. Claudia Castillo K.

2014

Introducción    

Normas  generales  de  protección,  prevención  y  comportamiento:  Por  todos  los  riesgos  indicados,  es  necesario  (y  obligatorio)  llevar  delantal  para  protegerse  de  los  productos  químicos.  Como  protección  personal  se  puede  utilizar,  cuando  sea  necesario,  guantes  y  máscara.   Todas   las   damas   y   caballeros   que   tienen   el   pelo   largo,   deben   recogerlo   en   forma  completa  en  un  moño  con  un  collet,  pinche  o  traba.  En  el  laboratorio  no  se  debe  fumar,  comer  ni  beber,  para  evitar  el  peligro  de  un  envenenamiento  o  contagio  por  contacto  accidental  con  algún  producto  tóxico  o  agente  patógeno.  El  material  de  vidrio  debe  ser  manipulado  con  precaución  para  evitar  roturas.  Se   recomienda   fijarse   en   el   nombre   de   las     disoluciones   y   productos   antes   de   utilizarlos.   Si   se  utilizan  pipetas  de  vidrio  o  plástico,  hay  que  pipetear  con  el  dedo  índice,  nunca  con  el  pulgar.  No  se   debe   pipetear   directamente   del   frasco   de   agua   destilada   o   de   las   disoluciones   que   se  comparten  con  otros  grupos:  debe  pipetearse  de  la  disolución  transvasada  previamente  a  un  vaso  precipitado.  Hay  que  manejar  con  precaución  las  sustancias  peligrosas:  ácidos,  álcalis,  disolventes  orgánicos  y  productos  tóxicos.  Estos  productos  no  deben  pipetearse  nunca  con  la  boca,  sino  con  ayuda  de  una  propipeta.      Seguridad  en  el  laboratorio  Deben  tener  presente  las  reglas  generales  de  seguridad.  Se  debe  estar  consciente  que  los  reactivos  utilizados  en  el  laboratorio  son  potencialmente  tóxicos,  irritantes  o  inflamables.  Sin  embargo  estas  sustancias  son  peligrosas  solo  cuando  no  se  manipulan  correctamente.    La  guía  y  el  cuaderno  de  laboratorio  Es   muy   importante   hacer   un   diagrama   de   flujo   antes   de   iniciar   la   sesión.   Los   procedimientos,  detalles,   observaciones   y   resultados   se   deben   registrar   en   la   guía   o   cuaderno   de   laboratorio  mientras  el  experimento  se  está  llevando  a  cabo.      Breve  pauta    para  preparar  el  Informe  de  Laboratorio.    Portada  Logo  institucional,  facultad,  escuela;  nombre  del  laboratorio,  integrantes  del  grupo,  asignatura,  docentes,  fecha  de  entrega.  Introducción  Breve  resumen  de  conceptos  y/o  importancia  del  tema.  La  información  debe  tener  relevancia  para  el  práctico  y  no  debe  ser  una  copia  de  un  libro,  de  la  guía  o  de  internet.  Procurar  que  no  exceda  de  una  plana.  Objetivo  Aquí  se  debe  incluir  cual  es  el  objetivo  del  práctico,  porque,  para  qué?    Parte  experimental    Materiales  y  métodos  Se  describen  los  reactivos,  materiales  y  equipo  que  se  utilizan,  así  como  la  metodología  empleada  Se  debe  redactar  en  tercera  persona.  

Resultados  y  discusión  Se  describen   los  resultados  obtenidos,  se   indican   los  cálculos,  tablas,  gráficas  o  figuras,  así  como  una  explicación  con  fundamentos  científicos  del  porqué  se  obtuvieron  esos  resultados.    Los   resultados   experimentales   se   resumen   en   forma   de   tabla   o   de   gráfica.   Las   tablas   y   gráficas  deben  nombrarse  ordenadamente  en  el  texto  (Tabla  1,  Tabla  2,  etc.)  y  deben  tener  un  título.  En  algunos   casos,   además,  puede   ser   interesante  dar  detalles  adicionales  en   forma  de  una   leyenda  colocada  debajo  del  título.  Las  unidades  en  que  se  expresan  los  resultados  deben  indicarse  en  la  parte  superior  de  cada  columna  (y  nunca  en  cada  línea  de  cifras).  Estas  unidades  deben  elegirse  de  manera  que  presenten  un  número   limitado  de  cifras   (por  ejemplo,  una  concentración  de  0.0072  mol/L  se  escribe  más  fácilmente  7.2  mmol/L  o  72  x  10-­‐4  mol/L).  En  general,  los  valores  obtenidos  se  presentan  en  forma  de  gráfica  y  no  de  tabla.  Para  trazar  una  gráfica  se  representan  los  valores  de  la  variable  independiente  (parámetro  conocido)  en  el  eje  de  abscisas  (eje  x)  y  los  de  la  variable  dependiente  (parámetro  desconocido)  en  el  eje  de  ordenadas  (eje  y).      Cuestionario  En  caso  de  existir  cuestionario,  incluirlo  en  el  informe.    Bibliografía  Reportar  las  fuentes  utilizadas  con  el  formato  estándar:  Para  libros:  Autor(s),  año  de  publicación,  título,  editorial  y  páginas  consultadas,  en  el  caso  de  internet  señalar  la  dirección  completa,  fecha  de   revisión  de   lapágina.  Para  el   caso  de   revistas   científicas:  Autor(es),   año,  nombre  del   artículo,  nombre  de  la  revista,  volumen,  número,  páginas.  (Norma  APA)    Los  Informes  se  escribirán  a  mano  en  un  cuadernillo  de  matemáticas  y  se  entregarán  en  el  laboratorio  siguiente,  al  inicio  de  éste.  La   entrega   del   informe   fuera   de   plazo   devengará   automáticamente   en   un   1   en   la  calificación.  Considere   en   el   informe   la   redacción   y   la   ortografía.   Se   descontarán  decimas   de  nota    por  estos  errores.  

OJO

Antes  del  inicio  del  laboratorio  se  realizarán  pruebas  de  entrada  al  laboratorio.  Las  preguntas  saldrán  de  la  guía  de  laboratorio,  del  práctico  que  se  realizará  ese  día  

 

LABORATORIO 2: INTRODUCCIÓN SOLUCIONES Y TAMPONES I. SOLUCIONES Una solución es una mezcla homogénea de dos o más componentes. El componente que está en mayor proporción se llama solvente y el o los componentes que están en menor proporción se llaman solutos. En soluciones líquidas, el solvente es líquido en tanto que los solutos pueden ser sólidos, líquidos o gases. La mayoría de las soluciones usadas en bioquímica son soluciones acuosas (solvente agua). Para caracterizar una solución no basta indicar sus componentes, sino que también la proporción en que estos están presentes en la solución, es decir, la concentración de cada uno de los solutos en la solución. UNIDADES DE CONCENTRACIÓN Las más usadas en la práctica son de dos tipos: -. Unidades de concentración referidas a volumen: Indican cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen de solución. Ej.: la molaridad, la normalidad, porcentaje p/v, g/l, etc. -.Unidades de concentración referidas a peso: indican cantidad de soluto disuelto por unidad de peso de solución o de solvente. Ej.: % p/p, molalidad. 1.-Molaridad (M): número de moles de soluto por litro de solución. Para preparar una solución de molaridad dada es necesario conocer el peso molecular (PM) del soluto. Se usan las relaciones: Peso soluto (g) = número de moles de soluto PM (g/mol)

N° moles de soluto = M Volumen solución (l) Ej.: Una solución 1 M (1 molar) de NaCl contiene 1 mol (58,8g) de NaCl por litro. Un mol de NaCl

corresponde a un valor igual al número de Avogadro de moléculas, que es 6,023 x 1023. La concentración de iones en solución también se indica en unidades molares, en este caso el

ión es la molécula. Ejemplos: Consideremos la solución 1 M de NaCl. Los enlaces iónicos de la red cristalina de

cloruro de sodio se rompen al disolverse la sal. NaCl -------------! Na+ + Cl-

Por cada mol de NaCl sólido se forma 1 mol de Na+ y un mol de Cl-. Luego: Concentración de Na+ = 1M Concentración de cloruro = 1 M Para las moléculas más complejas como MgCl2 MgCl2 -------------! Mg+2 + 2 Cl- Una solución de cloruro de magnesio 1M contiene:

Concentración de Mg+2 = 1 M Concentración de cloruro = 2 M Las concentraciones de soluciones diluidas se suele expresar en unidades que son

submúltiplos de M: Milimolaridad (mM): número de milimoles de soluto por litro de solución. La milimolaridad y los otros submúltiplos se definen en forma análoga: Milimolaridad (mM): 1 mmol = 10-3 moles, luego 1mM = 10-3 M Micromolaridad (µM) 1µmol = 10-6 moles, luego 1µM = 10-6 M Nanomolaridad (nM) 1 nmol = 10-9 moles, luego 1nM = 10-9 M 2. Normalidad (N): Número de pesos equivalentes (PE) de soluto por litro de solución. Solamente para algunos compuestos se define un PE, y este siempre tiene relación con la reactividad del compuesto. En general : PE = PM N Ácidos y bases: n = N° de protones que puede ceder (el ácido) o captar (la base) por molécula. Compuestos que sufren reacciones redox: n= N° de electrones captados (agente oxidante) o cedidos (agente reductor) por molécula. 3. Peso de soluto/volumen de solución en g/l, mg/l: Esta es la forma más sencilla de indicar la concentración de una solución, es la forma más usual, aparte de la molaridad. 4. Porcentaje peso/volumen (% p/v): Peso de soluto en gramos por 100 ml de solución (g%). Se habla de porcentaje ya que 100 ml de una solución acuosa relativamente diluida pesan aproximadamente 100g. para soluciones muy diluidas se usa el submúltiplo mg% = peso del soluto en mg por 100 ml de solución. 5. Porcentaje peso/ peso (%p/p): Peso en gramos de soluto por 100 gramos de solución. La concentración de la mayoría de los ácidos comerciales viene dada en %p/p. Aquí la proporción de soluto puede ser mayor que la proporción del solvente. Ej.: H2SO4 96%. Para poder transformar %p/p a concentración molar o normal es necesario conocer la densidad (d) de la solución. Ejemplo: Calcular la molaridad de HCl comercial del 28%, densidad 1,15 (kg/l). Primero calculamos cuánto pesa 1 litro de la solución.

1 l x 1,15 (kg/l) = 1,15 kg = 1150 g Ahora calculamos el peso de HCL puro contenido en este litro: 100 g de solución contienen 28 g, por lo tanto 1150 g de solución contienen 1150g x 0,28 = 322g Finalmente, calculamos a cuántos moles corresponde este peso de HCl: PM del HCl = 36,5 (g/mol) 322 (g) = 8,82 moles 36,5 (g/mol) Hemos calculado que 1 litro del ácido comercial contiene 8,82 moles de HCl, es decir, su concentración es 8,82 M.

6. Molalidad (m): Número de moles de soluto por 1000 gramos de solvente. Esta unidad de concentración se usa solamente para ciertos cálculos físico-químicos. Expresar la concentración en estas unidades presenta la ventaja de que se hace independiente de la temperatura. Al contrario, una concentración expresada en unidades referidas a volumen, como la molaridad, varía con la temperatura, ya que ésta afecta el volumen. Para soluciones acuosas diluidas m es prácticamente igual a M. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Para preparar una solución de un soluto dado se puede usar el soluto puro ( generalmente sólido) o una solución concentrada de él en el mismo solvente ( solución stock). Este último caso constituye una dilución. Para diluciones rige la relación: V1 x C1 = V2 x C2

V1 = volumen de la solución concentrada C1 = concentración de la solución concentrada V2 = volumen de la solución diluida C2 =concentración de la solución diluida C1 y C2 pueden ser unidades de concentración de cualquier sistema referido a volumen. Ejemplo: En un matraz aforado de 100 ml se colocaron 10 ml de una solución 2M de cloruro de sodio y se aforó con agua. ¿Cuál será la concentración de la solución resultante? Nuestro sentido común nos dice que la respuesta será 0,2 M, ya que la solución se diluyó 10 veces. El cálculo según la relación dada sería: C2 = V1 x C1 = 10 ml x 2M = 0,2 M V2 100 ml

PROBLEMAS SOLUCIONES 1.- a) ¿Cuántos g de NaOH sólido se requieren para preparar 500 ml de una solución 0,04 M? b) Exprese la concentración de la solución preparada en a) en términos de N, g/l, (% p/v).

2.- ¿Cuántos mililitros (ml) de H2SO4 3M se requieren para preparar 500 ml de una solución de H2SO4 de concentración? a) 0,05 M b) 0,002 N 3.- Describa la preparación de 3 litros de HCl 0,25 M, utilizando una solución comercial concentrada de HCl ( 32% p/p, d= 1,16 kg/l). 4.- 50 ml de H3PO4 85% p/p, d= 1,71 g/ml se diluyeron a 200 ml con agua. Calcule la normalidad de la solución. 5. a) ¿Cuántos ml de NaCl 0,5 M se necesitan para preparar 2 litros de NaCl 2 mM? b) ¿Cuántos ml de KCl 0,3 M se necesitan para preparar 2 litros de solución 50 mM?

6.- Ud. dispone de varias soluciones concentradas: NaCl 2M; KCl 0,5 mM; MgCl2 100 mM y CaCl2 1,3 M. A partir de esto, describa la preparación de 2 l de una solución que contenga NaCl 120 mM, KCl 35 µM, MgCl2 0,03mM y Na2SO4 0,06 M. 7.- Respecto de la solución preparada en 6, calcule la concentración para el anión Cl- y para el catión Na+.

pH Y TAMPONES ACIDOS Y BASES

Según la definición de Bronstedt: ÁCIDO: es un compuesto que tiende a ceder protones al medio. BASE: es un compuesto que tiende a captar protones del medio.

En medio acuoso, la reacción correspondiente de un ácido HA será:

HA + H2O "--! H3O+ + A –

u obviando la participación del agua:

HA "--! H+ + A- (1)

Considerando esta reacción en el sentido inverso, la especie a- puede captar protones. A- es la

base conjugada de HA.

Similarmente para una base B:

B- + H+ "-! BH+ (2)

BH+ es el ácido conjugado B.

Ejemplos de bases según Bronstedt son los compuestos orgánicos básicos, que deben su basicidad al grupo funcional amino. FUERZA DE ACIDOS Y BASES Un ácido o una base fuerte es el que está completamente disociado en solución. En cambio, un ácido débil está solamente parcialmente disociado y la base parcialmente protonada. Ácidos fuertes son: HCl, HNO3, HClO4, H2SO4 (ambos protones), H3PO4 (solamente el primer protón que se disocia). Bases fuertes son: NaOH, KOH, etc. Ácidos y bases débiles: prácticamente todos los ácidos y bases orgánicos pertenecen a este grupo. Ácidos y bases débiles Consideremos a modo de ejemplo el ácido acético, HOAc. Fórmula estructural: CH3- COOH Este ácido débil posee un solo protón ácido. En solución acuosa coexisten en equilibrio moléculas de la especie protonada con moléculas del anión acetato (OAc) y protones. La relación entre la concentración de las especies nombradas a una temperatura determinada está dada por la constante de equilibrio de la reacción de disociación, llamada constante de acidez, Ka: HOAC "----! OAc- + H+ (3)

Ka = [OAc] [H+]

[HOAc]

Ka de HOAc (25 °C): 1,78 x 10-5

Se suele expresar la acidez a través del pKa en vez de usar Ka:

pKa = - log Ka

pKa de HOAC (25 °C)=4,75

Se cumple:

que a mayor Ka ========# menor pKa =====# mayor acidez

Con el fin de comprender mejor el significado de la constante de acidez, calcularemos la concentración de las especies presentes en una solución 0,1 M de HOAc. Según la ecuación 3 [H+] = [OAc] = x

[HOAc] = 0,1 –x

El valor numérico de Ka indica que HOAC estará poco disociado, luego podemos aproximar:

[HOAc] = 0,1

reemplazando en la expresión de Ka

Ka = x2 = 1,78 x 10-5

0,1

x = 1,33 x 10-3 M

Es decir, en nuestra solución:

[HOAc] = 0,1 M

[OAc] = [H+] = 1,33 mM Comprobamos que la aproximación hecha fue correcta. El pH de la solución es igual a pH = - log (1,33 x 10-3) = 2,88 Para una base débil B se puede definir la constante de basicidad Kb Kb = [BH+]

[B] [H+]

Sin embargo, lo usual es caracterizar las bases débiles a través de la constante de acidez de su ácido conjugado BH+ (invirtiendo la reacción 2). Para un par ácido/base conjugada se cumple: Ka x Kb = Kw y

Kw = [H+] x [OH-] = 10-14 (25 °C)

Kw = constante de disociación del agua

ECUACIÓN DE HENDERSON-HASSELBACH

En forma análoga a lo visto para HOAC, para un ácido débil HA:

Ka = [A-] [H+] [HA]

Despejando [H+] y aplicando log se obtiene

pH = pKa + log [A-] Ecuación de Henderson-Hasselbach

[HA]

Esta ecuación establece la relación entre pH y la proporción entre la especie protonada y desprotonada. Se usa para calcular el pH de la mezcla de un ácido débil con un ácido fuerte o una base fuerte de un ácido débil con su sal, mezclas tampón, etc.. SOLUCIONES TAMPON

Cuando se titula una solución de HOAc con una solución de una base fuerte (NaOH), midiendo el pH después de cada adición se obtiene el siguiente gráfico, llamado curva de titulación: pH zona tamponante punto de equivalencia ml NaOH

Se aprecia que en un rango de pH alrededor de 4,75 (pKa) el pH varía muy poco

durante la adición de base, se trata de la zona tamponante del par HOAc/OAc-. (Definiremos este concepto más adelante). Las reacciones involucradas son:

1. NaOH Na+ + OH- 2. OH- + H+ H2O 3. HOAc OAc- + H+

La suma de las dos primeras reacciones hace disminuir la concentración de protones en la solución. Sin embargo, la tercera reacción simultáneamente repone parte de los protones neutralizados. El equilibrio de disociación de HOAc se desplaza hacia la formación de acetato. Para: pH = pKa ocurre que [HOAc] = [OAc-] (Verifique esta aseveración)

A medida que la concentración de la especie protonada HOAc en la solución se hace pequeña, el pH comienza a aumentar más fuertemente, hasta que la solución pierde su característica de tampón. Al titular una solución básica que contiene el anión acetato con un ácido fuerte se observa el mismo fenómeno. Estaríamos recorriendo nuestra curva de derecha a izquierda. Solución tampón (solución amortiguadora o buffer): Es una solución cuyo pH se mantiene prácticamente constante cuando se le agregan pequeñas cantidades de ácido o base. Las soluciones tampón son sistemas formados por un ácido débil y su base conjugada o por una base débil con su ácido conjugado. Zona tamponante de un sistema tampón: Es el intervalo de pH en el cual el sistema posee propiedades de tampón, depende del valor del pKa de la especie protonada. Un tampón es "bueno" aproximadamente 1 unidad de pH alrededor del pKa. Los valores de pKa para algunos tampones de uso común en bioquímica están contenidos en la tabla 1. También se usan mezclas de dos diferentes sistemas tampón, ejemplos: Tampón tris/fosfato, trietanolamina/dietanolamina. Capacidad de una solución tampón: La capacidad de una solución tampón indica la cantidad de ácido o de base que es capaz de absorber sin cambiar fuertemente su pH y depende de: - pH : es máxima para pH = pKa - concentración: a mayor concentración, mayor capacidad tamponante. Concentración de una solución tampón: Es la suma de las concentraciones de la especie protonada y de la especie deprotonada.

Compuesto pKa (20ºC) Acido fosfórico (pka1) 1,96 Glicina 2,45 Acido cítrico (pKa1) 3,10 Acido fórmico 3,75 Acido acético 4,75 Acido cítrico (pKa2) 4,75 Acido cítrico (pKa3) 5,40 MES (ácido conjugado) 6,15 Imidazol (ácido conjugado) 7,00 Acido fosfórico (pKa2) 7,21 HEPES (ácido conjugado) 7,55 Trietanolamina (ácido conjugado) 7,77 TRIS (ácido conjugado) 8,08 Acido fosfórico (pKa3) 12,30

Selección de un tampón: Las variables a considerar son en primer lugar: a) El pH al cual deseamos trabajar b) La capacidad que necesitamos Otros aspectos importantes pueden ser: c) Solubilidad de los compuestos

Ejemplo: Una desventaja de los buffer de fosfato es la baja solubilidad de sus sales. d) Variación del pH con la temperatura:

Ejemplo: Una desventaja de los tampones de Tris es que su pH varía notoriamente con la temperatura.

e) Volatilidad: Algunos sistemas tampón presentan la ventaja de ser volátiles. Ejemplo: Acetato de amonio, bicarbonato de amonio.

f) Transparencia a la luz U.V.: Cuando se desea detectar un compuesto por absorciometría, es necesario usar un buffer que sea suficientemente transparente a la longitud de onda de la determinación.

g) Interacciones entre el sistema tampón y las sustancias en estudio. Ejemplo: influencia de un sistema tampón sobre la actividad de determinada enzima.

Cálculos relacionados con la preparación de tampones: Ejemplo: Se desea preparar un litro de buffer acetato 0,1 M de pH = 4,60 a partir de ácido acético 2 M y acetato de sodio. La ecuación de Henderson-Hasselbach permite calcular la razón de las concentraciones de HOAc y OAc- necesaria para que el pH de la solución sea igual a 4,60: pH = pKa + log [OAc-] ; reemplazando el pKa de HOAc y el pH: [HOAc] 4,60 = 4,75 + log [OAc-] [HOAc] log [OAc-] = -0,15 [OAc-] = 0,708 [HOAc] [HOAc] Por otra parte: [HOAc] + [OAc-] = 0,1 (todas las concentraciones en M) [HOAc] = 0,1 - [OAc-] Reemplazando: [OAc-] = 0,708 0,1 - [OAc-] [OAc-] = 0,0708 - 0,708 [OAc-] [OAc-] = 0,0708 = 0,0415 M 1,708 [HOAc] = 0,1 - 0,0415 = 0,0585 M Se desea preparar un volumen igual a un litro, luego se necesitan 0,0415 moles de acetato de sodio. NaOAc : PM = 82 0,0415 moles = 3,4 g HOAc: se aplica la relación de las diluciones V1 = 1 (l) x 0,0585 M = 0,0293(l) 2 M Preparación de la solución: en un matraz aforado de 1 litro se colocan 3,4 g de acetato de sodio más 29,3 ml de HOAc 2 M y se afora con agua.

PROBLEMAS TAMPONES 1. ¿Cuáles son a) H+, b) OH-; c) pH; de una solución de un ácido fuerte HX de concentración 5

mM? Resp.: a) 5 x 10-3 M c) 2,30 b) 2 x 10-12 M 2. a) La concentración de iones H+ de una muestra de orina es 2 x 10-7 M. ¿Cuál es su pH? b) El pH de una muestra de suero es 7,4 ¿Cuál es la concentración de iones hidrógeno? Resp.: a) 6,7 b) 4 x 10-8 M 3. ¿Cuántos iones de a) H+ y b) OH- están presentes en 250 ml de una solución de pH = 4? Resp.: a) 1,51 x 1019 b) 1,51 x 1013 4. ¿Cuántos milílitros de HCl 0,05 N se requieren para neutralizar exactamente 20 g de NaOH? Resp.: 10000 ml = 10 litros 5. ¿Cuántos g de NaOH sólido se necesitan para preparar?: a) 250 ml de una solución 0,08 M y

b) 500 ml de una solución de NaOH a pH 9,7? Resp.: a) 0,8 g b) 1,00 mg 6. El pH de una solución 0,02 M de ácido débil HA es 4. a) ¿cuál es el grado de ionización de HA

en la solución? b) ¿cuál es el Ka? Resp.: a) 0,5% b) 5,03 x 10-7 7. El Ka de un ácido HA es 1,6 x 10-6 a) ¿Cuáles son pH y grado de ionización del ácido en una

solución 10-3 M? b) Calcular el pKa Resp.: a) 4,40; 4% b) 5,80 8. ¿Cuál es la concentración de ácido acético y acetato en un tampón acetato de concentración

0,1 M y pH 6,0? El Ka para el ácido acético es 1,78 x 10-5 Resp.: 94,7 mM; 5,3 mM ( [OAc-] y [HOAc] respectiv.) 9. Calcule el pH de las soluciones obtenidas al mezclar 10 ml de NaOH 0.01 M, con 90 ml de: a)

H2O b) NaCl 0,1 M c) una solución que contiene 0,05 M HOAc y 0,05 M NaOAc. ¿Cuál será el valor inicial del pH de la solución? Discuta los resultados.

Resp.: a) 11 b) 11 c) 4,77 10.¿Cuál es el pH de una solución que contiene acetato potásico 0,3 M y ácido acético 0,15 M?

(pKa ácido acético = 4,75) Resp.: 5,05 11. ¿Cuál es el pH de una solución que contiene NH4Cl 0,1 M y NH3 0,2 M. pKb NH3 = 4,6. Resp.: pH 9,7 12. Se preparó un "buffer" disolviendo en agua 5 x 10-3 moles de ácido fórmico y 7 x 10-3 moles de

formiato de sodio en un volúmen final de 1 l. El Ka del ácido fórmico es 1,8 x 10-4. a) calcular el pH de la solución resultante b) si esta solución se diluyera 10 veces ¿cuál sería el pH final? Resp.: a) 3,89 b) 3,89 13. Calcular el pH de una solución formada cuando a 200 ml de ácido acético 0,5 M se le añaden

100 ml de NaOH 0,1 M. pKa ácido acético = 4,75 Resp.: 3,8 14. Los tampones Tris/HCl se pueden obtener agregando HCl a una solución de Tris.

Tris = Tris (hidroximetil)aminometano Fórmula estructural: (CH3OH)3 CNH2 PM: 121,1 Acido conjugado: Tris H+, pKa = 8,1. Calcule la cantidad en gramos de Tris y el volúmen de HCl 1 M que se requiere para preparar 1 l de un buffer Tris/HCl 0,2 M, pH 7,5

Resp.: 24,2 g; 160 ml 15. Una solución amortiguadora contiene ácido acético 0,1 M y acetato de sodio 0,1 M. Calcular el

pH después de la adición de 10 ml de HCl 0,1 N a 90 ml del amortiguador. Resp.: 4,65 16. Describir la preparación de 2 litros de tampón fosfato 0,15 M, pH 6,9 partiendo de: a) solución 2 M de H3PO4 y solución 1 M de KOH b) soluciones 1 M de KH2PO4 y Na2HPO4 c) KH2PO4 sólido y K2HPO4 sólido Resp.: a) 150 ml H3PO4 2 M b) 200 ml KH2PO4 c) 27,2 g KH2PO4 400 ml KOH 1 M 100 ml Na2HPO4 17,4 g K2HPO4 17. La piridina es una base orgánica que reacciona con los H+ para formar Pyr-H+ Para Pyr-H+ :

pKa = 5,36. Se desea preparar un tampón de piridina/HCl de pH 5,5 titulando 50 ml de piridina 0,1 M con HCl 0,1 M.

¿Cuánto HCl se gastará? ¿Cuál será la concentración del tampón? Resp.: 21 ml; 0,070 M OBSERVACION: Grado de ionización de un ácido es la fracción de la concentración total que se encuentra disociada, se suele expresar como porcentaje.

Laboratorio  2:    Parte  Experimental.  Determinación  del  pH  y  preparación  de  soluciones  amortiguadoras  y  diluciones  

 Objetivo:  Aprender el uso correcto del pH metro y preparar soluciones con diferentes valores de pH.  Materiales  y  métodos    Materiales  Potenciómetro, pipetas Pasteur, matraz aforado 100 ml, vasos precipitados de 250 ml, piseta con agua, agitador magnético, espátula. Muestras para determinar pH: leche, jugo, bebidas, etc.  Reactivos  Solución estándar pH 4, pH 7; Solución de NaOH 10M, HCl concentrado, ácido acético, acetato de sodio, EDTA  Métodos    Uso  del  pH  metro  y  medición  del  pH  1.- El electrodo del pHmetro siempre debe estar sumergido en una solución de KCl o agua destilada. Enjuagar el electrodo con agua destilada y secar. 2.- Ajustar el pHmetro primero a pH 7, después a 4 con soluciones reguladoras comerciales. 3.- Entre cada pH enjuagar con agua destilada. 4.- Determinar el pH de varias muestras como leche, jugos, refrescos, etc,  Preparación  de  diferentes  soluciones    1.-­‐  Preparar  100  mL  de  una  solución  amortiguadora  de  acetato  de  sodio  50  mM,  pH  5. Para realizar esto, primero debe calcular cuántos gramos de acetato de sodio se necesitan, disolverlos en menos de 100 ml de agua destilada (por ejemplo 70mL) y ajustar el pH a 5 con ácido acético. Usar la formula M= (n/V) = (m PM)/V (M= molaridad, m=masa en gr, P.M.= peso molecular y V= volumen en litros) para hacerlos cálculos. 2.- Preparar  100  ml  de  EDTA  0,5  M  pH  8  Calcular cuántos gramos de EDTA necesitas, poner en 60 ml, comenzar a disolver con agitador magnético y tratar de ajustar el pH cercano a 8 (el EDTA comenzará a disolverse) y adicionar poco a poco más agua. Ajustar a pH 8 y aforar a 100 ml. Preparación  de  diluciones    1.- A partir de la solución 2, prepare una dilución. Prepare 100 ml de una solución de EDTA 0,1 M. Calcular cuántos ml de la solución 2 se van a necesitar. Medirlos con una pipeta y trasvasar a un matraz aforado de 100 ml. Aforar con agua destilada a 100 ml. Cálculos  aquí:                

Cuestionario  1. ¿Por qué el pH del potenciómetro se ajusta primero a pH 7 y no a 4 o 10? 2. ¿Por qué el electrodo se debe mantener en una solución de KCl saturado? En caso de no

contar en el laboratorio con KCl, ¿Que otros compuestos pueden usarse? 3. Si quisiera preparar un buffer fosfato de potasio pH 11, ¿qué sales seleccionaría? 4. ¿El buffer de acetato de sodio que se preparó está a un pH que se puede considerar

adecuado para servir como solución amortiguadora? .Explique su respuesta. 5. En la preparación del acetato de sodio, cual es el ácido y cual la base conjugada.

Bibliografía  1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press. 2. Robert, JF., and White B.J. 1990. Biochemical techniques theory and practice. 1st edition. Waveland Press, Inc. USA. 3. Douglas  A. Skoog and Donald M. West.1971.Principles of Instrumental Analysis. Holt, Rinehart and Winston, Inc. 4. Rodney  F. Boyer.1986. Modern Experimental Biochemistry. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 5. Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning. A laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press

Laboratorio 3 y 4 : Espectrofotometría: Absorciometria Montaje de una Técnica Fotocolorimetrica

PRINCIPIOS DE ABSORCIOMETRIA DE UV/VISIBLE

La absorciometría aprovecha la propiedad de ciertos compuestos de absorber radiación electromagnética. Los diferentes tipos de radiación electromagnética, como ser rayos X, luz ultravioleta (UV), luz visible, luz infrarroja, ondas de radio, etc., se propagan a velocidad común pero difieren en longitud de onda y frecuencia. Se cumple que:

c = λ x υ c = velocidad de la luz en el vacío λ = longitud de onda υ = frecuencia El ojo humano detecta la radiación del rango de longitudes de onda de 400 a 800 nm, llamada luz visible (1 nm = 10-9 m). La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la energía necesaria para producir transiciones de electrones desde un orbital molecular de menor energía a otro de mayor energía de ciertos compuestos, llamados cromóforos. Las sustancias coloreadas absorben luz visible, su color corresponde a la radiación no absorbida. La luz solar es blanca, ya que contiene radiación de todo el espectro visible, aparte de otras radiaciones. LEY DE LAMBERT-BEER

La ley de Beer-Lambert (o Lambert-Beer) es la ley fundamental de la absorciometría, ya que relaciona la absorción de la luz con la concentración de soluciones. Consideremos un haz de luz monocromática (luz de una sola longitud de onda) que atraviesa una solución de un compuesto contenido en un recipiente de vidrio. El siguiente esquema ilustra la situación: cubeta solución de concentración c I0 I luz incidente luz transmitida l Io = intensidad del haz incidente I = intensidad del haz transmitido l = camino óptico (ancho interior de la cubeta medido en cm). c = concentración

Si el compuesto absorbe a la longitud de onda dada, I es menor que Io. Cuanto mayor es el número de moléculas de este cromóforo encontradas por el haz de luz en su camino, menor será la intensidad de la luz transmitida. Dicho número de moléculas depende de la distancia recorrida a través de la solución (camino óptico) y de la concentración. La relación entre estos parámetros está dada por la ley de Lambert-Beer:

I = Io x 10- ε lc (1)

La forma de esta ley usada en la práctica es más sencilla y se obtiene de la siguiente

manera: Reordenando y aplicando logaritmos:

log I = - ε l c Io Se define como absorbancia (A) de una solución: A = log Io (2) ----- I Luego: A = ε • l • c (3) ley de Beer-Lambert (forma lineal)

Por convención se usa el siguiente sistema de unidades: l = camino óptico en cm c = concentración en M ε = coeficiente de extinción molar, en cm-1 x M-1 Sinónimos de absorbancia: densidad óptica, extinción.

El coeficiente de extinción molar: es una característica propia del cromóforo a una longitud de onda dada y representa la probabilidad de que el cromóforo absorba la radiación. Para explicar el significado se suele señalar que ε es igual al valor numérico de la absorbancia que tendría una solución 1 M del cromóforo si el camino óptico es igual a 1 cm. Es importante recalcar el carácter hipotético de esta afirmación, ya que normalmente no es posible preparar soluciones de concentración 1 M de los cromóforos (si el PM es alto, 1 M es una concentración extremadamente alta), y por otra parte el órden de magnitud de los coeficientes de extinción molar importantes corresponde a valores muy superiores al intervalo de absorbancias medibles en la práctica. Los coeficientes de extinción pueden tomar valores hasta 100.000 cm-1 M-1, aproximadamente.

Para compuestos de peso molecular desconocido se usa en vez del coeficiente de extinción molar la absorbancia de una solución de concentración estándar expresada en % P/V, medida en una cubeta de camino óptico dado como referencia. Ejm.: para proteínas se usa A0,1% (l = 1 cm), y para proteínas típicas a 280 nm tiene valores cercanos a 1.

Por otra parte, se define como transmitancia (T) de una solución: T = I (4) Io Es decir, la transmitancia es la fracción de la intensidad incidente transmitida por la solución. T se puede expresar como porcentaje (%T). %T = I x 100 Io

Aplicando logaritmos a (4) y reemplazando con (2) se obtiene: A = - log T (5)

Ejm: Si %T = 50, entonces T = 0,50 y A = 0,301 La ley de Lambert-Beer indica que para un cromóforo a una longitud de onda dada la

absorbancia aumenta en forma lineal con la concentración (con l = cte), mientras que la transmitancia disminuye en forma exponencial. (Fig. 1 y 2).

A A = ε l c T T = 10 -ε l c pendiente = ε x l c c Fig. 1 Fig. 2 El gráfico de la absorbancia de un cromóforo en solución en función de la longitud de onda

se denomina espectro de absorción. Un espectro de absorción se obtiene variando la longitud de onda para l y c constantes, y por lo tanto representa la variación de A con la longitud de onda (según (3)).

A continuación se muestra como ejemplo el espectro de absorción de riboflavina (en

fosfato de sodio, a pH 7,0). A 260 340 420 500 nm

longitud de onda (λ) El espectro de absorción de UV/visible es característico para un cromóforo determinado,

por lo tanto se puede usar para su identificación. Las características espectroscópicas se pueden resumir, indicando la posición de los máximos de las bandas de absorción (λ máx) con los correspondientes coeficientes de extinción. Por ejemplo, para riboflavina a pH 7,0:

λ máx (nm) ε (M-1 cm-1) 266 31.800 373 10.400 445 12.500

La riboflavina tiene color amarillo, debido a que su única banda en la región del visible a

445 nm, corresponde a absorción de luz azul. CALCULOS EN ABSORCIOMETRIA De la ley de Lambert-Beer se puede deducir: a) Para diluciones, si la absorbancia se mide a una misma longitud de onda, en la misma cubeta:

A1 V2 A2 V1

b) En un espectro:

A1 ε1 A2 ε2

La aditividad de la absorbancia:

La absorbancia de una solución a cierta longitud de onda es igual a la suma de las absorbancias de todos los cromóforos que contiene.

AT = A1 + A2 + A3 + ...

INSTRUMENTOS DE MEDIDA

Los componentes básicos de todos los instrumentos que se usan en absorciometría de UV/visible son: - Fuente de luz - Dispositivo que permite seleccionar la longitud de onda - Compartimento de muestra - Detector - Dispositivo que permite la lectura directamente o inscriptor Se pueden distinguir dos tipos de instrumentos: a) Fotómetros de filtro: La selección de la longitud de onda se realiza mediante filtros

intercambiables. b) Espectrofotómetros: Poseen un monocromador, son más sofisticados que los fotómetros de

filtro. Por otra parte se distinguen instrumentos que operan en el rango visible solamente y otros

que abarcan el UV y el visible (tienen 2 fuentes de luz). Además existen instrumentos de 1 solo haz y de doble haz.

El siguiente esquema muestra el trayecto de la luz en un espectrofotómetro que opera con

luz visible:

I0 I 0.532 lámpara de Monocromador Cubeta en Fototubo Pantalla Tungsteno portacubetas de lectura 1. FUENTE DE LUZ: No existe una fuente de luz que proporcione radiación de todo el rango espectral UV/visible de suficiente intensidad, por consiguiente se usan fuentes diferentes: Fuente de luz visible: lámpara de tungsteno. Sirve para 340-850 nm aproximadamente. Fuente de luz UV: lámparas de H2 o D2. Sirven para 200-375 nm aproximadamente. 2. SELECCION DE LA LONGITUD DE ONDA:

2.1. Filtros No proporcionan luz realmente monocromática sino que permiten el paso de un cierto rango de longitudes de onda alrededor de la longitud de onda de máxima transmitancia del filtro. 2.2. Monocromadores Poseen un elemento dispersor, que puede ser un prisma o una red de difracción. El elemento dispersor separa los haces de luz de diferente longitud de onda. Un sistema de espejos permite dirigir el haz de luz de la longitud de onda deseada hacia la ranura de salida:

493 nm ranura 492 nm 491 nm 491 nm 490 nm 490 nm 489 nm 489 nm 488 nm 487 nm luz monocromática 486 nm

Monocromador

Al cerrar más la ranura aumentará la monocromaticidad de la luz, pero siempre pasará un

cierto rango de longitudes de onda. La monocromaticidad de esta luz se mide a través del "ancho de banda" del espectrofotómetro (típicamente es de 1 a 10 nm). En la práctica se considera que un espectrofotómetro opera con luz prácticamente monocromática.

Un monocromador permite variar la longitud de onda en forma continua, condición necesaria para obtener espectros de absorción. Con un fotómetro de filtro no es posible obtener espectros de absorción. 3. COMPARTIMENTO DE MUESTRAS:

Allí se ubica la o las cubetas con las soluciones de muestra y de referencia. Las cubetas son de vidrio o plástico (para el visible) o cuarzo (para el UV). 4. DETECTOR:

Los detectores son de tipo fotoeléctrico: al incidir luz producen corriente eléctrica, de intensidad proporcional a la intensidad de la luz. Los detectores más usuales son los fototubos y los tubos fotomultiplicadores o fotomultiplicadores. 5. LECTURA O REGISTRO:

La mayor parte de los instrumentos indican o registran el valor de la absorbancia. Si el instrumento informa la transmitancia se calcula A usando la ecuación (5). La absorbancia normalmente se mide con 3 cifras después de la coma. El rango fotométrico de los espectrofotómetros normalmente es desde A = 0,000 hasta A = 2,000 ó 3,000, dependiendo del modelo.

APLICACION DE LA ABSORCIOMETRIA EN EL ANALISIS CUANTITATIVO

1. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE UN CROMOFORO PURO

Midiendo la absorbancia de la solución problema en un espectrofotómetro y conociendo el correspondiente coeficiente de extinción molar se puede calcular la concentración. Normalmente se usa la longitud de onda del máximo de una banda, cuyo valor se encuentra en la literatura.

Un método alternativo es construir una curva de calibración de A en función de c, que será una recta si se cumple la ley de Lambert-Beer (ver fig.1). Interpolando en la recta con la absorbancia de la solución problema se puede determinar su concentración. Una ventaja del método con curva de calibración es que permite usar también un fotómetro de filtro. La pendiente de la curva de calibración se ha llamado factor de calibración, k. Luego:

A = k • c (6) Si se ha usado un espectrofotómetro de buena calidad: k = ε x 1 Si el número de muestras es alto, será más práctico determinar k, desde el gráfico y usar la ecuación (6) que interpolar. 2. DETERMINACIONES A TRAVES DE UNA ENSAYO O "TEST"

Muchos compuestos que no pueden ser determinados directamente (midiendo su propia absorbancia), se pueden determinar por absorciometría usando un ensayo o "test". En el ensayo se agrega uno o varios reactivos cromogénicos que interaccionan o reaccionan específicamente con el compuesto a determinar, generándose un compuesto o complejo que absorbe. Normalmente en los test se genera un color (absorbancia de luz visible), por lo que se denominan ensayos colorimétricos. Casos en los cuales se realiza un test: 1. El compuesto no absorbe en todo el UV/visible:

Ejemplo: Determinaciones de azúcares, determinación de fosfato. 2. El compuesto absorbe en una región espectral (generalmente UV), pero no se puede efectuar

la determinación directa porque la muestra o "solución problema" es una mezcla que contiene otros compuestos que absorben en la misma región que el compuesto a determinar o/y la absorbancia es demasiado baja

Ejemplo: Determinación de proteínas. En este caso además es indispensable un test, si se

analiza una muestra con varias proteínas, de coeficientes de extinción desconocidos. El test se realiza en paralelo con la muestra problema, con una o varias soluciones del compuesto a determinar, de concentración conocida (soluciones patrón o estándar) y con el solvente (blanco del test). Posteriormente se miden las absorbancias "contra" el blanco, es decir, en instrumentos de 1 solo haz, se calibra A = 0 con el blanco en el haz. Alternativamente se pueden medir contra agua, y restar la absorbancia del blanco de todas las absorbancias. Esta A será proporcional a la concentración del compuesto que se va a determinar dentro de cierto rango de concentraciones, específico para cada test. Si se usó solamente una solución, se calcula la concentración por proporción directa: C (problema) = A (problema) C (estándar) A (estándar)

Si se usaron varias soluciones estándar se construye la curva de calibración del test. Para determinar la concentración del compuesto en la muestra problema se puede interpolar en la recta o usar el factor de calibración, como se explicó anteriormente. Es necesario destacar que para un test k no es igual a un producto ε x 1.

Al usar un test, debe tomar en cuenta la posible presencia en la muestra de compuestos que interfieran con el test, señalados normalmente en la literatura, junto al método. BIBLIOGRAFIA (Espectrofotometría) 1. H.Willard, L.Merrit, J.Dean "Instrumental Methods of Analysis". 2. G.Ewing "Instrumental Methods of Chemical Analysis". 3. D. Freifelder, "Physical Biochemisty". 4. S.B.Brown, Ed. "An Introduction to Spectroscopy for Biochemists".

Parte Experimental: En el presente práctico se estudiará la validez de la ley de Lambert Beer para soluciones acuosas de permanganato de potasio. Este compuesto presenta en el espectro visible una banda de absorción ancha, provista de hombros, cuyo máximo está a 525nm (ε = 2.500M-1 cm-1). Para la determinación fotocolorimétrica de sustancias que no absorben en la región del visible, se usa una reacción específica que lleva a la formación de un producto (o productos) coloreado. En estos casos es indispensable construir una curva de calibración para la determinación. Ejemplos típicos son las determinaciones de proteínas (método de Biuret, Método de Bradford, etc). Materiales: Solución de permanganato de potasio 0.1M Matraces aforados de 100 y 10 ml Vasos precipitados 50 ml Pipetas. Procedimiento: 1.- Prepare 100ml de una solución de KMnO4 que tenga absorbancia cercana a 1 a 525 nm. No es necesario efectuar una dilución rigurosamente cuantitativa. Esta solución se usará como muestra problema 2.- Trace el espectro de absorción de la solución problema en el rango espectral 400-600 nm Efectuar las lecturas a intervalos de 10, 5, 2 o 1 nm, determinando la posición de los máximos con mayor exactitud posible. Grafique los valores en papel milimetrado. 3.- Prepare 7 soluciones estándar cuya absorbancia en el máximo cubra en el rango entre 0 y 1.4 Utilice para ello una solución prediluida de permanganato 1mM. Mida la absorbancia de las soluciones en el máximo y a dos longitudes de onda situados en los flancos. En forma previa al práctico: Efectúe los cálculos necesarios para 1 y 3 y prepare una tabla de la siguiente forma: Tabla 1 Solución ml KMnO4

1mM Concentración A (medida)

Nº 525nm ___nm _____nm 1 2 3 4 5 6 7

Contenido del informe adicional: Espectro de absorción del KMnO4

• Cálculo de la concentración de la solución problema • Tabla Nº 1 • Curvas de calibración: Gráfico de A en función de C para cada longitud de onda ( en el

mismo gráfico) • Determinación de la concentración de la solución problema usando la curva de calibración

más adecuada.

Laboratorio 5y 6: Reconocimiento de Hidratos de Carbono

“Métodos cualitativos para la identificación de carbohidratos” (Monosacáridos, Disacáridos y Polisacáridos) 1. Objetivos: Identificar por métodos colorimétricos cualitativos los principales monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. 2. Introducción Los carbohidratos están distribuidos ampliamente en vegetales y animales en los cuales tiene participación estructural, funcional y metabólica. Los carbohidratos se clasifican dependiendo del número de átomos de carbono que posee y la función aldehídica o cetonia, estas a su vez le confiere la base para la mayoría de las reacciones usadas para su identificación y cuantificación. Cuando el carbohidrato está formado por una sola molécula de carbohidrato, se denomina monosacárido, por dos, disacárido y por más de dos, polisacárido. Los disacáridos son azucares formados por la unión de dos monosacáridos mediante el enlace glucosídico. Si este enlace se efectúa entre dos carbonos anoméricos, el disacárido no tendrá el potencial aldehído o cetona libre, por lo tanto no dan positivas aquellas pruebas que involucren la participación de estos grupos, recibiendo el nombre de azúcar no reductor, la sacarosa y la trealosa son ejemplos de los disacáridos no reductores (ver anexos). Todos los disacáridos que posean un carbono anomérico libre, darán positivas estas reacciones, llamándose azucares reductores, debido a que promueven la reducción del reactivo usado y ellos mismos se oxidan. Aunque la mayoría de los disacáridos carecen de importancia para el hombre, con algunas excepciones como la sacarosa, su estudio se debe a que disacáridos como la maltosa y la celubiosa, se originan como producto de la hidrólisis de polisacáridos, la maltosa, por ejemplo, es el producto de la hidrólisis del glucógeno y el almidón. Los polisacáridos, si son abundantes y representan para el hombre la principal fuente de energía metabólica de fácil aprovechamiento, el almidón, constituido por solo moléculas de glucosa es sin lugar a dudas la base alimenticia del globo terrestre, especialmente en la población de bajos recursos. En el anexo, se muestran las estructuras de los principales mono, di y polisacáridos. 3. Material y Metódos A.- Prueba de Molish Es una reacción general para carbohidratos que contienen más de 5 átomos de carbono, la reacción se muestra en la siguiente figura: Fig. 1: Reacción de Molish

B.- Prueba de Barfoed: Es una reacción para identificar monosacáridos, aunque algunos disacáridos (los reductores) dan positiva la reacción, pero con mas tiempo de calentamiento, ya que así se hidroliza el disacárido. El fundamento radica en la reducción del acetato cúprico a oxido cuproso. C.- Prueba de Bial o de Orcinol-HCl Es una prueba específica para pentosas la cual se muestra en la figura 2. La positividad se reconoce por la formación de una coloración verde botella brillante. Fig. 2: Reacción de Bial

D.- Prueba de Seliwanoff: Es específica para cetosas que contengan 5 o más átomos de carbono, pero se usa casi exclusivamente para identificar fructosa. La reacción se presenta en la figura 3. Fig. 3: Reacción de Seliwanoff E.- Prueba de Lugol: Es una prueba que se usa para identificar almidón. El color azul, se debe, posiblemente a la formación de un complejo: Ioduro de almidón.

G.- Prueba de Benedict: Es una prueba específica para las sustancias reductoras con grupos carbonilos libres. Fig. 4 Reacción de la prueba de Benedict cualitativo H.- Prueba Fenilhidrazina Es una prueba para distinguir asas (y oligosacáridos). Los carbohidratos que solo se diferencian en sus átomos de carbono 1 y/o 2 darán la misma osazona, como es el caso de la glucosa y la fructosa, que son isomeros de función. La figura 5 muestra la reacción. Fig. 5 Reacción de la prueba de Fenilhidrazina

Procedimiento: Materiales Tubos de ensayo, mechero, pinzas de madera Prueba Procedimiento: En un tubo de ensayo colocar: Volumen de Molish Sustancia problema 1 ml Reactivo de molish: 2 gotas MEZCLAR Agregar H2SO4 concentrado

Dejar caer lentamente por las paredes del tubo el ácido. La aparición de un anillo violeta-rojizo en el sitio de contacto de los dos líquidos indica que la muestra contiene carbohidratos.

0.50 ml

de Barfoed Sustancia problema 1 ml Reactivo de Barfoed: 2.5 ml Mezclar y calentar en baño de agua hirviente, contando los minutos

y sacra del baño cada tubo inmediatamente después que haya aparecido el precipitado rojo ladrillo de Cu2O. Anotar el tiempo que corresponda a cada carbohidrato. La aparición de un precipitado rojo antes de los 6 minutos indica la presencia de un monosacárido. La aparición de un escaso precipitado rojo, entre los 9 y 12 minutos indica la presencia de LACTOSA o MALTOSA.

de Bial Sustancia problema 1 ml Reactivo de Bial: 1.5 ml MEZCLAR Llevar a baño maría hirviente durante 3 minutos. La aparición de un

color verde botella, brillante y totalmente transparente indica la presencia de una PENTOSA. Algunos azucares dan con el Bial una coloración verde, pero ésta es opaca.

de Seliwanoff Sustancia problema 1 ml Reactivo de Seliwanoff: 2 ml Llevar a baño maría hirviente durante 10 minutos. La formación de

un color rojo cereza indica la presencia de FRUCTOSA.

de Lugol Sustancia problema 2 ml Reactivo de Lugol: 1 gota Mezclar y observar. La aparición de una coloración azul indica la

presencia del ALMIDON y una coloración roja indica el GLUCOGENO o Eritrodextrina. Si el color no cambia, el carbohidrato es un monosacárido o un disacárido.

de Benedict Sustancia problema 0.5 ml Reactivo de Benedict cualitativo: 2 ml MEZCLAR Llevar a baño maría hirviente por 5 minutos. La aparición de un

precipitado verde, amarillo o rojo indica la presencia de un AZUCAR REDUCTOR.

Fenilhidrazina Sustancia problema 2 ml Reactivo de Fenilhidrazina: 5 ml MEZCLAR BIEN Coloque los tubos en agua de baño María hirviendo durante 10

minutos. Al final del periodo de calentamiento, enfríe los tubos en chorro de agua.

DEJAR EN REPOSO POR 5 MINUTOS Examinar al microscopio la forma característica de los cristales de

osazona colocando con mucho cuidado una gota en el portaobjeto. Cubrir con la laminilla cubreobjeto evitando dañar los cristales con movimientos bruscos o exceso de muestra.

Marcha analítica para monosacáridos, disacáridos y polisacáridos

INFORME RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS 1. Complete el siguiente cuadro con la información deseada. En la casilla “Nº

Muestra”, coloque el numero de cada tubo de las muestras problemas que se le entrego. Use los signos (+) o (-), para reportar la positividad o negatividad de la reacción. Sobre la base de los resultados de sus pruebas, Ud. puede identificar la muestra problema. N° Muestra Molish Barfoed Bial Seliwanoff Lugol Benedict

1 2

ANEXO 1.- REPRESENTACIÓN DE FISCHER DE MONOSACÁRIDOS Representación de Fischer de los monosacáridos más frecuentes en la naturaleza:

2.- REPRESENTACIÓN DE HAWORTH Representación en estructuras de Haworth:

• • • • • • • • •

3.- DISACÁRIDOS MAS IMPORTANTES Y ESTRUCTURAS DEL PIRANO Y FURANO. Disacáridos más importantes:

• •

• 4.- ANÓMEROS DE LA GLUCOSA Y REPRESENTACIÓN EN SILLA • • • • •

• • • • • • • • • •

Laboratorio 7 Propiedades de las proteínas Objetivo: Observar las propiedades de las proteínas y cuantificar proteínas con un método colorimétrico. PROPIEDADES

Especificidad Las propiedades de las proteínas dependen de la estructura tridimensional en el medio acuoso, es decir, de los aminoácidos que se disponen en su superficie, que son los que constituyen el centro activo; también de los aminoácidos que se disponen hacia el interior, ya que son los que dan rigidez y forma a la proteína. Cada proteína tiene una conformación según su estructura primaria. Así, un pequeño cambio en la secuencia de aminoácidos provoca cambios en la estructura primaria, secundaria, terciaria, y por tanto pérdida de la actividad biológica.

Solubilidad Las proteínas globulares son solubles en agua, debido a que sus radicales polares o hidrófilos se sitúan hacia el exterior, formando puentes de hidrógeno con el agua, constituyendo una capa de solvatación. Esta solubilidad varía dependiendo del tamaño, de la forma, de la disposición de los radicales y del pH. Desnaturalización Pérdida de la estructura tridimensional o conformación, y por tanto también de la actividad biológica. Se produce al variar la temperatura, presión, pH, electronegatividad, etc. Esto provoca la rotura de los puentes de hidrógeno que mantienen las estructuras secundaria y terciaria, y las proteínas se convierten en fibras insolubles en agua. Si las condiciones son suaves, el proceso es reversible, y si el cambio es más drástico, es irreversible.

Material y Métodos • Tubos de ensayo • Pipetas grad. 5 ml • Mecheros • Baño María • Acido acético • Ac. Nítrico conc. • Solución de NaOH 40% • Solución de NaOH 20% • Solución de sulfato cúprico 1% • Solución de acetato de plomo 5% • Albúmina de bovino • Clara de huevo I. Coagulación de proteínas: Las proteínas, debido al gran tamaño de sus moléculas, forman con el agua soluciones coloidales. Estas soluciones pueden precipitar con formación de coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a los 70° C o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc. La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su denaturación por los agentes indicados, que al actuar sobre la proteína la desordenan por la destrucción de su estructura terciaria y cuaternaria.

Procedimiento: 1.- colocar en un tubo de ensayo algo de clara de huevo ( 3ml aprox.) 2.- añadir 3 ml de acido acético y calentar el tubo a la llama del mechero o en baño maría. II. Reacciones coloreadas a) Reacción xantoproteíca: Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo, cuando las proteínas son tratadas con acido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali vira a un color anaranjado oscuro. Procedimiento 1.- poner en el tubo de ensayo 3 ml de solución de albúmina de bovino 2.- Añadir 1 ml de HNO3 concentrado 3.- Calentar a 100° C en baño maría 4.- Enfriar en agua fría 5.- Añadir gota a gota solución de NaOH al 40%. b) Reacción del Biuret: La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptídico que se destruye al liberarse los aminoácidos. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada biuret, de formula:

NH2 – CO – N – CO – NH2 Que en contacto con una solución de sulfato cúprico diluida, da una coloración violeta característica. Procedimiento 1.- Poner en un tubo de ensayo 3 ml de albúmina de bovino 2.- Añadir 2 ml de solución de NaOH al 20% 3.- A continuación, 5 gotas de solución de CuSO4 al 1%. 4.- Debe aparecer una coloración violeta-rosácea característica. c) Reacción de los aminoácidos azufrados: Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Se basa esta reacción en la separación mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo. Procedimiento 1.- Colocar 3 ml de albúmina de bovino en tubo de ensayo. 2.- Añadir 2 ml de NaOH al 20% 3.- Añadir 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5% 4.- Calentar el tubo hasta ebullición 5.- Si se forma un precipitado de color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro de plomo, utilizándose el azufre de los aminoácidos, lo que nos sirve para identificar proteínas que tienen en su composición aminoácidos con azufre.

Laboratorio 8 Cuantificación de Proteínas INTRODUCCION:

Se han descrito muchos métodos diferentes para la determinación cuantitativa de proteínas. Estos métodos difieren entre sí en sensibilidad, existencia de interferencias, exactitud y sencillez. La selección del método adecuado se realiza considerando las características de las muestras que se desean analizar, que pueden ser extractos de tejidos animales o vegetales, líquidos biológicos de interés en bioquímica clínica (suero, orina), muestras obtenidas en el curso de la purificación de una proteína, fracciones de una columna cromatográfica, muestras de una proteína pura, etc.

En general los métodos utilizados para la determinación cuantitativa de proteínas consisten en la determinación absorciométrica directa o en ensayos de tipo colorimétrico, turbidimétrico o fluorométrico. Absorciometría de proteínas

La mayoría de las proteínas presentan un máximo de absorbancia a 280 nm aproximadamente, debido principalmente a la presencia de residuos de triptófano y tirosina, y en menor proporción fenilalanina. Los residuos de histidina, cisteína y cistina también presentan bandas de absorbancia en el ultravioleta cercano, pero se encuentran a menores longitudes de onda y son de menor intensidad. La posición exacta del máximo de absorbancia, así como el coeficiente de extinción molar de una proteína depende de su composición aminoacídica. Por consiguiente, solamente para soluciones de una proteína pura, conocida, cuyo coeficiente de extinción se ha determinado previamente, se puede calcular la concentración a partir de su absorbancia.

Se han efectuado estimaciones de la concentración total de proteínas en mezcla a partir de la absorbancia a 280 nm (A 280) o usando la razón A 280/A 260 (método de Warburg), que permite corregir el error debido a la contaminación por ácidos nucleicos los cuales presentan un máximo de absorbancia a 260 nm. Las proteínas también absorben fuertemente a longitudes de onda menores a 240 nm, debido principalmente a la contribución de los residuos de aminoácidos aromáticos, así como de los enlaces peptídicos (bajo los 220 nm). La literatura describe métodos para efectuar estimaciones de concentración utilizando la absorbancia en esta región. Sin embargo, todas estas estimaciones pueden llevar a un error considerable debido a la presencia de contaminantes o a una composición aminoacídica atípica. Ensayos colorimétricos

Los ensayos más usados son los de Biuret, de Bradford, de Lowry y el ensayo usando ácido bicinconínico. El ensayo de Biuret se utilizará en el presente práctico. El ensayo de Lowry es de sensibilidad algo menor al de Bradford (0,025 - 0,5 mg/ml), es más confiable, pero es más complicado. Cuantificacion de proteínas por el método de Biuret El reactivo de Biuret (sulfato cúprico en medio alcalino), reacciona con compuestos que contienen dos o más enlaces peptídicos dando una coloración violeta. El color desarrollado se debe a un complejo de coordinación entre el Cu++ y cuatro átomos de nitrógeno que provienen de dos cadenas peptídicas. El método de Biuret sirve para la determinación de concentraciones entre 1 y 10 mg/ml. Los dipéptidos y los aminoácidos (excepto serina y treonina) no dan esta reacción. Interferencias: Péptidos, Tris, sacarosa y pigmentos biliares también generan el color, sales de amonio y sacarosa afectan el color.

PARTE EXPERIMENTAL 1. ENSAYO DE BIURET MATERIALES Reactivo de Biuret: Preparación: Colocar 1.5 g de sulfato de cobre (CuSO4 X 5 H2O) y 6 g de tartrato de sodio y potasio (NaKC4H4O6 x 4 H2O) en un vaso de 1000 ml. Agregar alrededor de 500 ml de agua destilada y agitar hasta disolución. Agregar lentamente y agitando constantemente, 300 ml de hidróxido de sodio 2.5 N. Las dos soluciones deben estar a temperatura ambiente. Agregar 1.0 g de ioduro de potasio y agitar hasta que esté totalmente disuelto. Diluir a 1000 ml y guardar en frasco de polietileno. Este reactivo es estable indefinidamente. (Se entregará preparado). - Espectrofotómetro. - Solución patrón de albúmina 10 mg/ml PROCEDIMIENTO CURVA DE CALIBRACION Atención: realice el ensayo de la muestra en forma paralela a la curva de calibración. - Disponga de seis tubos y coloque en ellos volúmenes de solución estándar que contengan 2;

4; 6; 8 y 10 mg de albúmina. El sexto tubo úselo como blanco, coloque 1 ml de agua destilada en vez de albúmina.

- Complete a 1 ml con agua destilada (De esta forma Ud. ha preparado soluciones de albúmina de la concentración correspondiente al rango del test).

- Agregue 4 ml del reactivo de Biuret - Deje desarrollar color durante 30', luego mida A a 540 nm contra el blanco. (En forma previa

la práctico, prepare una tabla que indique para cada tubo: volumen de agua, volumen de solución estándar, mg/ml (proteínas), A.

DETERMINACION DE PROTEINAS EN UNA MUESTRA - En un tubo coloque 1 ml de la muestra a determinar. Si es necesario, use la muestra

prediluída. - Agregue 4 ml del reactivo de Biuret. - Deje desarrollar color durante 30' y mida A a 540 nm. INFORME Contenido (aparte de lo habitual): - Tablas de valores - Curva de calibración: gráfico de absorbancia en función de concentración. - Calculo de la concentración de la muestra, considerando prediluciones. BIBLIOGRAFIA $ Methods in Enzymology Vol. 3 pág. 447 $ Bradford, M.M., Analytical Biochemistry 72, 248 - 254 (1976).

Laboratorio 9: “Reconocimiento de Enzimas” y “Efecto temperatura y pH sobre la actividad enzimática”

1. Objetivos: Poner de manifiesto la presencia de la enzima CATALASA en tejidos animales y vegetales. Comprobar la acción de la temperatura sobre la actividad de las enzimas y comprobar la acción hidrolítica de la AMILASA. Comprbar el efecto que tiene en la actividad de una enzima las variaciones de pH y temperatura

2. Introducción

Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica. Todas las reacciones químicas del metabolismo celular se realizan gracias a la acción de catalizadores o enzimas. La sustancia sobre la que actúa una enzima se denomina substrato. Pasteur descubrió que la fermentación del azúcar mediante levaduras, con su conversión en alcohol etílico y anhídrido carbónico es catalizada por fermentos o enzimas. En 1897 Buchner logró extraer de las células de levadura las enzimas que catalizan la fermentación alcohólica. Sumner en 1926, aisló en forma cristalina la enzima ureasa, a partir de extractos obtenidos de Cannavalia enzyformis (Fabaceae) la que hidroliza la urea según la siguiente reacción:

UREASA (NH2)2 CO + H2O CO2 + 2 NH3

En 1930, Northrop aisló en forma cristalina las enzimas digestivas: pepsina, tripsina y quimotripsina. En la actualidad se conocen más de 2000 enzimas que han sido aisladas en forma cristalina.

En términos generales los catalizadores se caracterizan por las siguientes propiedades: 1º Son eficaces en pequeñas cantidades. Tienen un número de recambio alto, que varía entre 100 y 36 millones (anhidrasa carbónica). El número de recambio o actividad molar, se define como la cantidad de substrato transformado en la unidad de tiempo por una cantidad dada de enzima, por ej. la catalasa hidroliza 5,6 x 106 moléculas de H2 O2 por molécula de enzima por minuto, por lo que su número de recambio es 5,6 x 106. 2º No se alteran durante las reacciones en que participan. 3º Aceleran el proceso para la obtención del equilibrio de una reacción reversible. 4º Muestran especificidad. La acción de la enzima es extremadamente selectiva sobre un substrato específico. Las enzimas tienen pesos moleculares que oscilan entre 12.000 y un millón. Algunas enzimas son proteínas conjugadas; ya que poseen un grupo no proteico o prostético, por Ej. un azúcar -glucoproteínas, un lípido -lipoproteínas, un ácido nucleico -nucleoproteínas. Una enzima completa se denomina holoenzima, y está formada por una parte proteica (apoenzima) y un cofactor no proteico (coenzima).

HOLOENZIMA = APOENZIMA + COENZIMA Entre los cofactores que requieren las enzimas para su funcionamiento están las coenzimas: NADPH+H (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido), NAD (nicotinamida adenina dinucleotido), FAD (flavina adenina dinucleótido), piridoxal, biotina, tiamina, ácido tetra hidrofólico, cobalamina, etc. Así mismo, muchas enzimas requieren activadores metálicos, y he de allí la importancia de los minerales para el buen funcionamiento y crecimiento de las plantas. Las enzimas son biocatalizadores proteicos esenciales para mantener los procesos metabólicos a velocidades compatibles con la vida, contribuyendo además a su regulación. Debido a su naturaleza proteica las enzimas pueden modificar su actividad por cambios de temperatura y pH, factores que pueden alterar la estructura molecular de la enzima, provocando su desnaturalización.

En general una reacción química aumenta su velocidad de reacción al aumentar la temperatura, pero en el caso de las reacciones catalizadas por enzimas, este efecto se observa sólo entre 0 y 40 ºC, ya que a temperaturas mayores la enzima se desnaturaliza debido a la ruptura de enlaces débiles, principalmente puentes de hidrógeno y la pérdida de su conformación nativa. Debido también a su naturaleza proteica la enzima presenta numerosos grupos ionizables, los que derivan de los radicales de sus aminoácidos constituyentes. Las alteraciones del pH pueden cambiar el grado de ionización de los grupos químicos involucrados en el sitio activo de la enzima, afectando su actividad catalítica. Las enzimas son activas en un rango estrecho de pH, con una actividad máxima a un valor de pH denominado pH óptimo. Por tal motivo la actividad enzimática se mide en presencia de tampones o amortiguadores de pH. La amilasa salival es una enzima que rompe específicamente los enlaces glicosídicos α 1-4 de los polisacáridos. La hidrólisis del almidón por amilasa salival da como producto una mezcla de maltosa, maltotriosa (dextrinas) y glucosa. El almidón es un polisacárido formado por 2 tipos de cadena: amilasa (lineal), que presenta sólo enlaces α 1-4 y amilopectina (ramificada), con enlaces α 1-4 y α 1-6 El almidón se reconoce químicamente por el color azul intenso que desarrolla en presencia de yodo, por lo que la hidrólisis enzimática del almidón se puede determinar por la pérdida del color azul de una mezcla de reacción. 3. MATERIAL Y METODOS Gradilla Pipetas Soluciones de Fehling A y B Trocitos de hígado y tomate Tubos de ensayo Agua oxigenada Baño María Preparación enzimática: Lavado bucal con agua destilada, filtrado y mantenido en hielo. Tampón fosfato 0.1 M, pH 7.0, pH 5.0, pH 6.0 y pH 8.0 solución de Cloruro de sodio 0.03 M solución de almidón 1% p/v Solución de Lugol Almidón Papel Filtro Embudo Soporte Universal y de embudo

1.- Reconocimiento de la Catalasa La Catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y vegetales. La función de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolismo celular, se forma una molécula toxica que es el peróxido de hidrogeno o agua oxigenada. (H2 O2). La enzima descompone el peróxido de hidrogeno en agua y oxigeno, por lo que se soluciona el problema. La reacción de la Catalasa sobre el H2 O2, es la siguiente: 2 H2 O2 2 H2 O + O2 Catalasa REACCION: La existencia de la catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como muchas de las bacterias patógenas son anaerobias mueren con el desprendimiento de oxigeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos actúa sobre el agua oxigenada. En esta primera experiencia vamos a demostrar su existencia:

1. Colocar en tubo de ensayo unos trocitos de hígado 2. Añadir 5 ml de agua oxigenada 3. Se observará un intenso burbujeo debido al desprendimiento de oxigeno.

Nota: Se debe repetir esta experiencia con diferentes tejidos animales y vegetales. Puede ser interesante ir observando la mayor o menor actividad, según el tejido con el que se realice la experiencia. 2.- Desnaturalización de la catalasa. Mediante esta experiencia, vamos a ver una propiedad fundamental de las proteínas, que es la DESNATURALIZACION. Ya que la catalasa químicamente es un proteína, podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al perder la estructura terciaria, perderá también la función y como consecuencia su función catalítica, por lo que no podrá descomponer el agua oxigenada y no se observará ningún tipo de reacción cuando hagamos la experiencia anterior con muestras de tejidos hervidos.

1. colocar en un tubo de ensayo varios trocitos de hígado. 2. Añadir agua para hervir la muestra. Hervir durante unos minutos. 3. Después de este tiempo, retirar el agua sobrenadante. 4. Añadir 5 ml de agua oxigenada. 5. Observar el resultado.

3.- Hidrólisis del Almidón. Mediante esta experiencia, vamos a ver la actividad de otra enzima, la AMILASA o ptialina, presente en la saliva. Esta enzima actúa sobre el polisacárido Almidón, hidrolizando el enlace o-glicosídico, por lo que el almidón se terminara por transformar en unidades de glucosa. Es importante que recuerden las reacciones características de glúcidos para comprender esta experiencia. Procedimiento:

1. Poner en una gradilla 4 tubos de ensayo numerados del 1 al 4. 2. Añadir a cada tubo 5 ml de una solución diluida de almidón 3. A los tubos 3 y 4 añadir una pequeña cantidad de saliva.

% En el tubo 1 hacer reacción de Fehling.

Reacción de Fehling: - Tomar la muestra que se quiera analizar (normalmente una cantidad de 3 ml.)

1. Añadir 1 ml. de Fehling A y 1 ml. de Fehling B. El líquido del tubo de ensayo adquirirá un fuerte color azul.

2. Calentar el tubo al baño María o directamente en un mechero de Laboratorio. 3. La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo-ladrillo. 4. La reacción será negativa si la muestra queda azul, o cambia a un tono azul-verdoso.

Fundamento: Se basa en el carácter reductor de los monosacáridos y de la mayoría de los disacáridos (excepto la sacarosa). Si el glúcido que se investiga es reductor, se oxidará dando lugar a la reducción del sulfato de cobre (II), de color azul, a óxido de cobre (I), de color rojo-anaranjado.

% En el tubo 2 realicen la reacción de Lugol

Reacción del Lugol:

Este método se usa para identificar polisacáridos. El almidón en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol (disolución de yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta característico.

1. Poner en un tubo de ensayo unos 3 ml del glúcido a investigar. 2. Añadir unas gotas de Lugol. 3. Si la disolución del tubo de ensayo se torna de color azul-violeta, la reacción es positiva.

Fundamento: La coloración producida por el Lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molécula de almidón. No es por tanto, una verdadera reacción química, sino que se forma un compuesto de inclusión que modifica las propiedades físicas de esta molécula, apareciendo la coloración azul violeta.

Los resultados son los esperados para un polisacárido como el almidón Los tubos 3 y 4 contienen el almidón, al que se le ha añadido saliva. Colocar los tubos precipitados al baño maría, controlando la temperatura del agua que no hierva, ya que lo que intentamos es que la enzima de la saliva actué a 37 ºC. Mantener por 15 minutos. Después de este tiempo realizar las siguientes reacciones:

• En el tubo 3 realice la reacción de Fehling • En el tubo 4 realizar la prueba de Lugol

El resultado positivo obtenido en el tubo 3 nos indica que la amilasa de la saliva ha hidrolizado el almidón transformándolo en glucosa, por eso la reacción de de Fehling es ahora positiva. De forma similar, se puede interpretar el resultado del tubo 4, ahora nos da la reacción de polisacáridos negativa, ya que el almidón se ha hidrolizado. PROCEDIMIENTO pH y temperatura A.- Efecto de la Temperatura sobre la hidrólisis enzimática del almidón. Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 ml de la preparación enzimática, 1 ml de la solución de cloruro de sodio, 1 ml de la solución tampón fosfato pH 7.0 y 2 ml de solución de almidón. Mezcle suavemente sin agitar e incube durante 15 minutos en las siguientes condiciones: tubo 1 a 0ºC (sobre hielo), el tubo 2 a 37ºC en un baño termorregulado, el tubo 3 a 100ºC (baño maría) y el tubo 4 a temperatura ambiente. Incluya un quinto tubo sin cloruro de sodio en la mezcla de Reacción a temperatura ambiente. Al cabo de los 15 minutos agregue 1 gota de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados.

Tubo 1 2 3 4 5

Solución Almidón 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Tampón fosfato pH 7.0 1 ml 1 ml 1 ml 1ml 1 ml

Sol. cloruro de sodio 1 ml 1 ml 1 ml 1ml -

Preparación enzimática 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Temperatura incubación 0ºC 37ºC 100ºC TA TA

Lugol (gotas) 1 1 1 1 1

B.- Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival. Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 ml de preparación enzimática, 1 ml de solución de cloruro de sodio y 2 ml de solución de almidón. Posteriormente adicione 1 ml de tampón fosfato pH 5.0 al tubo 1, 1 ml buffer pH 6.0 al tubo 2 , 1 ml buffer pH 7.0 al tubo 3 y 1 ml buffer pH 8.0 al tubo 4. Mezcle y deje incubando a temperatura ambiente por 15 minutos. Al cabo de ese tiempo agregue una gota de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados.

Tubo 1 2 3 4 Solución Almidón 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Tampón fosfato 1 ml pH 5.0 1 ml pH 6.0 1 ml pH 7.0 1ml pH 8.0

Sol. cloruro de sodio 1 ml 1 ml 1 ml 1ml

Preparación enzimática 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Temperatura incubación TA TA TA TA

Lugol (gotas) 1 1 1 1

Laboratorio 10: FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA POR LEVADURAS (Sacharomyces cereviceae)

Fundamento: La glucosa es un carbohidrato fermentable por las levaduras. La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado por las levaduras y algunas clases de bacterias. Estos microorganismos transforman la glucosa en alcohol etílico y dióxido de carbono. La fermentación alcohólica, comienza después de que la glucosa entra en la célula. La glucosa se degrada hasta ácido pirúvico, en el proceso denominado glucólisis. Este ácido pirúvico se convierte luego en CO2 y etanol. Los seres humanos han aprovechado este proceso para hacer pan, cerveza, y vino. En estos tres productos se emplea el mismo microorganismo que es la levadura común o Saccharomyces cerevisae. Reactivos: Solución de glucosa (1 g en 100 ml) Reactivo de Benedict. Levadura de panadero seca activa. Procedimiento 1.- En un vaso de precipitado de 25 ml. agregar 10 ml de la solución de glucosa y añadir 0.3 g (la punta de una espátula) de levadura. Agitar hasta que la mezcla sea homogénea. Incube a 37 grados. Realizar la prueba de Benedict a esa mezcla a:

los 30 min., y a la hora y media de incubación.

2.- Para verificar que la solución de glucosa es un azúcar reductor, realice una prueba de Benedict a la solución de glucosa. 3.- Para verificar que la levadura no contiene ningún azúcar reductor, realizar un blanco de reacción (control) de la siguiente manera:

Mezcle 0.3 g (la punta de una espátula) de levadura con 10 ml de agua destilada. Efectúe una prueba de Benedict tomando 0.5 ml de esta solución de levadura.

Nota: La prueba de Benedict se efectúa de la siguiente manera: 1.- Pipetear 0.5 ml. de la solución problema en un tubo de ensayo 2.- Añadir 1 ml. de Reactivo de Benedict. 3.- Calentar en baño de agua hirviente durante 3 min. Si la muestra cambió de color azul a rojo ladrillo, hay presencia de azúcares reductores.

Laboratorio 11: “Determinación de Glicemia” 1. Objetivo: Determinar la concentración de glucosa sanguínea (Glicemia) en una muestra de Sangre. 2. Introducción:

La glucosa es el principal monosacárido del organismo y constituye un metabolito que

aporta energía vital para las funciones celulares. El catabolismo de la glucosa se realiza durante la glicólisis. Su determinación en sangre es útil para el diagnóstico y monitoreo de trastornos en el metabolismo de los hidratos de carbono, como la Diabetes Mellitus, hipoglicemias, tumores de los islotes pancreáticos y otras patologías. 3. MATERIAL Y METODOS: - Gluco tester - Lancetas - Tiras reactivas para determinación Glucosa en sangre - Algodón (tórulas) - Alcohol 70% - Guantes desechables - Actividades :

Determinación de glicemia. Se utilizará un instrumento para la determinación enzimática de la concentración de glucosa en una muestra de Sangre Discuta los resultados obtenidos y realice un informe, pudiendo considerar el anexo proporcionado a continuación:

ANEXO: METABOLISMO GLUCIDICO La glicemia normalmente se encuentra en el rango de 70 – 110 mg/dL. Normalmente una glicemia en ayunas superior a 126 mg/dl es francamente sospechosa de diabetes Mellitus. Pueden encontrarse hiperglicemias severas (400 mg/dl). r La principal causa de hiperglicemia es la Diabetes Mellitus, una enfermedad endocrina altamente prevalente en nuestro país, afectando a una 5% de la población. Sin embargo pueden existir otras causas de hiperglicemia. Otras causas de Hiperglicemia: Hipofisiarias, suprarrenales, tiroideas, infección aguda, encefalopatía, tóxicos, infarto miocardio, pancreatitis aguda, diabetes gestacional. Causas de Hipoglicemia: Esfuerzos musculares agotadores, hiperinsulismo, tratamiento insulínico, insuficiencia suprarrenal, hipotiroidismo, afecciones hepáticas, trastornos de la nutrición y digestivos, afecciones nerviosas, alcoholismo agudo. Cualquier alteración metabólica relacionada con la glicemia puede asociarse a la alteración de otros analitos como: hemoglobina glicosilada, insulina, glucagón, péptido C, glucosuria (concentración de glucosa en orina), proteinuria, albuminuria, etc.

INSULINA: Hormona producida por el páncreas que es esencial para la utilización de la glucosa por la célula. Esta hormona se encuentra en concentraciones normales en el plasma entre 2 –5 µU/mL. En condiciones patológicas como la obesidad y en los diabéticos obesos adultos, la insulinemia basal suele ser alta y luego de la administración de glucosa su aumento es tardío y alcanza cifras superiores a lo normal (250 µU/mL o más). En la diabetes juvenil se observa una disminución de insulina en ayunas, pero sobre todo una falta de respuesta de secreción de insulina frente a la ingesta de glucosa. PEPTIDO C: La insulina es una proteína que se secreta como una pro-hormona. En el plasma sufre una hidrólisis que conduce a la hormona activa más un péptido denominado PÉPTIDO C, el cual tiene una vida media biológica superior a la de la insulina. La determinación de este péptido es útil para determinar la actividad secretora de las células beta del páncreas, aún en los enfermos tratados con insulina es un índice indirecto de la secreción de insulina endógena residual del paciente diabético. Valores ayuno: 2,10 ng/mL Post-prandial: 4,2 ng/mL HEMOGLOBINA GLICOSILADA HbA1c: Los prolongados estados de hiperglicemia que presentan los pacientes diabéticos, conducen a la glicación no-enzimática de las proteínas. Una proteína susceptible a glicarse es la hemoglobina, cuya vida media es de 120 días, por lo tanto, la glicación de la hemoglobina indica que el paciente no ha tenido un buen control de su glicemia durante los 120 días previos a la evaluación de este parámetro. En otras palabras es una forma indirecta de evaluar la glicemia promedio de los 2 a 3 meses previos Valores referencia: 6.2% a 8.2% PROTEINURIA: Los pacientes diabéticos suelen presentar durante el curso de su patología, la denominada Nefropatía diabética, que es un tipo de insuficiencia renal. La proteinuria o concentración de proteínas en la orina es un buen indicador de la función del riñón. Normalmente la excreción de proteínas por la orina puede alcanzar unos 200 mg/24 horas o 20 mg/dL. Las proteínas que en condiciones normales aparecen en la orina son: la proteína de Tamm-Horsfall (40-70 mg) y la albúmina (10-20 mg). Rangos superiores a 20 mg/dl requieren exploración adicional y cifras superiores a 250 mg/24 requieren exploración uronefrológica. . Sobre 1000-2000 mg/24 hay que sospechar de insuficiencia renal avanzada. MICROALBUMINURIA: La microalbuminuria se define como pequeñas cantidades de albúmina que son excretadas en la orina, por sobre los niveles considerados normales. Estos valores pueden ocurrir entre 30 a 300 mg/24hr., cifras superiores son consideradas como macroalbuminuria y se asocian a insuficiencia renal severa. La nefropatía en la diabetes insulino dependiente puede ser reconocida en sus fases iniciales a través de la pesquisa de la microalbuminuria. Además de la diabetes Mellitus, la Hipertensión Arterial es otra condición que puede conducir a microalbuminuria. La microalbuminuria es considerada como un marcador precoz de daño renal.

Valores normales: hasta 10 mg/L

NOTA Emia: sufijo con el cual se denomina la concentración de un determinado analito en el suero o plasma Uria : sufijo con el cual se denomina la concentración de un determinado analito en la orina. Procedimiento: Se entregará con anticipación el protocolo del Kit a utilizar para este procedimiento.

Laboratorio 12: “Determinación de Colesterol y TG” 1. Objetivos: Determinar colesterol en una muestra de sangre 2. Introducción:

El Perfil lipídico consta de la determinación de Colesterol Total, triglicéridos y colesterol-

HDL. Adicionalmente, con estos parámetros se puede calcular el colesterol de LDL. El Colesterol es una molécula de naturaleza esteroidal con un grupo hidroxilo secundario en la posición C3. Se sintetiza principalmente en el hígado y se absorbe aquel que proviene de la dieta. Se estima que aproximadamente tres cuartos de colesterol se forman por neo síntesis y una cuarta parte proviene de la dieta. Los triglicéridos son ésteres de glicerol, un alcohol trivalente con tres ácidos grasos de cadena larga. Una parte de ellos se ingiere por la dieta y se transporta a través de los quilomicrones (triglicéridos exógenos). El hígado además sintetiza triglicéridos, los cuales son transportados a través de la VLDL (triglicéridos endógenos). El colesterol de HDL o lipoproteínas de alta densidad representa el transporte de colesterol desde los tejidos periféricos hacia el hígado, para su posterior excreción por la vía biliar. Este proceso de denomina, transporte reverso de colesterol, una ruta esencialmente antiaterogénica. Valores elevados de HDL protegen contra las cardiopatías coronarias, mientras que valores disminuidos de HDL, especialmente en combinación con triglicéridos elevados se asocian a un elevado riesgo cardiovascular. El colesterol de LDL o lipoproteína de baja densidad es proveniente del catabolismo de las VLDL (lipoproteína de muy baja densidad) y constituye una fuente de aporte de colesterol para ciertos requerimientos celulares como son: la síntesis de membranas, síntesis de hormonas esteroidales, síntesis de ácidos biliares y síntesis de vitamina D. La determinación del perfil lipídico sirve para el screening del riesgo aterogénico de un determinado paciente. 3. MATERIAL Y METODOS: - Kit Para medición de Colesterol y TG - Muestra de Suero - Guantes desechables - 4. Procedimiento: Se les entregará el Protocolo del Kit a utilizar con anticipación.