日皮会誌:95 (2), 145―155, 1985 (昭60）

絶賛状表皮発育異常症に発生したエクリン

　　汗器官癌由来培養細胞株の性状

　　　本　田　まりこ　　新　村　具　人

　　　　　　　　　　要　　旨

　比贅状表皮発育異常症患者に発生したエクリン汗器

官癌由来の培養細胞株を樹立し，その性状について検

索した．細胞は37歳男子の腹腔内転移巣より得られ，

37℃，5％Ｃ０２下で20%FBS添加Eagle's MEM を培

地として静置培養された．培養細胞は多角形で敷石状

に増殖し，重積傾向およびドーム形成がみられた．電

顕的に徴絨毛を有し，細胞質内および細胞間に管腔を

形成する傾向がみられた．小型のデスモソームと少数

のトノフィラーｘソトが認められたが，ウイルス粒子は

みられなかった．染色体数は86にモードを有する低４

倍体で，狭い範囲に分布し, t(4p-;9p゛？)が認めら

れた.ＢＡＬＢ/ｃマウス皮下での初代生着率は5/5であ

り,腹腔内移植では5/5に癌性腹膜炎による血性腹水を

みた．電顕像や酵素組織化学により培養細胞はエクリ

ン汗器官癌由来の腫瘍が示唆された．免疫組織学的検

索ではＤＡＫＯ社の乳頭腫ウイルス粒子に対する抗血

清では培養細胞および腹腔内転移巣細胞は陰性であっ

たが，患者より分離したウイルスで免疫した家兎抗血

清ではヒト乳頭腫ウイルス関連抗原が核および細胞質

内に認められた. Southern法によるウイルスゲノムの

検索で腹腔内転移巣および継代11代までの培養細胞中

にウイルスＤＮＡが検出されたが，継代17代の細胞中

にはウイルスゲノムは認められなかった．

　　　　　　　　　　緒　　言

　把贅状表皮発育異常症(epidermodysplasia　ver-

ruciformis, EV)は疲風様皮疹が幼児期より全身に多

発し,30歳を過ぎると種々の皮膚悪性腫瘍が多発する．

東京慈恵会医科大学皮膚科

Mariko Honda and Michihito Niimura : Character-

　ization of eccrine carcinoma established in tissue

　culture from ａ patient with epidermodysplasia

　verruciformis

昭和59年６月26日受付，昭和59年10月３日掲載決定

別刷請求先:（〒105)東京都港区西新橋3 －19－18

　東京慈恵会医科大学皮膚科　本田まりこ

本症の疲風様皮疹の角層および穎粒層の核内には多数

のtこト乳頭腫ウイルス(hｕｍａｎ　papillomavirus.

ＨＰＶ)が認められ，このウイルスが悪性腫瘍の発生に

何らかの役割をはたしているものと考えられ，現在

様々な検索が進められており，ＥＶ患者の皮膚悪性腫

瘍細胞中およびリンパ節転移巣の細胞中にウイルス粒

子としてではなく，ＨＰＶ-ＤＮＡがプラスミドＤＮＡと

してextrachromosomalに存在しているということ

が明らかにされている1)~3).

　今回，我々はＥＶ患者の腹部皮膚に発生したエクリ

ン汗器官癌腹腔内転移巣由来細胞を培養し，約２年間

の継代培養を重ね，なお旺盛に増殖しているので，そ

の培養経過および性状について述べるとともに培養細

胞とＨＰＶとの関連について興味ある結果を得たので

報告する．

　　　　　　　　　　方　　法

　培養材料:37歳,ＥＶ患者男性.腹部皮膚に発生した

皮膚悪性腫瘍腹腔内転移巣のうち１個を選び，培養材

料とした．転移巣は胡桃大で，淡紅色充実性の腫瘍．

外部は白色の結合織で被われている．中心部をさけ，

培養に供した．

　培養方法：材料を１ｍｍ大に細切し，プラスティク

シャーレに各々５個入れ,37℃，5％Ｃ０２下で静置培養

した．培養液は20%fetal bovine serum (ＦＩｏｗ社)加

Eagle's MEM (GIBCO)で，培養液の交換は３～４日

ごとに行った．

　培養経過：培養第１日目に組織片の周囲に小円形細

胞が多数認められた．第３日目より線維芽細胞様細胞

と突起をださない上皮様細胞の２種類のoutgrowth

がみられた．第４日目より敷石状に配列する細胞がか

なり増殖し, outhgrowthがこの細胞だけからなるも

りと線維芽細胞様細胞との混在がみられるものとが認

められた．線維芽細胞様細胞は可及的にガラス棒でか

きとった．上皮様細胞は，大小不同はあまりみられず

若干の異型性を示す程度で重積傾向は認められない．

培養１ヵ月後より上皮様細胞の増殖は遅くなった．培

養２ヵ月目で濾紙法によりクローニング施行，培養液

146 本田まりこ　　新村　真人

をHAM Flo, 10%fetal calf serum, 2.5% donner

horse serum, 2 % non-essencial amino acid (Flow

社)に変更．培養３ヵ月目より上皮様細胞が除々に増

殖しはじめ，継代２代目より安定した増殖がみられる

ようになった．

　抗ＨＰＶ-ＥＶ抗体作製：患者角質より分離精製4)し

たウイルスをFreund complete adjuvant (ＤＩＦＣＯ)

とともに家兎の足底に注射し, Ouchterlony法にて抗

体の産生を確認してから脱血し，血清を分離した．正

常人角質および皮膚にて吸収を行った．

　蛍光抗体間接法：既に我々が報告した方法5)で行っ

た．一次抗体として抗papillomavirus抗体(ＤＡＫＯ

社),抗ＨＰＶ-ＥＶ抗体を使用し，60倍にＰＢＳで希釈し

た．なお，プロテアーゼ処理は行わなかった．

　ＤＮＡ抽出：精製ウイルスと培養細胞はそのまま

を，癩風様良性皮疹と腹腔内転移巣の組織は凍結粉砕

してからSDS, Proteinase Ｋ (Merck社)処理した後，

フェノールにて抽出した．

　ＤＮＡの電気泳動：制限酵素のBam HI, Eco RI,

Hind III(宝酒造)で切断したＨＰＶヽＤＮＡと細胞より

抽出したＤＮＡを１％アガロースゲル上で電気泳動し

た後,エチジウムブロマイドで染色し,ＵＶランプ下で

観察した.

　32Pによる標識：ＨＰＶ-ＤＮＡをニックトラソス

レーションにより32Pで標識(Amersham社)した.

　Blotting　hybridization : アガロースゲル中の

ＤＮＡをアルカリ変性した後, Southern法6)によりニ

　トロセルロースフィルター上に移す32p標識ＨＰＶ･

ＤＮＡとの問にhybridizationを行い,各組織の細胞に

ＨＰＶ｡ＤＮＡフラグメソトの有無の検索をした．

　　　　　　　　　　結　　果

　腹腔内転移巣の組織学的所見

　1) HE染色所見

　腹腔内転移巣の一部では，クロマチソに富む

basaloidの細胞が索状あるいは島嶼状の細胞塊を形

成(図１)．他の部位では細胞質と核の明るい細胞が巣

状に増殖し，管腔形成傾向がみられる．核は大小不同

がみられ，時に分裂像が散見される(図２)．ごく一部

であるが，角化傾向もみられる．腫瘍巣は結合線維束

に被われる.

　2)電顕所見

　細胞内に多数のグド=･－ゲソ穎粒を有し，小型のデ

スモソームや少数のトノフィラメソトがみられる．ま

た，管腔形成傾向がみられ，短い微絨毛を有している．

一部，細胞内管腔も認められる，なおウイルス粒子は

見られない（図3）.

　3）ＰＡＳ染色

　ほとんどの細胞はジアスターゼ消ｲﾋ性ＰＡＳ陽性の

グリコーゲン穎粒を有するが，管腔壁を構成する細胞

や管腔内容物はジアスターゼ抵抗性である.

　4) Succinic dehydrogenase

　腫瘍細胞はsuccinic dehydrogenase陽性である.

　5) Carcinoembryonic antigen （ＣＥＡ）

　酵素抗体法5）によりＣＥＡの局在を調べたところ，管

腔壁を構成する細胞と管腔内容物のみ陽性所見を得

た．なお，患者血清中のＣＥＡ値は4. 5ng/mlと上昇が

みられた．

　培養細胞の性状（継代11～13代）

　1）形態

　継代３日目：大小不同の１核～多核の細胞で敷石状

に配列する．細胞は突起を有することもあり，また数

個の細胞が集まって，環状を示すところもみられる．

浮遊細胞もみられ互いに集まって細胞集団をなす（図

４）．

　継代１ヵ月目：重積傾向がみられ，一部球状のドー

ムを形成（図５）．また，各所に細胞内空胞がみられ，

空胞のために印環細胞様となっている．

　電顕所見：ドームは１層の細胞よりなり，重積傾向

の認められたところも細胞間小運河が多数みられる

（図６）．個々の細胞は徴絨毛を有し，細胞間に小型の

デスモゾームが認められる．細胞質に多数のグリコー

ゲン穎粒がみられ，また少数のトノフィラメソトも散

見される（図7）.

　2）増殖動態

　植込み数1×10=cells/dishでは，６日目まで指数的

に増殖し，倍加時間は31.7時間，細胞密度は2.7×lov

ｃｍ２であり，コロニー形成率は43.0%である（図8）.

　3）染色体数

　染色体数は86にモードを有する低４倍体で，狭い範

囲に分布（図９）．核型分析の結果，t（4p- ； 9p+?）

が認められた（図10).

　4）ヌードマウス生着率

　ＢＡＬＢ/Ｃ（ｎｕ/十）マウス皮下での初代生着率は，培

養細胞1×107個で5/5であり，移植後１ヵ月で造腫瘍

が認められた（図11).培養細胞1×107個の腹腔内移植

では移植後２ヵ月で5/5に癌性腹膜炎による血性腹水

をみた.

　5）ＰＡＳ染色

把贅状表皮発育異常症の培養癌細胞

図１　腹腔内転移巣組織所見.クロマチンに富むbasaloidの細胞が索状あるいは島嶼

　状の細胞塊を形成.×200

回孤延臭果芦夢ごFT－塑S阿:

=

14=:＼↓……日=ﾍﾟ:

……゜7

=

゜:………゛:ﾉl……=万……::ﾀﾞ……i

=:1………:17ﾉ:gjﾕ,万,:

I

J羅誦i頑IS漣屈指eg犀頴

図２　腹腔内転移巣組織所見．細肌質と核の明るい細胞の腫瘍巣，管腔形成傾向がみ

　られる.×200

　培養細胞はジアスターゼ消化性ＰＡＳ陽性のグリ

コーゲンを有するが，ドームを構成する細胞はジアス

ターゼ抵抗性である.

　6) Succinic dehydrogenase

147

　培養細胞も腹腔内転移巣細胞と同様にsuccinic de-

hydrogenase陽性である.

　7）ＣＥＡ

　一部の細胞にＣＥＡの局在が認められたが，培養１

148 本田まりこ　　新村　貝人

図３　転移巣腫瘍細胞の電顕所見．微絨毛（Ｖ）や細胞内管腔（Ｌ）がみられ，エク

　リソ汗器官由来細胞の所見を示す.×200

皿兪船積箭，絲心≪!. ･-Jt-%.聯昌いに皿

図４　継代３日目の培養細胞，大小不同の１核～多核の細胞で敷石状に配列する．

週後の培養上清中のＣＥＡ値（ＳＲＬ）は0.7ng/mlとご

く微量にすぎなかった．

　以上の所見より腹腔内転移巣および培養細胞はエク

リン汗器官癌が示唆された.

　8）その他ウイルス学的検索

　i)抗papillomavirus抗体

　培養細胞は電顕的にウイルス粒子は認められず，抗

papillomavirus抗体(ＤＡＫＯ社)での免疫組織学的検

索でも陰性を示した．しかし‥脆者ウイルスより作製

した抗ＨＰＶ-ＥＶ抗体を使用し，ＨＦＶ-ＥＶ粒子だけで

紀贅状表皮発育異常症の培養癌細胞

図５　継代１ヵ月目の培養細胞，球状のｄｏｍｅを各所に形成する．

図６　ｄｏｍｅの電顕所見，１層の細胞より形成されている.×2,000

149

150

細胞数

1×107

1×106

1×105

本田まりこ　　新村　偉人

・

●●=－

F.ご参

図７　培養細胞電顕所見，細胞間に不完全なデスモソームがみられ，微絨毛，多数の

　グリコーゲン穎粒を認める.×5,000

１

２　３　４

　　　日

５　６　７　８

数

図８　培養細胞のgrowth curve

なくＨＰＶ-ＥＶ関連抗原の検索を施行した結果，一部

の細胞の核および細胞質に陽性所見を得た(図12).ま

た，この所見は腹腔内転移巣細胞でも同様であった．

なお，この抗ＨＰＶ-ＥＶ抗体はＥＶの良性皮疹のウイ

ルス粒子の存在する核だけでなく病変部の基底細胞を

除くすべての細胞質を染色させ，正常部位と明らかに

細胞数

20

10

81 82 83 84 85 86 87 88 89 90

　　　　　染色体数

図９　培養細胞の染色体分布

区別ができる屯のである（図13).

　iD患者ＨＰＶ-ＤＮＡの電気泳動パターソ

　λファージＤＮＡを制限酵孝Hind Ill で切断し，モ

の電気泳動パターンをマーカーとしてＨＰＶ-ＤＮＡフ

ラダｙソトの塩基対数を計算するとHind IIIでは7.5

Kb, 6.9Kb, 5.2Kb, 4.4Kb, 2.8Kb, 2.0Kb, 0.55Kb,

Eco ＲＩでは7.5Kb, 5.5Kb, 1.85Kb, Bam ＨＩでは7.5

川|に‖｡| |４似付|‖|縦

付川川川川|‖

痢贅状表皮発育異常症の培養癌細胞

10

図10　染色体核型分析. t (4p- ; 9p+り）が認められた．

図11　7－ドマウス；培養細胞1×107個移植後3ヵ月

　目の皮下腫瘍

Kb, 3.78Kb, 2.1Kb,1.4Kbのフラダｊ‘ソトが得られ

た．ＨＰＶ-ＤＮＡの塩基対数は約8Kbであるので，この

方法では7.5Kbとやや低めに算出された. HPV-DNA

の制限酵素切断パターソより，この患者はＨＰＶ-5以外

に少なくとも３種類のＨＰＶ感染が考えられた．すな

わち，ＨＰＶ-５ＤＮＡはHini Illで5.2Kbと2.0Kb, Eco

ＲＩでは5.5Kbと1.85Kb, Bam ＨＩでは7.5Kbのフラ

ダメソトに相当するが, Hind Ill ではその他に５本の

バンドが認められる.塩基対数の総和を計算すると7.5

Kb, 6.9Kb十〇.55Kb, 4.4Kb+ 2.8Kbの３つの組合せ

が考えられ，ＨＰＶ-5以外に３種のウイルスが混在する

ことが推定される（図14九

　iii) HPV-5 DNA をprobeとしたSouthern法

151

　ミネソタ大学分子生物学教室に依頼し, Southern法

によるウイルスゲノムの検索でＨＰＶ-５ＤＮＡが,培養

細胞の継代４代も11代の細胞中に認められたが，患者

正常皮膚と継代17代の細胞中には検出されなかった

(図15).

　iｖ)患者�Ｖ-ＤＮＡをprobeとしたSouthern法

　患者は少なくとも４種類のＨＰＶ感染が考えられた

ので，このすべてのＨＰＶ-ＤＮＡを32Pでラベルし，こ

れをprobeとして検索したところ，患者癩風様皮疹と

腹腔内転移巣細胞中にＨＰＶ-ＤＮＡが検出された八

患者リンパ球や継代17代の培養細胞中には認められな

かった．また，疲風様良性皮疹と腹腔内転移巣細胞中

のＨＰＶ-ＤＮＡのバンドの位置が異なっていた(図

16).

　　　　　　　　　　考　　按

　乳頭腫ウイルス(papillomavirus)は本来皮膚や粘膜

に良性腫瘍である虎贅を発生させるＤＮＡウイルスの

１つであり，ヒト，ウシ，ウサギ，ウマ，イヌ，シカ

などそれぞれの動物に個有の乳頭腫ウイルスが存在す

る7).乳頭腫ウイルスはpolynucleotide sequenceの

50％以上の相違を示す時，１つの型(タイプ)とし，

現在ＨＰＶは26型8)に分類されている．この中で発癌と

関係があると考えられているものは, 3,5,8型など

のＥＶ患者から分離されるウイルスタイプ9)と6, 11,

16,18型の泌尿生殖器系のウイルスタイプ1o)である．こ

れらのウイルスと発癌との関係はいろいろな角度から

調べられている昿未だ確証は得られていない.ＥＶ患

152 本田まりこ　　新村　箕人

図１２　HPV-EV関連抗原陽性所見（蛍光抗体間接法）．一部の培養細胞に認められ

　る.×400

図13　巌風様良性皮疹のＨＰＶ-ＥＶ関連抗原陽性所見(ＰＡＰ法)．ウイルス粒子の存在

　する核だけでなく病変部の基底細胞を除くすべての細胞質に認められる.×200

23.1Kb一一

　9.4 ｡

　６．６一一･

　４．４一一

　２．３一一一一

　２．０－／Ｉ

λ

洗贅状表皮発育異常症の培養癌細胞

Hind 111　EcoRI　Bam HI　Uncut

図14　患者ウイルスＤＮＡの制限酵素切断パターソ，

　数種のウイルスタイプの感染が考えられる．

23,1

RＥr

ｙで工ＡＧＥ　＋工三こΞ

０ＡＳＴＲＩＬ　ＣＡＺＣＥＲ

［く一一

LＹＭＰ工ＯＯべｆｍ

MＥＴＡＳＴＡＳIＳ

口［Ｚ一〇Ｚ［［いＩ〇Ｚ

工つく

　　　　　　…

………４∧十・ﾌﾟ

　　　　　　　　　‥　ノ▽………」-,jUI尚.=,j｝轡ピ

　　　　　＝　………:：　　　　……］……:日･J jG万態犬

　　　　‥　　　　．････．　　　．・　　．．．･･･日=:i日1ﾘﾜ,回flE:日

図16　アガロース電気泳動（上段）と患者HPV-DNA

　をprobeとしたSouthern法（下段）

　巌風様良性皮疹と腹腔内転移巣中にＨＰＶ-ＤＮＡが

　検出される．

レ

ー皿皿臨「………………」」

』 ｛・゛

｝｛｝

」……゛

」゜ ……゛ 」゛・

｛～三灘

図１５　HPV-5 DNA をprobeとしたSouthern法

者に発生した皮膚悪性腫瘍中にウイルスゲノムの検出

の報告はあるが，これらは良性皮疹からのウイルス混

入を否定はできない．しかし，我々はウイルスの混入

が考えにくい転移巣細胞内にもウイルスゲノムの存在

することを既に発表した1).この現象を更に証明する

ために転移巣由来細胞株が必要と考え,今回,ＥＶ患者

に発生したエクリン汗器官癌腹腔内転移巣由来細胞株

樹立に成功したので，その培養経過およびその性状に

ついて述べ，また，ＨＰＶとの関係についても触れた．

　ＨＰＶ-５ＤＮＡの検索で，培養細胞の継代初期すなわ

ち継代４代と11代にウイルスゲノムが検出されたが，

継代17代では検出されなかった．樹立株の得られた患

者は，そのウイルスの制限酵素切断パターソから５型

以外に数種類のタイプのＨＰＶ感染が考えられた．

従って，得られた数種類のＨＰＶを含有ＤＮＡをすべ

てニックトラソスレーショソ法により32Pでラベル

し，これをprobeとしてSouthern法を行った.その結

果,知風様良性皮疹と腹腔内転移巣内にはHPV-DNA

がみられたが,継代17代ではＨＰＶ-５ＤＮＡと同様に検

出されなかった. Leventon-Kissら12)もjuvenile lar-

yngeal papillomatosisからの細胞株においてHPV

関連抗原が同様に継代初期の細胞だけに認めている．

　この患者は，日光裸露部以外にもエクリン汗器官腫

154 本田まりこ　　新村　真人

瘍が体の各所に発生し，これらの発生にウイルスが明

らかに何らかの役割をはたしているものと考えられる

が，ウイルス自体にoncogeneを持っているものとは

考えにくい. HPV-5はbovine papillomavirus 1型13)

と同様にウイルス自体にoncogeneを持つという報

告11)もあるが，仮にoncogeneを持っているとしたら

他の腫瘍ウイルスと同様に100％感染細胞を悪性化さ

せるはずである．しかし，ＥＶ患者の1/3のみに悪性腫

瘍が発生し，しかも疲風様良性皮疹のすべてが癌化す

るわけでない．従って，ＨＰＶ-ＤＮＡだけではなく他の

要因も加わって始めてcellular oncogeneが活性化し

癌化するものと考える．

　しかし，ひとたびＨＰＶ-ＤＮＡがcellular oncogene

を活性化させると子宮頚癌における単純ヘルペスウイ

ルスと同様に，細胞の維持増殖には不必要となり切り

出されるのかもしれない．この考えはhit-and-run

ｍｅｃｈａｎｉＳｍｌ５)といわれ，単純ヘルペスウイルスDNA

はげっ歯動物の細胞を癌化させる八癌化した細胞中

にはすでに単純ヘルペスウイルスＤＮＡは含まれてい

ないということに基づく．転移巣細胞および継代初期

の培養細胞中にHPV-DNAは検出されたが, HPV-

ＥＶ関連抗原は癌細胞のすべての細胞中に存在せず，

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5）本田まりこ，村上京子，仲田佳子，大関武，新村真

一部の細胞のみであった．これは単に細胞周期の違い

やHPV　geneの表現の差異によるものだけでなく，

ＨＰＶ-ＤＮＡ自体の存在の有無を示していると思われ，

ＨＰＶ-ＤＮＡが細胞の維持増殖に必要とされていない

ことを物語っていると考えられる.０ｒthら16)もin situ

hybridization法で調べるとすべての癌細胞中に

ＨＰＶ-ＤＮＡは保持されておらず,約1/10,000個の割合

であるとしている．しかし, HPV-DNAのごく一部の

ＤＮＡが存在している場合，検出されない可能性があ

るので,更に検討を加えていく必要があると思われる．

また，叛風様良性皮疹から検出されるＨＰＶ-ＤＮＡの

電気泳動パターンが転移巣細胞中とは異なっていたこ

とは何を意味するか今後検索する必要があろう．

　本論文の要旨の一部は第47回日本皮膚科学会東日本学術

大会，第45回The societyforinvestigativedermatology,

第83回日本皮膚科学会学術大会にて発表した．稿を終える

にあたり，御指導,御助言を賜った東京慈恵会医科大学第１

細菌学教室大野典也教授,吉本真先生,同大学第２解剖学教

室石川　博助教授に厚く御礼申し上げます．

　なお，本研究の一部は武田科学振興財団および日本リ

ディアオリリー協会の研究助成金によった．附記して謝意

を表する．

文　　献

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