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7/25/2019 Cel Mad Adip1

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CIRUGAPLSTICA IBERO-LATINOAMERICANA

Cir.plst. iberolatinoam.-Vol. 39-Supl. 1-2013/Pag. S44-S50

Resumen

La terapia basada en clulas madre adultas constituyela forma de tratamiento ms innovadora para la regenera-cin de los tejidos patolgicos, ausentes o deficitarios;tambin de relleno esttico apropiado para variedad de in-dicaciones cosmticas y reconstructivas, y una de las l-neas prioritarias de investigacin traslacional en todo elmundo, evitando los problemas de rechazo inmune de loshomotrasplantes, las complicaciones inherentes a la im-plantacin de otros materiales aloplsticos, las secuelas

estticas o funcionales de las zonas donantes de los auto-trasplantes de mayor morbilidad, y los problemas ticosdel uso de clulas madre embrionarias.

El cirujano plstico tiene un papel protagonista tantoen la extraccin del injerto de clulas madre del abdomenmediante una liposuccin manual tumescente, como en laaplicacin clnica rpida sobre distintos defectos, defor-midades o prdidas de sustancia.

Presentamos el protocolo de extraccin y procesa-miento de clulas madre derivadas del tejido adiposo(ADSC) aprobado por el Comit tico de InvestigacinClnica, que resulta ser factible, seguro y reproducible,pudiendo servir de gua de actuacin para el diseo denuevos estudios clnicos controlados sobre la eficacia delautotrasplante de clulas madre aplicados a muchas otraspatologas en el universo de la Ciruga Plstica en el queest comprometida la cicatrizacin.

Palabras clave Tejido adiposo,

Lipoinfiltrado, Clulas madre.

Cdigo numrico 19-104-15841

Abstract

Adult stem cells-based therapy represents the most in-novative treatment to regenerate the pathologic tissues(absent or lacking), to replace like with l ike as an aes-thetic filler for a variety of cosmetic and reconstructiveindications, and is one of the trending translationalresearch lines all over the world; avoiding the host im-mune response and implant rejection problems of thehuman allotransplants, the inherent complications due tothe implantation of alloplastic materials, the functional

and aesthetic secuelae of donor sites in high morbidityautotrasplants, and the bioethical problems with the useof embrionary stem cells. Plastic surgeon has a relevantrole such in the extraction of the cellular graft from theabdomen by means of a tumescent manual liposuction,as in the quick clinical application to different defects,deformities and losses of substance. The protocol of ex-traction and processing of adipose derived stem cells(ADSC) approved by the Clinical Researching EthicalCommittee is presented as a feasible, safe and reprodu-cible guide for the design of new controlled clinical stu-dies about the efficacy of the stem cell autotrasplants forthe treatment of many pathologies inside the universe ofplastic surgery in which scarring process is compromi-sed.

Key words Adipose tissue,

Lipofilling, Stem cells.

Numeral Code 19-104-15841

Serna-Cullar, E.

Protocolo de extraccin y procesamiento de

clulas madre adultas del tejido adiposoabdominal: coordenadas del cirujano pls tico en

la investigacin traslacionalProtocol of extraction and process ing of adult s tem ce lls from

abdominal adipose tissue : coordenates of the plas tic surgeon intranslational res earching

Serna-Cullar, E.*, Santamara-Sols, L.**

* Facult at ivo Es ec ia lis t a de rea . Unidad de es tin c ln ica de Ciru a Pl s tic a Recons truct iva . Hos ita lUnive rs it ario Mar us de Va lde -


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Serna-Cullar, E., Santamara-Sols, L.

Introduccin

La Medicina actual y, por ende, la Ciruga Plstica,Reparadora y Esttica, se apoya y gira en torno a proce-dimientos salvavidas de trasplantes del mismo indivi -

duo (autotrasplante) o de distintos individuos de la mismaespecie (homotrasplante). Los avances en la conserva-cin y transporte de rganos, los nuevos medicamentosinmunosupresores e inmunomoduladores, el perfeccio-namiento del instrumental y de los materiales quirrgi-cos, y la depuracin tcnica de manos especializadas,apoyadas en la microciruga, ha permitido que sean ha-bituales los trasplantes de rganos y tejidos como rin,hgado, corazn, pulmn, pncreas, intestino, hueso, car-tlago, msculo, tendones o piel; de unidades funcionalescomo extremidades o manos; incluso de unidades estti-cas como cara, tringulo orofacial o folculos piloseb-ceos. A pesar de los 1643 trasplantes ejecutados en 2011,la demanda aumenta y el 50% de los pacientes en lista deespera para algn trasplante no acaban beneficindosedel procedimiento.

Ante esta realidad, investigadores y clnicos, han es-timulado y potenciado las donaciones humanas, se hanrealizado muchos estudios de factibilidad y rechazo conxenotrasplantes, pero sobre todo, se ha dirigido el es-fuerzo hacia la proliferacin y diferenciacin de clulasmadreprogenitoras, embrionarias o adultas, in vitro e invivo; y de clulas madre adultasmultipotenciales de m-

dula sea (1,2), sangre perifrica o de tejidos residentes(3-5). El trasplante no slo tiene que ver con la dicotomavida/muerte, sino que tiene un impacto crucial en la ca-lidad de vida de los pacientes; incluso se indican tras-plantes con finalidad esttica adems de reparadora,reconstructiva, recuperadora o reemplazadora.

Estamos en una nueva era de la Medicina, que persi-gue la regeneracin de los tejidos biolgicos mediante eluso de clulas madre vehiculizadas por estructuras de so-porte (matrices o moldes reabsorbibles o biodegradables)y estimuladas por molculas bioactivas como los factoresde crecimiento (6,7). Estos tres son los componentes in-

tegrantes de la ingeniera tisular, que pueden representarseen un tringulo equiltero, interactuando conti-nuamente entre s. De los tres, en muchos aspectos las c-lulas son el paso crtico o limitante de la triada regenera-tiva, pues a diferencia de matrices, protenas y molculas,no pueden manufacturarse y deben ser extradas, purifi-cadas y replicadas sin alterar su potencial terapetico, ensuficiente cantidad, antes de su aplicacin clnica.

De la misma manera, esta ciencia implica la colabo-racin multidisciplinaria de bilogos, bioqumicos, cien-tficos de biomateriales y clnicos. Por sus conocimientosen Biologa de los trasplantes, anatoma quirrgica y es-

tructura y funcin del tejido adiposo, por su capacidadtcnica para la extraccin mnimamente invasiva de in-

de esttica (trasplante celular, injerto celular, relleno ce-lular, adhesivo celular), el cirujano plstico debe recla-mar su papel protagonista en este terreno (8).

La fuente de clulas para ingeniera tisular dependede los requerimientos de la estructura que va a ser rege-

nerada. Las clulas madre embrionarias son pluripoten-ciales y se aslan de la masa interna de los blastocistos.

Aunque conservan gran capacidad de diferenciacin, tie-nen algunos problemas que deben ser resueltos antes desu aplicacin clnica: cultivo celular sin exposicin a pro-tenas animales, desarrollo potencial de tumores hamar-tomatosos y teratomas, y rechazo inmunolgico por partedel husped. Actualmente, las clulas madre adultas re-tienen todava un grado de multipotencialidad, son msventajosas para su diferenciacin preeminente hacia teji-dos de extirpe mesodrmica, como el hueso (interdepen-dencia entre la adipognesis y la osteognesis); y seextraen del tejido adiposo unilocular (Fig.1) desde quese demostr que ste es la fuente ms abundante de c-lulas madre adultas multipotenciales, en numero 10 a1000 veces mayor que de la mdula sea (9).

La pared abdominal es una zona habitual de depsitograso, dividido en compartimentos superf icial y profundopor el sistema fascial circunferencial (Fig.2). Por sus ca-ractersticas de rpido acceso, acmulo graso abundanteo suficiente, versati lidad y fcil manejo, y de extraccinmnimamente invasiva del tejido adiposo con muy bajondice de complicaciones y secuelas, el compartimento

profundo del tejido celular del abdomen se elige comozona donante ideal del tejido adiposo para aislar las c-lulas madre adultas.

Material y MtodoDescribimos a continuacin de manera detallada el

protocolo y mtodo de terapia celular en Ciruga Plstica

Extraccin del lipoaspiradoDespus de desinfectar la zona donante con povidona

iodada y preparar el campo quirrgico, se inyecta mepi-

Fig . 1 . Tej ido adiposo uni locular m aduro adul to ex t ra do de l abdom en: fun-


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Protocolo de extraccin y procesamiento de clulas madre adultas del tejido adiposo abdominal: coordenadas del cirujanoplstico en la investigacin traslacional

vacana al 1% en la piel umbilical inferior para incidirluego 3 mm con hoja de bistur del n11. Se practica unaliposuccin manual tumescente con frmula anestsicade Klein modificada (500mg lidocana 5% + 12,5 meqde H2CO3Na + 1mg de adrenalina 1:100.000 en 1 litrode Ringer Lactato fro), mediante cnulas perforadas convarios orificios, de 3 y 4 mm de dimetro y distinto di-seo, conectadas a jeringas de 50 cm3 en las que se prac-tica vaco con freno. La disrupcin mecnica de loslobulillos de tejido adiposo en el espesor del comparti-

mento profundo del hemiabdomen inferior permite obte-ner un lipoaspirado (Fig.3), que se trasvasa a tubos delaboratorio de 50 cm3, llenando nicamente 20 cm3 de sucapacidad.

Procesamiento del lipoaspiradoTRATAMIENTO FSICO: se rellena el tubo de labo-

ratorio con igual volumen de suero fetal bovino (10)(Fig.4), se agita y se centrifugan los tubos a 3000 revo-luciones por minuto (rpm) (900g) durante 2 minutos. Seobtiene un centrifugado con 3 capas diferenciadas. Su-perior: adipocitos rotos, cidos grasos libres y triglicri-

dos, que se elimina mediante capilaridad. Inferior:solucin salina, anestsico local y clulas hemticas, que pocitos) y estroma (matriz extracelular de tejido fibroso

Fig . 2 . Tomo grafas com putarizadas s in (2a) y con cont ras te (2b), en las q uese a precian los co mpa rt ime ntos ab dom inales de g rasa supe rfic ia l (S) y pro-fundo (D), sep arado s por e l s i s tem a fas cia l c ircunferencia l (f lecha s).

F ig . 3 . Lip o su c c i n t u mes cen t e man u a l d e l co mp ar t ime n t o p ro fu n d o d e la b d o m e n .

Fig . 4 . Relleno de los tub os con igual volume n de sue ro fe ta l bovino , quese rn ag i tad o s y cen t r ifu g ad o s a 3 0 00 rp m d u ran t e 2 m in u t o s .

Fig . 5 . Tubo d e labora torio co n te j ido a diposo p urif icad o de spu s de e l imi-nar la capa superior del cent ri fugado (adipoci tos ro tos, c idos grasos l i -b re s y tr ig lic rid o s ) p o r c a p ila rid a d y e l e s tr a to in fe rio r d e l c e n t rifu g a d o(lquido anes ts ico , s uero , c lu las hem t icas) por drena je gravitac ional .


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TRATAMIENTO ENZIMTICO: la matriz extrace-lular se digiere con colagenasa al 0,075% durante 30 mi-nutos a 37C. Se inactiva despus la enzima con igualvolumen de medio de cultivo y se centrifuga la mezcla a250g durante 10 minutos. Tras desechar el lquido y grasaindeseables, se obtiene un precipitado de alta densidad

proveniente del lipoaspirado (Fig. 6).TRATAMIENTO QUMICO: se resuspende el preci-pitado en 2 cm3 de cloruro amnico 160mM (NH4Cl) du-rante 10 minutos a temperatura ambiente para lisar losrestos de hemates y se realiza una tercera centrifuga-cin de esta solucin a 250g durante 1 minuto. Se aade1 cm3 de medio de cultivo al centrifugado.

Cultivo celularSe realiza una incubacin inicial del precipitado en

medio de cultivo Eagle modificado de Dulbecco, con un10% de suero fetal bovino (10) y un 1% de penicilina y

estreptomicina, en condiciones de 37C y un 5% CO2. Enesta fase se aprecian clulas fusiformes y estructuras es-

las clulas fijas de la placa se mantienen en el incubadoren las mismas condiciones. Cuando el nivel de subcon-fluencia celular alcanza el 70%, hecho que sucede entreel 5 y 7 da (Fig. 8), se incuban las clulas con tripsinaa 37C para disgregarlas, se lavan con suero fetal bovino

y se recogen finalmente en 1 cm3 de solucin Ringer Lac-tato.

RESULTADOSLa Sociedad Internacional de Terapia Celular esta-

blece unos criterios rigurosos de comprobacin de querealmente las clulas obtenidas son clulas madre:

Adherencia al plstico en 24 horas. Morfologa fusiforme a las 30 horas (anloga a fi-

broblasto). Verificacin de la expresin de ms de 95% de

marcadores de clulas madre mesenquimales pro-venientes del tejido adiposo mediante citometrade flujo: CD 29, CD 44 y CD 90 positivos; ymenos de un 2% de expresin de marcadoresCD 45, CD 34, CD144 y CD106.

Diferenciacin posible a adipocitos, condrocitos yosteoblastos.

Fig . 6 . Tubo de laboratorio con prec ip i tado de a l ta de nsidad .

Fig . 7 . Incub acin in ic ia l: c lu las con ram ificac iones y es t ructuras es fero i-d e s q u e c o r re sp o n d en a re s t o s d e g ra sa . Fo t o g ra fa en co n t ra s t e d e fa se ,s in te i r, de cu l t ivo de c lu las m adre 300x.

Fig . 8 . Nivel de s ubco nfluenc ia c e lu lar c erca no a l 70%. Fotog rafa e n co n-t raste de fas e , s in te i r, de cul t ivo de c lu las ma dre 100x.


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La caracterizacin celular se practic en conjuncincon los departamentos de Anatoma Patolgica, BiologaMolecular y Farmacologa, utilizando tcnicas de cito-metra de flujo, inmunofluorescencia indirecta e inmu-nohistoqumica. Se obtuvieron los siguientes marcadorescelulares positivos: CD34 (Fig.9), C-kit (Fig.10),

-actina (Fig.11), desmina (Fig. 12), vimentina (Fig.13),keratina (Fig.14). El marcador de las clulas melnicas

optimizacin del cultivo de clulas madre adultas. Paraello, se estudia el ritmo de crecimiento celular en otrosmedios de cultivo, la evolucin de la expresin de mar-cadores durante el periodo de proliferacin y el anlisisdel efecto de distintos productos biolgicos y qumicosen las clulas.

Estas clulas tienen dos propiedades bsicas:1. A medida que se dividen, tienen el potencial de re-

Fig. 10. C-kit+.

Fig. 11.lfa-actina +.

Fig. 12. Desmina + .

Fig. 13. Vimentina+.

Fig. 14. Kera tina +.

Fig. 15. S100-.


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para diferenciarse a otros tipos celulares disminuyecon la edad.

2. Potencial diferenciador hacia distintos tipos celu-lares. El cultivo de estas clulas en medio Eaglemodificado de Dulbecco con un 10% de suero fetal

bovino (10) y suplementados con diferentes sus-tancias, estimula su diferenciacin hacia clulas deextirpe:ADIPOGNICA: isobutilmetilxantina 0,5mM+dexametasona 1M+ insulina 1 M+ indometa-cina 200 M + 1% antibitico. OSTEOGNICA: dihidroxivitamina D3 0,1M+ fosfato 2 ascrbico 50 M + glicerofosfato10 Mm + 1% antibitico. CONDROGNICA: insulina 6,25 g/ml +TGF1 10 ng/ml + fosfato 2 ascrbico 50 Nm +1% antibitico.

MIOGNICA: hidrocortisona 50 M + 1% an-tibitico.NEUROGNICA: mercaptoetanol 5-10 mMsin suero fetal bovino.

Demostracin objetiva en todas ellas de la multipo-tencialidad de las clulas madre adultas provenientes deltejido adiposo abdominal.

Discusin

En la clnica, se ha probado el uso preliminar de c-lulas madre en distintas patologas (11), y se estn lle-vando a cabo numerosos ensayos clnicos en fase III yIV que evalan la seguridad, factibil idad y reproductibi-lidad a largo plazo de esta nueva tcnica, cumpliendo losestrictos criterios bioticos. A este respecto la AgenciaEspaola del Medicamento y Productos Sanitarios(AEMPS) recuerda y advierte textualmente que:

La oferta directa a ciudadanos y pacientes de dis-tintas terapias basadas en la manipulacin de c-lulas madre de diferentes orgenes y postuladaspara el tratamiento de las ms variadas enferme-dades y condiciones clnicas est contribuyendo a

generar cierta confusin en la sociedad. Se ad-vierte del uso premeditado de determinada termi-nologa mdica en situaciones que nada tienen quever con el tratamiento de enfermedades humanas.

Con la excepcin de los trasplantes de precursoreshematopoyticos, las terapias con clulas madreutilizadas para el tratamiento de cualquier tipo deenfermedad son consideradas medicamentos y, portanto, su desarrollo, autorizacin y uti lizacin deberealizarse de acuerdo con las normas especficasestablecidas para este tipo de medicamentos en Eu-ropa y Espaa. Hasta la fecha, no hay ningn

medicamento basado en clulas madre que estcomercializado en Espaa, por lo que la ofertade dichos tratamientos fuera de las tres exce cio-

logos, queratinocitos para tratamiento de quema-dos y clulas troncales limbocorneales para lesio-nes corneales, y de los ensayos clnicos o el usocompasivo autorizados por la AEMPS, es ilegal.

En el caso particular de los cosmticos, de acuerdo

con la reglamentacin, estos productos no puedencontener derivados de origen humano, por lo quela utilizacin de clulas madre humanas en pro-ductos comercializados es ilegal. Los productos abase de clulas madre humanas en tratamientoscon finalidades estticas tambin tienen la consi-deracin de medicamento, por lo que les resultande aplicacin los mismos principios que el restode tratamientos basados en clulas madre: demos-trar su calidad, seguridad y eficacia en ensayos cl-nicos adecuados que permitieran al ciudadanosaber los efectos y posibles riesgos de su utiliza-cin. Hasta la fecha no se ha autorizado ningnmedicamento de este tipo con fines estticos, porlo que su presencia en el mercado se consideraigualmente ilegal.

Los tratamientos que se basan en clulas madre deorigen vegetal no tienen ninguna relacin con lasclulas madre de origen humano y no se ha de-mostrado que posean ninguna utilidad en el trata-miento de enfermedades. No obstante, si as sepostulara, sus efectos deberan ser probados en en-sayos clnicos adecuados y les resultaran de apli-

cacin los mismos principios. La utilizacin deeste tipo de clulas en cosmticos u otro tipo deproductos para tratamientos estticos no est rela-cionada con la prevencin, tratamiento o diagns-tico de las enfermedades humanas. La utilizacinde la misma terminologa busca, en muchas oca-siones, aprovechar el aspecto novedoso de las te-rapias con clulas madre para trasladarlo a otrosmbitos ajenos al contexto mdico.

Este aviso para navegantes delimita en nuestro pasactualmente el uso y posibilidades de la Terapia Celulara grupos de investigacin traslacional (rpida aplicacin

clnica) formados por un equipo multidisciplinar (concirujano plstico incluido!), dotados de una infraestruc-tura especfica y tcnicas avanzadas de Biologa Mole-cular y Celular, que trabajan en un Instituto de Inves-tigacin vinculado a un Hospital Universitario con unComit de tica de Investigacin Clinica, y con el apoyoacadmico, institucional y econmico necesarios. El ci-rujano plstico inmerso en este grupo debe conocer elproducto que maneja (clulas madre mesenquimales pro-venientes del tejido adiposo), su procedimiento de ob-tencin y procesamiento (liposuccin y lipoaspirados) yel productor (insti tucin, patrocinador, departamentos de

investigacin) (12).Otra estrategia para uso clnico desde un abordaje de


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mediante una matriz o molde, intentando fabricar un im-plante neoadiposo: enriquecimiento con clulas madreadultas para mejorar la supervivencia de los injertos degrasa, al favorecer la angiognesis y minimizar la res-puesta inflamatoria (13), o su combinacin con cido po-

lilctico o con colgeno frente a esponjas de cidohialurnico. Sin embargo, son necesarios ms estudiospara avanzar en el conocimiento de las seales ntimasimplicadas en la diferenciacin celular, las interaccionesentre las clulas y la matriz, y de la biologa de los mor-fogenes relacionados con el tejido adiposo (14).

Conclusiones

El tejido adiposo abdominal es la fuente ms abundantey accesible de clulas madre mesenquimales, por su fcily rpida disponibilidad y su aplicacin clnica con muy

baja morbilidad. En aplicaciones clnicas preliminares yensayos de investigacin, los injertos de clulas madrehan originado un proceso de cicatrizacin progresiva efec-tiva, sin observarse fenmenos de rechazo ni de prolifera-cin celular incontrolada; aunque se requiere unseguimiento a largo plazo del comportamiento de las c-lulas y su efecto en determinadas patologas clnicas.

El protocolo de investigacin presentado es seguro,factible y reproducible; puede servir de gua central y esperfectamente extrapolable, implantable y asimilable porotros grupos. Pero cada uno debiera trabajar y crecer sobresu propio mtodo y modificaciones; buscar y ensayar suspropias aplicaciones clnicas en el relleno, cobertura, obli-teracin o cicatrizacin de mltiples defectos, y realizar suanlisis y comprobacin objetiva de los resultados obte-nidos segn Medicina Basada en la Evidencia.

Llegado el momento en que la colaboracin del ciru-jano plstico en cada grupo de investigacin sea habitualy d sus frutos clnicos, estamos convencidos de que el t-tulo de nuestra especialidad ser Ciruga Plstica, Est-tica y Regenerativa.

Direccin del autor

Dr. Eduardo Serna CullarUnidad de Gestin Clnica de Ciruga PlsticaReconstructiva.Hospital Universitario Marqus de Valdecil la.

Avenida Valdecil la s/n39008 Santander, Cantabria, Espaae-mail: [email protected]

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