55
ĆELIJSKE KULTURE

ĆELIJSKE KULTURE

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Biologija

Citation preview

Page 1: ĆELIJSKE KULTURE

ĆELIJSKE KULTURE

Page 2: ĆELIJSKE KULTURE

ĆELIJSKE KULTURE

UVOD

Kultura ćelija podrazumijeva održavanje ćelija u vještaĉki kontroliranojsredini koja pogoduje njihovom rastu.

Prvo uspješno kultiviranje animalnih ćelija izvršio je Ross Harrison 1907. god., kada je, pokušavajući posmatrati razvoj nervnih vlakana, uspio kultivirati tkivo embriona žabe 1-4 sedmice.

Šira upotreba ove tehnike poĉela je kasnih 1940. i ranih 1950. godina.

U ranom periodu tehnike kulture ćelija uglavnom se radilo o iznalaženjunaĉina prevazilaženja problema kontaminacije (razvoj antibiotika).

U novije vrijeme, glavno obilježje razvoja ove tehnike je njena komercijalizacija. Kultivirati se mogu ćelije, tkiva i organi.

Page 3: ĆELIJSKE KULTURE

ĆELIJSKE KULTURE

LABORATORIJ ZA ĆELIJSKE KULTURE

UVsvjetlost

Uređaj zasterilizaciju

Dezinfekcijska sredstva

Zaštitna odjeća i rukavice

Laminar

Page 4: ĆELIJSKE KULTURE

ĆELIJSKE KULTURE

LABORATORIJ ZA ĆELIJSKE KULTURE

Inkubator

Temperatura: obiĉno 37ºC za ćelije sisara

Vlažnost zraka: spreĉava isparavanje medija

CO2: najĉešće 5%, održavanje pH.

Page 5: ĆELIJSKE KULTURE

ĆELIJSKE KULTURE

LABORATORIJ ZA ĆELIJSKE KULTURE

Mikroskopi

Standardni Inverzni

Page 6: ĆELIJSKE KULTURE

ĆELIJSKE KULTURE

LABORATORIJ ZA ĆELIJSKE KULTURE

Centrifuge Kontejneri sa tečnim azotom

Page 7: ĆELIJSKE KULTURE

ĆELIJSKE KULTURE

USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ĆELIJA

Za uspješan rast humanih ćelijskih kultura neophodno je obezbijeditisljedeće uslove:

SterilnostTemperaturaKoncentracija CO2

pHAdekvatan sastav i količina hranjivog medijaPosude za kultivaciju

Page 8: ĆELIJSKE KULTURE

USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ĆELIJA

STERILNOST

Mogi mikroorganizmi rastu intenzivnije i brže od humanih ćelija u kulturi, a većina njih proizvode toksine koji štete kultiviranim ćelijama i na kraju mogu uzrokovati uništenje kulture.

Kontaminanti ćelijskih kultura mogu voditi porijeklo iz organizma ĉije se ćelije kultiviraju ili iz okolne sredine (obiĉno iz zraka)

Da bi se sprijeĉio unos kontaminanata, potrebno je pridržavati se osnovnih pravila aseptiĉne tehnike koja podrazumijevaju:

Izbjegavanje kontakta sterilnog pribora ili posuĊa, koji dolaze u direktnikontakt s uzorkom, sa nesterilnim priborom i golim rukama

Izbjegavanje kašljanja, kihanja, priĉanja ili disanja direktno nad sterilnimpriborom koji dolazi u direktni kontakt s uzorkom

Page 9: ĆELIJSKE KULTURE

USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ĆELIJA

STERILNOST

Adekvatna upotreba odgovarajuće opreme

Rad sa kulturama iskljuĉivo u laminaru sa protokom sterilnog zraka

Lice koje radi sa kulturama ćelija mora biti adekvatno odjeveno (mantil,rukavice, maska za lice)

Sterilizacija pribora upotrebom autoklava ili suhog sterilizatora i korištenje plastiĉnog sterilnog materijala za jednokratnu upotrebu.

Page 10: ĆELIJSKE KULTURE

USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ĆELIJA

STERILNOST

Smanjenje mogućnosti kontaminacije kulture postiže se dodavanjemantibiotika u medije.

Antibiotici su komercijalno dostupni i pripremljeni za ćelijske kulture i obiĉno sadrže: penicilin, streptomicin, kanamicin ili gentamicin.

Fungicidi: nistatin i fungizon, obiĉno se dodaju u primarne ćelijske kulture,da bi se sprijeĉila infekcija Candidom albicans.

Kontaminacija primarnih ćelijskih kultura virusima obiĉno je posljedica prisustva virusa u ćelijama prije biopsije.

Virusne infekcije obiĉno su hroniĉne i ne ubijaju domaćinske ćelije u kulturi.

Page 11: ĆELIJSKE KULTURE

USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ĆELIJA

TEMPERATURA

Optimalna temperatura za humane ćelijske kulture je 37ºC.

Blago povećanje temperature povećava stopu umnožavanja ćelija do odreĊenog nivoa. Kada se postigne gornji prag, dalje povećanje temperature djeluje inhibitorno na rast ćelija.

Temperature ispod 37ºC usporavaju ćelijski metabolizam i rast kulture.

Temperatura u inkubatoru ne smije varirati više od ±0.25ºC.

Više temperature djeluju štetnije na kulture, od nižih. Kratkotrajno izlaganjetemperaturi višoj za 3ºC od normalne može dovesti do smrti cijele kulture.

Iste kulture mogu preživjeti kratkotrajna izlaganja temperaturi nižoj za 10ºCod normalne.

Page 12: ĆELIJSKE KULTURE

USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ĆELIJA

TEMPERATURA

Ćelijske kulture izvedene iz odreĊenih tkiva, kao i pojedine ćelijske linije, mogu zahtijevati nešto drugaĉiju teperaturu za optimalan rast.

Primjer: normalna temperatura testisa je znaĉajno niža od tjelesne temperature i iznosi 33ºC, zato je za odvijanje spermatogeneze in vitro potrebno održavati tu temperaturu.

Ćelije insekata, crva i riba npr., zahtijevaju znaĉajno niže temperaturekultivacije od 37ºC.

Page 13: ĆELIJSKE KULTURE

USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ĆELIJA

PH MEDIJA

Optimalan pH za kutivaciju je 7.0-7.4

Ovaj pH u kulturi se održava zahvaljujući puferima koje medij sadrži ikoncentraciji gasova u inkubatoru.

Uobiĉajeno je da se za najveći broj ćelijskih linija u inubatoru održava mješavina gasova: 5%CO2 i 95% atmosferski zrak.

Page 14: ĆELIJSKE KULTURE

USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ĆELIJA

SASTAV I KOLIČINA HRANJIVOG MEDIJA

Sastav medija mora biti podešen za odreĊeni tip ćelija.

Najĉešće korišteni mediji su RPMI 1640, MEM (minimal essential medium) iĈangov medij.

Ovi osnovni mediji sadrže veliki broj materija koje ćelije trebaju za uspješan rast u kulturi, kao što su: neorganske soli, aminokiseline i vitamini.

Važno je u medij dodati antibiotike da bi se smanjila mogućnost kontaminacije (najĉešće penicilin/streptomicin).

Mediji sadrže L-glutamin, a za kulture limfocita periferne krvi neophodan jemitogeni stimulator-fitohemaglutinin.

U kompletnom mediju za ćelijsku kulturu neophodan je serum (najĉešćeBSA-goveĊi serum albumin).

Page 15: ĆELIJSKE KULTURE

USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ĆELIJA

SASTAV I KOLIČINA HRANJIVOG MEDIJA

Uloga seruma nije razjašnjena ali je dokazano da bez njega ćelije u kulturi ne mogu preživjeti dugo.

Održavanje pH kompletnog medija obezbjeĊuje prisustvo puferskih soli.

Primjer sastava medija za kultivaciju epitelnih ćelija:

200 mL RPMI 1640 (bazalni medij)42.5 mL serum (BSA)2.5 mL L-glutamin5.0 mL otopine penicilina/streptomicina

Page 16: ĆELIJSKE KULTURE

USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ĆELIJA

POSUDE ZA KULTIVACIJU

U zavisnosti od tipa ćelija koji se kultivira, potrebe kultiviranja u otvorenom ili zatvorenom sistemu, kao i specifiĉnosti eksperimenta koji se izvodi, bira se adekvatna posuda za kultivaciju.

Preferira se upotreba plastiĉnih sterilnih posuda namijenjenih za jednokratnuupotrebu.

Najĉešće se koriste multiwell ploĉe, T-flaskovi zapremine 25-75 mL, Petri posude i tube za centrifugiranje sa konusnim dnom, zapremine 15 mL.

Page 17: ĆELIJSKE KULTURE

USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ĆELIJA

POSUDE ZA KULTIVACIJU

Page 18: ĆELIJSKE KULTURE

USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ĆELIJAPOSUDE ZA KULTIVACIJU

S p i nn er bo tt l es / f l a s k s : staklene boce sa centralnom teflonskom drškom sa magnetom; uzgoj ćelija u suspenziji

Ro ll er bo tt l e s : plastične boce; ćelije prianjaju za unutrašnju površinu boce

Page 19: ĆELIJSKE KULTURE

POHRANJIVANJE ĆELIJSKIH KULTURA

Ćelije se pohranjuju zamrzavanjem (krioprezervacija).

Osnovni princip uspješne krioprezervacije je postepeno zamrzavanje i brzo odmrzavanje. Obiĉno se hlaĊenje obavlja brzinom 1 do 3ºC po minuti, a otapanje tako što se zamrznute ćelije stave u vodenu kupelj na 37ºC.

Ćelije koje su namijenjene za krioprezervaciju moraju biti vijabilne - preko 90%, ne smiju pokazivati znakove mikrobne kontaminacije i moraju biti u log fazi rasta (ne smiju biti konfluentne, tj. ne smiju dostići najveću gustoću).

Potrebno je da su u visokoj koncentraciji seruma/proteina (obiĉno oko 50%).

Koristi se krioprotektant, dimetilsulfoksid (DMSO) ili glicerol, koji štite ćeliju odstvaranja ledenih kristala. Najĉešće se koristi DMSO koncentracije 10%. Nakonotapanja ćelija, DMSO se uklanja centrifugiranjem.

Ćelije se mogu na neodreĊeno vrijeme pohraniti u teĉnom azotu (˂135ºC).

Page 20: ĆELIJSKE KULTURE

PRIMARNE ĆELIJSKE KULTURE I

SUBKULTIVIRANJE

Kada se iz nekog organizma biopsijom ili hirurški odstrane fragmenti odreĊenog tkiva, a zatim stave u odgovarajuću vještaĉki kontroliranu sredinu za kultiviranje, ćelije će se vezati za podlogu, dijeliti se i rasti.

Ovo je primarna ćelijska kultura.

Ćelijska kultura može se smatrati primarnom do njenog prvog subkultuviranja(pasažiranja).

Termin kratkotrajne kulture se koristi za primarne ćelijske kulture koje se nemogu subkultivirati.

Primarne ćelijske kulture koje su dobijene od jedne ili nekoliko ćelija i koje su vezane za podlogu, rastu tako da formiraju koloniju koja se naziva primarnom kolonijom.

Page 21: ĆELIJSKE KULTURE

PRIMARNE ĆELIJSKE KULTURE

Dvije osnovne metode dobijanja primarnih ćelijskih kultura su:

Kulture eksplantata – mali komadići tkiva se, uronjeni u medij, vežu za dno plastiĉne ili staklene posude, a zatim se kroz nekoliko dana pojedinaĉne ćelije izdvajaju iz tkivnih eksplantata i vežu za podlogu posude ili ostaju u mediju (zavisno od tipa ćelija) gdje poĉinju da se dijele i rastu.

Enzimska disocijacija – rašireniji i brži metod koji podrzumijeva disocijaciju tkiva na pojedinaĉne ćelije proteolitiĉkim enzimima kolagenazom ili tripsinom. Ovim se dobija suspenzija pojedinaĉnih ćelija koje se zatim stavljaju u posude sa kultivacijskim medijem u inkubator gdje se dijele i rastu.

Page 22: ĆELIJSKE KULTURE

SUBKULTIVIRANJE (PASAŽIRANJE)

Kada ćelije u primarnoj kulturi ispune sav raspoloživi prostor (dno posude ili medij) potrebno je premjestiti ćelije u nove posude sa svježim medijem. Ovaj postupak oznaĉen je kao pasažiranje.

Odvajanje kultiviranih ćelija od dna posude postiže se kratkotrajnim izlaganjem tripsinu ili veoma nježnim struganje specijalnim špatulama.

Ostatak ćelija u suspenziji može se krioprezervirati uz pomoć dimetilsulfoksidaili glicerola na -130ºC.

Kasnije, po potrebi, odlediti i ponovo kultivirati.

Page 23: ĆELIJSKE KULTURE

SISTEMI ĆELIJSKIH KULTURA

Dva su osnovna sistema ćelijskih kultura. Razlika izmeĊu ovih sistema je zasnovana na sposobnosi ćelija da se vežu za podlogu staklene ili plastiĉne posude.

Sistemi jednoslojnih ćelijskih kultura

U ovim sistemima kultiviraju se ćelije koje imaju sposobnost vezanja napodlogu, gdje rastu u jednom sloju.

Jednoslojne kulture se uglavnom održavaju u T-flaskovima, Petri posudama, multi-well posudama i tubicama.

Na ovaj naĉin kultiviraju se fibroblasti, epitelne ćelije, amniociti, većina tumorskih ćelija i dr.

Page 24: ĆELIJSKE KULTURE

SISTEMI ĆELIJSKIH KULTURA

Sistemi ćelijskih kultura u suspenziji

Obiĉno se kultiviraju uz mućkanje u Erlenmajer posudama. U nekim sluĉajevima se kultiviraju bez mućkanja u T flaskovima i tubicama.

Na ovaj naĉin kultiviraju se limfociti, koštana srž, kao i odreĊeni tipovi tumora(neuroblastomi i limfomi).

OdreĊeni tipovi uzoraka mogu se kultivirati na oba naĉina (ćelije limfnihĉvorova).

Page 25: ĆELIJSKE KULTURE

SISTEMI ĆELIJSKIH KULTURA

Sistemi ćelijskih kultura mogu biti otvoreni i zatvoreni.

To zavisi od toga da li je ĉep posude u kojoj se kultura uzgaja zatvoren djelimiĉno ili potpuno.

U otvorenim sistemima, ćelijske kulture razmjenjuju gasove sa okolnom atmosferom, dok zatvoreni sistemu nemaju tu mogućnost.

Zatvoreni sistemi imaju manju mogućnost kontaminacije mikroorganizmima, alizato gomilaju produkte ćelijskog metabolizma koji mogu biti toksiĉni.

Page 26: ĆELIJSKE KULTURE

TIPOVI ĆELIJA U KULTURI

Kultivirane ćelije se na osnovu morfologije i izgleda mogu podijeliti u triosnovna tipa:

1. E-tip, epitelu sliĉne ćelije: rastu vezane za podlogu, izgledaju pljosnato ipoligonalnog su oblika.

2. L-tip, limfoblastima sliĉne ćelije: u kulturi nisu vezane za podlogu, ostaju ususpenziji i semisuspenziji, taložeći se na dnu posude i sferiĉnog su oblika.

3. F-tip, fibroblastima sliĉne ćelije: rastu vezane za podlogu, izgledaju izduženo i bipolarne su.

Amniociti (AF-tip) predstavljaju zaseban tip ćelija. To su ćelije fetalnog porijekla koje sekultiviraju iz amnionske teĉnosti, pleomorfne su i multinuklearne.

1 2 3

Page 27: ĆELIJSKE KULTURE

ĆELIJSKE LINIJE

Ćelijske linije nastaju od primarnih ćelijskih kultura nakon njihovog prvogsubkultiviranja.

Ćelijske linije su omogućile veliki napredak u istraživanju i kontroli ćelijskogciklusa, proizvodnji vakcina i rekombinantnih proteina.

Neke ćelijske linije vremenom poĉinju pokazivati znakove starenja i prestaju se dijeliti, pa se nazivaju ograniĉenim ćelijskim linijama.

Termin ćelijska linija ukazuje da kultura vodi porijeklo od brojnih ćelija prisutnihu primarnoj kulturi.

Ukoliko je poznato da ćelijska linija vodi porijeklo od jedne jedine ćelije, tada senaziva klonalnom ćelijskom linijom.

Sojevi ćelijskih linija predstavljaju linije ćelija koje imaju neke specifiĉne iliunikatne osobine.

Page 28: ĆELIJSKE KULTURE

ĆELIJSKE LINIJE

Većina ćelijskih linija se može dijeliti neograniĉeno i nazivaju se trajnim ili besmrtnim ćelijskim linijama.

Da bi ograniĉena ćelijska linija postala trajna, mora proći proces imortalizacije ili transformacije, što se in vitro može desiti spontano ili djelovanjem nekih lijekova, zraĉenja ili virusa.

Pionirske ćelijske linije su izvedene iz normalnih adultnih animalnih tkiva.

Jedna od najpoznatijih trajnih animalnih ćelijskih linija, koja se danas široko koristi je izvedena linija iz ćelija ovarija adultnog kineskog hrĉka, 1959. (engl. CHO-Chinese hamster ovary)

Većina danas poznatih ćelijskih linija izvedene su iz tumora ili in vitrotransformiranih ćelija.

Ima i ćelijskih linija koje se široko koriste a izvedene su iz normalnih humanih tkiva, npr. linija normalnih fibroblasta WI-38, koje imaju ograniĉen životni vijek in vitro.

Page 29: ĆELIJSKE KULTURE

ĆELIJSKE LINIJE-PRIMJER

HeLa-najpoznatija tumorska ćelijska linija.

1952. Georg i Margaret Gey su tragali za humanim ćelijama koje će preživjeti izvan tijela neograniĉeno, i dobili su ćelijsku liniju koja se dijelila kao nijedna do tada, porijeklom iz ćelija cervikalnog kancera Henriette Lacks.

Henrietta Lacks umrla je u 32. godini života, a HeLa ćelijska linija postala je poznata širom svijeta.

Danas se koristi kao model u mnogim laboratorijama prilikom istraživanja ćelijskih efekata lijekova i zraĉenja, a zaslužna je i za razvoj vakcine Polio.

Iako zbog kultiviranja postoji mnogo sojeva HeLa ćelija, svi vode porijeklo odistih tumorskih ćelija pacijentice Lacks.

HeLa ćelije u svom genomu imaju 20 poznatih klonalnih abnormalnihhromozoma (poznatih kao HeLa hromozomski potpis ili HeLa markeri).

Page 30: ĆELIJSKE KULTURE

PRIMJENA KULTURE ĆELIJA

Kulture ćelija primjenjuju se u nekoliko oblasti:

istraživanja raka

genetičko savjetovanje

genetičko inženjerstvo

kulture ćelija kao fabrike

genska terapija

testiranje toksičnosti

Page 31: ĆELIJSKE KULTURE

PRIMJENA KULTURE ĆELIJA

ISTRAŽIVANJE RAKA

U citogenetiĉkom istraživanju raka potrebno je prvo in vitro uzgojiti ćelije istraživanog raka kako bi se mogle dobiti metafazne ćelije sa hromozomima pogodnim za analizu.

Brojne hromozomske aberacije, strukturne i numeriĉke, detektovane su u razliĉitim tipovima kancera.

Hromozomska nestabilnost karakteristiĉna je za sve kancere, a neke karakteriziraju posebni kariotipovi (npr. Filadelfija hromozom-hroniĉna mijeloidna leukemija).

Kulture tumorskih ćelija pogodne su za testiranje potencijalnih antitumorskihsupstanci i lijekova.

Page 32: ĆELIJSKE KULTURE

PRIMJENA KULTURE ĆELIJA

GENETIČKO SAVJETOVALIŠTE

Dobijanje kariograma iz kultiviranih amniocita omogućava ranu i egzaktnu detekciju širokog spektra genetiĉkih poremećaja fetusa.

Page 33: ĆELIJSKE KULTURE

PRIMJENA KULTURE ĆELIJA

GENETIČKO INŽENJERSTVO

Mogućnost transfera genetiĉkog materijala na ćelije u kulturi omogućuje molekularnim biolozima istraživanja gena od interesa i proteina koje ti geni kodiraju.

Omogućeno je dobijanje velikih koliĉina željenog proteina za dalja istraživanja.

Page 34: ĆELIJSKE KULTURE

PRIMJENA KULTURE ĆELIJA

ĆELIJE KAO FABRIKE

Kulture ćelija mogu se koristiti u proizvodnji mnogih važnih susptanci, a tri su oblasti posebno važne:

1. Masovna proizvodnja virusa: uzgojem virusa in vitro i njihovih produkata u kulturi ćelija omogućen je razvoj vakcina za veliki kašalj, bjesnilo, hepatitis B i dr.

2. Masovna proizvodnja proteina: genetiĉki transformirane ćelije u kulturi mogu proizvoditi proteine koji imaju važnu primjenu u lijeĉenju i dijagnostici (inzulin, terapijska antitijela, antitijela koja koriste imunološke tehnike)

3. Proizvodnja tkiva i organa: vještaĉki uzgojena tkiva kože dana se masovno koriste kod pacijenata sa teškim opekotinama, a vještaĉka proizvodnja organa kao što su jetra, pankreas i bubrezi, je u fazi istraživanja.

Page 35: ĆELIJSKE KULTURE

PRIMJENA KULTURE ĆELIJA

GENSKA TERAPIJA

Ćelije uzete iz organizma pacijenta kojem nedostaje funkcionalni gen, mogu biti uzgojene u kulturi, a zatim tehnikama genetiĉke transformacije oštećeni gen može biti zamijenjen funkcionalnim.

Takve ćelije mogu se uzgojiti u kulturi u velikom broju a zatim vratiti uorganizam pacijenta.

Page 36: ĆELIJSKE KULTURE

PRIMJENA KULTURE ĆELIJA

TESTIRANJE TOKSIČNOSTI

In vitro testovi na kultiviranim ćelijama se koriste sami ili uz in vivo testove na laboratorijski životinjama prilikom istraživanja bioaktivnosti novih lijekova, kozmetike, hemikalija ili bioloških materija.

Pozitivni ili negativni efekti koje ovi agensi mogu ispoljiti na kulturama ćelija obiĉno se dijele na:

efekte na nivou ćelija – citotoksičnostefekte na nivou genetiĉkog materijala – genotoksičnost

U istraživanjima ovog tipa veoma su znaĉajne kulture ćelija izvedene iz jetre i bubrega te humani limfociti periferne krvi (naroĉito kod ispitivanja genotoksiĉnosti).

Postoji veliki niz testova koji se koriste za ispitivanje toksiĉnosti. MeĊutim, veoma je teško otkriti sve aspekte odreĊenih mutagenih supstanci.

Page 37: ĆELIJSKE KULTURE

PRIMJENA KULTURE ĆELIJA

DOBIJANJE ĆELIJA ZA UZGOJ U KULTURI

Kolekcije ćelijskih kultura -“banke ćelija”

Veliki izbor dobro okarakterisanih ćelijskih linija

Suspenzija željenih ćelija se doprema poruĉiocu u zamrznutom stanju (na suhom ledu); po pristizanju u laboratoriju, ćelije se odmrzavaju i poĉinje kultivacija.

Uz ćelije, dobija se i katalog sa svim potrebnim informacijama vezanim zauslove uzgajanja i “istoriju” date ćelijske linije.

Page 38: ĆELIJSKE KULTURE

PRIMJENA KULTURE ĆELIJA

DOBIJANJE ĆELIJA ZA UZGOJ U KULTURI

Najveće i najpoznatije banke ćelija sa preko 3000 okarakterisanih ćelijskihlinija:

The American Type Culture Collection (ATCC) USAwww.atcc. org

The Europian Collection of Animal Cell Culture (ECACC) UKw w w .ec a cc.org