Células madre: Mito y Realidad

Agustín G Zapata

Departamento de Biología Celular

Facultad de Biología

Universidad Complutense de Madrid

Terapia Celular

Capacidad de sustituir/renovar tejidos alterados con progenitores de

la misma o distinta estirpe

- Igual estirpe (Trasplante HSCs)

- Distinta estirpe (poco o ningún éxito)

porque DESCONOCEMOS

Los mecanismos que regulan la biología de las células madre utilizadas y, en especial,

Los mecanismos que regulan su diferenciación en

condiciones de bioseguridad

Generación de hESC

(Thomson et al 1998 Science 282, 1145)

Células Totipotentes

Células Indiferenciadas con capacidad de autorrenovación (capacidad de una célula para

mantener su identidad tras división) y bajo determinadas condiciones de diferenciar a cualquier

tipo celular especializado

Embrionarias:

Células stem embrionarias: Las más multipotentes; provienen de unembrión fecundado del que se extraen en unestadio de pocas células (muchos congelados).

Células germinales primordiales: Menor totipotencia; provienen de fetos abortadosde 8 semanas de gestación.

Adultas:

Presentes en todos los tejidos; difíciles de aislar y caracterizar fenotípicamente; crecimiento mucho mas difícil en cultivo; no “problemas éticos”.

Fetales

Progenitores presentes en los tejidos durante desarrollo

Mecanismos reguladores de las ESCs

• Rutas de señalización• Lif – gp130 – Stat 3• BMP – TGFβ – Smad• MAPK – ERK• Wnt (?)

• Factores de transcripción

• Organización de la cromatina.• Factores epigenéticos• Represores génicos (genes

Polycomb)• ARNs no codificantes

Stat 3E-rasc-myc

Klf 4β- catenina

Oct 3/4Sox 2Nanog

Factores que afectan el comportamiento de hESCs

Mantienen status ESC

Morfógenos de la SF TGFβ

Activina, Nodal, TFGβ, GDF3

Growth FactorsFGF2, FGF4, PDGF +

SIP

Wntsobre todo efectos en

proliferación ESC

Inducen diferenciación ESC

MorfógenosBMP2, BMP4, BMP7

Redes Reguladoras Transcripcionales de ESCs

Core Oct4Oct4, Sox2*,

Nanog

+

Smad1, Stat 3, Tfc3

(vías de BMP, LIF y Wnt)

(señales extracelulares

afectan directamente

al core)

Core MycC-myc, n-myc,

E2f1, Zfx, Rex1, Ronin

Bloqueo de la diferenciación de ESc murinas

Ivanova et al (2006)Nature 442, 533

• Nanog, Oct 4, Sox 2, bloqueadores generales• Nanog regula niveles de Oct4 y Sox 2• Oct 4 bloquea específicamente diferenciación a

trofectodermo• Esrrb, Tbx 3, Tcl1 bloquean específicamente diferenciación

del epiblasto

Mesodermo Endodermo Cresta Neural

Citocl 1, Cebpa, Esx 1, Fos, Jun, Usf 1, Kif 7, Sox 9, Snail 1

Otx 2Pitx 2Sox 18Otros

EpiblastoESCs

Endodermo extraembrionario (Gata 6, Gata 4)

Trofectodermo (Cdx 2, Eomes, Hand 1)

Nanog, Sox 2, Esrrb, Tbx 3, TcL 1

NanogOct 4, Sox 2, Nanog

Problemas con la diferenciación de ESCs

• La eficacia de la diferenciación disminuye en cada estadio; primero se generan progenitores intermedios difíciles de expandir

• La mayoría de las céls diferenciadas de ESCs no son totalmente maduras, generándose una población final heterogénea donde solo un pequeño % corresponde al tipo celular deseado

NECESARIO,• Mejorar la eficacia de la

diferenciación• Diseñar métodos reproducibles,

incluidos aquellos para aislar las poblaciones deseadas

Problemas utilización ESCs

• Condiciones “humanas” o “humanizadas”. Medios estándar sintéticos. Condiciones GMP. RESUELTO

• Condiciones de preservación adecuadas. RESUELTO

• InmunogenicidadTransferencia nuclearRESUELTO ??

• Bioseguridad: Estabilidad / Transformación neoplásica

Claves de la Transferencia nuclear en oocitoshumanos (Tachibana et al 2013 Cell 153, 1)

•Sincrónicación ciclo núcleo donante/citoplasma huésped : Rápida rotura EN y condensa-ción cromosomas ; elimina-ción TF y epigenéticossomáticos y sustitución por mols embrionarias (Alteraciones sincronización bloquean desarrollo embrión)•Mecanismos standardactivación oocitos(ionomicina, 6-DMAP) insufi-cientes, necesaria electro-poración suplementaria•“Calidad” oocitos (genoma donante)

¿Porque los problemas con la transferencia nuclear en humanos?

•Factores que convierten un programa genético adulto en el del nuevo embrión son desconocidos• No activación genes embrionarios bloquea el desarrollo (embriones no pasan de 8 células o si llegan a blastocisto las hESCson inestables)•Protocolos utilizados basados en modelos murinos, mejor los de primates•Eliminación núcleo del oocito afecta negativamente la reprogramación del núcleo somático trasferido (Núcleos somáticos trasferidos a oocitos nucleados desarrollan blastocistos y hESCpoliploides)

A) Fb 2N donantes núcleos; B) ICM obtenidos con protocolos no-óptimos; C) Husos en oocitos nucleados; D) Husos en oocitos enucleados + cafeina; E) ICM obtenida con protolos óptimos; F) hESC de TF

¿Por qué pueden aparecer tumores tras inyección de progenitores pluripotentes?

• Presencia de células indiferenciadas tras diferenciación de hESCs

• Redes genes responsables de pluripotencia también implicados en oncogénesis

• Inestabilidad genómica de hESCs podría afectar su diferenciación y la funcionalidad de las céls diferenciadas

• Casi la mitad de los genes que muestran alteraciones genéticas en hESC están funcionalmente relacionados con oncogenes

• PSC que muestran defectos en reparación ADN y paradas de ciclo no todas mueren, una minoría continúa proliferando y acumulan alteraciones genéticas que pueden representar ventajas selectivas

¿Por qué pueden aparecer tumores tras inyección de

progenitores pluripotentes?. II

Necesario:

• Eliminación selectiva de las célsindiferenciadas y mutadas

• Mejora en la caracterización de teratomas y teratocarcinomas para impedir su formación

Necesidad monitorizar antes aplicación clínica

Jaenisch & Young ’08 Cell 132, 567

Células madre pluripotentesinducidas (iPSCs)

Protocolo Reprogramación• Fibroblastos adultos (ratón, humano)

transducción viral (lenti/retro) OCT4, Sox2, c-myc, Klf4 (tb sin c-myc) por lo menos 12 d

• Seleccionadas por activación gen Fbx15 (target de Oct4) (iPSC incompletamente reprog):- Forman teratomas, no quimeras- Pluripotencia requiere expresión continua de Oct4 y Sox2 (Oct4 y Nanogendógenos no expresados, promotores metilados)

• Seleccionadas por activación Oct4/Nanogendógenos (totalmente reprog):- Expresión génica y configuración cromatina- Pluripotencia dependiente de Oct/Nanogendógenos, promotores hipometilados- Crom X reactivado- Producen quimeras y generan embriones- Expresan marcadores pluripotentes: AlkPasa, SSEA-1

De Sommer & Mostoslavsky 2010 Cell Research & Therapy 1, 26

Problemas con iPS• Baja eficacia de reprogramación (1 cada

1000 cels) (Eficacia 30%)

• La mera expresión de marcadores no “iguala” las iPS con ESC

• No sabemos como evaluar las iPShumanas

• Cualquier técnica de reprog genera riesgo de mutaciones o cambios epigenéticos (evaluación genómica de cada clón)

• La reprog inhibe las rutas de supresión de tumores y activa oncogenes

• Las céls reprogramadas están en situación de estrés extremo

• Ratones generados con iPS (sin usar c-myc) tiene una vida media menor

• Desconocemos muchos aspectos de los mecs de reprogramación

Semejanzas y diferencias entre ESCs, iPSCsy ESC-TN (derivadas de la misma línea

somática y de óvulos de la misma mujer)

-30% iPSCs no anomalías cromosómicas (eficacia razonable; no siempre hay alteraciones durante reprogramación)- Metilaciones en ESC-TN más parecidas a las de ESCsque a iPSCs. iPSCs tienen patrones metilación más alterados-Falta de metilaciones produce alteraciones trascripcionales en las iPSC. ESCs-NT más parecidas a ESCs pero también tienen

iPSCs y Terapia Celular• Problemas de bioseguridad (Controles

exhaustivos), sin embargo:

- Univ Kyoto ensayos con pacientes de Parkinson en 3 años

- Centro Riken en Kobe pacientes con maculopatías de edad, fase I

• Utilidades no vinculadas a capacidad pluripotente:

- Análisis de pluripotencia y senescencia celular

- Patogenia enfermedades sin modelos

- Origen y progresión de enfermedades (genes implicados)

- Screening fármacos

- Vehículos celulares para Terapias de reemplazamiento génico y celular

De Nicholas & Kriegstein 2010 Nature 463, 1031

Células mesenquimales (MSC)

• In vivo en G0, más abundantes en hueso que en BM y tb en adiposo, cordón, FL, PB y pulmón. Relacionadas con pericitos

• No expresan marcadores hematopoiéticos(CD14- CD34-CD45-) pero sí mol de adhesión (CD 73+ CD 90+ CD 105+ CD 166+) y otros marcadores: CD29, CD44, CD49a-f, CD51, CD106, CD133, CD271 (loNGFR), Stro-1, SSEA1, 4, 3G5), Nestina, PDGFRα, β (este fenotipo corresponde a las MSC aisladas de los cultivos no a las células puestas a cultivar; cultivo cambia fenotipo y otras propiedades)

• Expresan R para: IL1, IL3, IL4, IL6, IL7, IL15, IFNγ, TNFα, CCR1, CCR7, CXCR4, CXCR5, CXCR6, TLR1, 3, 4, 5

Propiedades Inmunológicas de MSC se utilizan en el tratamiento

de distintas patologías

• MSC regulan todas las etapas de la respuesta inmune:

- Diferenciación DC inmaduras y función de DC maduras

- Proliferación céls T y B

- Supresión actividad céls efectoras, TH1 y TH17

- Activación céls reguladoras, TH2 y Treg

- Efectos sobre NKs ???

• Mols. Implicadas: HPF, PGE2, TGFβ, IDO, ON, IL10, BMP4, Galactinas ???

• Eficaces en alogenia

• Propiedades no constitutivas, dependientes ambiente (IFNγ)

• Utilización en Autoinmunidad y GvHD

MSC producen células del linaje mesodérmico ????

Benayahu et al ’09 Annals Anat 191, 2

La investigación sobre célsstem ha proporcionado

importantes avances acerca de

-Mecanismos Reguladores de la Diferenciación y reprogramación

-iPSCs , excelente modelos experimentales para estudiar la patogénesis de enfermedades mono- y multigénicas (Parkinson, Schizophrenia, ALS, distrofias, Fanconi, etc..) y screening de librerias de drogas

-MSCs son células inmuno-reguladores y anti-inflamatorias (GvH disease, BM engraftment, Inflamation, Cicatrización)

Alternativas a la Terapia Cellular

• Generar subunidades funcionales (mas funcionales que morfológicas)

- Auto-organización de estructuras epiteliales intestinales, gástricas y de colon (organoides) a partir de célsaisladas endodérmicas Lgr 5+, hESCs o iPSCs

- Otros tejidos más complejos: hipofisis, tejido retiniano or cortical y epitelio de la glándula mamaria

• Ingenieria Tisular

Ensamblar poblaciones celulares dispersas en biomateriales o matrices naturales descelularizadas

Ingenieria Tisular

Órganos descelurizados y sus matrices reconstituidos con céls madre (mejor tejidos huecos que órganos sólidos con muchas células)

•Control preciso grado de descelurización(adhesión céls madre o rechazo inmunológico)•Elección céls madre (mejor varios tipos derivados de iPSCs)•Números de células necesarias muy alto e integridad vasculatura clave•Eliminación adecuada del detergente que genera toxicidad celular

Futuro:

•Cultivos 3D de progenitores en scaffolds•Si no se puede sustituir un órgano restituir las partes dañadas

Creación de yemas hepáticas a partir de iPSCs(Takebe et al 2013 Nature 499, 481)

Creación yemas hepáticas humanas (4 mm) tridimensionales, vascularizadas a partir de mezclas de hepatocitos (provenientes de iPSCs), MSC y HUVACs que recuerdan hígados fetales

Trasplantadas en distintas zonas ratones producen proteínas hepáti-

cas humanas sin desarrollo de tumores o teratomas a los 6 meses

Problemas a resolver:

Yemas son muy pequeñas (3-4 millones céls y un hígado un billón) y necesitan irrigarse; podrían injertarse en hígados y dejar que fueran creciendo (ver costo económico)

Otros órganos derivados de endodermo (páncreas, pulmón) podrían ser generados también por este método aunque la heterogeneidad celular es mayor que en hígado

Cualquier Terapia Celular debe ser en último término superior en eficacia y seguridad a cualquier Terapia basada en fármacos

http://www.closerlookatstemcells.org

(nuevas stem cell therapies)