Ejercicio experimental 2. Identificación de las células del sistema inmune.

OBJETIVO

• Identificar los diferentes componentes celulares de la respuesta inmune en sangre periférica humana a través de sus características morfológicas y de afinidad por colorantes.

¿CÓMO?

A través de una tinción basada en la tinción de Wright que se describe a continuación:

MATERIALES • Microscopio óptico

• Portaobjetos

• Lanceta estéril

• Cronómetro

• Alcohol

• Aceite de inmersión

Colorante de Wright

Buffer de fosfatos, pH=7.0

TÉCNICA

-Limpiar el dedo pulgar (de la mano que menos ocupe la persona voluntaria) con agua y con jabón. Desinfectarlo posteriormente con alcohol. -Con la lanceta estéril realizar una punción en la parte apical del dedo de forma paralela a la huella digital del dedo pulgar. -Depositar una gota de sangre de (aproximadamente 40 µl) en un extremo de un portaobjetos.

-Colocar un portaobjetos como indica el dibujo y deslizarlo sobre toda la superficie del portaobjetos de manera que se pueda obtener una fina película de sangre (monocapa). El porta absorbe la gota y la arrastra, pero sin pasar nunca por encima de ella para no dañar las células. Dejar secar a temperatura ambiente.

-Colocar el frotis de sangre sobre la bandeja de tinción.

- Cubrir el portaobjetos con 1-2 mL de colorante de Wright.

- Tras 1-3 min, añadir un volumen igual de Buffer de fosfatos pH=7.0, homogenizar con

movimientos suaves hasta que la mezcla adquiera un brillo verde metálico.

- Se deja actuar de 5 a 10 min.

- Lavar con agua. - Dejar secar aireando el portaobjetos

- Observar al microscopio óptico con el objetivo de 40X y posteriormente a 100X utilizando aceite

de inmersión.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA Al microscopio se verán con un dominio predominante los glóbulos rojos, hematíes o eritrocitos teñidos de color rojo por la eosina. No tienen núcleo y son más delgados por el centro que por los bordes. Los glóbulos blancos o leucocitos se identifican fácilmente por la presencia de núcleo, teñido de morado por la hematoxilina. Hay varias clases de leucocitos:

1. Linfocitos: de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos, tienen un solo núcleo que ocupa

casi todo el glóbulo.

2. Monocitos: son los leucocitos mayores, poco frecuentes normalmente, núcleo grande,

redondo, son los más móviles y su función principal es la fagocitosis.

3. Polimorfonucleares: núcleo fragmentad. Pueden ser eosinófilos, con abundantes

granulaciones teñidas de rojo por la eosina, neutrófilos y basófilos.

Con una adecuada tinción se conseguirá los siguientes aspectos morfológicos de las células: 1. Forma y dimisiones de la célula 2. Aspecto de la cromatina. 3. Citoplasma 4. Granulación

Ejercicio experimental 3. Identificación órganos linfoides.

OBJETIVO

• Identificar la estructura macroscópica y localización de los diferentes órganos linfoides primarios y secundarios a través de sus características morfológicas e identificar las células que en ellos residen por su afinidad por colorantes.

¿CÓMO?

A través de la disección de órganos linfoides en ratones y la tinción de Wright.

MATERIALES

• Microscopio óptico

• Portaobjetos

Caja petri

• Equipo de disección

• Agujas

• Guantes

• Jeringa de 1mL

• Tela de organza

• Tabla de disección

• Cronómetro

• Alcohol

• Aceite de inmersión

Colorante de Wright

Buffer de fosfatos, pH=7.0 FUNDAMENTO

Prácticamente todos los métodos empleados para teñir células hematopoyéticas se basan en el empleo del colorante de Wright, constituido fundamentalmente por la mezcla de eosina y azul de metileno. Tanto la eosina como el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras celulares, de forma que tienen carácter básico aquellas que fijan en mayor medida la eosina (Colorante ácido). Mientras las que poseen propiedades ácidas fijan principalmente el azul de metileno (colorante básico). Esto explica que ciertas estructuras basófilas presentes en el núcleo o en el citoplasma se tiñen de azul, mientras que otros componentes acidófilos como la hemoglobina adquieren un color rosado.

PRCEDIMIENTO

1) Localización de los órganos linfoides.

- Sacrificar al ratón por dislocación cervical.

- Fijar el ratón a la tabla de disección.

- Rociar alcohol sobre el ratón para facilitar el manejo del mismo.

- Realizar una incisión en V en la piel del ratón en región abdominal del mismo, retirar con

cuidado la piel del ratón hacia los lados y comenzar la extracción de los ganglios

linfáticos, bazo y timo. (Apoyarse con el esquema)

- Depositar 3 ganglios en 0.5 mL de PBS en una caja petri.

- Depositar el timo en 0.5 mL de PBS en una caja petri.

- Depositar bazo en 0.5 mL de PBS en una caja petri.

- Disgregar todos los órganos con la ayuda del embolo de una jeringa de 1 mL y tela de

organza.

- Una vez obtenidas las suspensiones celulares, colocar una gota de la suspensión

celular en un portaobjetos limpio y desengrasado y dejar secar

- Cubrir el portaobjetos con 1-2 mL de colorante de Wright.

- Tras 1-3 min, añadir un volumen igual de Buffer de fosfatos pH=7.0, homogenizar con

movimientos suaves hasta que la mezcla adquiera un brillo verde metálico.

- Se deja actuar de 5 a 10 min.

- Lavar con agua.

- Dejar secar aireando el portaobjetos.

- Observar al microscopio óptico con el objetivo de 40X y posteriormente a 100X utilizando

aceite de inmersión.

2. Observar al microscopio las preparaciones de bazo, ganglios y timo.

ANEXO 1. Esquema de localización de los órganos linfoides primarios y secundarios en ratón

Sup erficial cervicals

ANEXO 2. Características de los órganos linfoide primarios y secundarios

Al microscopio se verá:

Bazo: Dominio predominante de glóbulos rojos teñidos de color rojo por la eosina. No

tienen núcleo y son más delgados por el centro que por los bordes.

◙ Linfocitos: de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos, tienen un solo

núcleo que ocupa casi toda la célula.

◙ Macrófagos: son los leucocitos de mayor tamaño, poco frecuente, núcleo

grande, laxo y redondo.

◙ Células dendríticas: Mayores que los linfocitos muy poco frecuentes, con una

gran cantidad de prolongaciones citoplasmáticas.

Ganglio: No se observan eritrocitos.

◙ Linfocitos: de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos, tienen un solo

núcleo que ocupa casi toda la célula.

◙ Macrófagos: son los leucocitos de mayor tamaño, poco frecuente, núcleo

grande, laxo y redondo.

◙ Células dendríticas: Mayores que los linfocitos muy poco frecuentes, con

una gran cantidad de prolongaciones citoplasmáticas.

Timo: No se observan eritrocitos.

◙ Linfocitos: de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos, tienen un solo

núcleo que ocupa casi toda la célula.

Anexo 3. Cortes histológico de Timo, Bazo, Ganglios y Placas de Peyer.

Timo El timo está rodeado de una delgada cápsula de tejido conectivo que se proyecta hacia el interior como septos dividiendo al órgano en lobulillos. En cada lobulillo se aprecia una corteza de linfocitos densamente agrupados y una médula más clara. El timo carece de nódulos linfoides y está sostenido por células reticulares epiteliales. Los corpúsculos de Hassall son exclusivos del timo y se localizan en la médula. Son estructuras redondeadas y acidófilas constituidas por células epiteliales aplanadas dispuestas en forma concéntrica, que pueden sufrir queratinización y calcificación en la zona central.

Lobulillos Zona cortical Corpúsculo de Hassall

PLACAS DE PEYER

Las placas de Peyer están formadas por agregados de nódulos linfoides situados en la lámina propia y submucosa de intestino delgado, particularmente íleon. Se pueden apreciar en ocasiones los centros germinales. El tejido linfoide difuso entre dichos folículos linfoides está formado por linfocitos T.

GANGLIOS LINFÁTICOS

En periferia se distingue el tejido conjuntivo capsular fibroso por debajo del cual aparece el seno subcapsular como un espacio vascular que en determinados puntos es difícil de apreciar, en la parte cortical se observan folículos secundarios y tejido linfoide difuso quedando una porción central correspondiente a la zona medular rica en vasos sanguíneos y senos linfáticos.

Bazo La sección esplénica muestra una cápsula fibrosa de la que se desprenden trabéculas o septos que dividen parcialmente al parénquima esplénico. El bazo consta de una porción conocida como

pulpa blanca o pupa roja. La pulpa blanca está situada periarteriolarmente (alrededor de las ramas de la arteria esplénica central) formando estructuras envolventes o vainas cilíndricas conocidas como vaina linfoide periarteriolar que se mantienen parcialmente separadas de la pulpa roja por una capa de tejido linfoide laxo conocida como zona marginal. Dentro de la pulpa blanca las células linfoides se distribuyen tanto de forma dispersa como agrupadas en folículos. La pulpa roja formado por senos venososo y cordones celulares (cordones de Billroth).

Bazo: cápsula (a), la pulpa roja (b), la pulpa blanca (c) y las trabéculas (d).