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CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CONSTRUCCIÓN Y EVALUACIÓN DE UN CONSORCIO FÚNGICO
PARA LA BIORREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON
HAP’S
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE MAESTRO EN
CIENCIAS
PRESENTA
ARMANDO HERNÁNDEZ CARRO
ASESOR
DRA DIANA VERONICA CORTÈS ESPINOSA
Tepetitla, Tlaxcala Agosto 2018
4
5
6
7
DEDICATORIA
A mis papas: Por su amor y compresión.
A mis amigos: Por su apoyo que he tenido en todo momento.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco el apoyo económico otorgado por el Instituto Politécnico Nacional, así
como al Programa Institucional de Formación de Investigadores
Así mismo agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT)
por la beca otorgada bajo el número de registro: 5987912
8
INDICE
CONTENIDO DE TABLAS ...................................................................................................... 10
CONTENIDO DE ILUSTRACIONES ................................................................................... 11
CONTENIDO DE GRAFICAS ................................................................................................ 12
RESUMEN ..................................................................................................................................... 13
ABSTRACT ................................................................................................................................... 14
GLOSARIO ................................................................................................................................... 15
ABREVIATURAS ....................................................................................................................... 16
1. INTRODUCCIÓN. .......................................................................................................... 17
2. ANTECEDENTES. ......................................................................................................... 18
2.1 Contaminación de Hidrocarburos Aromáticos Policìclicos. ............................ 18
2.12 Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos. ................................................................... 19
2.13 Factores que afectan el proceso de biodegradación de Hidrocarburos. ......... 20
2.14 Ventajas y Desventajas de Tecnologías de Remediación de suelos. ............... 22
2.15 Tratamientos para la Biorremediación de suelos. .................................................. 22
2.16 Tratamientos Biológicos. .............................................................................................. 23
2.17 Remediación de suelos contaminados con HAP’s ................................................ 24
2.18 Degradación de HAP’s por Bacterias. ....................................................................... 24
2.19 Ruta metabólica de bacterias en la degradación de Fenantreno ....................................... 26
2.2 Ruta metabólica de bacterias en la degradación de Pireno.................................................. 26
2.23 Degradación de Pireno por hongos filamentosos. ............................................................ 28
2.24 Degradación de HAP’S por hongos Ligninolíticos................................................. 28
3. Antecedentes Directos. ........................................................................................... 31
4. Justificación. ................................................................................................................. 32
5. Hipótesis. ......................................................................................................................... 32
6. Objetivo general........................................................................................................... 33
7. Objetivo particular. ..................................................................................................... 33
8. Estrategia Experimental.......................................................................................... 34
9. Estrategia Experimental.......................................................................................... 35
9
9.2 Selección del medio de cultivo para el crecimiento del consorcio fúngico en
cultivo sólido para la degradación de HAP’s .................................................................... 36
9.3 Pruebas de antagonismo en placa entre las cepas seleccionadas ..................... 37
9.4 Cinética de crecimiento en cultivo sólido usando diferentes
residuos agroindustriales para determinar las condiciones de
inoculación ............................................................................................................................. 38
9.5 Estandarización de condiciones de cultivo sólido para la degradación de
HAP’s por un consorcio fúngico. ......................................................................................... 39
9.6 Evaluación del consorcio fúngico seleccionado en la degradación de
hidrocarburos en un suelo contaminado con PAH’s en tratamientos de
Bioaumentacion y Bioestimulacion .................................................................................... 40
10. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 41
Resultados. ................................................................................................................................. 53
Etapa 1: Aislamiento de cepa fúngica de interés y prueba a tolerancia
a HAP’s. ..................................................................................................................................... 53
Metodología Aislamiento De Cepa Fúngica de Interés. .............................................................. 54
Primeras Aislamiento de Cepa Crecida sobre madera contaminada......................... 55
Pruebas de tolerancias a HAP’s Cepa Beige. ................................................................... 57
Pruebas de tolerancias a HAP’s Cepa Blanca .................................................................. 58
Velocidad de Crecimiento Radial entre Cepas. .................................................. 59
Etapa 1: Segundo Aislamiento de Cepa Crecida sobre madera
contaminada. ......................................................................................................................... 60
Pruebas de Tolerancia a HAP’s .................................................................................... 61
Velocidad de Crecimiento Radial entre Cepas. .................................................. 64
Observaciones Macroscópicas de Cepas ............................................................... 64
Aislamiento de DNA Genómico .................................................................................... 65
Etapa 1: Selección de Medio de Cultivo .................................................................. 66
Cepas no Ligninolìticas. .................................................................................................. 66
Sondeo de Enzimas Peroxidasas ................................................................................ 70
Discusiones. ........................................................................................................................... 79
Conclusión ............................................................................................................................... 80
Consulta Bibliográfica. ..................................................................................................... 81
10
CONTENIDO DE TABLAS
Tabla 1 Comparación de HAP’s empleados en este estudio. ................................................. 19
Tabla 2 Factores que influyen en un proceso de biorremediacion. ....................................... 20
Tabla 3 Tecnologías de remediación INSITU y EXSITU. ........................................................ 22
Tabla 4 Tratamientos para remediación. .................................................................................... 22
Tabla 5 Tratamientos Biológicos INSITU y EXSITU. ............................................................... 23
Tabla 6 Bacterias degradadoras de HAP’s. ............................................................................... 25
Tabla 7 HAP’s degradados por bacterias. ................................................................................. 25
Tabla 8 Diseño Experimental para Pruebas de Tolerancia ..................................................... 35
Tabla 9 Diseño Experimental para selección de Medio de Cultivo ........................................ 36
Tabla 10 Esquema de Pruebas Antagónicas ............................................................................ 37
Tabla 11 Esquema de Placa de Petri para prueba antagónica. (A) Cepa problema, (B, C,
D, E, F, G, H, I) Cepas periféricas. .............................................................................................. 37
Tabla 12 Diseño Experimental de Cinética de crecimiento en cultivo solido con Residuo
Agroindustrial. ................................................................................................................................. 38
Tabla 13 Cinética de Degradación de HAP’S por Consorcio. ................................................. 39
Tabla 14 Cinética en Invernadero. .............................................................................................. 40
*(P/V) Tabla 15 Composición medio Czapek. ......................................................................... 41
Tabla 16 Composición medio Kirk Modificado. ......................................................................... 41
Tabla 17 Composición medio Toyamas. .................................................................................... 41
Tabla 18 Materiales Para Secado de Muestra. ......................................................................... 42
Tabla 19 Materiales Para Extracción De Soxhlet. .................................................................... 43
Tabla 20 métodos de Cuantificación de Hidrocarburos ........................................................... 45
Tabla 21 Material Para Extracción De HTP’s ............................................................................ 45
Tabla 22 Material Para cuantificación de Hidrocarburos por Cromatografía........................ 46
Tabla 23 Material y reactivos para extracción de DNA Genómico ......................................... 48
Tabla 24 Mezcla de Reacción para PCR ................................................................................... 50
Tabla 25 Condiciones para Reacción de PCR .......................................................................... 50
Tabla 26 Tabla de reacción para sondeo de peroxidasas ....................................................... 52
Tabla 27 Donadores de Electrones ............................................................................................. 52
Tabla 28 Velocidades de Crecimiento radial de cepas aisladas ¡Error! Marcador no definido.
Tabla 29 Velocidades de Crecimiento radial de cepas aisladas ............................................ 64
Tabla 30 Selección de Medio de Cultivo Para Cepas del Consorcio .................................... 66
Tabla 31 Selección de Medio de Cultivo Para Cepas ligninoliticas del Consorcio ............. 68
Tabla 32 Velocidades de Crecimiento radial de cepas aisladas ............................................ 69
Tabla 33 sondeo de enzimas ligninoliticas en Phanerochaete crhysosporium ................... 70
Tabla 34 sondeo de enzimas ligninoliticas en Pleorotus ostreatus........................................ 71
Tabla 35 sondeo de enzimas ligninoliticas en cepas aisaladas ............................................. 72
Tabla 36 sondeo de enzimas ligninoliticas en cepas aisaladas ............................................. 73
11
CONTENIDO DE ILUSTRACIONES
Ilustración 1 Ruta de Degradación de Fenantreno por Bacterias. ........................................ 26
Ilustración 2 Ruta de Degradación de Pireno por Bacterias. ................................................. 26
Ilustración 3 Ruta metabólica para degradación de Pireno en Hongos Filamentosos ...... 28
Ilustración 4 Ruta metabólica para degradación de Antraceno en Hongos ligninoliticos. 29
Ilustración 5 Ruta metabólica para degradación de Pireno en Hongos ligninoliticos. ....... 29
Ilustración 6 Placa con colorantes ............................................................................................. 52
Ilustración 7 Primer Aislamiento Cepa de interés ................................................................... 55
Ilustración 8 Purificación de cepa fúngica de interés ................. ¡Error! Marcador no definido.
Ilustración 9 Cepas Obtenidas del proceso de Purificación ..... ¡Error! Marcador no definido.
Ilustración 10 Prueba de tolerancia a PAH’s de Cepa Blanca .............................................. 57
Ilustración 11 Prueba de tolerancia a PAH’s de Cepa Beige ................................................ 58
Ilustración 12 Segundo Aislamiento por cobertera de Crudo de Petroleo al 2% y Mezcla
de HAP’s ............................................................................................. ¡Error! Marcador no definido.
Ilustración 13 Cepas purificadas de cobertera de Crudo y HAP’s ........................................ 60
Ilustración 14 Prueba de Tolerancia de Cepa C1PCC a PAH’s ........................................... 61
Ilustración 15 Prueba de Tolerancia de Cepa C2PCC a PAH’s ........................................... 61
Ilustración 16 Prueba de Tolerancia de Cepa C3PCC a PAH’s ........................................... 62
Ilustración 17 Prueba de Tolerancia de Cepa C4PCP a PAH’ .............................................. 62
Ilustración 18 Análisis Microscópico de cepas aisladas ......................................................... 64
Ilustración 19 ADN Genómico de muestras aisladas ............................................................. 65
Ilustración 20 Amplificaciones por PCR de genes ITS de cepas aisladas .......................... 65
Ilustración 21 Micelio Cepa Blanca Aislada ............................................................................. 73
Ilustración 22 Pruebas antagónicas entre cepas del consorcio fúngico en residuos de
olote y caña en Presencia y ausencia de crudo ........................................................................ 74
Ilustración 23 Pruebas antagónicas entre cepas del consorcio fúngico en residuos de
maíz y cacahuate en Presencia y ausencia de crudo .............................................................. 74
Ilustración 24 Pruebas antagónicas entre cepas del consorcio fúngico en Typha Latifolia
y controles con medio Toyamas en presencia y ausencia de crudo ...................................... 75
Ilustración 25 Visualización estereoscópica de interacciones en olote de maiz entre
cepas: C1PCC, C2PCC y C3PEC vs Trichoderma asperellum H15 ...................................... 75
Ilustración 26 Visualización estereoscópica de interacciones en A) Cacahuate sin crudo
entre cepas: Aspergillus niger y Fusarium verticiloides y B) Residuo de cacahuate con
crudo entre cepas: Panerochaete chrysosporium y Pleourotus ostreatus ............................ 76
Ilustración 27 Visualización estereoscópica de interacciones en C) Typha sin crudo entre
cepas: Pleourotus ostreatus y CP1PCC y D ) Typha con crudo entre cepas: Aspergillus
terreus y Phanerochaete chrysosporium .................................................................................... 76
Ilustración 28 Visualización estereoscópica de interacciones en rastrojo de maíz entre
cepas: Blanca vs C1PCC y Aspergillus terreus y C1PCC ....................................................... 77
12
CONTENIDO DE GRAFICAS
Grafica 1 Crecimiento de Cepa Blanca en PAH’s .................................................................... 57
Grafica 2 Crecimiento de Cepa Beige en PAH’s ...................................................................... 58
Grafica 3 Velocidad de crecimiento radial en prueba de tolerancia ...................................... 63
Grafica 4 Velocidad de crecimiento radial de cepas en distintos medios ............................. 67
Grafica 5 Velocidad de crecimiento radial de cepas ligninoliticas en distintos medios ...... 69
13
RESUMEN
La explotación del petróleo y sus derivados, así como la descontrolada
problemática de derrames provocados por la ordeña clandestina de ductos han
provocado un daño irreversible al suelo y subsuelo de nuestro territorio nacional.
Los Hidrocarburos Aromáticos Policiclicos (PAH’s) son compuestos que se
encuentran el petróleo y sus derivados los cuales por sus propiedades
fisicoquímicas resultan ser compuestos muy tóxicos a la salud humana y
altamente persistentes en el ambiente.
Actualmente existe una variedad de tratamientos fisicoquímicos enfocados a la
remediación de suelos contaminados con PAH’s sin embargo en la mayoría de los
casos estos resultan ser: económicamente más costosos, agresivos con el medio
ambiente y generadores de compuestos más tóxicos.
La biorremediacion se define como el empleo de organismos vivos para eliminar o
neutralizar contaminantes del suelo o del agua. En los procesos de
biorremediación generalmente se emplean consorcios microbianos, aunque
algunos se basan en la introducción de cepas definidas de bacterias u hongos.
El presente trabajo se encamina a la construcción de un consorcio fúngico entre
hongos de la pudrición blanca y hongos filamentosos el cual fue diseñado para su
aplicación de en tratamientos de bioestimulacion y bioaumentacion en un suelo
modelo contaminado artificialmente con una mezcla de PAH’s (Fenantreno y
Pireno)
14
ABSTRACT
the explotation of petroleum and its derivatives, as well as the uncontrolled issue of
spills caused by clandestine pipeline milking have caused irreversible damage to
the soil and subsoil of our national territory. The Policiclics aromatic hydrocarbons
(PAH's) are compounds that are oil and its derivatives which by its
physicochemical properties are to be composed very toxic to human health and
highly persistent in the environment. There is currently a variety of physicochemical
treatments focus on the remediation of soils contaminated with PAH's, however in
the majority of cases these are: economically costly, aggressive with the
environment and generators of more toxic compounds.
Bioremediation is defined as the use of living organisms to remove or neutralize
contaminants from the soil or water. In bioremediation processes usually microbial
consortia, are used although some are based on the introduction of defined strains
of bacteria or fungi.
This paper moves toward the construction of a fungal consortium of white rot fungi
and filamentous fungi which was designed for his application of treatments of
biostimulation and bioaumentacion soil contaminated model artificially with a
mixture of PAH's (Phenanthrene and pyrene)
15
GLOSARIO
Actinomicetos: son microorganismos del suelo caracterizados por ser organismos intermedios entre los hongos y las bacterias. Tienen aspecto filamentoso y, al igual que los hongos, la capacidad de segregar antibióticos (estreptomicina, aureomicina, terramicina, cloromicetina y tetraciclina) por otro lado, como las bacterias, los actinomicetos realizan numerosas reacciones bioquímicas y participan en el proceso de formación de humus y en la alimentación de las plantas al mineralizar la materia orgánica.
Asfáltenos: Son compuestos poliaromáticos, insolubles en n-heptano, con un número de átomos de carbono superior a 50. El contenido de asfáltenos de un crudo puede ser el causante de depósitos en intercambiadores y/o líneas.
Bioacumulaciòn: La bioacumulación es un proceso de depósito gradual y durante un determinado tiempo, de un compuesto químico en el organismo de un ser vivo, ya sea porque el producto es absorbido con mayor rapidez de lo que puede ser utilizado o porque no puede ser metabolizado por el organismo
Hemotiolato Proteínas: Amplio grupo de monooxigenasas que actúan conjuntamente con la NAD(P)H-Flavina oxidoreductasa en numerosas oxidaciones de función mixta de compuestos aromáticos. Catalizan la hidroxilación de un amplio espectro de sustratos y son importantes en el metabolismo de esteroides, fármacos y toxinas.
Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos: son un grupo de compuestos diferentes que se forman durante la combustión incompleta del carbón, petróleo y gasolina y otras sustancias orgánicas. Estos HAPs puros generalmente son sólidos incoloros, blancos o amarillo-verde pálido. Los HAP’s se encuentran en alquitrán, petróleo crudo, creosota y alquitrán, está comprobado que su impacto a la salud causa daños mutagènicos, teratógenos y carcinogénicos.
Lixiviación: es un proceso físico de traslado de materia que acontece cuando un dado solvente líquido traspasa un sólido, originando de esta manera la elusión de algún componente soluble en dicho sólido.
Ubicuo: Cualidad de ubicuo que está presente en todas partes.
16
ABREVIATURAS
ADN: Acido Desoxirribonucleico ANOVA: Análisis de Varianza
CIA: Solución de Cloroformo Alcohol Isoamilico
EPA: Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos
HAP’s: Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos
ITS: (Internal Transcribed Spacer) Espacio Transcrito Interno
LAC: Enzima Lacasa
LIP: Enzima Lignino Peroxidasa
LSD: (Least significant diference) Mínima diferencia significativa
MnP: Enzima Manganeso Peroxidasa
NCBI: (National Center for Biotechnology Information) Centro Nacional Para
la Información en Biotecnología
PDA: Agar Papa-Dextrosa
pH: Potencial de Hidrogeno
ppm: Partes por millón
RBBR: (Remazol Brillant Blue R) Colorante Azul Remazol Brillante
RPM: Revoluciones por minuto
SDS: Dodecil Sulfato Sodico
TPH: Hidrocarburos Totales del petróleo
UFC: Unidades Formadoras de Colonias
VP: Enzima Versátil Peroxidasa
17
1. INTRODUCCIÓN.
La contaminación antropogénica causada por diversas actividades industriales
(Petroquímica, Minera, Papelera, Textil, agroquímica entre otras.) Ha provocado
un efecto irreversible que ha afectado a los sectores productivos, sociales y
económicos. Con el paso del tiempo los daños ambientales se han convertido en
indicadores directos que evalúan la contaminación de estas industrias en su
entorno. La Biotecnología al ser una ciencia de carácter interdisciplinario enfocada
al desarrollo de servicios y productos amigables con el ambiente, se involucra de
lleno en la búsqueda de soluciones a la actual problemática ambiental.
En los últimos años el continuo desarrollo de tecnologías que permitan una eficaz
remediación de sitios contaminados (Suelo, subsuelo y mares) se ha convertido en
el principal eje de la remediación. Algo evidente es que no existe aún una
tecnología que sea totalmente amigable con el medio ambiente, ya que la gran
mayoría generan subproductos y residuos que mantienen latente la contaminación
ambiental. La Biorremediación ha emergido como una opción viable por su
eficiente uso de microorganismos (Hongos y Bacterias) teniendo como
protagonistas los sistemas enzimáticos que estos poseen ya que por sus
características estos son capaces de degradar una amplia gama de compuestos
tóxicos, ajustándose así a las necesidades de la actual problemática ambiental, la
biorremediacion es : una opción económica, amigable con el ambiente y practica
ya que en la mayoría de los casos se llega a la eliminación completa de los
contaminantes.
En los últimos años la contaminación por Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos en
territorio nacional ha sido consecuencia de un mal manejo de residuos tóxicos y de
un constante derrame ocasionado por tomas clandestinas fallidas, generando así
un agudo impacto al suelo y subsuelo.
Este proyecto de investigación está encaminado a potencializar la degradación de
Hidrocarburos Aromáticos Policìclicos (HAP’s) en suelo, empleando como principal
herramienta los sistemas enzimáticos de un consorcio de hongos del género no
ligninolìtico y ligninolìtico, mediante ensayos de tolerancia, pruebas antagónicas y
ensayos de degradación.
18
2. ANTECEDENTES.
2.1 Contaminación de Hidrocarburos Aromáticos Policìclicos.
La industria petroquímica en México se ha desarrollado aceleradamente,
generando diversos satisfactores económicos. Sin embargo, su expansión y
desarrollo también ha dado origen a graves problemas ambientales, derivados
de emergencias ambientales, con graves repercusiones a la salud de la
población y al equilibrio ecológico de los ecosistemas. Entre las causas que
han generado este deterioro ambiental por la contaminación de cuerpos de
agua y suelos a lo largo de todo el país, se encuentran las siguientes:
Manejo inadecuado y abandono de materiales y residuos peligrosos.
Mantenimiento inadecuado o falta de éste en instalaciones petroleras.
Explosiones en instalaciones de alto riesgo.
Fugas en líneas de conducción.
Derrames de hidrocarburos por tomas clandestinas.
Todos los eventos en los que se encuentran involucradas sustancias que implican
algún riesgo para el ambiente o la población y que generaran la contaminación de
suelos y cuerpos de agua, son conocidos como emergencias ambientales. Estas
emergencias dañan suelos agrícolas, provocando un perjuicio económico y social
debido a la inutilización de estos suelos para la producción de cultivos o ganadería
(Infante, 1998). Por un lado, la contaminación del suelo por hidrocarburos afecta la
flora, fauna y microorganismos del suelo (Madigan et al., 1999), la fertilidad de los
suelos, el crecimiento de las plantas, así como la existencia y sobrevivencia de los
animales que se alimentan de éstas (Infante, 1998).
En México existen extensas áreas contaminadas con hidrocarburos del petróleo,
debido principalmente a derrames, así como a las actividades propias de la
industria petrolera. Se estima que en los últimos 20 años han provocado pérdidas
por más de 50 mil millones de dólares, con mayor impacto en el aspecto ambiental
y agrícola (Navarro Machado, 2009). Este tipo de compuestos se acumulan en
ecosistemas marinos y terrestres, siendo responsables del deterioro de algunos
suelos contaminados. La contaminación del suelo y el agua ha venido en aumento
como resultado de las malas prácticas en la explotación, refinación, distribución,
mantenimiento y almacenamiento de petróleo crudo y sus derivados (Iturbe et al.,
2007).
19
2.12 Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos.
Los Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (HAP’s) son un grupo ubicuo de
compuestos orgánicos hidrófobos que constan de dos o más anillos de benceno
combinados en arreglos lineales, angulares o de racimo. Los HAP’s son los
componentes más importantes de petróleo crudo, creosota, asfalto y alquitrán de
hulla. Contaminan el suelo a través de muchas rutas, incluyendo la quema de
combustibles fósiles, la fabricación de gas, procesamiento de madera, escapes de
automóviles y la incineración de residuos (Harvey,1991). Hay más de 100 diversos
compuestos HAP’s, y la mayoría de ellos persiste en el ecosistema durante
muchos años debido a su baja solubilidad acuosa y su absorción a las partículas
sólidas (Volkering et al,1998)
La presencia de HAP’s en forma de sedimentos son un significativo riesgo para el
suelo, ya que son tóxicos, muta génicos y en algunos casos, cancerígenos
(Cerniglia y Heitkamp, 1989). Sobre su abundancia se sabe que 16 HAP’s han
sido incluidos en la lista de contaminantes prioritarios de Agencia de Protección
del suelo de los Estados Unidos (Keith y Telliard, 1979). A continuación, se
describirán los hidrocarburos que serán empleados en este estudio.
Tabla 1 Comparación de HAP’s empleados en este estudio.
Nombre Características Estructura
Fenantreno
se encuentra como contaminante en suelos, sedimentos, y sitios acuáticos. Es un hidrocarburo aromático tricíclico. Puesto que es el Hidrocarburo Aromático más pequeño con una "región Bahía" y una "región K”, se utiliza a como sustrato modelo para estudios sobre el metabolismo de HAP’s cancerígenos.
Benzo (a) Pireno.
El Benzo [a] Pireno es uno de los Hidrocarburos Aromáticos Policìclicos que se encuentran en petróleo crudo, alquitrán de hulla y creosota. se clasifica como un compuesto carcinogénico para los seres humanos
Pireno.
El Pireno es subproducto del proceso de manufactura de gas y otros procesos de combustión incompleta. puede ser biodegradado por bacterias y hongos a través de Dioxigenasas en bacterias y reacciones de monooxigenasas y oxidoreductacsas en hongos.
20
2.13 Factores que afectan el proceso de biodegradación de Hidrocarburos.
La Implementación exitosa de las tecnologías de Biorremediación en sitios
contaminadas depende de las características de los sitios contaminados y un
sistema complejo de múltiples factores que afectan al proceso de biodegradación
de hidrocarburos de petróleo (Jain et al., 2011).
Los principales factores que limitan la tasa de biodegradación pueden agruparse
como: características del suelo, características del contaminante,
biodisponibilidad, y numero de microorganismos (Alexander, 1995). Con el fin de
adoptar y aplicar alguna estrategia de Biorremediación es muy importante
considerar y entender estos factores limitantes.
Características del suelo.
Las características del suelo son importantes para el éxito de la biodegradación de
hidrocarburos, algunos de los principales factores limitantes son: textura,
permeabilidad, pH, porosidad, temperatura del suelo, contenido de nutrientes y
contenido de oxígeno del agua del suelo. La textura del suelo afecta la
permeabilidad, contenido de agua y la densidad aparente del suelo. Suelo de baja
permeabilidad dificulta el transporte y la distribución de agua, nutrientes y oxígeno.
Parámetro Crecimiento de microorganismos
Biodegradación de Hidrocarburos
pH 5.5-8.8 6.5-8.0
Temperatura(°C) 10-45 20-30
Porcentaje de Oxigeno 10% 10-40%
C:N:P 100:10:1(0.5) 100:10:1(0.5)
Contaminantes - 5-10% HC del peso del suelo
Metales Pesados <200 ppm <700 ppm
Tabla 2 Factores que influyen en un proceso de biorremediacion.
Características del Contaminante
Los Hidrocarburos del petróleo contienen una mezcla compleja de compuestos por
lo que no todos los componentes del petróleo se degradan a la misma velocidad.
A consecuencia los microorganismos que degradan hidrocarburos dependen de la
estructura química y concentración de estos compuestos.
Los Hidrocarburos de petróleo son categorizados en cuatro fracciones:
Hidrocarburos saturados, aromáticos, resinas y asfáltenos. De estas fracciones de
petróleo, los alcanos de longitud media (C10-C25) tienden a ser fácilmente
biodegradados, mientras que los alcanos de cadena más larga (C25-C40) son
hidrofóbicos y por lo tanto son difíciles de biodegradar debido a su baja solubilidad
en agua. Por otra parte, los alcanos
21
de cadena ramificada y los ciclo alcanos son biodegradados con mayor lentitud a
comparación los alcanos lineales. Por último, los hidrocarburos Aromáticos,
alquitranes, betún y materiales asfálticos, tienen los puntos de ebullición más altos
y la menor solubilidad en agua por lo que presentan una baja biodisponibilidad
para ser biodegradados.
Biodisponibilidad.
Aun cuando las condiciones son óptimas para la biodegradación de
hidrocarburos, se ha demostrado que una fracción residual de estos sigue
siendo no biodegradable. Es decir, después de entrar en contacto con el suelo,
un contaminante orgánico se puede perder por, lixiviación, volatilización,
bioacumulaciòn o bien ser quelados y formar complejos con los minerales
presentes en el suelo. La transferencia de masa de un contaminante
determina entonces la biodisponibilidad microbiana. El término
"biodisponibilidad" se refiere a la fracción de los productos químicos en el suelo
que puede ser utilizada o transformada por los microorganismos nativos u
organismos vivos.
Población Microbiana.
La capacidad de la comunidad microbiana del suelo para degradar hidrocarburos
depende de la cantidad de microorganismos y su actividad catabólica. Los
Microorganismos pueden ser aislados de casi todas las condiciones ambientales.
Los principales factores que afectan la tasa de descomposición microbiana de
hidrocarburos son: la biodisponibilidad del contaminante; el número de
microorganismos presentes en el suelo; la actividad de microorganismos
degradantes y la estructura molecular del contaminante (Semple et al., 2003). El
número de microorganismos del suelo es generalmente en el rango de 104 a 107
UFC, para una biodegradación exitosa este número no debe ser inferior a 103 por
gramo de suelo.
Una población inferior a 103 UFC por gramo de suelo indica la presencia de
concentraciones tóxicas de contaminantes orgánicos o inorgánicos (Margesin et
al., 2000; Petrović et al., 2008). La actividad de la microflora del suelo puede ser
controlada por los factores mencionados: pH, temperatura, nutrientes, oxígeno etc.
Para una biodegradación exitosa, también es necesario que los microorganismos
pueden desarrollar actividad catabólica, por las siguientes actividades: inducción
de enzimas específicas, desarrollo de nuevas capacidades metabólicas a través
de cambios genéticos y enriquecimiento selectivo de microorganismos capaces de
transformar el contaminante objetivo (Margesin et al., 2000, Semple et al., 2003).
22
2.14 Ventajas y Desventajas de Tecnologías de Remediación de suelos.
IN-SITU EX - SITU
Ventajas
Permiten tratar el suelo sin necesidad de excavar ni transportar.
Potencian disminución de costos.
Menor tiempo de tratamiento
Más seguros en cuanto a uniformidad es posible homogenizar y muestrear periódicamente.
Desventajas
Mayores tiempos de tratamiento.
Pueden ser inseguros en cuanto a uniformidad y heterogeneidad en las características del suelo.
Dificultad para verificar la eficacia del proceso
Necesidad de excavar el suelo.
Aumento en costos de e ingeniería para equipos
Debe considerarse la manipulación para el material y la posible exposición al contaminante.
Tabla 3 Tecnologías de remediación INSITU y EXSITU.
2.15 Tratamientos para la Biorremediación de suelos.
Tratamientos Biológicos
Ventajas Desventajas
En cuanto a costos son efectivos.
Tecnologías mucho más benéficas para el ambiente.
Los contaminantes generalmente son destruidos.
Se requiere un mínimo o ningún tratamiento posterior.
Requiere mayores tiempos de tratamiento.
Es necesario verificar la toxicidad de intermediarios y/o productos.
No pueden emplearse si el tipo de suelo no favorece el crecimiento microbiano.
Tratamiento Fisicoquímicos
Son efectivos en cuanto a costos.
Pueden realizarse en periodos cortos.
El equipo es accesible y no se requiere de mucha energía ni ingeniería.
Los residuos generados por técnicas de separación deben tratarse o disponerse: Aumento de costos y necesidad de permisos.
Los fluidos de extracción pueden aumentar la movilidad de los contaminantes: necesidad de sistemas de recuperación.
Tratamientos térmicos Es el grupo de tratamientos más costosos.
Tabla 4 Tratamientos para remediación.
23
2.16 Tratamientos Biológicos.
Tratamientos biológicos IN-SITU Tratamientos biológicos EX-SITU Bioventeo: su objetivo es estimular la biodegradación natural de cualquier compuesto biodegradable en condiciones aerobias
Bioremediaciòn en fase solida (composteo): es un proceso biológico controlado, por el cual pueden tratarse suelos y sedimentos contaminados con compuestos orgánicos biodegradables, para obtener subproductos inocuos estables
Bioestimulaciòn: implica la circulación de soluciones acuosas (que contengan nutrientes y/u oxígeno) a través del suelo contaminado
Bioaumentaciòn: se requiere el tratamiento inmediato de un sitio contaminado, o cuando la microflora autóctona es insuficiente en número o capacidad degradadora. Consiste en la adición de microorganismos vivos, que tengan la capacidad para degradar el contaminante en cuestión, para promover su biodegradación o su biotransformación.
Biolabranza: La superficie del suelo contaminado es tratada en el mismo sitio por medio del arado. El suelo contaminado se mezcla con agentes de volumen y nutrientes, y se remueve periódicamente para favorecer su aireación
Biorremediación en fase de lodos (birreactores): Los birreactores pueden usarse para tratar suelos heterogéneos y poco permeables, o cuando es necesario disminuir el tiempo de tratamiento, ya que es posible combinar controlada y eficientemente, procesos químicos, físicos y biológicos, que mejoren y aceleren la biodegradación.
Fitoremediación: es un proceso que utiliza plantas para remover, transferir, estabilizar, concentrar y/o destruir contaminantes (orgánicos e inorgánicos) en suelos, lodos y sedimentos, y puede aplicarse tanto in situ como ex situ. Los mecanismos de fitorremediación incluyen la rizodegradación, la Fito extracción, la biodegradación y la Fito estabilización
Tabla 5 Tratamientos Biológicos INSITU y EXSITU.
24
2.17 Remediación de suelos contaminados con HAP’s
El termino tecnología de tratamiento implica cualquier operación unitaria o serie de
operaciones unitarias que alteran la composición de una sustancia peligrosa o
contaminante a través de acciones químicas, físicas o biológicas de manera que
reduzca la toxicidad, movilidad o volumen del material contaminado. (EPA 2001)
La eliminación de HAP’s de suelo contaminado es esencial durante su
remediación según las normas mexicanas correspondientes. El tratamiento
biológico de suelos contaminados con HAP’s debería ser una opción eficiente,
financieramente asequible y adaptable, más que los tratamiento físico-químicos,
debido a que presentan ventajas potenciales como la completa degradación de los
contaminantes, menor incremento de costos, mayor seguridad y menor
perturbación del suelo (Habe y Omori, 2003)
La oxidación química, utilizando oxidantes fuertes en suelos y aguas
contaminadas con PAH, es una estrategia que ha sido considerada efectiva para
superar las limitaciones de la biorremediación (Bartha et al,1992)
La Biorremediación es el mejoramiento in- situ de organismos del suelo como las
plantas verdes y microorganismos como hongos y bacterias para la degradación
de contaminantes orgánicos del suelo. Se trata de la aplicación de organismos y
nutrientes al suelo contaminado para mejorar la biodegradación (Bioestimulaciòn).
Los microorganismos utilizados en Biorremediación deben haber sido probados en
estudios de laboratorio.
2.18 Degradación de HAP’s por Bacterias.
Se han encontrado numerosas bacterias que degradan HAP’s y algunas pueden
utilizar HAP’s de bajo peso molecular como su única fuente de carbono. Las vías
bioquímicas comunes para la degradación bacteriana de los HAP’s como
naftaleno (Annweiler et al., 2000), fenantreno (Pinyakong et al., 2003), antraceno
y acenafteno (Pinyakong et al., 2004) han sido investigadas.
Los Mecanismos de biodegradación requieren la presencia de oxígeno molecular
para iniciar el ataque enzimático y la oxidación de los anillos de HAP’s. En el
primer paso la dioxigenasa cataliza los anillos generalmente ocurre en sistemas
bacterianos aeróbicos para producir cis-dihidrodioles como primeros bioproductos
por un sistema enzimático multicomponente.
Estos intermediarios dihidroxilados entonces pueden ser divididos por las
dioxigenasa en los anillos intradiol o extradiol para unirse mediante una ruta
orto o meta, que lleve a intermediarios centrales tales como protocatechuates y
catecoles que se convertirán en intermediarios del ciclo ácidos tricarboxílico
(Cerniglia, 1992).
25
Bacterias Gram Negativas Bacterias Gram Positivas
Pseudomonas spp Nocardia spp.
Acinetobacter spp Mycobacterium spp
Alcaligenes sp Corynebacterium spp
Flavobacteriuml Arthrobacter spp
Grupo Cytophaga Bacillus spp
Xanthomonas spp Tabla 6 Bacterias degradadoras de HAP’s.
Aunque muchas bacterias son capaces de metabolizar los contaminantes
orgánicos, una sola especie bacterias no posee la capacidad enzimática para
degradar todos o incluso la mayoría de los compuestos orgánicos en un suelo
contaminado. Por lo que Comunidades microbianas mixtas tienen el potencial de
biodegradación más poderoso porque la información genética de más de un
organismo es necesaria degradar las complejas mezclas de compuestos
orgánicos presentes en las zonas contaminadas. El potencial genético y ciertos
factores ambientales como temperatura, pH y fuentes de nitrógeno y fósforo
disponibles determinan la tasa y el grado de degradación.
Bacteria HAP’s
Burkholderia sp. Naftaleno
Alcaligenes faecalis AFK2 Fenantreno
Sphingomonas Naftaleno, Fenantreno y Pireno
Pseudomonas Naftaleno
Mycobacterium sp Antraceno Tabla 7 HAP’s degradados por bacterias.
El género Pseudomonas, bacilos Gram-negativos aerobios que n muestran tener
un alto potencial de a degradación. En las bacterias con mayor degradación de
contaminantes orgánicos pueden encontrarse los géneros Xanthomonas,
Comamonas y Burkholderia. Algunas especies utilizan 100 diferentes compuestos
orgánicos como fuentes de carbono. El inmenso potencial del Pseudomonas no
depende únicamente de las enzimas catabólicas, sino de su capacidad de
regulación metabólica (Hougton y Shanley, 1999). Un segundo grupo importante
de bacterias degradadoras son especies ahora clasificadas como Rhodococcus
spp, Mycobacterium spp y Corynebacterium spp. Las cuales son actinomicetos
aerobios que muestran una considerable diversidad morfológica.
26
2.19 Ruta metabólica de bacterias en la degradación de Fenantreno
Ilustración 1 Ruta de Degradación de Fenantreno por Bacterias.
2.2 Ruta metabólica de bacterias en la degradación de Pireno
Ilustración 2 Ruta de Degradación de Pireno por Bacterias.
27
2.22 Degradación de HAP’S por hongos.
Varios estudios han demostrado que diversos hongos son capaces de la
mineralización de los HAP’s. Estos hongos pueden ser clasificados en dos grupos:
hongos ligninolíticos y no ligninolíticos (Cerniglia, 1997). Al menos dos
mecanismos están involucrados en la biodegradación de HAP’s: uno utiliza el
sistema P-450 del citocromo y el otro utiliza las enzimas extracelulares solubles
del catabolismo de la lignina, incluyendo lignina peroxidasa (LiP), manganeso
peroxidasa (MnP) y lacasas (Tortella y Diez, 2005). Estas enzimas son no
específicas y oxidan una gran variedad de compuestos orgánicos. Estas enzimas
carecen de selectividad porque la lignina contiene una variedad de estructuras
aromáticas formadas en las paredes celulares, En los hongos no ligninolíticos, las
enzimas de citocromo P450 monooxigenasa catalizan la oxidación de HAP’s a
óxidos, que son los productos iniciales de metabolismo HAP’s.
Los sitios contaminados por HAP’s se han caracterizado por llevar años sin ningún
tratamiento y con el tiempo, los contaminantes presentan menor biodisponibilidad
para la degradación microbiana. (Andreoni et al, 2007). En este caso el empleo de
hongos filamentosos ofrece algunas ventajas en comparación con la degradación
bacteriana (Sasek 2003) debido a que la morfología de los hongos les permite
tener mayor biodisponibilidad de los contaminantes por el desarrollo de hifas.
Los hongos filamentosos no ligninolíticos están ampliamente distribuidos en suelo
y algunos de ellos tienen la capacidad de remover compuestos xenobioticos. El
primer paso en el metabolismo de los HAP’s por hongos no ligninolíticos es la
oxidación del anillo aromático por acción de una monooxigenasa produciendo un
areno inestable. El complejo enzimático que cataliza la formación de óxidos de
areno es complejo de citocromo P450 (Omura 1999). Esta es una ruta similar al
metabolismo de HAP’s por mamíferos.
Las monooxigenasas citocromo P450 constituyen una gran familia de proteínas
hemotiolato ampliamente distribuidas en las diferentes formas de vida incluyendo
procariotas (archea, bacteria), eucariotas inferiores (Hongos) y eucariotas
superiores (animales y plantas). El complejo citocromo P450 juega un papel muy
importante en el metabolismo de una amplia variedad de compuestos endógenos
y xenobioticos. El complejo enzimático P450 se puede dividir según la evolución
de la familia por lo que el citocromo P450 se puede dividir en dos clases
principales, B (Bacteriano), y E (Eucariótico) (Gotoh 1993).
28
2.23 Degradación de Pireno por hongos filamentosos.
Ilustración 3 Ruta metabólica para degradación de Pireno en Hongos Filamentosos
2.24 Degradación de HAP’S por hongos Ligninolíticos.
Debido a su ventaja de ser capaces de difundir a los HAP’s inmóviles, las enzimas
extracelulares fúngicas del catabolismo de la lignina parecen ser más capaces que
las enzimas intracelulares bacterianas para hacer el ataque inicial de HAP’s en el
suelo. Los Hongos de pudrición blanca son ubicuos en la naturaleza y tienen
capacidad para degradar y mineralizar lignina (Martínez et al., 2005).
Varios informes han demostrado que los hongos de pudrición blanca son capaces
de degradar HAP’s y tienen el potencial de Biorremediar suelos contaminados por
HAP’s y sedimentos. Gran cantidad del micelio de varias especies de hongos de
pudrición blanca se utilizan para aumentar el alcance de la Biorremediación de
HAP’s en el suelo. La cepa Phanerochaete crysosporium, es la mejor
caracterizada esta puede oxidar, Pireno, antraceno y Benzo [a] pireno (Bogan et
al., 1996).
29
2.25 Degradación de Antraceno por hongos ligninolíticos.
Ilustración 4 Ruta metabólica para degradación de Antraceno en Hongos ligninolíticos.
2.26 Degradación de Pireno por hongos ligninolíticos.
Ilustración 5 Ruta metabólica para degradación de Pireno en Hongos ligninolíticos.
30
Pleurotus ostreatus es un basidiomiceto de pudrición blanca que degrada la
lignina de la pared celular de las plantas (Sarikaya y Ladisch, 1997). Pleurotus
ostreatus secreta una serie de isoenzimas pertenecientes a la actividad oxidante
de la enzima manganeso peroxidasa y lacasa, por lo que este basidiomiceto es
usual en el empleo para la biorremediación de suelos con HAP’s (Lestan y Lamar
1996).
Phanerochaete crysosporium fue el primer hongo ligninolìtico en el que se
aislaron las primeras peroxidasas ligninolìticas. (Singh y Chen 2008). Encontraron
segrega una variedad excepcional de peroxidasas y oxidasas con potencial redox
alto en comparación con otros hongos.
La peroxidasas son una familia de enzimas desintosicadoras que catalizan la
reducción de H2O2 a expensas de varios sustratos reductores. La mayoría de las
peroxidasas contienen un grupo hemo y son enzimas que usan el peróxido de
hidrogeno para catalizar un numero de reacciones oxidativas (Dolphin y col, 1991).
En general las peroxidasas pueden oxidar una amplia variedad de sustratos
incluyendo aminas aromáticas, índoles, fenoles, lignina, haluros y manganeso.
(Dunford, 1995)
31
3. Antecedentes Directos.
Reyes, et al., 2013 Evaluaron la eficiencia de nueve cepas de hongos no
ligninolíticos aislados de suelo contaminado para biodegradar una mezcla 1:1 de
Fenantreno y Pireno. Las cepas de hongos no ligninolíticos consistían en los
géneros: Fusarium, Neuroespora, Aspergillus, Scedosporium, Penicillium,
Neosartorya y Talaromyces. Este estudio mostro un potencial en estos géneros al
metabolizar el contaminante. Los géneros que presentaron mayor porcentaje de
degradación (aproximadamente el 21% de la muestra) fueron Aspergillus terreus,
Talaromyces spectabillis y Fusarium sp. Tolerando una concentración de 2,000 mg
de la mezcla de HAP’s.
Zafra, et al., 2013 Aislaron y seleccionaron un consorcio altamente tolerante con
capacidad de degradar hidrocarburos aromáticos policìclicos (HAP’s) de cuatro y
cinco anillos. A partir de estudios morfológicos y moleculares pudieron seleccionar
14 cepas de hongos y bacterias de 50 cepas aisladas inicialmente. Los géneros
fúngicos correspondieron a: Aspergillus, Penicilium, Fusarium, Trichoderma,
Scedosporium y Acremonium. Los géneros bacterianos correspondieron a
Pseudomonas, Klebsiella, Bacillus, Enterobacter, Streptomyces,
Stenotrhopomonas, Kocuria y Delftia. Estos géneros se integraron por su
tolerancia a altas concentraciones de HAP’s como Pireno, Fenantreno y Benzo
[α]pireno. El consorcio fue expuesto a una concentración de 0 - 6000 mg de HAP’s
por litro. Trichoderma Asperellum H15, Aspergillus nominus H7, Aspergillus flavus
H6, Pseudomonas aeruginosa B7, Klebsiella sp. B10 y Stenotrophomonas
maltophilia B14. Crecieron usando HAP’s como fuentes de carbono y presentaron
una remarcada de 6,000 mg por litro de HAP’s. Demostraron que el consorcio fue
capaz de remover el 87.76% de Fenantreno, 48.18% de Pireno y 56.55% de
Benzo [α] pireno, después de 14 días.
Moreno Montaño, 2015 Estableció condiciones iniciales ideales para la
conformación de un consorcio fúngico con capacidad para tolerar y degradar altas
concentraciones de hidrocarburos del petróleo de un suelo contaminado con
diésel. Los hongos que conforman el consorcio fueron Aspergillus niger SCB2,
Talaromyces spectabillis SSC12, isoformo de Paecilomyces variotti y Tricoderma
asperellum H15-50869.Para lo cual previamente evaluó la actividad antagónica
posteriormente procedió a realizar pruebas de crecimiento del consorcio sobre
diferentes residuos agrícolas. Realizo ensayos de tratabilidad a nivel
macrocosmos para estandarizar las condiciones de cultivo para la degradación de
hidrocarburos por el consorcio. El residuo de avena fue el residuo seleccionado
obteniendo un porcentaje de remoción de TPH del 53%.
32
4. Justificación.
La actual problemática ambiental requiere una mayor eficiencia en la aplicación de
las técnicas de remediación para así poder contrarrestar el impacto generado por
los contaminantes. La industria petroquímica es de las principales industrias que
genera un impacto ambiental. La biorremediacion es la técnica sustentada en la
remediación de sitios contaminados mediante la acción de hongos, bacterias y
plantas. Ante tratamientos fisicoquímicos y térmicos los métodos biológicos
ofrecen una alternativa económica, eficaz y amigable con el ambiente. El empleo
de hongos de la podredumbre blanca en los tratamientos biológicos obedece a
que estos tienen un sistema enzimático inespecífico especializado en la
biodegradación de compuestos recalcitrantes. Los consorcios fúngicos son una
alternativa eficaz para lograr la mineralización completa de los compuestos
contaminantes ya que los intermediarios generados por una cepa son el sustrato
de otra, mediante estas relaciones de comensalismo los consorcios fúngicos
encaminan la degradación del contaminante a una completa mineralización.
5. Hipótesis.
La conformación de un consorcio fúngico con cepas carbonoclastas promoverá la
degradación de los HAP’s en un suelo contaminado, usando un residuo
agroindustrial como soporte y como texturizador del suelo contaminado. La
integración de cepas ligninolìticas al consorcio potencializará la biodegradación de
los HAP’s mejorando los porcentajes de remoción de estos en el estudio.
33
6. Objetivo general.
Obtener un consorcio fúngico formado por cepas ligninolìticas y no ligninolìticas
para su aplicación en la degradación de Hidrocarburos aromáticos Policìclicos.
7. Objetivo particular.
Formación de un consorcio fúngico por la selección de cepas a través de
pruebas antagónicas en placa en presencia y ausencia de hidrocarburo.
Estandarización de condiciones de crecimiento de consorcio seleccionado
en un cultivo sólido.
Evaluar la eficacia de degradación de una mezcla de HAP’s por consorcio
seleccionado mediante tratamientos de bioestimulaciòn y bioaumentaciòn
34
8. Estrategia Experimental.
Formación de un consorcio fúngico
mediante la selección de cepas por pruebas de
antagonismo.
Etapa #2
Estandarización de condiciones de crecimiento del
consorcio seleccionado en un cultivo sólido.
Etapa #3 Evaluar la eficacia de degradación de una
mezcla de HAP’s por el consorcio seleccionado.
Etapa #1
Selección de medio de cultivo.
Realización Pruebas de antagonismo.
Selección de residuo agroindustrial.
Realización de cinéticas de crecimiento en estado solido
Realización de Ensayos en Macrocosmos.
Realización Ensayos a Nivel invernadero.
O
B
J
E
T
I
V
O
G
E
N
E
R
A
L
Aislamiento e Identificación de cepas para su integración al consorcio fúngico
35
9. Estrategia Experimental.
Etapa 1
9.1 Prueba de una cepa tolerante a HAP’s
Cepa/ concentración (ppm)
500 1000 1500 2000
Cepa Verde + HAP’s xx xx xx xx
Cepa Verde – HAP’s x x x x
Cepa Blanca + HAP’s xx xx xx xx
Cepa Blanca – HAP’s x x x x
Cepa Beige + HAP’s xx xx xx xx
Cepa Beige – HAP’s x x x x Tabla 8 Diseño Experimental para Pruebas de Tolerancia
Unidades experimentales: 45 unidades experimentales las cuales serán cajas
de Petri con medio mínimo Czapek.
Variables Respuesta: Medición de la velocidad radial, observación morfológica
de cepas.
La metodología para contaminar las placas de Petri consistirá en preparar tres
soluciones de acetona e hidrocarburos a una concentración de 500 ppm,1000 ppm
y 1500 ppm. Agregando 1 ml de la solución a las cajas de Petri hasta cubrir la
superficie de la placa de Petri, esto se realizará en campana de extracción, sin
flama y sin flujo laminar para evitar posibles accidentes. La preparación de la
solución de acetona e hidrocarburos consistirá en preparar 3 soluciones stock de
50 ml, considerando que serán 30 unidades experimentales, las cuales llevarán 1
ml de mezcla acetònica. Se considera un volumen final de 80 ml por solución
tomando en cuenta las perdidas por la volatilidad de la acetona. Realizándose los
cálculos correspondientes podemos afirmar que se pesaran 0.066 gramos de cada
hidrocarburo disolviéndolos en los 80 ml de acetona, teniendo así una
concentración final de 500 ppm,1000 ppm y 1500 ppm.
36
9.2 Selección del medio de cultivo para el crecimiento del consorcio fúngico
en cultivo sólido para la degradación de HAP’s
Se realizará un screening de diferentes medios de cultivo para seleccionar aquel
donde todas las cepas muestren el mejor crecimiento. Se trabajará con 9 cepas
seleccionadas de las cuales 4 corresponden a hongos ligninolíticos, dentro de
estas 4 cepas se anexó una nueva cepa aislada de madera tratada y 5 cepas de
hongos no-ligninolíticos, por otro lado, se evaluarán 4 medios mínimos diferentes,
quedando el diseño experimental formado de 36 tratamientos.
Medio de Cultivo
Cepas Czapek Toyamas Kirk
modificado
Cepas Ligninolìticas
Pleurotus ostreatus XXX XXX XXX
Phanerochaete crhysosporium XXX XXX XXX
Cepas No ligninolìticas
Trichoderma asperellum H15 XXX XXX XXX
Talaromyces spectabillis XXX XXX XXX
Fusarium verticiloides XXX XXX XXX
Aspergillus niger XXX XXX XXX
Tabla 9 Diseño Experimental para selección de Medio de Cultivo
Las unidades experimentales del diseño serán cajas de Petri de 3 divisiones con los diferentes medios de cultivo, las cuales se inocularán por triplicado con cada una de las cepas seleccionada con una concentración de 1x106 Esporas/ml. Todas las placas se incubarán a la temperatura ideal de acuerdo a la cepa hasta que el microorganismo invada el espacio designado en la placa. Se determinará la velocidad de crecimiento radial (mm/d) por la medición del diámetro de la colonia cada 24 h. Por otro lado, se realizarán análisis fenotípicos de las cepas en cada uno de los medios de cultivo en evaluación, para lo cual se harán observaciones macro y microscópicas en microscopio óptico y/o estereoscopio. Todos los resultados de velocidad de crecimiento radial serán analizados estadísticamente por una comparación de medias para la selección del medio de cultivo.
37
9.3 Pruebas de antagonismo en placa entre las cepas seleccionadas
Tabla 10 Esquema de Pruebas Antagónicas
Se realizarán pruebas de antagonismo con la finalidad de observar si no existe
algún tipo de inhibición entre las cepas que formarán el consorcio. Se hará uso de
la técnica modificada que fue estandarizada por Zafra y col. 2015, la cual consiste
en placas de Petri con el medio de cultivo seleccionado en ausencia y presencia
de hidrocarburos. Las placas con crudo serán contaminadas en la superficie una
solución al 2% de petróleo crudo. Todas las placas se inocularán con una de las
cepas en el centro de la placa y en la periferia se inocularán las ocho cepas
restantes, las placas se incubarán a 30°C durante 10 días.
Tabla 11 Esquema de Placa de Petri para prueba antagónica. (A) Cepa problema, (B, C, D, E, F, G, H, I) Cepas periféricas.
Cepas
Pleurotus ostreatus
Phanerochaete crhysosporium
Trametes versicolor
Cepa nueva
Trichoderma asperellum
H15 Talaromyces spectabillis Fusarium
Aspergillus terreus.
Aspergillus níger
Pleurotus ostreatus
Phanerochaete crhysosporium
Trametes versicolor
Cepa nueva
Trichoderma
asperellum H15
Talaromyces spectabillis
Fusarium
Aspergillus
terreus.
Aspergillus níger
A
E
F
D
H
B
G
C
I
A
E
F
38
Las variables respuesta serán el porcentaje de inhibición y se visualizará
interacción entre cada una de cepa contra la cepa desafiante, mediante
microscopia óptica o microscopia estereoscópica. Esto se realizará en presencia y
ausencia de hidrocarburos.
Etapa 2.
9.4 Cinética de crecimiento en cultivo sólido usando
diferentes residuos agroindustriales para determinar las
condiciones de inoculación
Se propondrán cuatro residuos agroindustriales: Bagacillo de caña, Aserrín,
Bagazo de betabel, olote de maíz. De estos se seleccionarán tres residuos para
su posterior inoculación con cada una de las cepas seleccionadas en dos de los
cuatro medios de cultivo seleccionados en la primera etapa.
Medios de cultivo
Residuo Agroindustrial
Tratamiento Tiempo (d)
3 6 9 12 15
M1
R1 consorcio xx xx xx xx xx control xx xx xx
R2 consorcio xx xx xx xx xx control xx xx xx
R3 consorcio xx xx xx xx xx control xx xx xx
M2
R1 consorcio xx xx xx xx xx
control xx xx xx R2 consorcio x xx xx xx xx
control xx xx xx R3 consorcio xx xx xx xx xx
control xx xx xx Tabla 12 Diseño Experimental de Cinética de crecimiento en cultivo solido con
Residuo Agroindustrial.
Las unidades experimentales serán botellas serológicas de 50 ml con 1g de
materia húmeda, para lo cual se colocarán 0.7 g de residuo agroindustrial estéril y
se ajustará a 30% de humedad con medio de cultivo estéril según el diseño
experimental, las unidades experimentales se inocularán con 1x106 esporas/g de
residuo, se incubarán a 30 °C durante 15 días. Se cuantificará CO2, Cada 24
horas se realizará cuenta viable y observaciones morfológicas.
39
9.5 Estandarización de condiciones de cultivo sólido para la
degradación de HAP’s por un consorcio fúngico. Se realizarán cinéticas en cultivo sólido para estandarizar la degradación de una
mezcla HAP’s (Pireno y Fenantreno) en suelo modelo por el consorcio microbiano.
El tiempo idóneo para la adicción de los HAP’s y suelo fue el tiempo seleccionado
en la etapa anterior en la que los microrganismos se encontraran en su etapa
exponencial de crecimiento.
Tabla 13 Cinética de Degradación de HAP’S por Consorcio.
Las unidades experimentales serán botellas serológicas de 50 ml con suelo
modelo previamente homogenizado por tamizado con un tamaño de 2mm, para
los controles en cada tratamiento el suelo y los residuos agroindustriales fueron
previamente esterilizados en autoclave a 121 ° C durante 1 hora, el residuo
agroindustrial fue inoculado con una concentración de 3 x108 esporas del
consorcio incubados a 30° C durante 5 días con aireación cada 48 horas durante
20 minutos. Las variables respuesta serán, La cuantificación de CO2 mediante
titulación y el seguimiento de poblaciones.
40
Etapa 3.
9.6 Evaluación del consorcio fúngico seleccionado en la degradación de
hidrocarburos en un suelo contaminado con PAH’s en tratamientos de
Bioaumentacion y Bioestimulacion
Se realizarán ensayos con suelo contaminado por HAP’s en botellas de 50ml con
suelo contaminado sin esterilizar con la finalidad de la evaluar la capacidad de
degradación del consorcio en un suelo real contaminado y la capacidad
texturizaste del residuo agroindustrial seleccionado.
Tabla 14 Cinética para evaluar consorcio en tratamientos de bioaumentación y bioestimulacion.
Las unidades experimentales serán botellas de 50 ml d las cuales serán el
Inoculo: Cepas no ligninoliticas y Phanareochaete Chrysosporium con
concentración de esporas de 1x107 Esporas por gramos de residuo, Cepas
Ligninoliticas se inocularán con un disco de Micelio. Incubación: 30°C. Variables
respuesta: Producción de CO2 cuenta viable, observaciones morfológicas y
DGGE.humedad y pH
41
10. MATERIALES Y MÉTODOS
Medios de cultivo.
Los medios mínimos de cultivo a emplear requieren que sean limitados en su de
nitrógeno, esto para inducir la expresión de enzimas ligninolìticas, al igual que
cubran los requerimientos de oligoelementos para las cepas no ligninolìticas, los
medios mínimos serán: Czapek, Toyamas y Kirk modificado.
Composición de medios de cultivo.
Medio Czapek.
Componente. Concentración g/l.
Sacarosa 30
NaNO3 2
K2HPO4 0.5
MgSO4. 7 H2O 0.5
FeSO4. 7 H2O 0.01
Agar Bacteriológico 2.5%* *(P/V) Tabla 15 Composición medio Czapek.
Medio Kirk Modificado.
Componente. Concentración g/l.
Glucosa 10
Tartrato de amonio 0.20
MgSO4. 7 H2O 0.5
KH2PO4 2
CaCl2 0.1
Tiamina * HCl 1 (mg)
Solución de elementos Traza 10 (ml)
Agar Bacteriológico 20
Agua Destilada 1 (Litro) Tabla 16 Composición medio Kirk Modificado.
Medio Toyamas
Componente. Concentración g/l. Glucosa 10
(NH4)2so4 10
MgSO4 0.5
KH2PO4 3.0
CaCl2. 2H2O 0.5
Tabla 17 Composición medio Toyamas.
42
Cepas utilizadas.
Las cepas con las que pretende conformar el consorcio fúngico son: Trichoderma
asperellum H15, Talaromyces spectabillis, Fusarium verticiloides, Aspergillus
níger, Aspergillus Terreus. Como cepas no ligninolìticas y Pleurotus ostreatus,
Phanerochaete crhysosporium, Trametes versicolor como cepas ligninolìticas.
Estas se encuentran en el cepario del centro de investigación en biotecnología
aplicada.
Conservación de cepas.
Estas se encuentran conservadas sobre agar papa dextrosa y glicerol al 25%,
almacenadas en un congelador a -20 grados centígrados.
Conserva de esporas. La conservación de esporas se realiza en crio viales con glicerol al 25 % (v/v). La
metodología consiste en cortar trozos de agar y micelio con un horadador de
diámetro definido, los cortes se depositan en los crio viales adicionados con 1 ml
de glicerol al 25% y posteriormente almacenándolos a -20 °C en el ultra
congelador.
Recolección de Esporas en matraces de 250 ml. Se realiza matraces de 250 ml, con 50ml de medio papa dextrosa, La metodología consiste en inocular los matraces, con los trozos de agar impregnados con micelio de las cepas de las conservas esto en condiciones estériles, Posteriormente se incuban a 30°C dejándolos crecer durante 7 días aproximadamente, tiempo necesario para que el micelio cubra toda la superficie del matraz. La metodología para la cosecha de esporas se realiza agregando una solución de tween 80 al 0.01% hasta cubrir la superficie del matraz de manera conjunta se agregaron perlitas de ebullición. Agitando de manera lenta se observará como las esporas del micelio se desprenden quedando en la solución de tween 80 y perlitas de ebullición. Por último, se vierte la mezcla de tween 80 y perlitas de ebullición con esporas en tubos falcón.
Extracción de Hidrocarburos aromáticos poli cíclicos de suelo.
Aunque el análisis de hidrocarburos puede hacerse con muestras húmedas, se
recomienda secarlas y molerlas para obtener muestras más homogéneas. El
secado de suelo para extracción se lleva a cabo de la siguiente forma.
Materiales
1 Espátula
1 Mortero
1 Papel Aluminio
1 Frascos de vidrio de 30mL Tabla 18 Materiales Para Secado de Muestra.
43
Procedimiento:
Poner a secar la muestra (8-15 g de suelo) extendida en un papel aluminio
a 30ºC, durante 48 horas, en un cuarto de temperatura controlada o a la
sombra.
Moler la muestra en un mortero hasta obtener partículas finas.
Colocar la muestra seca en un frasco seco y limpio.
Aunque las muestras se ponen a secar, casi nunca se elimina completamente el
agua, por lo que hay que determinar la humedad final de éstas.
Para extraer los hidrocarburos de suelos contaminados se utiliza el método de
reflujo con equipo Soxhlet, tomando como referencia los métodos D5369-93 de la
ASTM (2003) y 3540C y 3541 de la US EPA (1996, 1994).
Material y Equipo. Reactivos.
Equipo de reflujo Soxhlet de 250 ml Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)
Diclorometano (cloruro de metileno, CH2Cl2) grado HPLC
Perlas de ebullición.
Cartuchos de celulosa o fibra de vidrio.
Balanza analítica.
Vaso de precipitados 250 ml.
Viales.
Espátula. Tabla 19 Materiales Para Extracción De Soxhlet.
Procedimiento
1) Colocar de 5 a 10 g de suelo seco y finamente molido en un cartucho de
celulosa o fibra de vidrio.
2) Adicionar sulfato de sodio anhidro en una relación suelo: sulfato 1:1 y mezclar.
3) Colocar cada cartucho conteniendo las muestras dentro de la camisa o
columna extractora del equipo Soxhlet.
4) Adicionar 125 ± 5 ml de diclorometano en el matraz de bola y colocar
suficientes perlas de ebullición para evitar la proyección del solvente al calentarse.
5) Ensamblar el equipo Soxhlet e iniciar calentamiento hasta alcanzar una
temperatura de 45°C.
6) Mantener el reflujo en estas condiciones durante 8 horas, de tal manera que se
efectúen entre 6 y 8 reflujos por hora, lo que permitirá la liberación de los analitos.
7) Recuperar el concentrado en un vial de 40 ml con tapón de teflón para su
cuantificación por alguno de los métodos reportados.
44
Cuantificación de Dióxido de Carbono
Cuantificación de CO2 por titulación.
Una manera indirecta de medir el crecimiento y la supervivencia del
microorganismo en el cultivo solido es mediante la cuantificación de CO2 producido
por las cepas fúngicas. La cuantificación se realizará utilizando el método de
absorción alcalina (Anderson 1982), donde a través de una trampa de NaOH 3N
se adiciono aire filtrado libre de CO2 por medio de una bomba la cual la cual
desplaza el CO2 presente en el cultivo solido producido por el microorganismo en
un transcurso de 48 horas, este CO2 removido es atrapado y disuelto en NaOH
0.15 N adicionado con un indicador.
En esta reacción se producirá la formación de carbamatos y agua, el NaOH que
no haya reaccionado con el CO2 será titulado con HCl 1N, en una mezcla de
acetato de bario y fenolftaleína para hacer visible la reacción. De este modo se
determinarán los moles de OH- remanentes en la solución.
Cuantificación de CO2 por Cromatografía.
Procedimiento
1) Sistema de degradación: colocar una muestra de suelo en un recipiente
(botella serológica) sellado con un tapón de hule y arillo de aluminio (la cantidad
dependerá del tamaño del sistema por establecer); posteriormente, se incubará a
condiciones de temperatura, humedad, pH, establecidas. Las condiciones
dependerán del sistema de monitoreo del suelo que se desee evaluar.
2) A través del tapón de hule introducir la jeringa para obtener la muestra de gas.
3) Tomar con la jeringa de 0.5 a 2.0 ml de muestra de la atmósfera de los sistemas
por monitorear.
4) Antes de inyectar la muestra gaseosa, la cromatografía de gases debe estar a
las condiciones señaladas adecuadas.
5) Inyectar el volumen total de la muestra de gas tomada en la jeringa en el
cromatógrafo de gases.
6) El resultado de la medición en este equipo permite cuantificar dióxido de
carbono (CO2), Oxígeno (O2), nitrógeno (N2) y Metano (CH4).
45
Cuantificación de hidrocarburos totales.
Después de realizar la extracción y/o fraccionamiento de los hidrocarburos
contenidos en una muestra de suelo, estos se pueden cuantificar por varios
métodos, entre ellos:
Métodos de Cuantificación de Hidrocarburos.
Métodos gravimétricos
HTP’s
Asfáltenos
Métodos analíticos
Espectroscopia de Infrarrojo
Cromatografía de gases
Tabla 20 métodos de Cuantificación de Hidrocarburos
La técnica de gravimetría mide el peso de los contaminantes totales extraídos con
un solvente por medio de una balanza analítica. Ofrece una cuantificación general
que no requiere equipo sofisticado, es un procedimiento sencillo, barato y rápido.
Hidrocarburos totales del Petróleo (HTP’s)
Fundamento: El método se basa en la cuantificación de los hidrocarburos que
son extraídos dentro de un solvente adecuado. El solvente es evaporado y el
extracto orgánico obtenido es pesado. Esta cuantificación es llamada HTPs y es
reportada como porcentaje de la muestra total en peso seco. Este método es más
adecuado para petróleos pesados que no se pierden en la etapa de evaporación.
Material y Equipo.
Matraz de Bola de 250 ml
Rotoevaporador
Viales o tubos de vidrio de 25ml
Balanza Analítica
Pinzas Tabla 21 Material Para Extracción De HTP’s
Procedimiento.
1) Poner a peso constante el recipiente donde se colocará el extracto orgánico
obtenido (matraz de bola para la extracción, vial o tubo de vidrio).
2) Colocar el recipiente en la estufa a 120ºC durante 4 horas. Sacar este
material y colocarlo en un desecador para que se enfríe.
3) Pesar el recipiente, después colocarlo otra vez dentro de la estufa y volver
a realizar el procedimiento hasta que el peso no cambie. Anotar el peso del
recipiente (RA).
46
4) Una vez que el extracto orgánico obtenido esté en un matraz de bola, tubo
o vial de vidrio a peso constante, se procede a la evaporación total del
solvente (diclorometano) en un rotoevaporador 740 ± 50 mbar y 45°C hasta
sequedad.
5) Pesar nuevamente el matraz, vial o tubo con el extracto libre de solvente.
Anotar el peso (RB)
Cálculo
HTPs (mg kg-1 de s.s.) = (RB – RA) * (FC) / (P * FH).
Cuantificación de hidrocarburos del petróleo por cromatografía de gases
La principal ventaja de este tipo de método es que provee información acerca del
tipo de petróleo en la muestra, además de su cuantificación, aunque la
identificación del tipo de producto no es siempre sencilla (Weisman, 1998).
Para la cuantificación de los hidrocarburos presentes en el extracto orgánico libre
de asfáltenos se tomó como referencia los métodos 8015B y 8440 de la US EPA
(1996) utilizando cromatografía de gases con detector de ionización flama
(CG/FID).
Material y Equipo Reactivos
Cromatógrafo de gases con detector de ionización de flama CG/FID
Hexano (CH3(CH2)4CH3) Grado HPLC
Columna capilar DB-1.
Viales de 40 ml con tapa de teflón
Pipetas Pasteur.
Viales especiales para el cromatógrafo con tapa de teflón
Jeringa de 10 µL
Pipeta de vidrio 5 ml Tabla 22 Material Para cuantificación de Hidrocarburos por Cromatografía
Donde:
HTPs (mg kg-1 de s.s.) = hidrocarburos totales del petróleo en mg/ kg de suelo seco.
RA= peso (mg) del recipiente vacío a peso constante.
RB = peso (mg) del recipiente con el extracto orgánico concentrado.
P = cantidad de suelo extraído (g).
FH= factor de corrección de humedad (1-(%humedad/100)).
FC = factor de corrección para transformar a kg de s.s. = 1 000
47
Procedimiento
1) Colocar la muestra en un vial para cromatografía y sellar. El volumen
dependerá de la cantidad de muestra y tipo de viales empleados.
2) Una vez que la muestra está envasada, se procede a hacer su inyección (1 µl)
en el CG/FID para su cuantificación.
3) Para determinar la concentración de HTPs en las muestras, el cromatograma se
integra considerando el área bajo la curva de los picos resueltos, y extrapolando
dicho valor en una curva de calibración.
Curva de calibración
La curva de calibración es específica del tipo de hidrocarburo por analizar y se
prefiere tomar una muestra proveniente del suelo contaminado. A partir del
extracto orgánico obtenido se puede conocer su peso y preparar una serie de
diluciones e inyectarlas al cromatógrafo de gases, con el fin de obtener una curva
de concentración conocida contra área de picos resueltos. Lo anterior permitirá
extrapolar el área de la muestra problema en la curva de calibración y conocer la
concentración de la misma.
Cálculos
Para obtener la concentración de hidrocarburos en la muestra, se considera la
curva de calibración que tiene una correspondencia lineal entre el área bajo la
curva y la concentración del extracto de acuerdo con la ecuación obtenida:
C (mg L-1) = (A – b) / m.
HTPs (mg / kg s.s.) = (C)* (V/ FC1) * FC2 / (P * FH).
Donde
C = concentración de HTPs (mg L -1).
A = área bajo la curva.
m = pendiente de la ecuación obtenida
b = ordenada al origen de la ecuación obtenida.
Donde
HTPs (mg / kg s.s.) = Hidrocarburos totales del petróleo en mg kg-1 de suelo seco
C = hidrocarburos totales del petróleo en mg L-1.
V = volumen de hexano donde está resuspendida la muestra (5 ml o 60 ml).
P = cantidad de suelo extraído (g).
FH = factor de corrección de humedad del suelo (1-(%humedad/100)).
FC1 = factor de corrección para obtener los HTPs contenidos en el hexano = 1 000.
FC2 = factor de corrección para convertir los HTPs contenidos en la muestra en mg kg-1 s.s.= 1 000
48
Amplificación de secuencias ITS para Hongos.
La metodología a seguir es la descrita por Reader y Broda (1985). La
metodología consta de lo siguiente:
Equipos Materiales Reactivos
Incubadora
Liofilizadora
Vortex
Termociclador
Matraz Erlenmeyer de 500 ml
Tubos ependorf
ARNasa
Acetato de sodio 3M
Agua destilada estéril
Agua grado HPLC
Agarosa al 0.8%
Ácido acético Glacial
Alcohol Isoamilico
Buffer HSD
Buffer TED
Cloroformo
EDTA 0.5 M
Etanol Absoluto
Fenol Acido
HCl 1M
NaCl al 0.9%
SDS al 10%
TE
TRIS Base
Tabla 23 Material y reactivos para extracción de DNA Genómico
Preparación de micelio para extracción de DNA.
1.- Se preparan matraces de Erlenmeyer de 500 ml con 100 ml de medio YPG.
2.- Posteriormente se inoculan a una concentración de 1x105 Esporas/ml
incubándolos a 30°C durante 24 horas.
3.- El micelio obtenido en la superficie del matraz se recolecta por filtración se lava
con 100 ml de solución de NaCl al 0.9% y posteriormente con 100 ml de agua
destilada estéril.
4.-Se elimina el exceso de agua en el micelio y se congela a -80°C, El micelio
congelado se liofiliza para someterse a un proceso de extracción de ADN.
49
Extracción de DNA Total.
1.- El micelio previamente liofilizado se tritura, pesando en un tubo ependorf de 20
a 50 mg a los cuales se le agregará 500 µl de buffer HSD (HEPES 10Mm a pH
6.9, sacarosa 0.5 mM y EDTA 20 mM), posteriormente se agitará la mezcla por
vortex durante 30 Segundos.
2.-Se agregan 50 µl de SDS al 10% mezclando lentamente por inversión de tubo,
incubándose posteriormente en baño de agua a 65 °C durante 15 minutos.
3.- Se agregan 500 µl de amortiguador TED (Tris 50M, EDTA 20 mM, ajustando a
un pH 8) agitando los tubos por inversión.
4.-La mezcla se desproteiniza mediante extracciones sucesivas agregando 600 µl
de solución fenol-CIA. Se homogenizan los tubos por inversión lentamente durante
3 minutos, se centrifugan a 12000 rpm durante 7 minutos a una temperatura de
4°C recuperándose la fase acuosa. La preparación de la solución fenol-CIA se
describe en el anexo 1.
5.- Se repite nuevamente el paso 4 hasta obtener una interface limpia, no es
necesario realizar más de dos fenolizaciones.
6.- A continuación, se hace una nueva extracción con un volumen de CIA, se
mezcla durante un minuto y se centrifuga por 15 minutos a 12 000 rpm.
7.- Se extrae el sobrenadante, cuidando de no tocar ninguna de las otras dos
fases inferiores y se agrega a un tubo ependorf nuevo.
8.-Se agrega 1/10 de volumen de acetato de sodio 3M con pH 5.2 y 0.6 volúmenes
de etanol absoluto enfriando previamente a -20° C. Se mezcla suavemente para
evitar el rompimiento del ADN.
9.- Se centrifugan a 14000 rpm durante 15 minutos a una temperatura de 4°C, se
tira el sobrenadante y se lava el precipitado con 500µl de etanol frio al 70% (v/v).
10.- Se centrifuga a 14 000 rpm durante 15 minutos a 4°C, se desecha el
sobrenadante y se evapora el etanol para secar el precipitado.
11.- Se re suspende en 700µl de TE y se añaden 5 µl de ARNasa, incubándose a
37 °C durante 30 minutos. La preparación de la ARNasa se describe en el anexo
2.
12.- Se agrega 1/10 del volumen de acetato de sodio 3M con 5.2 y 0.6
volúmenes de etanol absoluto frio se repiten los pasos 9 y 10. Por último se re
suspende el precipitado en 50µl de H2O estéril grado HPLC.
13.- Una vez extraído el DNA se observa la calidad del extracto por electroforesis
en gel de agarosa, utilizando agarosa al 0.8% (p/v) disuelta en tampón TAE. El
TAE se prepara a
50
una a una concentración 50X, mezclando 57.1ml de ácido acético glacial, 100 ml
de EDTA al 0.5 M con un pH de 8, 242 Gramos de Tris base y agua destilada
hasta aforo de un litro.
Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).
1.- La reacción para la amplificación de las secuencias ITS se lleva a cabo en un
tubo Ependorf de 200 µl adicionando los siguientes reactivos:
Reactivo Volumen en µl
H2O Estéril grado HPLC 36.5
Tampón 10X para la Enzima 5.0
Mezcla de Nucleótidos 1.0
Primer ITS5 1.0
Primer ITS4B 1.0
DNAc Molde 5.0
Enzima 0.5
Volumen Final 50.0
Tabla 24 Mezcla de Reacción para PCR
2.- Es recomendable manejar un ambiente absoluto de esterilidad en el manejo de
los reactivos y en la preparación de la mezcla de la reacción, destinando áreas
exclusivas para este fin. Se recomienda usar un juego de pipetas exclusivo para
PCR, así como pipetas con filtro.
3.- Una vez adicionado el ADN la mezcla debe homogenizarse ligeramente y
centrifugarse por unos 10 segundos e inmediatamente colocar en el termociclador
bajo las siguientes condiciones:
1 ciclo a 94°C durante 5 minutos Desnaturalización
Se aplicaron 30 ciclos más como se describe
1.- Desnaturalización 94°C,1 minuto
2.-Hibridacion 50°C,1 minuto
3.- Elongación 72°C, 45 Segundos
Un último ciclo de 7 minutos a 72°C Tabla 25 Condiciones para Reacción de PCR
4.-Los productos de PCR se separan en un gel de agarosa al 0.8% (utilizando un
voltaje de 90 V) y las bandas de aproximadamente 700 pb, que corresponden a la
región ITS1-5. 8-ITS2, se purifican utilizando un Kit de purificación para su
posterior secuenciación, El análisis in sillico de la secuencia se realiza en base
datos de NCBI.
51
Metodología a Seguir Sondeo de Enzimas Ligninolìticas.
Preparar placas de Petri con los medios de cultivo
correspondientes para P. crhysosporium y Pleurotus ostreatus
Cortar cilindros de cada medio e inocularlos a una concentración de
1x10-7 Esporas /ml de P. crhysosporium. Para P. ostreatus se
inoculará cada cilindro cortando un disco de pleura la cual se
situará sobre la superficie de cada cilindro.
Inoculo
Los cilindros inoculados se incubarán por 24 horas P.
crhysosporium a 37° C y P. ostreatus a 25°C incubación
Las mezclas de reacción con el colorante inmovilizado se
realizarán en cajas de Petri de tres divisiones con un volumen
final de mezcla de 9ml a una concentración final de 0.02% del
colorante a excepción de azure B el cual quedara al 0.0033%
La mezcla de reacción se realizará tal y como se
detalla en la tabla. Un paso antes se deben esterilizar
las mezclas por filtración
Mezcla de
Reacción
Una vez solidificadas las mezclas de reacción se
procede a colocar los cilindros inoculados sobre la
superficie agregando cada 24 horas a los donadores y
aceptores de electrones para LiP y MnP
52
Mezcla de reacción para sondeo de Enzimas
Ligninolìticas
Reactivo/Enzima MnP LiP VP Lac
pH 4.5 3 3 4.5 4.5
Tartrato de Sodio (0.9M) 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
MnSO4 * H2O (18 mM) 1mL - - 1mL -
Alcohol Veratrilico (18mM) - 1mL 1mL - -
CUSO4 (13.5mM) - - - - 1mL
Agar (1.8%) 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL
Colorante (0.18%) 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
H2O2(36mM) 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
Tabla 26 de reacción para sondeo de peroxidasas
Tabla 27 Donadores de Electrones
Ilustración 6 Placa con colorantes
Reactivo/Enzima LiP MnP
H2O2 500 µl para
0.04% 500 µl para 0.04%
Alcohol Veratrilico 500 µl para
10mM
MnSO4 * H2O 500 µl para 2mM
53
Resultados.
Etapa 1: Aislamiento de cepa fúngica de interés y prueba
a tolerancia a HAP’s.
La cepa de interés se detectó en una pieza de madera trabajada por ebanistería,
la metodología seguida para su recolección es “el aislamiento por tejido
modificada” propuesta por Hernández et al 2006. La cual consistió en lo
siguiente. En un ambiente de absoluta asepsia, incluyendo los materiales
previamente esterilizados, se cortó el píleo del hongo longitudinalmente con un
bisturí; con la ayuda de unas pinzas estériles y frías, se tomaron fragmentos del
cuerpo fructífero el cual debió estar en buen estado y libre de tierra o insectos.
Los trozos de cuerpo fructífero Se colocaron en tubos de vidrio con agua destilada
previamente esterilizada, los tubos con los trozos de cuerpo fructífero se
almacenaron en una hielera para su posterior traslado al centro de investigación.
1x106
Inoculo en cajas de Petri con medio nutritivo.
En cajas de Petri con medio de cultivo nutritivo, se inoculo el cuerpo fructífero y
esporas tomadas del sobrenadante de los tubos. Las cajas con los aislamientos se
incubaron entre 25-30°C, de preferencia en obscuridad o penumbra. Se
seleccionaron las cajas de Petri que presentaron mejor crecimiento y se
transfirieron a nuevas cajas con medio de cultivo nutritivo. La resiembra fue
realizada periódicamente con un tiempo aproximado de 10 días por resiembra.
Pruebas de Tolerancia a HAP’s.
Las pruebas de tolerancia a HAP’s se realizaron inicialmente en cajas de Petri con
tres divisiones probando tres medios mínimos distintos: Czapek, Toyamas y Kirk
modificado, a una concentración de 2000 ppm. A esa concentración las cepas
mostraron inhibición del crecimiento por lo que se replanteo el experimento para
realizarlo a tres concentraciones de HAP’s las cuales fueron de 500 ppm, 1000
ppm y 1500 ppm. Los resultados obtenidos muestran una tolerancia de la cepa
blanca a 500 ppm y 1000 ppm. Y una tolerancia de la cepa Beige a 500 ppm.
Siendo entonces posibles cepas candidatas a ser integradas en el consorcio
fúngico de interés.
54
Inoculo con cuerpo
fructífero y esporas
Medio Czapek
incubado a 30°C
PRIMER AISLADO
Pre inoculó
Directo
Selección de Cepa por Cobertera
de Crudo al 1%
Aislamiento por Estría
Simple en medio PDA
Cepas Aisladas
Pruebas de Tolerancia a HAP’s
SEGUNDO
AISLADO
Metodología Aislamiento De Cepa Fúngica de Interés.
Inoculo con cuerpo
fructífero y esporas
Cajas de Petri con medio PDA y Malta Agar a
incubación de 30, 37 °C y Temperatura Ambiente
Resiembras Sucesivas en Medio PDA y Malta Agar
Cepa Fúngica de Interés. Hidratación de Tejido en
Agua estéril.
Cepas Aisladas: Cepa Blanca, Cepa Beige Cepa verde Pruebas de Tolerancia a HAP’s Identificación Morfológica y
Molecular
55
Primeras Aislamiento de Cepa Crecida sobre madera contaminada.
El aislamiento se realizó en condiciones de esterilidad hidratando el cuerpo
fructífero cortado en agua previamente esterilizada. La suspensión de esporas que
quedo como sobrenadante se inoculo en dos medios que promueven las
condiciones ideales para el crecimiento fúngico, como lo es el medio Papa
dextrosa (PDA) y el agar malta.
Ilustración 7 Primer Aislamiento Cepa de interés
En este paso del aislamiento no se podía aun definir una cepa fúngica aislada ya
que se tenía una mezcla de distintos microorganismos los cuales estaban
intrínsecos en el cuerpo fructífero al momento de aislamiento. Cabe señalar que
se inocularon las placas de dos distintas maneras: Por cuerpo fructífero y por
esporas. Esto se realizó tanto en medio Malta Agar y Agar Papa Dextrosa. De los
dos inóculos el que mejor funciono fue el inoculo con esporas y que el inoculo por
cuerpo fructífero no desarrollaba micelio.
Purificación de Cepa fúngica mediante resiembra en placa.
La resiembra en cultivo superficial por estría abierta (Inglis et al. 2012) resulta ser
una técnica eficaz para la purificación de cepas fúngicas, en está resiembra fue
posible ir observando diferenciación micelial a comparación de la Heterogeneidad
de cepas observadas desde un principio. Después de tres resiembras ya era
posible distinguir cepas con coloración beige, verde y coloración blanca. Cada una
creciendo a temperaturas y condiciones distintas, la cepa beige creció
adecuadamente en agar malta a 30ºC, la cepa verde en medio PDA a 37ºC y la
cepa con micelio Blanco creció a 30ºC en medio PDA.
Medio de Cultivo/
Temperatura
30ªC
37ºC
Temperatura Ambiente
PDA
Agar Malta
56
Ilustración 8 Fenotipos obtenidos durante el proceso de purificación
En la segunda resiembra fue posible distinguir en su totalidad dos cepas las
cuales fueron descritas como cepa Beige y cepa verde. Se distinguió una cepa
que pigmentaba el micelio de color naranja, pero durante el estudio esta fue
descartada por que no crecía de la misma forma que la cepa beige y la cepa
verde. Cepa de micelio blanco: En Agar papa dextrosa creció una cepa aislada
con micelio característico ya que visualmente se ve como algodón. Según
Hernández et al 2006 el crecimiento micelio de esta naturaleza indica que la
recolección del cuerpo fructífero fue adecuada. Cepa de micelio beige: En agar
malta creció una cepa aislada con un crecimiento característico color beige. Cepa
de micelio Verde: Desde las primeras resiembras ya sea por cuerpo fructífero o
esporas, se ha encontrado el crecimiento de esta cepa con color característico del
micelio verde.
Ya durante la tercera resiembra se pudo distinguir que las cepas crecían de
manera pura es decir crecía solo el color de micelio deseado, y no con
interferencias como sucedía en las primeras resiembras. En este punto fue posible
observas el crecimiento de una cepa blanca, una cepa beige y una cepa verde.
Medio de Cultivo/
Temperatura
30ªC
37ºC
Temperatura Ambiente
PDA
Agar Malta
57
Pruebas de tolerancias a HAP’s Cepa Beige.
Ilustración 9 Prueba de tolerancia a HAP’s de Cepa Blanca
Grafica 1 Crecimiento de Cepa Blanca en HAP’s
El análisis de ANOVA sugiere que existe una diferencia estadísticamente
significativa p <0.05. La Comparación de medias por la prueba LSD sugiere una
diferencia entre las medias del control y el tratamiento de 1500 ppm de HAP’s,
además de que evidencia diferencia significativa entre las medias de los
tratamientos de 1500 y 500 ppm. Durante la cinética la cepa mostro un mejor
crecimiento a 500 ppm. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa estadístico
STATGRAPHICS Centurión XV.
58
Pruebas de tolerancias a HAP’s Cepa Blanca El efecto tenido que tienen los HAP’s sobre sobre el crecimiento radial es significativo ya que en esta cepa se presenta una inhibición del crecimiento a comparación de los controles. A excepción de los tratamientos con medio Toyamas y Czapek. Por Lo que se propone replantear el experimento realizando un gradiente de concentraciones de 500,1000 y 1500. De manera conjunta se incrementará la concentración de glucosa a 10 g/l
Ilustración 10 Prueba de tolerancia a HAP’s de Cepa Beige
Grafica 2 Crecimiento de Cepa Beige en HAP’s
De las cepas evaluadas esta es la que presento una mejor tolerancia esta cepa
creció a un tiempo de 16 días. El análisis estadístico sugiere que no existe una
diferencia significativa entre las medias de los tratamientos. En el grafico es
posible observar una estrecha correlación entre el control y el tratamiento a 500
ppm. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa estadístico
STATGRAPHICS Centurión
59
Velocidad de Crecimiento Radial entre Cepas.
Tabla 28 Velocidades de Crecimiento radial de cepas aisladas
El crecimiento radial da una razón del crecimiento de la cepa en función del tiempo, por lo que para esta prueba de tolerancia a hidrocarburos este parámetro cuando es que el crecimiento de una cepa está siendo inhibido por los hidrocarburos aromáticos policìclicos o cuando es que las cepas están presentando una tolerancia a HAP’s durante su crecimiento. Los resultados de la velocidad de crecimiento radial en la cepa Beige nos siguieren una tolerancia a 500 ppm con respecto a su control. El análisis estadístico sugiere que no existe una diferencia significativa entre las medias de los tratamientos. En el grafico es posible observar una estrecha correlación entre el control y el tratamiento a 500 ppm. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa estadístico STATGRAPHICS Centurión
60
Resultados
Etapa 1: Segundo Aislamiento de Cepa Crecida sobre madera
contaminada.
Selección de Cepas crecidas sobre Crudo y Mezcla de HAP’s
La metodología seguida para este segundo aislamiento fue la descrita por
Zafra et al 2016, la cual consistió en inocular con esporas y cuerpo fructífero
placas con medio Czapek suplementadas con ampicilina. Después de cuatro y
seis días de crecimiento se virtió agar noble al 15% sobre la placa, cuidando que
la temperatura del agar no fuera muy alta. Una vez solidificado el agar se
contaminaron las placas con crudo al 1% y una mezcla de HAP’s a 1000 ppm
(Fenantreno, Pireno y Benzo(a) pireno. Transcurridos los días las cepas tolerantes
a Crudo y a HAP’s colonizaron y crecieron sobre la superficie.
Aislamiento de Cepas por Estría Simple en Placa de Petri.
Aislados de Placas con crudo al 2%
Ilustración 11 Cepas purificadas de cobertera de Crudo y HAP’s
La cobertera con crudo provoca que las cepas fúngicas busquen la disponibilidad
de oxígeno y nutrientes teniendo que penetrar esta con las hifas, en estas pruebas
las cepas que eran capaces de degradar las fracciones aromáticas del crudo son
las que sobrevivieron.
Tratamiento UE Primer Pase Segundo Pase Tercer Pase
Placa con crudo al 1% con dilución 1:100
Tratamiento Inoculado con Cuerpo Fructífero
Placa con crudo al 1% con
dilución 1:100 Tratamiento Inoculado
con Pre inoculó De Esporas
Placa con crudo al 1% con
dilución 1:1000 Tratamiento Inoculado con Cuerpo Fructífero
61
Pruebas de Tolerancia a HAP’s
Prueba de tolerancia Cepa: C1PCC
Ilustración 12 Prueba de Tolerancia de Cepa C1PCC a HAP’s
Prueba de tolerancia Cepa: C2PCC
Ilustración 13 Prueba de Tolerancia de Cepa C2PCC a HAP’s
Las pruebas de tolerancia de la
cepa C2PCC muestran una
disminución del crecimiento en
altas concentraciones de la
mezcla de HAP’s (Fenantreno y
Pireno). Al día 6 el mayor
crecimiento se reportó a 500
ppm (3.39 mm/día).
Macroscópicamente es posible
observar cambios en la
pigmentación del micelio de los
tratamientos con respecto al
control observando una notable
decoloración. A 2000 ppm se
observa una disminución del
crecimiento.
Las pruebas de tolerancia de
la cepa C1PCP muestran una
disminución del crecimiento en
altas concentraciones de la
mezcla de HAP’s (Fenantreno
y Pireno). Al día 6 la mayor
velocidad del crecimiento se
reportó en 1500 y 2000 ppm
(3.24 y 3.19 mm/día).
Macroscópicamente es posible
observar cambios en la
pigmentación del micelio de
los tratamientos con respecto
al control observando una
notable decoloración de
conidiacion.
62
Prueba de tolerancia Cepa: C3PEC
Ilustración 14 Prueba de Tolerancia de Cepa C3PCC a HAP’s
Prueba de tolerancia Cepa: C4PCP
Ilustración 15 Prueba de Tolerancia de Cepa C4PCP a HAP’s
Las pruebas de tolerancia de la
cepa C3PEC muestran una
disminución del crecimiento en
altas concentraciones de la
mezcla de HAP’s (Fenantreno y
Pireno). Al día 6 la velocidad de
crecimiento radial se mantuvo en
el rango de 3.1 a 3.3 mm/Día en
todos los tratamientos.
Macroscópicamente es posible
observar cambios en la
pigmentación del micelio de los
tratamientos con respecto al
control observando una notable
decoloración. Como fue
reportado por Zafra et al 2016
Las pruebas de tolerancia de la
cepa C4PCP muestran una
disminución del crecimiento en
altas concentraciones de la
mezcla de HAP’s (Fenantreno y
Pireno). Al día 6 la mayor
velocidad del crecimiento se
reportó en 1500 y 2000 ppm
(3.24 y 3.19 mm/día).
Macroscópicamente es posible
observar cambios en la
pigmentación del micelio de los
tratamientos con respecto al
control observando una notable
decoloración. Como fue
reportado por Zafra et al 2016
las altas concentraciones de
HAP's alteran la membrana
celular fúngica y alteran la ruta
de conidiacion desencadenando
cambios en la velocidad radial y
la esporulación.
63
Gráficos de Extensión Radial de cepas aisladas.
Cepa:C1PCC Cepa:C2PCC
Cepa:C3PEC Cepa:C4PCP
Grafica 3 Velocidad de crecimiento radial en prueba de tolerancia Eje X: Tiempo, Eje Y: Extensión Radial
La extensión radial en el control fue mayor que los tratamientos, en los cuales los
tratamientos de 1500 y 2000 ppm mostraron una mayor extensión, el análisis
estadístico por ANOVA (P< 0.05) de una vía arrojo que no existe diferencia
significativa entre los tratamientos.
64
Velocidad de Crecimiento Radial entre Cepas.
Tabla 29 Velocidades de Crecimiento radial de cepas aisladas
El análisis de ANOVA indica que no hay diferencia significativa (P < 0.05) en la
velocidad de crecimiento radial de cada uno de los tratamientos, esto fue
corroborado Mediante la prueba de comparaciòn multiple de Tukey’s.
Observaciones Macroscópicas de Cepas
Ilustración 16 Análisis Microscópico de cepas aisladas objetivo 100X
Las cepas Presentan hifas septadas que varían entre los 200 y 230 µm de grosor,
las hifas tienen conidióforos que se dividen entre 4 y 3 ramificaciones (Metulas)
con una longitud aproximada de 2000 y 2500 µm. La morfología de las esporas es
semieliptica en el caso de las cepas C2PPC y C4PCP. Y esférica en las cepas
C1PCC y C3PEC.
65
Aislamiento de DNA Genómico
Ilustración 17 ADN Genómico de muestras aisladas
Ilustración 18 Amplificaciones por PCR de genes ITS de cepas aisladas
Siguiendo el protocolo de extracción de DNA por el método fenol cloroformo se
crecieron las cepas en medio YPG Durante 48 horas a 100 rpm de agitación. Las
muestras obtenidas se emplearán pala la amplificación de las regiones ITS para
su posterior identificación.
Mw C1 C2 C3 C4
MW C1 C2 C3 C4
66
Resultados
Etapa 1: Selección de Medio de Cultivo
Cepas no Ligninolìticas.
Para realizar la conformación de un consorcio con cepas fúngicas ligninolìticas y
no ligninolìticas requiere estandarizar un medio de cultivo optimo, para encontrar
los requerimientos nutricionales y metabólicos necesarios para ambas clases.
Tabla 30 Selección de Medio de Cultivo Para Cepas del Consorcio
Toyamas
67
Crecimiento Radial Cepas no Ligninolìticas
Aspergillus niger Trichoderma asperellum H15
Fusarium Verticiloides Talaromyces spectabilis
Grafica 4 Velocidad de crecimiento radial de cepas en distintos medios. Eje X: Tiempo (Horas), Eje Y: Extensión Radial (Milímetros)
68
Aspergillus terreus
Grafica 4 Velocidad de crecimiento radial de cepas en distintos medios. Eje X: Tiempo (Horas), Eje Y: Extensión Radial (Milímetros)
Crecimiento radial cepas Ligninolìticas
Tabla 31 Selección de Medio de Cultivo Para Cepas ligninolìticas del Consorcio
69
Crecimiento radial cepas Ligninolìticas
Pleurotus ostreatus Phanerchaete crhysosporium
Grafica 5 Velocidad de crecimiento radial de cepas ligninolìticas en distintos medios. Eje X: Tiempo (Horas), Eje Y: Extensión Radial (Milímetros)
Las velocidades de crecimiento radial para esta cepa no muestran diferencias
significativas de acuerdo al análisis de ANOVA (P < 0.05). La velocidad de
crecimiento radial fue mayor en el Medio Toyamas.
Velocidades de crecimiento radial.
Tabla 32 Velocidades de Crecimiento radial de cepas aisladas
Las velocidades de crecimiento radial reportadas muestran que el medio Toyamas
es el indicado para el crecimiento de las cepas fúngicas, ya que en él se
encuentran las mayores velocidades de crecimiento, seguido por el medio Czapek
y por último el medio Kirk Modificado
Velocidades de crecimiento radial en medios de cultivo (mm/día)
Cepas Czapek Kirk Modificado Toyamas
Trichoderma asperellum H15 0.419 ± 0.00216 0.351 ± 0.0329 0.371±0.0342
Aspergillus niger 0.169 ± 0.0135 0.133 ± 0.00081 0.238± 0.0099
Talaromyces spectabillis 0.166 ± 0.00047 0.183±0.00094 0.206± 0.0018
Fusarium verticiloides 0.309 ± 0.0053 0.126 ± 0.033 0.358 ± 0.027
Pleurotus ostreatus 0.159±0.0018 0.073±0.0024 0.145±0.00094
Phanerochaete crhysosporium 0.624±0.0332 0.905±0.0225 1.625±0
70
Sondeo de Enzimas Peroxidasas
Phanerochaete crhysosporium
La selección de medio de cultivo sugiere que el medio Toyamas es el indicado
para la conformación del consorcio. El sondeo de enzimas Peroxidasas involucra
el uso de colorantes y reactivos que promueven un ambiente oxidativo para la
acción de las enzimas ligninolìticas.
Tabla 33 sondeo de enzimas ligninolìticas en Phanerochaete crhysosporium
En general, la expresión de genes lignolíticos es activada por la disminución de
nutrientes como el nitrógeno, carbono o azufre y es por ende una respuesta de
estrés ante carencias nutricionales. En P. crhysosporium, la expresión del gen
mnp es activada por la ausencia de nitrógeno en el cultivo (Gold & Alic, 1993; Li
et al., 1994).
De igual manera los genes lip de P. crhysosporium son regulados de varias
maneras, por ejemplo, la respuesta a la deficiencia de nitrógeno y carbono
(Stewart et al., 1992; Broda et al., 1995; Stewart & Cullen, 1999).
En el sondeo de enzimas ligninolìticas fue posible observar la actividad de la
enzima Manganeso Peroxidasa después de 8 días.
71
Pleurotus ostreatus
Tabla 34 sondeo de enzimas ligninolìticas en Pleurotus ostreatus
En Pleurotus ostreatus la actividad de las enzimas se expresó a partir de los dos
primeros días, siendo notoria la decoloración de la enzima Lacasa, Manganeso
Peroxidasa y Versátil Peroxidasa. Entre las oxidasas producidas por hongos de
podredumbre blanca, las lacasas tienen un potencial redox relativamente bajo
(0,4-0,8 V), pertenecen a un grupo de polifenol oxidasas que contienen átomos de
cobre en el sitio catalítico y generalmente se denominan oxidasas multicobre
(Palmer et al., 1999). Las lacasas son responsables de la degradación de la
lignina en la naturaleza. Esta enzima carece de especificidad de sustrato y, por lo
tanto, es capaz de degradar una amplia gama de compuestos no ligninolíticos,
incluidos ciertos xenobióticos como aguas residuales de color industrial, aceites y
productos derivados del petróleo, compuestos clorados y HAP’s (AboState et al.,
2011).
72
Cepas aisladas
Conjuntamente con el análisis molecular el sondeo de enzimas ligninolìticas da
indicios de la naturaleza de las mismas, en este análisis cuatro de las cepas
aisladas dieron un resultado negativo.
Tabla 35 sondeo de enzimas ligninolìticas en cepas aisladas
El resultado de estas pruebas corrobora la inexistencia de enzimas ligninolìticas
en las cepas aisladas, es posible observar que en el diseño experimental se
incluyó como control positivo a Pleurotus ostreatus el cual desde los primeros dos
días tuvo el cambio de coloración correspondiente.
73
Cepa Blanca Aislada
Tabla 36 sondeo de enzimas ligninolìticas en cepas aisladas
De las seis cepas aisladas existe una que pose características macroscópicas
similares a las de un hongo ligninolìtico.
Ilustración 19 Micelio Cepa Blanca
Aislada Microscopia cepa fúngica aislada
74
Pruebas Antagónicas
Ilustración 20 Pruebas antagónicas entre cepas del consorcio fúngico en residuos de olote y caña en Presencia y ausencia de crudo
Ilustración 21 Pruebas antagónicas entre cepas del consorcio fúngico en residuos de maíz y cacahuate en Presencia y ausencia de crudo
75
Ilustración 22 Pruebas antagónicas entre cepas del consorcio fúngico en Typha Latifolia y controles con medio Toyamas en presencia y ausencia de crudo
Interacción en Pruebas Antagónicas
Ilustración 23 Visualización estereoscópica de interacciones en olote de maíz entre cepas: C1PCC, C2PCC y C3PEC vs Trichoderma asperellum H15
C2PCC
C1PCC
C3PEC
76
Ilustración 24 Visualización estereoscópica de interacciones en A) Cacahuate sin crudo entre cepas: Aspergillus niger y Fusarium verticiloides y B) Residuo de cacahuate con crudo entre cepas: Phanerochaete crhysosporium y Pleurotus ostreatus
Ilustración 25 Visualización estereoscópica de interacciones en C) Typha sin crudo entre cepas: Pleurotus ostreatus y CP1PCC y D ) Typha con crudo entre cepas: Aspergillus terreus y Phanerochaete crhysosporium
A B
C D
77
Ilustración 26 Visualización estereoscópica de interacciones en rastrojo de maíz entre cepas: Blanca vs C1PCC y Aspergillus terreus y C1PCC
Tabla 37 Antagonismo entre cepas del consorcio (+) Existió inhibición y (-) No existió inhibición
78
Tabla 38 Antagonismo entre cepas del consorcio (+) Existió inhibición y (-) No existió inhibición
Las pruebas antagónicas mostraron la trascendencia que tiene en el consorcio la
presencia de residuo agroindustrial y de hidrocarburos en su medio. Estos dos
factores mejoraron las interacciones entre las cepas manteniendo un equilibrio en
el crecimiento de cada una de ellas. El residuo de caña es el que mostro ser el
menos indicado para el desarrollo de estas pruebas ya que el desarrollo de micelio
de las cepas se vio disminuido. Los residuos de Cacahuate, Olote y Typha
latifolia presentaron un mejor crecimiento de las cepas y una mejor interacción
entre cada una de ellas.
Trichoderma asperellum mostro ser la cepa más favorecida por la adición de
residuos agroindustriales y de Hidrocarburos aromáticos policiclicos teniendo la
capacidad de crecer mejor que las cepas restantes del consorcio inhibiendo su
crecimiento, con excepción de las cepas Aspergillus niger y las cepas C1PCC,
C2PCC, C3PEC y C4PCP
79
Discusiones.
Aislamiento de cepa fúngica de interés y prueba a tolerancia a HAP’s.
El proceso de degradación de HAPs en suelos es lento por la flora nativa, por ello
el aislamiento e identificación de los microorganismos con capacidad de
degradarlos se vuelve una tecnología muy eficiente ya que al bioaumentar un
suelo se incrementa la velocidad de degradación del contaminante (Mao, J et al
2012). Para aumentar la eficacia del consorcio se integrarán las cepas obtenidas
en el primer aislamiento ya que estas muestran tolerancia de 500 a 1000 ppm de
una mezcla de HAP’s (Fenantreno, Pireno y Benzo (a) pireno). Reyes cesar et al
2014 aisló cepas fúngicas de suelo contaminado con crudo las cuales tuvieron una
tolerancia de 1000 ppm, de acuerdo con lo reportado por Zafra et al 2015 se
observaron cambios morfológicos y cambios en la velocidad de crecimiento radial
de las cepas aisladas.
Segundo Aislamiento de Cepa Crecida sobre madera contaminada.
Con un segundo aislamiento de la cepa fúngica se obtuvieron cuatro cepas
diferentes a las obtenidas originalmente, siguiendo la metodología propuesta por
Zafra et al 2015. Con las técnicas moleculares hoy en día, es más fácil y confiable
identificar tanto una cepa microbiana, como un consorcio la identificación de cepas
fúngicas por secuencias ITS por PCR-DGGE es la técnica más usada. Por lo que
es importante realizar la identificación molecular de las cepas aisladas. Ya que de
esta manera conoceremos las necesidades nutricionales, las condiciones
ambientales y el potencial metabólico de las cepas aisladas.
selección de Medio de Cultivo para las cepas del Consorcio.
Las pruebas antagónicas son una etapa definitiva para la conformación de un
consorcio fúngico, para esto es importante tener un medio de cultivo ideal en el
que cada una de las cepas encuentren las condiciones y los requerimientos
nutricionales apropiados, y así eliminar factores externos en el antagonismo de las
cepas fúngicas. El medio adecuado para el crecimiento de las cepas del consorcio
fúngico fuel medio Toyamas ya que fue el medio que no mostro diferencia
significativa ANOVA (P < 0.05).
Sondeo de Enzimas Ligninolìticas.
El sondeo de enzimas por métodos colorimétricos es un método instantáneo que
da indicios sobre la actividad de enzimas ligninolìticas en cepas fúngicas, en la
selección del medio de cultivo Pleurotus ostreatus presento condiciones
ligninolìticas en el medio Toyamas y el hongo Phanerochaete crhysosporium
mostro actividad solamente de manganeso peroxidasa en el medio Toyamas. De
las cepas aisladas solo un mostro actividad ligninolìtico, asemejándose al género
Pleurotus ostreatus.
80
Conclusión
Diversos estudios muestran que un solo microorganismo no es capaz de degradar
completamente los contaminantes de un suelo contaminado, llegando a veces a la
generación de metabolitos secundarios más tóxicos que el original, por lo que las
cepas aisladas que han mostrado tolerancia a hidrocarburos se emplearan para
potencializar la eficacia del consorcio Fúngico.
La selección del medio de cultivo idóneo para el crecimiento y mantenimiento de
las cepas del consorcio es importante, por lo que se demostró que el medio
Toyamas es el medio adecuado para las especies ligninolìticas y no ligninolìticas
del consorcio.
81
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85
ANEXOS
Anexo 1 Purificación de cepa asilada primera y segunda resiembra
Segunda Resiembra Hongo Aislado en medio Nutritivo
Medio de cultivo PDA Medio de cultivo Malta Agar.
Micelio verde PDA
Micelio verde Malta
Crecimiento Beige
PDA
Crecimiento Beige
Malta
Micelio Naranja PDA
Micelio Naranja
Malta
Primera Resiembra Hongo Aislado en medio Nutritivo
Medio de cultivo PDA Medio de cultivo Malta Agar.
Cuerpo Fructífero
Cuerpo Fructífero
Esporas
Esporas
Cuerpo Fructífero
Micelio Beige
Micelio Blanco
Micelio Verde
Micelio Verde
Micelio Blanco
86
Anexo 2 Cepas aisaldas
Cepas Fúngicas aisladas en medio nutritivo
Cepa de micelio blanco: En Agar papa dextrosa creció una cepa aislada con micelio característico ya que visualmente se ve como algodón. Según Hernández et al 2006 el crecimiento micelio de esta naturaleza indica que la recolección del cuerpo fructífero fue adecuada.
Cepa de micelio beige: En agar malta creció una cepa aislada con un crecimiento característico color beige.
Cepa de micelio Verde: Desde las primeras resiembras ya sea por cuerpo fructífero o esporas, se ha encontrado el crecimiento de esta cepa con color característico del micelio verde.
87
Anexo 3 segundo Proceso de aislamiento
