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総タンパク質を用いたデータ補正定量ウェスタンV3ワークフロー
電気泳動&ブロッティング&イメージング
6
Application Insights
2 V3 ウェスタンブロッティングワークフロー
■ ウェスタンブロッティングのデータ補正のトレンド ■ 総タンパク質補正に最適なStain-Freeテクノロジー
■ Stain-Freeテクノロジーを用いたデータ補正の実例
HKPではタンパク質の濃度を数値化することが困難であるのに対し、総タンパク質（Stain-Free）はタンパク質濃度を反映した定量結果が得られることが示されています。特にHKPの多くは過剰発現していることが多く、今回の結果のように本来のタンパク質量を反映した数値結果を得ることが難しいことがよくあります。
電気泳動後にStain-Freeゲルを検出した画像
Stain-Freeによりラベルされたタンパク質をメンブレン上で検出した画像
バイオ・ラッドではHKPを代替する総タンパク質補正を行うためのフローとして独自技術Stain-Freeテクノロジーを用いた定量ウェスタンV3ワークフローを提案しております。
Stain-Free TGX ゲルは、ゲル中にトリハロ化合物が含まれており、染色剤を用いることなく電気泳動後のゲルにUV照射することで、ゲル中のタンパク質の可視化が可能です（右参照）。さらに、一度Stain-Freeによりラベルされたタンパク質は、メンブレンへ転写された後にもラベル状態は保持されているため、UV照射により簡単に検出が可能です。この特性を利用することで、ウェスタンブロッティングにおける総タンパク質量補正に利用することが可能です。
ゲル中およびメンブレン上の総タンパク質検出
検出画像（上）HKP（β-actin,β-tublin,GAPDH）（左）総タンパク質（Stain-Free）
総タンパク質（Stain-Free）
ライセートローディング量（μg） ライセートローディング量（μg） ライセートローディング量（μg） ライセートローディング量（μg）
ウェスタンブロッティングのデータを定量的解析をする場合、目的のタンパク質を検出するだけでなく、同様に検出されたハウスキーピングタンパク質（HKP）を用いデータ補正することで、データの信頼度が担保されます。
従来法では、このデータ補正にはGAPDHやβ-Actin等の代表的なHKPが一般的に用いられてきましたが、近年では総タンパク質を用いたデータ補正法が着目されるようになりました。
ハウスキーピングタンパク質（HKP）によるデータ補正 総タンパク質によるデータ補正
HKPと総タンパク質（Stain-Free）の定量比較
Stain-Freeテクノロジーのタンパク質検出原理
総タンパク質検出法（メンブレン）の比較
HeLa lysate load, µg
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β-actinStain-Free
GAPDH
β-tubulin
Quantitative response
HKPと総タンパク質の数値比較例（10 μg/ウェルの強度を1とした場合の各濃度における強度の比率）
β-actin
β-tubulin
GAPDH
50 40 30 20 10
左のウェスタンブロッティングの結果をもとに、実際にHKP（β-actin）、および総タンパク質（Stain-Free）を用いターゲットタンパク質（MEK, Akt, Erk）のデータ補正を行った一例です。データ補正を行った結果、10 μg/ウェルを1とした場合、HKPでは40 μg/ウェルにおいて期待値（---Expected Value）の2倍ほど高い値が示されました。それに対し、総タンパク質では期待値に近い値で算出され、より適切に補正されていることが示されました。
総タンパク質（Stain-Free）
50 40 30 20 1050 40 30 20 10
β-actin
MEK
Akt
Erk
50 40 30 20 10
10 40 40HeLa lysate load, µg
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its) 総タンパク質
（Stain-Free）
Expected Value
HKP（β-actin）■■■
MEKAktErk
MEK、Akt、ErkをHKPおよび総タンパク質によりデータ補正した結果（10 μg/ウェルの補正値を1とした場合の40 μg/ウェルにおける補正値の比較）
検出画像（上）MEK,Akt,Erk,HKP（β-actin）（左）総タンパク質（Stain-Free）
HKPと総タンパク質（Stain-Free）のデータ補正の比較
UVUV UVUV
NHNH
OH
トリハロ化合物
トリハロ化合物
タンパク質のトリプトファンとゲル中のトリハロ化合物が結合する
修飾されたトリプトファンがUV照射により蛍光を発する
UV照射※ UV照射※ゲル中に含まれるトリハロ化合物
トリハロ化合物
トリハロ化合物
ゲル中のタンパク質のトリプトファン残基
NH2
COOH
Trp NHNH
OH
※ 最 適 な U V 照 射条件は使用機器に よって 変 わります。
※バイオ・ラッドの撮影装置はUV照射条件が各装置毎に最適条件でデ フォルトセッティング さ れています。
蛍光
NHNH
OH
トリハロ化合物
トリハロ化合物
メンブレン上の総タンパク質を検出する代表的な方法として、CBBやPonceau Sなどの可視染色する方法や、SYPRO Ruby等の蛍光染色する方法があります。Stain-Freeは、低コストでありながら操作性も良く、CBB以上の検出感度を持つため、総タンパク質によるデータ補正に最適なツールとして利用することが可能です。
Ponceau SとStain-Freeの検出画像の違い
Ponceau Sの場合 Stain-Freeの場合（転写後のメンブレン上の検出画像）
メンブレン上の総タンパク質検出法の特長
検出タイプ 感度
抗原抗体反応への
リスク
CBB/Amid Black
染色剤
Ponceau S
SYPRO Ruby
Stain-Free
可視
可視
蛍光
蛍光
○
×
◎
○
脱色
不可
可
可
不要
操作性
○
○
×
○
コスト
低
低
高
低
高
低
低
低
1. 一般的に用いられるHKPは、ターゲットタンパク質と比べ過剰発現していることがほとんどで、正確な量を反映した検出が困難なことが多い
2. 様々な刺激や状態の変化によってHKPの発現量が変化するHKPの発現量が変化する要因●細胞、組織等の齢や種の違いによる発現量の変化●転写後調整による変化●細胞周期のステージの違い●成長変化●実験条件の違いなど※HKPの発現量の変化については様々な論文で報告されています（Bulletin6350
参照）。
3. ストリッピング/リプロービング等の操作によるエラーや操作の煩雑性がある一般的なHKPの検出は、目的タンパク質を検出した後、ストリッピングやリプロービング操作によりメンブレンを初期状態に戻してから、再度検出を行います。そのため、ストリッピングやリプロービング操作によるエラー、時間的な問題、検出コストがかかるといった問題点があります。
1. サンプル 種やサンプルの状 態を問わず一定量のサンプル量があれば実施することができる
2. 電気泳動した全てのタンパク質の総和を用い定量化するため、安定性が高い
3. ランニングコスト、操作時間を軽減することができる
●HKP検出用の抗体、および化学発光分のコストが不要となるため大幅なコストダウンが可能です。
●HKPを検出するための抗原抗体反応時間や、ストリッピングやリプロービング等の時間を節約できます。
4. HKPに代替する方法として推奨されるようになり始めています
●幾つかのジャーナルではHKPの発現の安定性が議論され、総タンパク質を用いた方法が推奨されるようになっています。
JBC(Journal of Biological Chemistry）のガイドライン一例
http://jbcmission.asbmb.org/collecting-and-presenting-data
JBC editors recommend TPN for normalizing western blots.
It is typically better to normalize western blots using total protein loading as the denominator.
Fosang AJ and Colbran RJ(2015).Transparencyis the key to quality. J Biol Chem 290, 29,692-29,694.
We prefer that signal intensities are normalized to total protein by staining membranes with Coomassie Blue,Ponceau S, or other protein stains, and we strongly caution against the use of housekeeping proteins for normalization, unless there is clear demonstration that expressoin of thehousekeeping protein is unaffected by experimentaltreatments.
V3 ウェスタンブロッティングワークフロー 3
■ ウェスタンブロッティングのデータ補正のトレンド ■ 総タンパク質補正に最適なStain-Freeテクノロジー
■ Stain-Freeテクノロジーを用いたデータ補正の実例
HKPではタンパク質の濃度を数値化することが困難であるのに対し、総タンパク質（Stain-Free）はタンパク質濃度を反映した定量結果が得られることが示されています。特にHKPの多くは過剰発現していることが多く、今回の結果のように本来のタンパク質量を反映した数値結果を得ることが難しいことがよくあります。
電気泳動後にStain-Freeゲルを検出した画像
Stain-Freeによりラベルされたタンパク質をメンブレン上で検出した画像
バイオ・ラッドではHKPを代替する総タンパク質補正を行うためのフローとして独自技術Stain-Freeテクノロジーを用いた定量ウェスタンV3ワークフローを提案しております。
Stain-Free TGX ゲルは、ゲル中にトリハロ化合物が含まれており、染色剤を用いることなく電気泳動後のゲルにUV照射することで、ゲル中のタンパク質の可視化が可能です（右参照）。さらに、一度Stain-Freeによりラベルされたタンパク質は、メンブレンへ転写された後にもラベル状態は保持されているため、UV照射により簡単に検出が可能です。この特性を利用することで、ウェスタンブロッティングにおける総タンパク質量補正に利用することが可能です。
ゲル中およびメンブレン上の総タンパク質検出
検出画像（上）HKP（β-actin,β-tublin,GAPDH）（左）総タンパク質（Stain-Free）
総タンパク質（Stain-Free）
ライセートローディング量（μg） ライセートローディング量（μg） ライセートローディング量（μg） ライセートローディング量（μg）
ウェスタンブロッティングのデータを定量的解析をする場合、目的のタンパク質を検出するだけでなく、同様に検出されたハウスキーピングタンパク質（HKP）を用いデータ補正することで、データの信頼度が担保されます。
従来法では、このデータ補正にはGAPDHやβ-Actin等の代表的なHKPが一般的に用いられてきましたが、近年では総タンパク質を用いたデータ補正法が着目されるようになりました。
ハウスキーピングタンパク質（HKP）によるデータ補正 総タンパク質によるデータ補正
HKPと総タンパク質（Stain-Free）の定量比較
Stain-Freeテクノロジーのタンパク質検出原理
総タンパク質検出法（メンブレン）の比較
HeLa lysate load, µg
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β-actinStain-Free
GAPDH
β-tubulin
Quantitative response
HKPと総タンパク質の数値比較例（10 μg/ウェルの強度を1とした場合の各濃度における強度の比率）
β-actin
β-tubulin
GAPDH
50 40 30 20 10
左のウェスタンブロッティングの結果をもとに、実際にHKP（β-actin）、および総タンパク質（Stain-Free）を用いターゲットタンパク質（MEK, Akt, Erk）のデータ補正を行った一例です。データ補正を行った結果、10 μg/ウェルを1とした場合、HKPでは40 μg/ウェルにおいて期待値（---Expected Value）の2倍ほど高い値が示されました。それに対し、総タンパク質では期待値に近い値で算出され、より適切に補正されていることが示されました。
総タンパク質（Stain-Free）
50 40 30 20 1050 40 30 20 10
β-actin
MEK
Akt
Erk
50 40 30 20 10
10 40 40HeLa lysate load, µg
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its) 総タンパク質
（Stain-Free）
Expected Value
HKP（β-actin）■■■
MEKAktErk
MEK、Akt、ErkをHKPおよび総タンパク質によりデータ補正した結果（10 μg/ウェルの補正値を1とした場合の40 μg/ウェルにおける補正値の比較）
検出画像（上）MEK,Akt,Erk,HKP（β-actin）（左）総タンパク質（Stain-Free）
HKPと総タンパク質（Stain-Free）のデータ補正の比較
UVUV UVUV
NHNH
OH
トリハロ化合物
トリハロ化合物
タンパク質のトリプトファンとゲル中のトリハロ化合物が結合する
修飾されたトリプトファンがUV照射により蛍光を発する
UV照射※ UV照射※ゲル中に含まれるトリハロ化合物
トリハロ化合物
トリハロ化合物
ゲル中のタンパク質のトリプトファン残基
NH2
COOH
Trp NHNH
OH
※ 最 適 な U V 照 射条件は使用機器に よって 変 わります。
※バイオ・ラッドの撮影装置はUV照射条件が各装置毎に最適条件でデ フォルトセッティング さ れています。
蛍光
NHNH
OH
トリハロ化合物
トリハロ化合物
メンブレン上の総タンパク質を検出する代表的な方法として、CBBやPonceau Sなどの可視染色する方法や、SYPRO Ruby等の蛍光染色する方法があります。Stain-Freeは、低コストでありながら操作性も良く、CBB以上の検出感度を持つため、総タンパク質によるデータ補正に最適なツールとして利用することが可能です。
Ponceau SとStain-Freeの検出画像の違い
Ponceau Sの場合 Stain-Freeの場合（転写後のメンブレン上の検出画像）
メンブレン上の総タンパク質検出法の特長
検出タイプ 感度
抗原抗体反応への
リスク
CBB/Amid Black
染色剤
Ponceau S
SYPRO Ruby
Stain-Free
可視
可視
蛍光
蛍光
○
×
◎
○
脱色
不可
可
可
不要
操作性
○
○
×
○
コスト
低
低
高
低
高
低
低
低
1. 一般的に用いられるHKPは、ターゲットタンパク質と比べ過剰発現していることがほとんどで、正確な量を反映した検出が困難なことが多い
2. 様々な刺激や状態の変化によってHKPの発現量が変化するHKPの発現量が変化する要因●細胞、組織等の齢や種の違いによる発現量の変化●転写後調整による変化●細胞周期のステージの違い●成長変化●実験条件の違いなど※HKPの発現量の変化については様々な論文で報告されています（Bulletin6350
参照）。
3. ストリッピング/リプロービング等の操作によるエラーや操作の煩雑性がある一般的なHKPの検出は、目的タンパク質を検出した後、ストリッピングやリプロービング操作によりメンブレンを初期状態に戻してから、再度検出を行います。そのため、ストリッピングやリプロービング操作によるエラー、時間的な問題、検出コストがかかるといった問題点があります。
1. サンプル 種やサンプルの状 態を問わず一定量のサンプル量があれば実施することができる
2. 電気泳動した全てのタンパク質の総和を用い定量化するため、安定性が高い
3. ランニングコスト、操作時間を軽減することができる
●HKP検出用の抗体、および化学発光分のコストが不要となるため大幅なコストダウンが可能です。
●HKPを検出するための抗原抗体反応時間や、ストリッピングやリプロービング等の時間を節約できます。
4. HKPに代替する方法として推奨されるようになり始めています
●幾つかのジャーナルではHKPの発現の安定性が議論され、総タンパク質を用いた方法が推奨されるようになっています。
JBC(Journal of Biological Chemistry）のガイドライン一例
http://jbcmission.asbmb.org/collecting-and-presenting-data
JBC editors recommend TPN for normalizing western blots.
It is typically better to normalize western blots using total protein loading as the denominator.
Fosang AJ and Colbran RJ(2015).Transparencyis the key to quality. J Biol Chem 290, 29,692-29,694.
We prefer that signal intensities are normalized to total protein by staining membranes with Coomassie Blue,Ponceau S, or other protein stains, and we strongly caution against the use of housekeeping proteins for normalization, unless there is clear demonstration that expressoin of thehousekeeping protein is unaffected by experimentaltreatments.
4 V3 ウェスタンブロッティングワークフロー
Stain-Freeを用いた総タンパク質補正は、ターゲット分子を化学発光および蛍光いずれの方法で検出した場合にも用いることができます。
化学発光と蛍光検出に対応
⑤抗原抗体反応
メンブレン上に転写されたタンパク質の確認、およびゲルに残存しているタンパク質の確認を行います。
目的タンパク質を検出し、バンドの強度を数値化します。また、④で得たメンブレン上の総タンパク質画像から総タンパク質量を算出し、目的タンパク質のデータ補正を行います。ImageLabソフトウェアではバンドの検出からデータ補正までの一連の流れを自動化し、データ補正を簡便に行うことが可能です。
④転写状態の確認
電気泳動後のStain-Freeゲル
UV光による検出
転写されたメンブレン メンブレンに転写されたタンパク質の可視化
UV照射によりゲル中のトリハロ化合物をタンパク質に結合させ、タンパク質の可視化を行います。
サンプルのアプライ量一般的なLysateを用いる場合、10-50 μg/ウェルの範囲を目安としてください。
分子量スタンダード有色スタンダードを使用する場合プレシジョンPlusスタンダード（未着色）とプレシジョンPlusブルースタンダードを1:1で混合し、10 μl/ウェルで使用してください。※プレシジョンPlusブルースタンダードは青い着色済みのバンドはStain-Freeで検出されない
ため、未着色のプレシジョンPlusスタンダードと混合し、使用します。※プレシジョンPlusデュアルスタンダードは、赤い着色済みバンドが強い蛍光を示すため、使用
には適しません。
ゲル通常のポリアクリルアミドゲルからStain-Freeゲルへ変更します。プレキャストを使用する場合TGX Stain-Freeゲル自作ゲルを使用する場合TGX Stain-Free FastCastアクリルアミド溶液キット
メンブレン自家蛍光の低い、メンブレンを強く推奨しております。PVDFの場合低蛍光PVDFメンブレンニトロセルロースの場合 変更の必要はありません
検出装置以下のバイオ・ラッドのCCDカメラタイプの撮影装置（P4 Stain-Free検出に最適化された撮影解析システム参照）を用い検出することを推奨いたします。これらの装置にはStain-Freeを用いた総タンパク質補正を行うために最適化された撮影条件が予め設定されています。他社製品を使用する場合には、UV光源の波長、光の強さ、露光時間等の違いにより、最適な検出ができない場合があります。
タンパク質とトリハロ化合物の結合UV照射時間：45秒～※推奨照射時間は使用する撮影装置に
よって異なります
②ゲル中の総タンパク質の可視化、電気泳動状態の確認
電気泳動後のStain-Freeゲル
総タンパク質の可視化
コストダウンを実現Stain-Freeを用いた総タンパク質補正は、HKPの検出コストが不要なため、大幅なコストダウンを実現します。
HKP検出用のコストを削減することで、最大¥5,000以上/メンブレンの検出コストを削減することができます。
Stain-Free検出に最適化された撮影解析システムバ イ オ・ラッド の C C D カ メラ を 用 い た 撮 影 装 置 は 、Stain-Freeによる総タンパク質補正を行う際の検出条件が機種ごとに最適化され、条件がプリセットされています。全ての撮影装置にはImageLabソフトウェアが標準で添付されており、濃度定量や分子量算出をはじめ、総タンパク質やHKPを用いたデータ補正解析を行うことが可能です。また、本ソフトウェアはライセンスキーを必要とせずWindows/Mac OSに対応しており、どなたでも場所を選ばず解析を行うことが可能です。※他社の撮影装置を用いたStain-Free検出は、条件が最適化されていないため、場合
によって十分な検出感度が得られないことがございますのでご注意ください。
蛍光検出とStain-Free検出を行い、重ね合わせた画像蛍光検出（ターゲット） 赤、緑Stain-Free検出（総タンパク質） 青
化学発光検出とStain-Free検出を行い、重ね合わせた画像化学発光検出（ターゲット） 赤Stain-Free検出（総タンパク質） 青
Stain-Free
化学発光
蛍光
ImageLab
〇
〇
〇
〇
〇
〇
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〇
〇
〇
〇
〇
〇
〇
メン
ブレ
ン1
枚の
検出
に必
要な
コス
ト（概
算）/
¥ 発光試薬（HKP用）
1次&2次抗体（HKP用）
発光試薬（ターゲット用）
1次&2次抗体（ターゲット用）
メンブレンゲル
1,700
5,200
2,100
1,700
5,200
2,100
1,700
5,100
2,000
1,400
5,100
2,000
2,500
2,000
2,0001,400
5,100
2,000
2,500
2,000
0
5,000
10,000
15,000
化学発光 蛍光化学発光化学発光蛍光化学発光
HKP補正 総タンパク質補正 HKP補正 総タンパク質補正
自作ゲルの場合 プレキャストゲルの場合
¥13,100
¥9,200¥7,300
¥15,000
¥10,900¥9,000
100 4004001,700
5,100
2,000 一般的なLysateサンプルを用いた際のサンプル量目安～ 50 μg/ウェル
総タンパク質の可視化が可能なStain-Freeゲルを用いた電気泳動を行います。
①電気泳動
トリハロ化合物の結合したタンパク質をメンブレンへ転写します。
③転写
UV照射されたゲル 転写されたメンブレン
転写されなかったタンパク質を確認できます。
UV光による検出
ImageLabソフトウェアにより総タンパク質およびターゲットタンパク質の検出、ノーマライズを実施
化学発光用基質と反応（蛍光検出の場合：不要）
化学発光検出もしくは、蛍光検出
抗原抗体反応後のメンブレン
蛍光検出をした場合
・ImageLabソフトウェア
⑥化学発光/蛍光検出および総タンパク質検出
■ Stain-Free TGXテクノロジーを用いた定量ウェスタンV3ワークフローStain-Freeテクノロジーを用いた総タンパク質補正のポイント
Q. 総タンパク質の解析はどのように行えばよいですか？A. はじめにメンブレン上の各レーンにおける総タンパク質を全て囲い、バックグ
ラウンドを差し引いた値を総タンパク質量として算出します。その値を用い、ターゲットタンパク質の値をレーン間の総タンパク質のバンド強度比で割り算して算出します。バイオ・ラッドの解析ソフトウェアImageLabソフトウェアには、総タンパク質やHKPを用いたデータ補正を自動計算する機能が搭載されています。総タンパク質を検出するパラメータも至適化されているため、どなたでも簡単に正確な解析が得られます。
Q. 論文等での使用実績はどの程度ありますか？A. HKPの発現量の安定性についての報告がされるようになり、その代替法として
総タンパク質を用いた補正方法が着目されるようになりました。このような動きと、Stain-Freeによる操作の簡便性もあり、ここ数年で600報を超える論文での使用実績があります。代表的な論文リストは、Bulletin6351を参照してください。また、HKPの安定性に関する論文リストは、Bulletin6350を参照してください。
Q. Stain-Freeを用いた総タンパク質補正を行う場合、特別に必要なものは何ですか？
A. 右ページの「Stain-Freeテクノロジーを用いた総タンパク質補正のポイント」をご確認ください。
Q. Stain-Freeを用いた総タンパク質補正を行う場合、一般的なウェスタンブロッティングの操作から変更する手順はありますか？
A. 基本的な操作の変更はございませんが、必ず電気泳動後のStain-FreeゲルにUVを照射し、タンパク質にトリハロ化合物を結合させる操作を行う必要があります（右フロー②参照）
Q. Stain-Freeを用いたV3ワークフローは総タンパク質補正以外のメリットはありますか？
A. 電気泳動後の状態を確認したり、転写後のゲルやメンブレンを撮影することで転写効率を確認することが可能です。これにより事前のトラブル回避につながり安定的なウェスタンブロッティングが可能になります。
Q. トリハロ化合物の影響により抗体との反応性の低下は起きませんか？A. 抗体が認識するタンパク質のエピトープ周辺にトリプトファンが存在する場合
には、影響が出る可能性がございます。この影響を最小限に抑えるため、機種ごとに最適な検出条件を用いて撮影することを推奨いたします。
Q. UV照射に使用する装置は他社製品で代用することはできますか？A. UV光源に使用されている波長や光量はそれぞれの装置によって異なるため、
場合によってうまく検出されない場合があります。弊社ではStain-Freeの検出に最適化されているバイオ・ラッド社製撮影装置を推奨しております。
よくあるご質問
Publ
icat
ion
Num
ber
600
500
400
300
200
100
02012 2013
Publication Year2014 2015 2016 2017
6 23 37
116
198
491
各撮影装置の対応アプリケーション
GelDoc EZ GelDoc XR Plus
ChemiDoc XRS Plus
ChemiDoc Touch
ChemiDoc Touch MP
Stain-Freeゲル
V3 ウェスタンブロッティングワークフロー 5
Stain-Freeを用いた総タンパク質補正は、ターゲット分子を化学発光および蛍光いずれの方法で検出した場合にも用いることができます。
化学発光と蛍光検出に対応
⑤抗原抗体反応
メンブレン上に転写されたタンパク質の確認、およびゲルに残存しているタンパク質の確認を行います。
目的タンパク質を検出し、バンドの強度を数値化します。また、④で得たメンブレン上の総タンパク質画像から総タンパク質量を算出し、目的タンパク質のデータ補正を行います。ImageLabソフトウェアではバンドの検出からデータ補正までの一連の流れを自動化し、データ補正を簡便に行うことが可能です。
④転写状態の確認
電気泳動後のStain-Freeゲル
UV光による検出
転写されたメンブレン メンブレンに転写されたタンパク質の可視化
UV照射によりゲル中のトリハロ化合物をタンパク質に結合させ、タンパク質の可視化を行います。
サンプルのアプライ量一般的なLysateを用いる場合、10-50 μg/ウェルの範囲を目安としてください。
分子量スタンダード有色スタンダードを使用する場合プレシジョンPlusスタンダード（未着色）とプレシジョンPlusブルースタンダードを1:1で混合し、10 μl/ウェルで使用してください。※プレシジョンPlusブルースタンダードは青い着色済みのバンドはStain-Freeで検出されない
ため、未着色のプレシジョンPlusスタンダードと混合し、使用します。※プレシジョンPlusデュアルスタンダードは、赤い着色済みバンドが強い蛍光を示すため、使用
には適しません。
ゲル通常のポリアクリルアミドゲルからStain-Freeゲルへ変更します。プレキャストを使用する場合TGX Stain-Freeゲル自作ゲルを使用する場合TGX Stain-Free FastCastアクリルアミド溶液キット
メンブレン自家蛍光の低い、メンブレンを強く推奨しております。PVDFの場合低蛍光PVDFメンブレンニトロセルロースの場合 変更の必要はありません
検出装置以下のバイオ・ラッドのCCDカメラタイプの撮影装置（P4 Stain-Free検出に最適化された撮影解析システム参照）を用い検出することを推奨いたします。これらの装置にはStain-Freeを用いた総タンパク質補正を行うために最適化された撮影条件が予め設定されています。他社製品を使用する場合には、UV光源の波長、光の強さ、露光時間等の違いにより、最適な検出ができない場合があります。
タンパク質とトリハロ化合物の結合UV照射時間：45秒～※推奨照射時間は使用する撮影装置に
よって異なります
②ゲル中の総タンパク質の可視化、電気泳動状態の確認
電気泳動後のStain-Freeゲル
総タンパク質の可視化
コストダウンを実現Stain-Freeを用いた総タンパク質補正は、HKPの検出コストが不要なため、大幅なコストダウンを実現します。
HKP検出用のコストを削減することで、最大¥5,000以上/メンブレンの検出コストを削減することができます。
Stain-Free検出に最適化された撮影解析システムバ イ オ・ラッド の C C D カ メラ を 用 い た 撮 影 装 置 は 、Stain-Freeによる総タンパク質補正を行う際の検出条件が機種ごとに最適化され、条件がプリセットされています。全ての撮影装置にはImageLabソフトウェアが標準で添付されており、濃度定量や分子量算出をはじめ、総タンパク質やHKPを用いたデータ補正解析を行うことが可能です。また、本ソフトウェアはライセンスキーを必要とせずWindows/Mac OSに対応しており、どなたでも場所を選ばず解析を行うことが可能です。※他社の撮影装置を用いたStain-Free検出は、条件が最適化されていないため、場合
によって十分な検出感度が得られないことがございますのでご注意ください。
蛍光検出とStain-Free検出を行い、重ね合わせた画像蛍光検出（ターゲット） 赤、緑Stain-Free検出（総タンパク質） 青
化学発光検出とStain-Free検出を行い、重ね合わせた画像化学発光検出（ターゲット） 赤Stain-Free検出（総タンパク質） 青
Stain-Free
化学発光
蛍光
ImageLab
〇
〇
〇
〇
〇
〇
〇
〇
〇
〇
〇
〇
〇
〇
メン
ブレ
ン1
枚の
検出
に必
要な
コス
ト（概
算）/
¥ 発光試薬（HKP用）
1次&2次抗体（HKP用）
発光試薬（ターゲット用）
1次&2次抗体（ターゲット用）
メンブレンゲル
1,700
5,200
2,100
1,700
5,200
2,100
1,700
5,100
2,000
1,400
5,100
2,000
2,500
2,000
2,0001,400
5,100
2,000
2,500
2,000
0
5,000
10,000
15,000
化学発光 蛍光化学発光化学発光蛍光化学発光
HKP補正 総タンパク質補正 HKP補正 総タンパク質補正
自作ゲルの場合 プレキャストゲルの場合
¥13,100
¥9,200¥7,300
¥15,000
¥10,900¥9,000
100 4004001,700
5,100
2,000 一般的なLysateサンプルを用いた際のサンプル量目安～ 50 μg/ウェル
総タンパク質の可視化が可能なStain-Freeゲルを用いた電気泳動を行います。
①電気泳動
トリハロ化合物の結合したタンパク質をメンブレンへ転写します。
③転写
UV照射されたゲル 転写されたメンブレン
転写されなかったタンパク質を確認できます。
UV光による検出
ImageLabソフトウェアにより総タンパク質およびターゲットタンパク質の検出、ノーマライズを実施
化学発光用基質と反応（蛍光検出の場合：不要）
化学発光検出もしくは、蛍光検出
抗原抗体反応後のメンブレン
蛍光検出をした場合
・ImageLabソフトウェア
⑥化学発光/蛍光検出および総タンパク質検出
■ Stain-Free TGXテクノロジーを用いた定量ウェスタンV3ワークフローStain-Freeテクノロジーを用いた総タンパク質補正のポイント
Q. 総タンパク質の解析はどのように行えばよいですか？A. はじめにメンブレン上の各レーンにおける総タンパク質を全て囲い、バックグ
ラウンドを差し引いた値を総タンパク質量として算出します。その値を用い、ターゲットタンパク質の値をレーン間の総タンパク質のバンド強度比で割り算して算出します。バイオ・ラッドの解析ソフトウェアImageLabソフトウェアには、総タンパク質やHKPを用いたデータ補正を自動計算する機能が搭載されています。総タンパク質を検出するパラメータも至適化されているため、どなたでも簡単に正確な解析が得られます。
Q. 論文等での使用実績はどの程度ありますか？A. HKPの発現量の安定性についての報告がされるようになり、その代替法として
総タンパク質を用いた補正方法が着目されるようになりました。このような動きと、Stain-Freeによる操作の簡便性もあり、ここ数年で600報を超える論文での使用実績があります。代表的な論文リストは、Bulletin6351を参照してください。また、HKPの安定性に関する論文リストは、Bulletin6350を参照してください。
Q. Stain-Freeを用いた総タンパク質補正を行う場合、特別に必要なものは何ですか？
A. 右ページの「Stain-Freeテクノロジーを用いた総タンパク質補正のポイント」をご確認ください。
Q. Stain-Freeを用いた総タンパク質補正を行う場合、一般的なウェスタンブロッティングの操作から変更する手順はありますか？
A. 基本的な操作の変更はございませんが、必ず電気泳動後のStain-FreeゲルにUVを照射し、タンパク質にトリハロ化合物を結合させる操作を行う必要があります（右フロー②参照）
Q. Stain-Freeを用いたV3ワークフローは総タンパク質補正以外のメリットはありますか？
A. 電気泳動後の状態を確認したり、転写後のゲルやメンブレンを撮影することで転写効率を確認することが可能です。これにより事前のトラブル回避につながり安定的なウェスタンブロッティングが可能になります。
Q. トリハロ化合物の影響により抗体との反応性の低下は起きませんか？A. 抗体が認識するタンパク質のエピトープ周辺にトリプトファンが存在する場合
には、影響が出る可能性がございます。この影響を最小限に抑えるため、機種ごとに最適な検出条件を用いて撮影することを推奨いたします。
Q. UV照射に使用する装置は他社製品で代用することはできますか？A. UV光源に使用されている波長や光量はそれぞれの装置によって異なるため、
場合によってうまく検出されない場合があります。弊社ではStain-Freeの検出に最適化されているバイオ・ラッド社製撮影装置を推奨しております。
よくあるご質問
Publ
icat
ion
Num
ber
600
500
400
300
200
100
02012 2013
Publication Year2014 2015 2016 2017
6 23 37
116
198
491
各撮影装置の対応アプリケーション
GelDoc EZ GelDoc XR Plus
ChemiDoc XRS Plus
ChemiDoc Touch
ChemiDoc Touch MP
Stain-Freeゲル
6 V3 ウェスタンブロッティングワークフロー
Ordering Information
プレキャストゲルTGXシリーズは、高効率で転写を可能にするウェスタンブロッティングに最適なプレキャストゲルです。また、Stain-Free ゲルは、ウェスタンブロッティングの総タンパク質を用いたデータ補正に最適です。ミニプロティアンTGX Stain-Freeゲル ウェル容量：10well （30 μl）、10well Deep （50 μl）、12well （20 μl）、15well （15 μl）価格 10枚パック¥20,600ゲル濃度 10well 10枚 10well Deep 10枚 12well 10枚 15well 10枚 保存7.5% 4568023 4568024 4568025 4568026 4℃10% 4568033 4568034 4568035 4568036 4℃12% 4568043 4568044 4568045 4568046 4℃4-15% 4568083 4568084 4568085 4568086 4℃4-20% 4568093 4568094 4568095 4568096 4℃8-16% 4568103 4568104 4568105 4568106 4℃Any kD 4568123 4568124 4568125 4568126 4℃※ミニプロティアンゲルをカセットから取り出す際には、別売のTGXオープニングレバー4560000（¥500）が必要となります。
Criterion TGX Stain-Freeゲル ウェル容量：12+2well （45 μl）、18well （30 μl）、26well （15 μl）価格 4枚パック¥12,000、10枚パック¥28,500ゲル濃度 12+2well 10枚＊ 18well 10枚＊ 26well 10枚＊ 保存7.5% 5678023J10 5678024J10 5678025J10 4℃10% 5678033J10 5678034J10 5678035J10 4℃12% 5678043J10 5678044J10 5678045J10 4℃4-15% 5678083J10 5678084J10 5678085J10 4℃4-20% 5678093J10 5678094J10 5678095J10 4℃8-16% 5678103J10 5678104J10 5678105J10 4℃Any kD 5678123J10 5678124J10 5678125J10 4℃＊4枚パックはカタログ番号の末尾をJ04に変更してください。
自作用ゲル作成試薬TGX Stain-Free FastCastアクリルアミド溶液キットは、TGXプレキャストゲルと同性能のゲルを自作することができる自作用キットです。FastCastアクリルアミド溶液キットカタログ番号 品名 （各ミニゲル約60枚） 価格1610181 TGX Stain-Free FastCast アクリルアミド溶液キット 7.5% ¥23,0001610183 TGX Stain-Free FastCast アクリルアミド溶液キット 10% ¥23,0001610185 TGX Stain-Free FastCast アクリルアミド溶液キット 12% ¥23,000
泳動槽関連ミニプロティアンTetraセルカタログ番号 品名 価格1658005JA ミニプロティアン Tetra レディーゲルセル 2 枚用
構成内容：下部バッファー槽、ケーブル付フタ、電極アッセンブリ、バッファーダム¥42,000
1658004JA ミニプロティアン Tetra レディーゲルセル 4 枚用構成内容：下部バッファー槽、ケーブル付フタ、電極アッセンブリ、コンパニオンランニングモジュール、バッファーダム
¥67,000
※ミニプロティアンTetraセル 2枚用は、コンパニオンランニングモジュールを追加することで、4枚用にすることが可能です。
Criterionセルカタログ番号 品名 価格1656001 Criterionセル 構成内容：下部バッファー槽、パワーケーブル付フタ、サンプルローディングガイド ¥60,000
転写装置トランスブロットTurbo は、電源装置内蔵の高効率かつ高速に転写を行えるブロッティングシステムです。
トランスブロットTurboシステム転写パック付 トランスブロットTurboシステムRTA転写キット付カタログ番号 品名（構成：本体、いずれかの転写パック） 価格 カタログ番号 品名（構成：本体、いずれかのRTA転写キット） 価格1704150J2 トランスブロットTurbo with NC（ミニ） ¥280,000 1704270J1 トランスブロットTurbo w/RTA NC（ミニ） ¥306,0001704150J8 トランスブロットTurbo with NC（ミディ） ¥285,000 1704274J1 トランスブロットTurbo w/RTA 低蛍光PVDF（ミニ） ¥313,000
1704271J1 トランスブロットTurbo w/RTA NC（ミディ） ¥324,0001704275J1 トランスブロットTurbo w/RTA 低蛍光PVDF（ミディ） ¥335,000
トランスブロットTurbo専用消耗品トランスブロットTurbo転写パック トランスブロットTurbo RTA転写キットメンブレンやろ紙が予め特殊な転写溶液で平衡化されたパックです。電気泳動後すぐにトランスブロットTurboに設置し、高効率かつ高速での転写を可能にします。
転写パックで使用されているメンブレン・ろ紙・転写バッファーがキット化されており、ランニングコストを抑えたいお客様に最適です。
カタログ番号 品名（10パック） 価格 カタログ番号 品名（構成：メンブレン（40枚）、ろ紙（80セット）、5X転写バッファー） 価格1704158 トランスブロットTurbo転写パック、 NC（ミニ）、7x8.4 cm ¥16,800 1704270 トランスブロットTurbo用RTA転写キットNC（ミニ） ¥46,0001704159 トランスブロットTurbo転写パック、 NC（ミディ）、8.5x13.5 cm ¥23,600 1704274 トランスブロットTurbo用RTA転写キット低蛍光PVDF（ミニ） ¥54,000
1704271 トランスブロットTurbo用RTA転写キットNC（ミディ） ¥66,0001704275 トランスブロットTurbo用RTA転写キット低蛍光PVDF（ミディ） ¥78,000
蛍光検出用メンブレン蛍光/ケミルミウェスタン対応 低蛍光PVDFメンブレン 蛍光/ケミルミウェスタン対応 ニトロセルロースメンブレンカタログ番号 品名 価格 保存 カタログ番号 品名 価格 保存1620260 低蛍光PVDFメンブレン/フィルターペーパーセット 7×8.5 cm, 10セット ¥17,500 室温 1620146 ニトロセルロースメンブレン（0.2 μm） 7×8.5cm, 10セット ¥8,000 室温1620261 低蛍光PVDFメンブレン/フィルターペーパーセット 7×8.5 cm, 20セット ¥32,500 室温 1620168 ニトロセルロースメンブレン（0.2 μm） 8.5×13.5 cm, 10セット ¥14,500 室温1620262 低蛍光PVDFメンブレン/フィルターペーパーセット 8.5×13.5 cm, 10セット ¥26,500 室温 1620112 ニトロセルロースメンブレン（0.2 μm） 30×350 cm, 1ロール ¥55,000 室温1620263 低蛍光PVDFメンブレン/フィルターペーパーセット 8.5×13.5 cm, 20セット ¥47,500 室温1620264 低蛍光PVDFメンブレン 28×380 cm, 1ロール ¥171,000 室温
V3 ウェスタンブロッティングワークフロー 7
高感度ケミルミ検出用試薬Clarity Western ECL Substrateシリーズカタログ番号 品名 価格 保存1705060 Clarity Western ECL Substrate （200 ml, 約33回分＊） ¥20,000 室温1705061 Clarity Western ECL Substrate （500 ml, 約84回分＊） ¥40,000 室温1705062 Clarity Max Western ECL Substrate （100 ml, 約16回分＊） ¥38,000 室温1705062J1 Clarity Max（100 ml） & Clarity（200 ml）セット ¥52,500 室温＊ミニゲル（60 cm2相当）換算
蛍光標識2次抗体超高感度な蛍光検出を可能にするStarBright Blue シリーズ、低バックグラウンド検出を可能にするDyLight800 シリーズがラインアップされています。
StarBright Blue 520/700標識2次抗体 DyLight 800標識2次抗体カタログ番号 品名 価格 保存 カタログ番号 品名 価格 保存12005866 ヤギ抗マウスIgG StarBright Blue 520（400 μl） ¥20,000 4℃ STAR36D800GA Sheep anti Rabbit IgG：Dylight 800 0.1 mg ¥21,600 4℃12005867 ヤギ抗マウスIgG StarBright Blue 520（80 μl） ¥10,000 4℃ STAR117D800GA Goat anti Mouse IgG （H/L）：
DyLight 800 （Multi Species Adsorbed） 0.1 mg¥21,300 4℃
12005869 ヤギ抗ウサギIgG StarBright Blue 520（400 μl） ¥20,000 4℃12005870 ヤギ抗ウサギIgG StarBright Blue 520（80 μl） ¥10,000 4℃ STAR71D800GA Goat anti Rat IgG：
Dylight 800 （Mouse Adsorbed） 0.1 mg¥21,900 4℃
12004158 ヤギ抗マウスIgG StarBright Blue 700（400 μl） ¥20,000 4℃12004159 ヤギ抗マウスIgG StarBright Blue 700（80 μl） ¥10,000 4℃12004161 ヤギ抗ウサギIgG StarBright Blue 700（400 μl） ¥20,000 4℃12004162 ヤギ抗ウサギIgG StarBright Blue 700（80 μl） ¥10,000 4℃
Rhodamine標識ハウスキーピング用抗体Rhodamine標識ハウスキーピング用抗体 (交差性： ヒト、マウス、ラット）カタログ番号 品名 価格 保存 カタログ番号 品名 価格 保存12004163 抗アクチン hFAB Rhodamine 200 μl ¥36,000 -20℃ 12004166 抗チューブリン hFAB Rhodamine 40 μl ¥18,000 -20℃12004164 抗アクチン hFAB Rhodamine 40 μl ¥18,000 -20℃ 12004167 抗GAPDH hFAB Rhodamine 200 μl ¥36,000 -20℃12004165 抗チューブリン hFAB Rhodamine 200 μl ¥36,000 -20℃ 12004168 抗GAPDH hFAB Rhodamine 40 μl ¥18,000 -20℃
検出装置高感度、かつ高解像度な検出を可能にする撮影装置です。ChemiDoc Touch MP はバイオ・ラッドの StarBrightシリーズや DyLight800 などの蛍光検出試薬や Stain-Free の検出に最適化され、幅広い蛍光検出を可能にします。
カタログ番号 品名 価格17001402JA17001401JA
ChemiDoc Touch MPイメージングシステム （ケミルミ・蛍光対応）ChemiDoc Touch イメージングシステム （ケミルミ）
¥7,900,000¥4,900,000
1708265J1PC ChemiDoc XRS Plus Image Labシステム ¥2,500,000システムの詳細や仕様、その他システムについては、装置カタログをご参照ください。
PrecisionAbTM 抗体■抗体性能は最大12細胞株により検証済
■検証用に使用したプロトコール付で安心
■トライアルサイズ（20 μl）はポジティブコントロール付
Ordering Informationカタログ番号 品名 価格 保存V******* PrecisionAb抗体 100 μl （10回分） ¥50,000 4℃V*******KT PrecisionAb抗体 20 μl （2回分）＋コントロールライセート ¥24,000 -20℃
お薦めの関連製品 ウェスタンブロット検証済み抗体
検証例：プロット全体のデータを開示しているため、特異性や内在性タンパク質への反応性を確認できます。
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Bio-RadPrecisionAb Vendor S Vendor C
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Bio-Rad PrecisionAb
Vendor SVendor C
B
比較データ：Jurkatセルライセート中のBCL-2タンパク質検出を各社抗体を用いて行った。A： ウェスタン検出シグナル（左）とStain-Freeイメージ（右、分子量スタンダードと総タンパク質）。B： ウェスタン検出シグナル定量結果（総タンパク量で補正済）。同等または高い希釈率で他社製抗体よりも強いシグナルが得られている。
製品リストはbio-rad-antibody.jp からご確認ください
対象ラインアップ随時拡大中!!!
関連アプリケーション : バイオ・ラッドの新しい蛍光ウェスタンブロッティングウェスタンブロッティングにおいて化学発光法を用いた検出は最も一般的な方法です。しかしながら、化学発光法では1回の反応で1種類のターゲットタンパク質しか検出することができず、必ずしも最適な方法とは言えません。この問題を解決する方法として、蛍光を用いることが可能です。蛍光法では、ターゲットタンパク質ごとに2次抗体にラベルされる蛍光物質を変えることで、複数のターゲットタンパク質を一度に検出ができるようになります。バイオ・ラッドの蛍光ウェスタンブロッティングでは、独自の超高感度蛍光色素と高感度検出を可能にする撮影装置を組み合わせることで、一般的な蛍光ウェスタンブロッティングと比べ、より高感度な検出を実現します。
蛍光ウェスタンブロッティングは、こんなお客様に最適です●同一サンプルから複数のターゲットタンパク質を検出している●リン酸化タンパク質の検出を行っている ●定量解析を行っている ●ランニングコストを抑えたい
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化学発光検出試薬●SureBeadsシリーズ
磁気ビーズを採用した、迅速、かつ効率的に免疫沈降を行うためのビーズおよび専用ラック
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免疫沈降関連製品●Clarity Western ECL Substrate●Clarity Max Western ECL Substrate
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バイオ・ラッドではウェスタンブロッティング関連製品のお試し用サンプル品をご提供しております。ご希望のお客様は、下記のアドレスよりお申込みいただきますようお願いいたします。なお、サンプル品の内容は予告なしに変更されることがございます。予めご了承いただきますようお願いいたします。
蛍光検出（3-Plex）検出例
タンパク質 : ATG7蛍光色素 : StarBright Blue700
タンパク質 : AKR1C2蛍光色素 : DyLight800
タンパク質 : 総タンパク質蛍光色素 : Stain-Free
3-Plex重ね合わせ画像
https://info.bio-rad.com/wb-sample-request.htmlU R L
お試し用サンプル受付中 !!!
バイオ・ラッド ラボラトリーズ 株式会社 取扱店
ライフサイエンス www.bio-rad.com本 社 〒140-0002 東京都品川区東品川 2-2-24 TEL：03-6361-7000大阪営業所 〒532-0025 大阪市淀川区新北野 1-14-11 TEL：06-6308-6568福岡営業所 〒812-0013 福岡市博多区博多駅東 2-5-28 TEL：092-475-4856 ※学術的お問い合わせは TEL：03-6404-0331
※価格（税抜き）、仕様は2018年4月現在のもので、予告なく変更することがあります。※本カタログに記載されている会社名、商品名は各社の商標または登録商標です。
C11579L 1803a
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