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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE LOS MOCHIS PROCESOS INDUSTRIALES DE FERMENTACIÓN MANUAL DE PRÁCTICAS INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS 2011

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INSTITUTO TECNOLGICO DE LOS MOCHIS

PROCESOS INDUSTRIALES DE FERMENTACIN

MANUAL DE PRCTICAS

INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS 2011

Departamento de Ing. Qumica y Bioqumica

Ing. en Industrias Alimentarias

Manual de Prcticas de PROCESOS INDUSTRIALES DE FERMENTACIN

Elaborado por:

Esa Bojrquez Velzquez Estudiante de Ingeniera Bioqumica

M.C. Rafael Jimnez Martnez Asesor

ndice PREFACIO ....................................................................................................................... 1 1. DATOS HISTRICOS ............................................................................................... 3 2. PROCESOS INDUSTRIALES DE FERMENTACIN ................................................ 5 3. NATURALEZA DE LOS MICROORGANIMOS EMPLEADOS EN PROCESOS INDUSTRIALES .................................................................................. 12 4. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Y OBTENCIN DE CULTIVIOS AXNICOS ..................................................................................................................... 14 4.1. Desarrollo de mtodos de cultivo puro ................................................................. 14 4.1.1. Primeros cultivos puros .................................................................................. 14 4.1.2. Tcnicas de cultivo puro ................................................................................ 16 4.1.3. Consideraciones en el Aislamiento de Microorganismos ............................... 19 4.1.4 Cultivos Bimembres ........................................................................................ 20 5. IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS ........................................................... 22 5.1. Morfologa ............................................................................................................ 22 5.2. Bioqumica y Fisiologa ........................................................................................ 23 6. CRECIMIENTO MICROBIANO .................................................................................. 25 6.1. Naturaleza y Expresin Matemtica del Crecimiento ........................................... 25 6.2. Cintica de crecimiento microbiano ..................................................................... 27 6.3. Rendimiento del crecimiento microbiano ............................................................. 31 6.4. Cultivo continuo de microorganismos .................................................................. 32 6.5. Influencia de la Concentracin de Nutrientes en la Velocidad de Crecimiento .... 35 6.6. Metabolitos Primarios y Secundarios ................................................................... 37 EXPERIMENTOS ........................................................................................................... 39 I. BACTERIAS ................................................................................................................ 40 I.I Aislamiento y Obtencin de Cultivos Axnicos ....................................................... 43 I.II Cintica de Crecimiento Bacteriano ....................................................................... 46 I.III Elaboracin de Yogurt ........................................................................................... 48 I.IV Influencia de la Composicin del Medio de Cultivo en el Crecimiento Bacteriano ...................................................................................... 52 II. MOHOS ...................................................................................................................... 55 II.I Aislamiento de Hongos .......................................................................................... 58

II.II Caracterizacin Morfolgica Macro y Microscpica y Evaluacin de Parmetros Cinticos........................................................................ 58 II.III Produccin de cido Ctrico por Aspergillus niger ............................................... 64 Importancia de la Produccin de cido Ctrico ........................................................ 64 III. LEVADURAS............................................................................................................. 68 III.I Aislamiento y Caracterizacin Morfolgica de Levaduras Anaerobias Facultativas ............................................................................ 73 III.II Produccin de Etanol y Cintica de Crecimiento de Levaduras ........................... 76 ANEXOS ........................................................................................................................ 78 A.I Composicin de medios de cultivo ........................................................................ 77 A.II Tincin diferencial por el mtodo de Gram ........................................................... 79 A.III Imgenes siembra por estra en placa ................................................................. 81 A.IV Cinticas de crecimiento microbiano ................................................................... 84 A.V Mohos y levaduras ante el microscopio ............................................................... 85 A.VI Pruebas bioqumicas ........................................................................................... 87 A.VII Anlisis de azcares reductores mediante el mtodo del cido dinitrosaliclico (DNS). ......................................................................................................................... 94 RECOMENDACIONES PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO .............................. 97 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................... 97

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PREFACIO

Todo comenz con un hombre llamado Leeuwenhoek, un vendedor de telas holands quin fue el primer hombre en observar seres microscpicos a los que llam animculos, gracias a lentes de aumento que el mismo tall y microscopios que construy con sus propias manos. En la tarea de descubrir el mundo microscpico siguieron hombres como el implacable Lazzaro Spallanzani, cuyos esfuerzos se enfocaron en contrarrestar y desmentir las ideas afirmadas por la teora de la generacin espontnea. Sera imperdonable dejar de mencionar al gran Louis Pasteur, considerado el padre de la fermentacin y quien defini este proceso como el desarrollo de vida en ausencia de aire, incursion en la elaboracin de las primeras vacunas contra el carbunco y contra la rabia, y salv a la industria vincola francesa, al descubrir que eran diversos tipos de microbios los responsables de que se estropeara el vino. Quin iba a pensar que bastaba con calentar el mosto por un tiempo, para en gran medida asegurar una buena produccin?. Entre los hombres de microbios se encuentra tambin el metodolgico alemn Robert Koch quien, al aislar el microbio causante del carbunco Bacillus antraxis, determin los postulados para asegurar el carcter patgeno de un microorganismo, y en gran parte fue gracias a l, que tuvo lugar el desarrollo de mtodos prcticos y certeros para la obtencin de microorganismos en forma de cultivos puros. La existencia de los antibiticos que salvan tantas vidas, se debe a la perspicacia que tuvo Alexander Fleming, al ser capaz de detectar la presencia de una sustancia que inhiba el desarrollo de colonias bacterianas alrededor de un hogo dentro de una caja Petri, la penicilina.

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A lo largo de la historia las investigaciones desarrolladas por estos y muchos otros hombres, han permitido la aplicacin de los sistemas biolgicos a niveles industriales, generando producciones en masa de bienes y servicios muy variados. En la actualidad gracias a estos procesos es posible obtener un sinfn de productos de gran importancia, los cuales satisfacen necesidades muy diversificadas de la sociedad en general. Por ello debe hacerse nfasis en garantizar que, las nuevas y futuras generaciones dirigidas al mantenimiento y ejercicio de los bioprocesos, comprendan los principios cientficos y tecnolgicos que rigen su comportamiento. El presente trabajo incluye algunos de los aspectos relacionados con el aprendizaje de un Ingeniero en Industrias Alimentarias, considerando que parte de su perfil de egreso implica el entendimiento de los procesos fermentativos para su aplicacin a nivel industrial, o en reas de investigacin que busquen la optimizacin, nuevas especies microbianas o fuentes de materias primas ms econmicas que generen mayor rentabilidad.

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1. DATOS HISTRICOSLas aplicaciones de los microorganismos han estado presentes desde tiempos inmemorables, ya sea en el campo de la salud, permitiendo la produccin de vacunas y antibiticos o en la produccin de alimentos mediante procesos de fermentacin. El hombre hizo uso de ellos sin saber que stos existan desde que descubri la manera de hacer cerveza, vinagre, vino o pan. El queso fue elaborado en Irak a partir de leche de vaca o cabra en el 6 000 a.C., el pan se conoce desde 4 000 a.C. aproximadamente, la cerveza era conocida antes del 6 000 a.C. por sumerios y babilonios, y en el antiguo Egipto exista ya verdadera produccin en 1 700 a.C., el vinagre se produca desde antes de esa fecha y el vino es tambin muy antiguo, ya que existe evidencia de su produccin antes del 2 000 a.C. en Egipto, y en China se usaban mohos para fermentar soya alrededor del ao 500 a.C. En la primera mitad del siglo XX tiene lugar el desarrollo de procesos fermentativos a nivel industrial para la produccin de etanol, cido actico, cido lctico, cido ctrico, cido glucnico acetona, butanol y glicerol. En este periodo las fermentaciones anaerbicas se realizaban en cultivos sumergidos y las fermentaciones aerbicas en cultivos en superficie. La demanda continua exiga incrementar la productividad de fermentaciones industriales para la obtencin de levadura de panificacin y cidos orgnicos, lo que condujo al uso de tanques profundos con suministro de grandes cantidades de aire estril. El desarrollo de procesos para obtencin de penicilina durante la Segunda Guerra Mundial reafirm e impuls el avance de la fermentacin industrial. Sin embargo, el periodo de la postguerra provoc un estancamiento temporal debido al crecimiento de la industria petroqumica, y la disponibilidad de qumicos de bajo costo para la produccin de cidos orgnicos y solventes mediante sntesis qumica. Hacia el final de siglo XX, un mejor entendimiento de la biologa molecular propici el desarrollo de sistemas de fermentacin eficientes para la obtencin de productos bioqumicos. En el presente las aplicaciones industriales de fermentaciones implican, entre otros casos, el uso de pectinasas para incrementar la produccin de jugos de frutas, y amilasas para modificaciones enzimticas de almidones. Estos son ejemplos que involucran la intervencin indirecta de microorganismos en el desarrollo de alimentos y sus componentes. La produccin de goma por la bacteria fitopatgena Xanthomonas campestris, es un ejemplo de explotacin de un organismo originalmente 3

indeseable, para la produccin de un aditivo empleado como agente de viscosidad en el desarrollo de bebidas y productos alimenticios semislidos. El uso del moho Aspergillus niger para implementar la obtencin de cido ctrico con altos rendimientos fue establecido en los aos 1920s, tornndose como un ejemplo clsico de un proceso realizado inicialmente mediante cultivo en superficie que eventualmente fue convertido a un proceso sumergido aireado con la aplicacin de cepas mutantes. Actualmente, las tecnologas de fermentacin han adquirido prestigio debido al potencial biotecnolgico de los microorganismos, al evidente riesgo que representan los procesos de sntesis qumica tanto para las personas como para el medio ambiente, y al posible desarrollo de una economa sustentable por el uso de materias primas renovables. Con la aparicin de la biologa molecular, en los aos cincuenta, se descifra la estructura del material gentico, as como los mecanismos celulares que permiten traducir en protenas la informacin gentica. En los aos setenta surgen las tcnicas de la ingeniera gentica y con ello la posibilidad de aislar, editar y manipular el material gentico, logrndose incluso el trasplante de genes entre especies, crendose as los organismos transgnicos. Este conjunto de conocimientos sobre el material gentico y las protenas de la clula viva, as como de las metodologas para manipularlos, constituye una de las plataformas de despegue de la biotecnologa moderna. A partir de 1979 la Microbiologa Industrial recibe un nuevo y notable impulso cuando se concretan a nivel de procedimientos prcticos las posibilidades que ofrece la ingeniera gentica, disciplina surgida como consecuencia del avance de la Biologa Molecular. Esto posibilita la produccin industrial, basada en la utilizacin de microorganismos recombinantes, de sustancias nuevas nunca producidas antes por esa va, como la insulina, la hormona de crecimiento, el interfern y otras de muy reciente aparicin en el mercado de productos relacionados con el rea de la salud.

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2. PROCESOS INDUSTRIALES DE FERMENTACINEl trmino fermentacin (del latn fervere = hervir) inicialmente fue reservado para la actividad microbiana anaerbica donde, en el proceso de produccin de energa, el ATP solo se genera por fosforilacin a nivel de sustrato y el receptor final de electrones es un compuesto orgnico (uno de los ejemplos ms representativos de metabolismo anaerobio es la fermentacin del azcar lactosa para generar cido lctico). Debe su nombre a la accin de las levaduras sobre melazas, azcares o extractos de frutas y granos ya que hacan hervir estos medios gracias a la produccin de dixido de carbono en la fase acuosa. En la actualidad se denomina fermentacin a todo proceso en el que se vean involucrados microorganismos, sean aerobios o anaerobios, y a aquellos en los que se utilizan clulas animales y vegetales. Es por ello que los procesos de Microbiologa Industrial o las Fermentaciones Industriales o los Procesos Industriales de Fermentacin, son o pueden considerarse como sinnimos. Sin embargo el uso de este trmino se est haciendo muy general y se corre el peligro de no poder aplicarlo con precisin a un determinado tipo de proceso biolgico. Los microorganismos pueden ser considerados desde dos puntos de vista antagnicos. Uno corresponde al aprovechamiento de sus actividades metablicas (crecimiento y produccin de metabolitos) para obtener bienes y/o servicios, y otro completamente distinto corresponde a los efectos perjudiciales que ocasionan, generalmente asociados al desarrollo de enfermedades, tanto en el hombre como en los animales, y al deterioro producido sobre alimentos y materiales diversos. La Microbiologa Industrial se ocupa fundamentalmente de las actividades tiles de los microorganismos. La Biotecnologa es una actividad multidisciplinaria que incorpora la aplicacin de los principios cientficos y de la ingeniera al procesamiento de materiales por agentes biolgicos para proveer bienes y servicios. Los agentes biolgicos pueden ser clulas microbianas, animales, vegetales y enzimas, entendindose por bienes a cualquier producto industrial relacionado con alimentos, bebidas, productos medicinales, etc., y por servicios a aquellos vinculados a la purificacin de aguas y tratamiento de efluentes. Esta definicin que es la ms conocida y aceptada por la mayor parte de los pases fue propuesta por la Organizacin para la Cooperacin Econmica y el Desarrollo (OECD).

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Por lo tanto, la Microbiologa Industrial representa una parte, seguramente la ms importante de la Biotecnologa. As mismo las bases de la Microbiologa Industrial estn cimentadas en los principios de disciplinas como Matemticas, Qumica, Bioqumica, Termodinmica, Microbiologa, Biologa Celular, Tecnologas de Instrumentacin y Control e Ingeniera, las cuales permiten incorporar a los procesos fermentativos conceptos de Estequiometria, Fenmenos de Transporte y Operaciones Unitarias (transferencia de materia, calor y cantidad de movimiento), criterios de Escalamiento, Cintica Enzimtica y de

Crecimiento Microbiano, conocimiento de las Rutas Metablicas as como estudios acerca de la influencia del medio de cultivo sobre la productividad del proceso y la formacin de productos. Una rama importante en la aplicacin de microorganismos a nivel industrial es la Biotecnologa Molecular, la cual se enfoca en la produccin de un amplio rango de protenas, sin embargo, haciendo uso de una serie de tcnicas y metodologas denominadas en conjunto Tecnologa de DNA Recombinante, puede tambin desarrollar la obtencin de una gran diversidad de compuestos de bajo peso molecular. Con sistemas de expresin eficientes, es relativamente fcil clonar y expresar genes de protenas particulares. EL producto final lo constituye la protena expresada o la catlisis de una reaccin especfica. En ocasiones, mediante manipulacin gentica, se incorpora una nueva actividad cataltica a un microorganismo, la cual es usada para producir metabolitos de bajo peso molecular in vivo. Actualmente una gran cantidad de productos farmacuticos y alimentarios son producidos mediante bioprocesos industriales bien establecidos. Por ejemplo, las bacterias son capaces de producir aminocidos que pueden emplearse en alimentos y medicamentos. A diferencia de la sntesis qumica que genera mezclas de productos (como en el caso de los aminocidos donde se presentan formas isomricas tanto Lcomo D-), los procesos cimentados en sistemas biolgicos poseen una gran especificidad, gracias a lo cual e ha logrado la obtencin de cientos de productos de origen microbiano en forma pura.

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Hoy en da existen ms de 200 tipos de productos alimenticios fermentados en el mercado. Existe gran nmero de procesos biolgicos ampliamente usados en la industria para la fabricacin de productos de alta calidad (Tablas 21. y 2.2) como antibiticos y cidos orgnicos como ctrico, actico, butrico y propinico. La sntesis de protenas y aminocidos, lpidos y cidos grasos, azcares simples y polisacridos, glicerol y muchas otras sustancias qumicas mediante bioprocesos, presentan aplicaciones industriales convenientes desde el punto de vista econmico. EL principal enfoque de las fermentaciones industriales es implementar sistemas de cultivo de microorganismos a gran escala. La produccin de biomasa se considera como la obtencin de masa celular a partir de bacterias, mohos y levaduras. Las principales aplicaciones se observan en la elaboracin de levadura para panificacin y de protena celular (SCP, Single Cell Protein). En algunos pases ha sido empleada un alga llamada Spirulina para alimentacin de ganado. La SCP es usada como fuente de alimento producida a partir de materias primas renovables como suero de leche, celulosa, almidn, melazas y un amplio rango de desperdicios vegetales. En cuanto a los productos celulares, estos se clasifican intracelulares y extracelulares. Las enzimas son uno de los principales derivados de este tipo empleados en la industria. Las enzimas pueden ser extradas de plantas y animales, pero las enzimas microbianas tienen la caracterstica de poder ser producidas a gran escala mediante tcnicas convencionales. La actividad de produccin enzimtica es desarrollada por mutacin, seleccin y manipulacin gentica. EL uso de enzimas a nivel industrial es muy amplio, se aplican en produccin de cereales, caf, confitera, chocolate, jarabe de maz, productos lcteos, bebidas y jugos de frutas. Las enzimas ms comnmente usadas en las industrias de los alimentos son amilasa y proteasa en productos crnicos, pectinasa y hemicelulasa es caf, catalasa, lactasa y proteasa en productos lcteos y glucosa oxidasa en jugos de frutas.

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Tabla 2.1 Sectores industriales y bioproductos relacionados Sector Qumico Producto o Servicio Etanol, Acetona, Butanol cidos Orgnicos Enzimas Perfumes Polmeros Farmacutico Antibiticos Enzimas Inhibidores Enzimticos Anticuerpos Monoclonales Esteriodes Vacunas Energtico Etanol Metano (Biogs) Alimentario Productos Lcteos Levadura de Panadera Bebidas Aditivos Aminocidos Vitamina B Protenas (SCP) Agrcola Alimento para Ganado (SCP) Tratamiento de Residuos Pesticidas Microbianos Fijacin de N2

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Tabla 2.2 Productos industriales generados mediante bioprocesos y microorganismos responsables Producto Etanol (no para bebidas) cido 2-cetoglucnico Microorganismo Saccharomyces cerevisiae Pseudomonas sp. Aplicacin Qumica Intermediario para cido Daraboascrbico Pectinasa, proteasa Aspergillus niger, A. aureus Agentes clarificantes en jugos de frutas Amilasa bacteriana Bacillus subtilis Almidn modificado, papel prensado Proteasa bacteriana B. subtilis Detergentes, ablandamiento de fibras Dextran Sorbosa Leuconostoc mesenteroides Gluconobacter suboxydans Estabilizador de alimentos Produccin de cido ascrbico Cobalamina (vitamina B12) cido glutmico cido glucnico cido lctico cido ctrico Acetona-butanol Streptomyces olivaceas Brevibacterium sp. Aspergillus niger Rhizopus oryzae Aspergillus niger Clostridium acetobutylicum Suplemento alimenticio Aditivo de alimentos Productos farmacuticos Alimentos y medicamentos Alimentos y medicamentos Solventes, intermediario qumico Insulina, interfern E. coli recombinante Levadura de panadera Levaduras y cultivos iniciadores Protena microbiana (SCP) Lactobacillus bulgaricus Bacterias acidolcticas Candida utilis , Pseudomonas methyllotroph Penicilina Cefalosporina Penicillium chrysogenum Cephalosparium acremonium Eritromicina Streptomyces erythreus Antibitico Antibitico Antibitico Produccin de queso y yogurt Suplemento alimentario Terapia humana

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Es evidente que la ciencia se comprende ahora como un tipo de actividad de ndole multidisciplinaria, en la que el xito en la solucin de problemas cientficos y sociales complejos slo se podr vislumbrar con el concurso y la convergencia de mltiples conocimientos, herramientas y estrategias. Por lo que resulta adecuado recalcar que la biotecnologa moderna se puede definir como una actividad multidisciplinaria, cuyo sustento es el conocimiento de frontera generado en diversas disciplinas (entre otras, la biologa molecular, la ingeniera bioqumica, la microbiologa, la genmica y la inmunologa), que permite el estudio integral y la manipulacin de los sistemas biolgicos (microbios, plantas y animales). A partir de lo cual la biotecnologa moderna busca hacer un uso inteligente, respetuoso y sustentable de la biodiversidad, mediante el desarrollo de tecnologa eficaz, limpia y competitiva, para facilitar la solucin de problemas importantes en sectores tales como alimentacin, salud, agricultura, industria y medio ambiente. El papel que desempea as la biotecnologa moderna en el mundo actual es clave. El nuestro es un mundo contaminado y con ecosistemas destruidos por los impactos de la industrializacin. Un mundo con una poblacin en demanda creciente de alimentos, agua, recursos energticos, servicios de salud y vivienda. Ante esta realidad, si no mantenemos una conciencia crtica y nos movemos hacia la bsqueda de alternativas tecnolgicas eficaces, limpias, y respetuosas del medio ambiente iremos

irremediablemente hacia escenarios de mayor contaminacin y degradacin.

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3. NATURALEZA DE LOS MICROORGANIMOS EMPLEADOS EN PROCESOS INDUSTRIALESPor mucho tiempo los alimentos fermentados han sido preparados empleando la microflora nativa presente en las materias primas necesarias para su elaboracin, y a pesar del inminente riesgo que representa esta prctica debido a la posible presencia de patgenos, sigue vigente en diversas partes del mundo en la elaboracin comidas tpicas tradicionales. Sin embargo, cada vez ms, e iniciando con el aislamiento y purificacin de cepas de levaduras para cervecera por Emil Christian Hansen en 1883, en la fabricacin de muchos productos se emplean cultivos iniciadores. Estos microorganismos se denominan como Generalmente Reconocidos como Seguros (GRAS, Generally Recognized as Safe). Son seleccionados por las ventajas de sus propiedades en trminos de alto desempeo durante el proceso e impacto en la calidad del producto final. Muchas compaas y laboratorios acadmicos se encuentran en constante bsqueda y desarrollo de nuevos cultivos. En ocasiones pueden ser encontrados a manera de hallazgos afortunados, al buscar en una gran cantidad de muestras tomadas de diversos hbitats. Los mtodos de bsqueda emplean medios de cultivo y condiciones de crecimiento favorables que permitan el desarrollo de un microorganismo determinado en base a las caractersticas deseadas. Alternativamente, pueden obtenerse ciertas ventajas al conocer los lugares en los que se desarrollan ciertos tipos de microorganismos, por ejemplo, las levaduras se encuentran de manera abundante en las superficies de los frutos. Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de fuentes naturales o de una coleccin de cultivos. A nivel industrial, en general, cada firma posee su propia coleccin de organismos, muchos de los cuales han sido mejorados a travs de tcnicas clsicas de mutacin o de ingeniera gentica. Sin embargo, estas cepas slo son empleadas por la industria que las posee, debido al gran valor comercial de las mismas. En algunos casos se dispone de organismos modificados genticamente para llevar a cabo reacciones especficas de biosntesis, degradacin o biocatlisis, los cuales estn protegidos por patentes. Esto significa que un gran porcentaje de organismos aislados o modificados no estn disponibles para uso general en laboratorios. 12

Debido a que el xito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el microorganismo utilizado, en la eleccin del mismo se deben tener en cuenta ciertos criterios generales que se indican a continuacin: 1. El microorganismo debe poder obtenerse en forma de cultivo puro 2. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable. 3. Su velocidad de crecimiento deber ser alta. 4. Sus requerimientos nutricionales deben ser satisfechos a partir de medios de cultivo de costo reducido y si es posible que no necesite de factores de crecimiento. 5. Debe ser de fcil conservacin por largos perodos de tiempo, sin prdida de sus caractersticas particulares. 6. Debe llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto. 7. Si el objetivo del proceso es un producto, ste debe ser de alto rendimiento y de fcil extraccin del medio de cultivo. 8. Debe poder desarrollarse en cultivos a gran escala 9. De preferencia debe producir esporas u otra forma de reproduccin para su fcil inoculacin. 10. Ser inocuo, es decir, no representar peligro para el ser humano, plantas y animales. 11. Ser susceptible a modificacin gentica.

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4. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Y OBTENCIN DE CULTIVIOS PUROS4.1. Desarrollo de mtodos de cultivo puroCuando se trabaja con poblaciones microbianas mixtas pueden cometerse errores, pues se torna difcil determinar cul es el microorganismo responsable de la produccin del metabolito de inters o aquel que determina la obtencin de caractersticas deseables en procesos de maduracin, adems cabe la posibilidad de resultar en un rendimiento deficiente debido a la competencia por el o los sustratos disponibles, pero el factor probablemente ms importante en la elaboracin de alimentos es la incertidumbre en cuanto a la presencia de patgenos. En el siglo XIX se mantena que los microorganismos tenan una gran capacidad de variacin, respecto tanto a su aspecto morfolgico como a su funcin fisiolgica, esta creencia se dio a conocer como doctrina del pleomorfismo, mientras que la creencia contraria, relativa a que los microorganismos presentan una constancia y especificidad de forma y funcin, se dio a conocer como doctrina del monomorfismo. Hacia 1870 se empez a pensar que solamente podra tenerse una idea clara acerca de la forma y funcin de los microorganismos si las complicaciones inherentes al estudio de las poblaciones microbianas mixtas pudiesen evitarse mediante el uso de cultivos puros. Un cultivo puro o axnico es aquel que contiene una sola especie microbiana, proveniente de una sola clula. Los cultivos axnicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales solamente existen cultivos mixtos, en los cuales se presenta diversas especies de forma conjunta. Un cultivo axnico se obtiene artificialmente en el laboratorio. 4.1.1. Primeros cultivos puros Gran parte del trabajo inicial sobre las tcnicas para la obtencin de cultivos puros fue realizado por Brefeld, trabajando con hongos. Introdujo la prctica de aislar clulas, as como la del cultivo de los hongos sobre medios slidos, para lo cual aada gelatina a sus medios lquidos. Sus mtodos de obtencin de cultivos puros funcionaban admirablemente para los hongos, pero no resultaban adecuados cuando se aplicaban a 14

bacterias. Uno de los primeros en proponerse fue el mtodo de las diluciones. Un fluido que contena una mezcla de bacterias se dilua en medio estril, con la esperanza de que en ltimo trmino podra lograrse un crecimiento que tuviera su origen en una sola clula. En la prctica este mtodo es tedioso, difcil e incierto; tiene adems la evidente desventaja de que, en el mejor de los casos, solo se puede aislar en forma pura el microorganismo que predomina en la mezcla original. El mtodo de las diluciones era obviamente demasiado tedioso e inseguro para ser utilizado de forma rutinaria. Una manera ms prometedora de abordar el problema fue sugerida por J. Schroeter, quien encontr que sobre sustratos slidos, como patata, pasta de almidn, pan y albmina de huevo, se formaban desarrollos aislados de bacterias, o colonias. Robert Koch se dio cuenta en seguida de que el desarrollo de medios sencillos para la obtencin de cultivos puros de bacterias era esencial para el desarrollo de la nueva ciencia. Koch realiz experimentos utilizando superficies estriles de patatas cortadas, las cuales inoculaba con bacterias. Sin embargo, las patatas tienen claras desventajas; la superficie del corte es hmeda, lo que permite a las bacterias mviles desplazarse libremente sobre ella; el sustrato es opaco y, por ello a veces resulta difcil ver las colonias; y lo ms importante, la patata no es buen medio nutritivo para muchas bacterias. Koch concibi la idea de que sera mucho mejor si se pudiese solidificar un medio lquido bien conocido, aadiendo alguna sustancia transparente. De esta manera podra preparase un gel traslcido sobre el cual seran fcilmente visibles las colonias bacterianas que se desarrollasen. Al mismo tiempo, modificando la composicin del lquido base, podran atenderse los diferentes requerimientos de nutricin de las diferentes bacterias. Con esta idea presente, aadi gelatina como agente endurecedor. Una vez solidificada, la superficie de la gelatina se sembraba tomando una minscula cantidad de clulas bacterianas con una aguja de platino, previamente esterilizada pasndola por una llama y deslizndola varias veces, rpida y suavemente sobre la superficie del gel. Despus de cierto tiempo de incubacin, se presentaron diferentes colonias bacterianas, cada una de las cuales poda ser purificada repitiendo este proceso de siembra, que se dio a conocer como mtodo de siembra por estra. Poco despus, Koch descubri que en lugar de sembrar las bacterias sobre la 15

superficie de la gelatina ya solidificada, poda mezclarlas con la gelatina fundida. Cuando la gelatina se solidificaba, las bacterias quedaban inmovilizadas dentro del gel y ah se desarrollaban dando colonias aisladas. Esto se dio a conocer como mtodo de vertido en placa. Los cultivos puros eran luego transferidos a tubos de ensayo, que contenan gelatina nutritiva estril, los cuales haban sido taponados con algodn estril y se solidificaban en posicin inclinada, denominndose cultivos en tubo inclinado. A pesar del innovador mtodo desarrollado por Koch para la obtencin de cultivos puros, la gelatina presentaba varios inconvenientes. Es una protena altamente susceptible a la digestin y fluidificacin por las bacterias. Adems cambia de slido a lquido a temperaturas por encima de los 28C. Pronto fue introducido un nuevo agente solidificante, el agar. El agar es un polisacrido que se extrae de las algas rojas. Para fundir un gel de agar se requiere una temperatura de 100C, por lo que permanece slido a lo largo de toda la escala de temperaturas a la que se cultivan los microorganismos y, una vez fundido, permanece lquido hasta que la temperatura baja a 44C aproximadamente, hecho que hace posible su uso para la preparacin de cultivos por el mtodo de vertido en placa. Finalmente es un carbohidrato complejo que es atacado por muy pocas bacterias, por lo que el problema de su fluidificacin se presenta muy raras veces. 4.1.2. Tcnicas de cultivo puro La obtencin de un cultivo axnico es un proceso de dos etapas. Primero, hay que esterilizar todos los materiales para eliminar todos los microorganismos presentes en ellos. Segundo, hay que aislar y cultivar un solo microorganismo, para producir un clon de descendientes. Una vez que se cuenta con material y medios de cultivo estriles, el siguiente paso para obtener un cultivo axnico es inocular una sola clula de un microorganismo en un medio slido o lquido. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podr multiplicar en condiciones favorables. Un clon est constituido por una poblacin de clulas descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio slido. Una colonia de bacterias de tamao medio contiene, aproximadamente, 10 9 clulas individuales, casi tantos individuos como personas pueblan la tierra. 16

Para aislar clulas individuales, los microorganismos han de ser diluidos, debido al gran nmero en que normalmente estn presentes. La dilucin se realiza mediante siembra por estra cruzada (tambin llamada siembra por estra en placa), vertido en placa o extensin en superficie (extensin en placa). Los microorganismos son ubicuos, por lo que la preparacin de un cultivo puro no implica solamente el aislamiento de un determinado microorganismo a partir de una poblacin microbiana natural mixta, sino tambin el mantenimiento del individuo aislado y de su descendencia, en un ambiente artificial al que se impide el acceso a otros microorganismos. Los microorganismos no requieren mucho espacio para su desarrollo; de ah que pueda crearse un ambiente artificial dentro de los confines de un tubo de ensayo, de un matraz o de una caja Petri, los tres tipos de recipientes ms comnmente utilizados para cultivar microbios. El recipiente de cultivo debe estar inicialmente estril (libre de toda forma de vida) y despus de la introduccin del tipo de microorganismo deseado debe estar protegido de una posible contaminacin externa. 4.1.2.1. Aislamiento de cultivos puros por mtodos de siembra en placa La manera ms fcil de obtener cultivos puros de los microorganismos que forman colonias discretas sobre medios slidos se lleva a cabo utilizando alguna de las variables del mtodo de siembra en placa. Este mtodo implica la separacin e inmovilizacin de los organismos particulares dentro o sobre un medio de cultivo nutritivo solidificado por agar o algn otro agente gelificante adecuado. Mtodo de siembra por estra en placa: La siembra por estra es, en general, el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos. Para ello, con un asa de siembra con aro en la punta, se toma una muestra de una suspensin mixta de clulas convenientemente diluida, y a continuacin se hacen estras paralelas no superpuestas sobre la superficie de un medio slido previamente preparado en una caja Petri. Con forme se van haciendo estras en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio de cultivo menos microorganismos, es decir, el inculo se va diluyendo progresivamente con cada estra sucesiva, de tal manera que si las estras iniciales proporcionaron un crecimiento confluente, a lo largo de las ltimas estras se van desarrollando colonias bien aisladas. A continuacin, se flamea el asa, 17

se toca en la regin donde se han realizado las ltimas estras y se contina la siembra con la misma tcnica, en la superficie de medio an sin sembrar. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar clulas individuales. Es posible tambin aislar mediante estra por agotamiento, esto es, despus de tomar la muestra, se hacen estras a lo largo de toda la superficie de la placa sin despegar el asa. Despus de la incubacin es posible apreciar un gradiente de dilucin en el crecimiento de las colonias, de modo tal que, en la zona de la caja Petri donde se realizaron las primeras estras se presentar un crecimiento abundante, a diferencia de las ltimas estras que generarn colonias bien aisladas. Vertido en Placa y Extensin en Superficie. En estos mtodos, las suspensiones de clulas microbianas se diluyen antes de ser inoculadas. Se siguen estas tcnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilucin no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensin con mil millones de clulas por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensin con un centenar de clulas por mililitro. Por tanto se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, esto se logra aadiendo 1 mL de la suspensin bacteriana a 9 mL de medio estril o solucin salina estril. Se agita vigorosamente para diluir las clulas y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. En el mtodo de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en cajas Petri. Algunas colonias quedarn embebidas en el agar y otras crecern en la superficie. Las colonias superficiales se extendern y sern ms grandes. En el mtodo de extensin en placa, las muestras se siembran directamente en la superficie del agar contenido en la caja Petri, extendindose con la ayuda de un asa de Digralsky de cristal estril (varillas de vidrio dobladas en ngulo recto). La suspensin se absorbe en el agar, dejando las clulas microbianas sobre la superficie. Seguido de la siembra, las placas se dejan incubar hasta la aparicin de colonias. Las tcnicas por dilucin presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor nmero de colonias aisladas que el mtodo de siembra por estra.

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4.1.2.2. Aislamiento de microorganismos anaerobios El aislamiento de bacterias anaerbicas por los mtodos de siembra en placa plantea problemas especiales. Siempre que los organismos en cuestin no mueran rpidamente al ser expuestos al oxgeno, las placas pueden prepararse de manera usual y luego incubarse en recipientes cerrados, de los cuales se elimina el oxgeno bien sea por absorcin qumica o por evacuacin. Existen microorganismos a los que se les denomina anaerobios estrictos, ya que mueren al ser expuestos aunque sea momentneamente al aire, por lo que su cultivo requiere medidas extraordinarias para excluir, en todo momento, incluso trazas de oxgeno. Habitualmente se utilizan dos tcnicas principales para el cultivo de bacterias en completa ausencia de oxigeno; cultivo rodante y cmaras anaerbicas. 4.1.3. Consideraciones en el Aislamiento de Microorganismos Si se quiere aislar un microorganismo a partir de una poblacin natural mixta, con frecuencia resulta posible, siempre que la tcnica sea buena, preparar una serie de placas sembradas por dilucin en la que muchas de las colonias desarrolladas estn bien separadas unas de otras. Sin embargo estas colonias aisladas pueden distar mucho de representar un cultivo puro. Es probable que se inicie una colonia particular por dos microorganismos semejantes sembrados juntos en la placa para dar una colonia mixta. Adems, como los microorganismos varan enormemente en cuanto a sus requerimientos, ningn medio y conjunto nico de condiciones de crecimiento permitir el desarrollo de todos los microorganismos presentes en una poblacin natural. Ciertamente, es probable que solo una fraccin de los organismos inicialmente presentes sea capaz de formar colonias en cualquier medio dado. De ah que pueda haber miles de microorganismos que se depositaron tambin en la superficie del agar y que aunque no lograron un crecimiento macroscpicamente sigan siendo viables. La probabilidad de que algunos de estos microorganismos sean tomados y transferidos es muy elevada. Por todo lo anterior, NUNCA SE DEBE TOMAR LA COLONIA DE UNA PRIMERA PLACA PARA PREPARAR UN CULTIVO PURO. En lugar de esto, se debe sembrar por estra una segunda placa, utilizando una suspensin preparada a partir de una colonia bien aislada. Si todas las colonias de esta segunda placa resultan idnticas,

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una colonia bien aislada de estas puede entonces emplearse para establecer un cultivo puro. No todos los microorganismos capaces de crecer sobre medios slidos dan origen necesariamente a colonias bien aisladas. Ciertas bacterias flageladas mviles pueden extenderse rpidamente por la superficie ligeramente hmeda de la paca recin preparada. Esto puede evitarse mediante el uso de placas con la superficie bien seca, en las que las clulas quedan inmovilizadas. Las espiroquetas y los organismos que muestran movimientos de desplazamiento pueden moverse sobre un gel de agar o a travs de l, incluso cuando su superficie se encuentra seca. En tales casos, el movimiento de los organismos en cuestin sirve de ayuda para su purificacin, ya que pueden separarse de otras clases de microorganismos inmovilizados en el agar. 4.1.4 Cultivos Bimembres El fin que se pretende con el aislamiento es, normalmente, la obtencin de un cultivo puro. Sin embargo, existen ciertos casos en los que no se puede lograr esto, o en los que conseguirlo es tan difcil que no resulta prctico. En tales circunstancias la alternativa consiste en obtener el mejor grado de purificacin en forma de cultivo bimembre, el cual contiene solamente dos clases de microorganismos. Esta es la nica forma posible para mantener los virus, ya que estos organismos son todos parsitos intracelulares. Representa tambin la mejor manera de mantener en el laboratorio muchos de los protozoos que se alimentan en la naturaleza de microorganismos ms pequeos, en asociacin con sus presas microbianas. El establecimiento de un cultivo bimembre es una operacin que se realiza en dos fases. Primero es necesario establecer un cultivo puro del organismo que sirve de alimento (el hospedador en el caso de los virus y de los parsitos intracelulares obligados, la presa en el caso de los protozoos). Una vez logrado esto, el parsito o depredador puede ser aislado por cualquiera de los diversos mtodos existentes (siembra en placa en presencia del organismo que sirve de alimento, dilucin en medio lquido, aislamiento de una sola clula) e introducirlo en el cultivo puro del organismo que sirve de alimento.

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El mantenimiento con xito de los cultivos bimembres requiere un gran cuidado ya que es esencial mantener un equilibrio biolgico razonablemente estable entre los dos componentes. El medio debe permitir el suficiente desarrollo del organismo que sirve de alimento para satisfacer las necesidades del parsito o depredador, pero no tanto que sobrepase en crecimiento a su asociado y origine productos metablicos que sean perjudiciales para ste.

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5. IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOSMichael Adanson crea que si se observaban suficientes caracteres de un microorganismo, independientemente de su importancia, ste podra ser clasificado con exactitud. Este enfoque se denomina taxonoma numrica, la cual otorga igual valor a todos los caracteres. Mediante este enfoque se analizan un gran nmero de caracteres de muchas cepas y posteriormente se calcula el porcentaje de caracteres que comparten cada una de las distintas parejas posibles. La relacin de una pareja de cepas queda reducida a un nmero, el coeficiente de semejanza (Sj).

Los caracteres utilizados para clasificar bacterias son de dos tipos: los tradicionales y los modernos. Tradicionalmente, los taxnomos han empleado la morfologa, la bioqumica y la fisiologa, la serologa y la fagopata para tomar decisiones sobre una especie bacteriana. Actualmente, se puede utilizar el porcentaje de pares de bases GC, secuencias de bases de DNA, hibridacin de DNA, secuencias de bases de mRNA, secuencias de aminocidos de protenas y perfiles de protenas.

5.1. MorfologaLos criterios morfolgicos pueden ser, a su vez, a nivel macro- y microscpico. Los criterios macroscpicos tienen en cuenta el aspecto de las colonias al crecer en diferentes medios de cultivo. Por ejemplo, en el agar glucosado de sabouraud las colonias de levaduras suelen ser completas, ligeramente abombadas o planas, de consistencia mantecosa o cremosa, lisa o rugosa, con olor dulzn agradable, volvindose ms pastosas a medida que envejecen. La observacin a nivel microscpico revela la forma de las clulas individuales, la disposicin caracterstica que adoptan (cadenas, grupos o paquetes irregulares) y la disposicin de los flagelos, la formacin y tipo de esporas o la forma de reproduccin sea sta sexual o asexual. Sin embargo, un aspecto morfolgico no indica necesariamente una relacin cercana entre tipos de organismos, por tanto, los caracteres morfolgicos ayudan a describir 22

clulas microbianas, pero no suministran mucha ms informacin acerca de la relacin entre ellas. Existe una excepcin notable a esta afirmacin. La tincin de Gram pone de manifiesto un carcter morfolgico significativo, pues revela si una bacteria posee o no una membrana externa y tiene una pared de peptidoglicano gruesa o fina.

5.2. Bioqumica y FisiologaAlgunos de los caracteres bioqumicos y fisiolgicos utilizados para clasificar microorganismos se basan en las condiciones que permiten su crecimiento. Requerimientos de oxgeno (aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos), valores ptimos de pH para el crecimiento, condiciones osmticas y productos finales del metabolismo son ejemplos de parmetros en los cuales se basa la caracterizacin de un cepa. Las fuentes de carbono que permiten el crecimiento constituyen un conjunto de caracteres particularmente tiles, debido a que la mayora de las bacterias pueden utilizar muchas fuentes de carbono diferentes. Si una bacteria puede usar una fuente de carbono en particular o no, es un carcter que puede emplearse para calcular el coeficiente de semejanza. Incluso es posible identificar cualquier especie patgena Gram negativa, determinando cual o cuales de los 96 compuestos orgnicos diferentes pueden utilizar como fuente carbono. Otra propiedad de gran utilidad en el anlisis diferencial de microorganismos es su capacidad fermentativa, pues permite detectar la produccin cidos o gases. Cuando se acumulan los productos cidos de la fermentacin, el pH del medio baja; este cambio de pH puede detectarse de varias maneras, siendo la ms frecuente el adicionar un indicador en el medio de cultivo, el cual cambiar de color a medida que aumente la acidez. Por ejemplo, Escherichia coli puede diferenciarse de la especie estrechamente relacionada Enterobacter aerogenes por la prueba del rojo de metilo. Escherichia coli produce suficientes cidos cuando fermenta azcares como para cambiar el rojo de metilo desde amarillo a rojo, pero Enterobacter aerogenes no.

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La produccin tanto de cidos como de gases a partir de una fuente de carbono en particular puede ser muy informativa. Un microorganismo que produce cidos y gases a partir de la fermentacin de lactosa posee una gran probabilidad de ser Escherichia coli. Sin embargo, la formacin de cidos y gases a partir de lactosa es solo una identificacin presuntiva, cuya confirmacin requiere de la intervencin de pruebas adicionales. En trminos bioqumico-fisiolgicos las levaduras pueden diferenciarse en cuanto a su crecimiento a distintas temperaturas (4 o 37C), fermentacin de compuestos carbonados, asimilacin de distintas fuentes de carbono o nitrgeno y formacin de compuestos amiloides extracelulares. Las soluciones para determinar caractersticas fermentativas y asimilativas de compuestos carbonados emplean por lo general azcares como glucosa, maltosa o sacarosa, mientras que en la asimilacin de compuestos nitrogenados se utilizan sales como nitrato de potasio (KNO3) y sulfato de amonio (NH4SO3) nitrgeno. o aminocidos como lisina o triptfano como nica fuente de

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6. CRECIMIENTO MICROBIANOEn cualquier sistema bilgico, el crecimiento puede ser definido como el aumento ordenado de todos los componentes qumicos. El aumento de masa, por s solo, podra no indicar un crecimiento real, ya que las clulas podran estar incrementando nicamente su contenido en productos de reserva, tales como glucgeno o poli-hidroxibutirato. En un medio adecuado, y al cual se han adaptado perfectamente, las bacterias se encuentran en un estado de crecimiento equilibrado. Durante un periodo de crecimiento equilibrado, una duplicacin de la biomasa va acompaada de una duplicacin de todas las dems propiedades medibles de la poblacin, por ejemplo, protenas, DNA, RNA y agua intracelular. En otras palabras, los cultivos en crecimiento equilibrado mantienen una composicin qumica constante. La existencia del crecimiento equilibrado simplifica la tarea de medir la velocidad de crecimiento de un cultivo bacteriano; como la velocidad de crecimiento de todos los componentes de una poblacin es la misma, la medida de cualquier componente basta para determinar la velocidad de crecimiento.

6.1. Naturaleza y Expresin Matemtica del CrecimientoUn cultivo microbiano en crecimiento equilibrado imita una reaccin autocataltica de primer orden; es decir, la velocidad de aumento de bacterias en un tiempo dado es proporcional al nmero o masa de bacterias presentes en ese tiempo.

La constante de proporcionalidad, es un ndice de la velocidad de crecimiento y, por ello, se denomina constante de velocidad de crecimiento. Dado que suponemos que el crecimiento es equilibrado, tambin relaciona la velocidad de crecimiento de cualquier componente celular determinado con la cantidad de ese componente, lo que en trminos matemticos es:

donde N es el nmero de clulas/mL, X es la masa de clulas/mL, Z es la cantidad de cualquier componente celular/mL, t es el tiempo y es la constante de velocidad de crecimiento. Estas ecuaciones describen adecuadamente el crecimiento de la mayora 25

de los cultivos de bacterias unicelulares. Otras formas de ellas son ms tiles en la prctica, por ejemplo mediante su integracin tenemos:

y al convertir los logaritmos naturales a decimales,

donde los valores de Z y Z0 corresponde a la cantidad de cualquier componente bacteriano del cultivo en los tiempos t y t0, respectivamente. Midiendo Z y Z0, puede calcularse el valor de , la constante de velocidad de crecimiento del cultivo. As, si el cultivo contiene 104 clulas/mL en t0 y 4 horas ms tarde 108 clulas/mL, la velocidad de crecimiento especfica del cultivo es:

El valor de es suficiente para definir la velocidad de crecimiento de un cultivo. No obstante, tambin se utilizan a menudo otros parmetros. Uno de ellos es el tiempo de duplicacin promedio o tiempo de generacin (g), que se define como el tiempo requerido para que todos los componentes del cultivo aumenten en un factor de 2. La relacin entre g y puede deducirse, dado que si el intervalo de tiempo considerado (tt0) es igual a g, entonces Z equivaldr el doble de Z0, tenindose que:

En el ejemplo indicado, el tiempo de duplicacin promedio es g = 0.693/2.303 = 0.42 horas, es decir, 25 minutos. sta es una velocidad de crecimiento relativamente alta para una bacteria. Las anteriores ecuaciones matemticas del crecimiento bacteriano se han deducido a partir de la premisa de que la velocidad de incremento es proporcional al nmero (o masa) presente en cualquier momento dado. A partir de este supuesto, se demostr que el tiempo de duplicacin es constante equilibrado. 26 durante un periodo de crecimiento

6.2. Cintica de crecimiento microbianoSi se inocula un microorganismo en un volumen fijo de medio de cultivo fresco y estril, el cual constituya un sistema cerrado (cultivo Batch o por Lotes), y se determina la el logaritmo del nmero de clulas viables con respecto al tiempo, al graficar dichos datos pueden distinguirse las fases del crecimiento microbiano, tal y como se muestra en la figura 6.1:I II III IV V VI VII VIII

Logaritmo del nmero de clulas

Tiempo

Figura 6.1. Fases de la cintica de crecimiento microbiano para un cultivo por lotes I. Fase Lag o Fase de Latencia: Periodo de tiempo donde el cambio en el nmero de clulas es cero. II. Fase de Aceleracin del Crecimiento: El nmero de clulas empieza a incrementarse, la velocidad de divisin se incrementa hasta alcanzar su mximo. III. Fase de Crecimiento Exponencial: El nmero de clulas incrementa exponencialmente cuando la clula comienza a dividirse. La velocidad de crecimiento incrementa durante esta fase, pero la velocidad de divisin es constante a su valor mximo. IV. Fase de Desaceleracin de Crecimiento: Se debe a la escases de nutrientes, produccin de compuestos inhibidores, depredadores, etc. 27

V.

Fase Estacionaria: La poblacin celular alcanza su mximo valor y no incrementa de nuevo, el nmero de clulas generadas es igual al nmero de clulas que mueren.

VI.

Fase de Aceleracin Negativa de Crecimiento: Los nutrientes empiezan a agotarse resultando en el inicio del declive de la poblacin celular.

VII.

Fase de Muerte: Despus de que los nutrientes disponibles para el crecimiento se han agotado, las clulas empiezan a morir y el nmero de clulas viables disminuye.

VIII.

Crecimiento Crptico: Algunas clulas sobrevivientes se adaptan a las nuevas condiciones del medio y utilizan como nutrientes los restos de las clulas muertas, iniciando nuevamente el crecimiento.

El estudio y descripcin de la cintica de crecimiento microbiano se enfoca principalmente en tres de las fases sealadas, debido a su aplicacin e importancia en procesos a nivel industrial: Lag, Exponencial y Estacionaria. La fase Lag inicia despus de la inoculacin de un medio de cultivo estril, constituye un periodo de adaptacin. La longitud de este periodo depende de muchos factores tales como tipo y edad de los microorganismos, tamao de inculo y condiciones de cultivo. La fase de latencia usualmente se presenta cuando las clulas deben ajustarse al nuevo medio antes de que el crecimiento pueda iniciar. Cuando un cultivo microbiano es transferido de un ambiente a otro, necesita reorganizar sus componentes micro- y macromoleculares. Esto involucra la sntesis o represin de enzimas o componentes estructurales de la clula. Si un microorganismo inicialmente se encuentra en un medio de cultivo con bajas concentraciones de nutrientes y es inoculado en un medio con elevada cantidad de nutrientes, por lo general la fase Lag ser prolongada. Esto se debe a que las clulas necesitan producir las enzimas necesarias para metabolizar los nutrientes disponibles. En caso contrario, es decir, al pasar de un medio rico en nutrientes a uno con escasa concentracin, es muy probable que no se presente fase Lag. Otro factor importante que afecta la duracin de la fase de latencia es el tamao de inculo. Si se inocula una cantidad pequea de clulas en un volumen grande, se presentara una fase Lag larga. Para operaciones de cultivo de clulas a gran escala, 28

uno de los objetivos es garantizar que la fase Lag sea lo ms corta posible. Por lo tanto, el inculo de un fermentador industrial, necesita realizarse a partir de una serie de tanques de tamao progresivamente grande para minimizar el efecto de la fase Lag. La fase Exponencial es caracterizada e identificada por una lnea recta en una grfica semilogartmica donde se registra el logaritmo del nmero de clulas en el eje de las ordenadas y el tiempo en el eje de las abscisas, matemticamente se expresa como:

Lo cual predice una relacin exponencial entre el nmero de clulas en la poblacin (o cualquier otra propiedad sujeta a medicin) y el tiempo. Representa un periodo de crecimiento durante el cual la velocidad especfica de crecimiento () es constante. Esto significa que durante cada tiempo de duplicacin, el nmero de clulas de la poblacin se duplica en un factor de dos. La razn por la cual se registra grficamente el logaritmo del nmero de clulas en lugar de su valor aritmtico original es la siguiente: El nmero de microorganismos de una poblacin que aumenta exponencialmente se incrementa lentamente al principio y luego muy rpidamente, por ejemplo, durante las tres primeras duplicaciones de una sola clula slo se producen siete nuevas clulas, durante la sptima se originan 64 y durante la duplicacin vigsimo primera 1 048 576. Si se expresa esta curva en una escala aritmtica, el incremento inicial apenas se apreciara, mientras que las fases de crecimiento posteriores dispararan la grfica. En cambio, al graficar el valor logartmico, la curva se convierte en lnea recta, con una pendiente directamente relacionada con la tasa de crecimiento de la poblacin. Dado el comportamiento exponencial se tienen que el nmero total de clulas es igual a dos elevado a un exponente, dicho exponente es el nmero de generaciones que han transcurrido desde que la poblacin comenz a aumentar. La frmula general es N = 2n, donde N es el nmero de clulas en el cultivo despus de que pasen n tiempos de duplicacin. El crecimiento exponencial se encuentra limitado normalmente por el agotamiento de los nutrientes disponibles o por la acumulacin de productos txicos del metabolismo, como consecuencia, la velocidad de crecimiento disminuye y el crecimiento llega a detenerse. Las poblaciones microbianas raramente mantienen un crecimiento 29

exponencial a altas velocidades durante largo tiempo. La razn es evidente si se consideran las consecuencias del crecimiento exponencial. Una sola bacteria con una masa aproximada de 10-12 gramos y un tiempo de generacin de 20 minutos, tras 48 horas de crecimiento exponencial producira una descendencia de 2.21031 gramos, es decir, unas 4 000 veces la masa de la Tierra. La fase Estacionaria tiene lugar cuando todas las clulas detienen su divisin o cuando las clulas viables se encuentran en equilibrio con las clulas que mueren, es decir, la velocidad de generacin de nuevas clulas es igual a la velocidad de muerte. Durante el tiempo de incubacin posterior pueden ocurrir varias cosas. Despus de que el crecimiento neto ha cesado, tiene lugar la acumulacin de productos dentro de la clula y en el medio de cultivo, seguido de esto el metabolismo se detiene. La masa celular total puede permanecer constante, pero es muy probable que el nmero de clulas viables disminuya. Alternativamente, al reducirse la viabilidad, puede presentarse lisis celular. Esto conduce a la formacin de un medio complejo compuesto de sustancias intracelulares, gracias a lo cual puede presentarse un periodo de crecimiento secundario, denominado crecimiento crptico (VIII) en el que las clulas sobrevivientes se adaptan para asimilar las sustancias presentes como nutrientes. Frecuentemente, se forman metabolitos secundarios no esenciales por sistemas enzimticos anteriormente ausentes o fuera de funcionamiento. La composicin macromolecular de la clula sufre diversos cambios debido a las variaciones en cuanto a las demandas metablicas durante las distintas fases del crecimiento. Las clulas de la fase Estacionaria tienen una composicin qumica diferente a las de las clulas de la fase Exponencial. La composicin celular en la fase estacionaria depende del factor limitante especfico del crecimiento. A pesar de esto pueden hacerse algunas generalizaciones: las clulas en fase Estacionaria son ms pequeas que en la fase Exponencial (dado que la divisin celular contina despus que el incremento de masa se ha detenido), y son ms resistentes a agentes fsicos (calor, fro, radiaciones) y qumicos adversos. Algunos microorganismos son capaces de formar endosporas (especies de Bacillus o Clostridium principalmente) en respuesta a un ambiente restrictivo para el crecimiento. La importancia en la determinacin de la cintica de crecimiento de un microorganismo, estriba en que representa una herramienta de gran utilidad para evaluar factores y 30

establecer parmetros del proceso fermentativo en cuestin, tales como temperatura, pH, naturaleza y concentracin de nutrientes en el medio de cultivo y el tiempo ptimo de duracin en base al tipo de metabolito que se desea obtener.

6.3. Rendimiento del crecimiento microbianoLa cantidad neta de crecimiento de un cultivo de microorganismos es la diferencia entre la masa celular (o nmero de clulas) utilizada como inculo y la masa celular (o nmero de clulas) presente en el cultivo cuando se llega a la fase estacionaria. Cuando el crecimiento se encuentra limitado por un nutriente determinado, existe una relacin lineal fija entre la concentracin inicial de dicho nutriente y el crecimiento neto resultante. La masa de clulas producida por unidad de nutriente limitante es, por consiguiente, una constante (Y) denominada rendimiento (por la palabra yield en ingls). El valor de Y puede calcularse a partir de mediciones del crecimiento total mediante la ecuacin:

Donde X es el peso seco/mL de las clulas cuando el cultivo entra en la fase estacionaria, X0 el peso seco/mL inmediatamente despus de la inoculacin y S la concentracin de nutriente limitante. El rendimiento puede determinarse para cualquier nutriente que se imponga y una vez determinado puede emplearse para calcular la concentracin de dicho nutriente en una mezcla desconocida, midiendo que crecimiento soporta una muestra de la mezcla desconocida cuando se aade a un medio completo en todos los aspectos en el nutriente limitante. Este tipo de determinacin se conoce como bioensayo. Anteriormente se empleaba para determinar la concentracin de aminocidos y vitaminas en alimentos. Ahora se han hecho ms frecuentes los mtodos qumicos y fsicos, aunque el fundamento del bioensayo sigue siendo una herramienta de investigacin para detectar y cuantificar compuestos con actividades favorecedoras del crecimiento. Para realizar un bioensayo solamente se requiere una cepa microbiana para la cual la sustancia a ensayar sea un nutriente esencial.

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En el caso de los microorganismos quimioheterotrficos, el rendimiento medio en funcin de la cantidad de sustrato orgnico utilizado, suministra un ndice de la eficiencia de conversin del sustrato en masa bacteriana. Cuando ciertos microorganismos fermentadores estrictos se cultivan en medios ricos, y los experimentos con marcadores radiactivos muestran que poca o ninguna cantidad de carbono del sustrato fermentable se convierte en material celular, implica que en estas condiciones, el material celular proviene de los otros componentes del medio (aminocidos, purinas, pirimidinas, etc.), y el sustrato fermentable sirve nicamente como fuente de energa. El rendimiento en ATP de muchas fermentaciones es bien conocido, y el rendimiento celular (gramos de peso seco) por mol de ATP producido (YATP) es de unos 10 gramos de material celular/mol de ATP, lo que sugiere que la energa requerida para polimerizar elementos estructurales carbonados a macromolculas no vara mucho entre diferentes microorganismos. Sin embargo, esta constancia no se observa si se considera el rendimiento celular por mol de sustrato fermentado, ya que distintos microorganismos pueden fermentar a un mismo sustrato por rutas que difieren en el rendimiento de ATP. Zymomonas mobilis fermenta la glucosa produciendo alcohol etlico a travs de la ruta de Entner-Doudoroff,

produciendo 1 mol de ATP por mol de glucosa; las levaduras, por el contrario, fermentan la glucosa a etanol mediante la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas, produciendo 2 moles de ATP por mol de glucosa. Las levaduras producen considerablemente ms clulas por mol de glucosa fermentada que Zymomonas, pero aproximadamente la misma cantidad por mol de ATP originado en la fermentacin. La constancia aproximada de YATP puede utilizarse para deducir el rendimiento de ATP de una ruta desconocida.

6.4. Cultivo continuo de microorganismosLas poblaciones microbianas pueden mantenerse en estado de crecimiento exponencial durante un largo periodo de tiempo mediante la utilizacin de un sistema de cultivo continuo, el cual est conectado a un depsito de medio de cultivo estril. Una vez que se ha iniciado el crecimiento, se aade medio fresco del depsito de manera continua. El volumen en el recipiente de cultivo se mantiene constante eliminando el volumen en exceso. 32

Si el medio fresco entra a velocidad constante, la concentracin celular en el recipiente de cultivo permanece tambin constante despus de un periodo inicial de ajuste, pues los microorganismos se reproducen lo suficientemente de prisa como para reemplazar a los que se pierden por eliminacin del volumen excedente. Si se cambia a velocidad de alimentacin de medio fresco, se produce otro periodo de ajuste, seguido por el establecimiento de una poblacin constante con una nueva concentracin celular; la velocidad de crecimiento vara para compensar la nueva velocidad de prdida de clulas. Un sistema de cultivo continuo responde de esta manera a una amplia variacin de velocidad de entrada del medio fresco. Sin embargo, cualquiera que sea la velocidad de entrada del medio, los microorganismos no pueden crecer ms rpidamente de lo que lo haran en un cultivo discontinuo. La razn por la cual la velocidad de adicin de medio fresco determina la velocidad de crecimiento del cultivo, se debe al hecho de que la velocidad de crecimiento en un cultivo continuo est siempre delimitada por la concentracin de uno de los nutrientes; el sistema se encuentra autorregulado. Supngase un cultivo continuo que opera a una velocidad constante de adicin de medio fresco. Tras la inoculacin, el cultivo crecer a la mxima velocidad (max). A medida que aumente la densidad poblacional del cultivo, la velocidad de utilizacin de los nutrientes aumentar hasta que el agotamiento de uno de los nutrientes empiece a limitar la velocidad de crecimiento. Mientas la velocidad de crecimiento exceda la velocidad de perdida por eliminacin de volumen excedente, la densidad continuar aumentando, la concentracin de nutriente limitante continuar disminuyendo y, en consecuencia, la velocidad de crecimiento se reducir hasta que la velocidad de incremento de clulas por crecimiento iguale exactamente la velocidad de prdida por exceso. Si la velocidad de crecimiento se hiciera momentneamente menor que la velocidad de prdida de clulas, la densidad de poblacin disminuira, aumentara la concentracin de nutriente limitante y la velocidad de crecimiento se incrementara hasta que se alcance de nuevo el equilibrio entre la velocidad de crecimiento y la prdida de clulas. Al considerar el hecho de que en un cultivo continuo la concentracin celular permanece constante y es autorregulable, el sistema puede describirse en trminos matemticos como: 33

Velocidad de Produccin de Clulas en Crecimiento

=

Velocidad de Perdida de Clulas por Exceso de Volumen

Anteriormente se describi la velocidad de produccin de masa microbiana (dX/dt) como:

La velocidad de prdida de clulas por eliminacin de volumen en exceso (dX/dt) puede expresarse como:

Donde la velocidad de flujo (f) se mide en volmenes de cultivo (V) por hora. Despejando la tasa de dilucin (D), se tiene:

Despejando de la ecuacin de velocidad de produccin de masa microbiana, resulta:

Por tanto, = D, es decir, la velocidad de crecimiento es igual a la tasa de dilucin en un sistema estabilizado de cultivo continuo. Existe un claro ejemplo de sistema de cultivo continuo en la naturaleza; el aparato digestivo de los rumiantes, de los cuales, con los que ms estamos familiarizados son los bovinos. El rumen de una vaca funciona como un quimiostato, pues los nutrientes llegan de forma continua y los microorganismos crecen sin parar, y parte de su contenido pasa continuamente al sistema digestivo. Esto no significa que las vacas estn siempre comiendo, por el contrario, los rumiantes aportan nutrientes al rumen de manera regular masticando el forraje regurgitado. Cunado mastican, fluyen al rumen fragmentos de forraje suspendidos en saliva. La vaca no rumia siempre que est comiendo, pero el aporte de nutrientes al rumen es esencialmente continuo porque los 34

fragmentos slidos de celulosa actan como reservorio de nutrientes para los microorganismos.

6.5. Influencia de la Concentracin de Nutrientes en la Velocidad de CrecimientoDurante las fermentaciones, la velocidad de crecimiento puede considerarse anloga a la velocidad de una reaccin qumica, la cual se encuentra en funcin de la concentracin de los reactivos que intervienen en ella. En el caso del desarrollo microbiano, dichos reactivos estn representados por los nutrientes esenciales o sustratos necesarios para el crecimiento. La relacin existente entre la velocidad de crecimiento y la concentracin de sustratos fue descrita por Monod (1949), siendo similar a la cintica de saturacin que exhibe la adsorcin monomolecular. De esta manera, puede aplicarse al crecimiento microbiano un modelo similar al de una isoterma tipo Langmuir. El modelo de Monod est representado mediante:

donde es la velocidad especfica de crecimiento, max es la velocidad especfica de crecimiento mxima, S es la concentracin de sustrato, y Ks es una constante que equivale a la concentracin de sustrato cuando = 0.5 max. Los valores de Ks tienden a ser pequeos (1-120 mg/L). Se ha observado que ~ max cuando S > 10Ks, no siendo as cuando S < 10Ks, lo que indica que la velocidad especfica de crecimiento se encuentra estrechamente relacionada con la concentracin de sustrato. Debido a que los valores de Ks son bajos, la velocidad especfica de crecimiento durante la fase exponencial es constante. El periodo de transicin entre la fase exponencial y la estacionaria es usualmente corto o abrupto, pues la elevada concentracin celular consume rpidamente la poca cantidad disponible de sustrato residual. Por esta razn se torna muy difcil calcular los valores de K s en cultivos por lotes. Sin embargo, es posible emplear la velocidad inicial, momento en el que se consumen cantidades reducidas de sustrato y donde la velocidad de crecimiento inicial es cuantificada antes de que los cambios en la concentracin de sustrato sean significativos. 35

El modelo de Monod se basa en observaciones empricas pero frecuentemente es racionalizado por su analoga con el modelo de cintica enzimtica de MichaelisMenten, con la hiptesis de que el crecimiento est determinado por la velocidad limitante de catlisis enzimtica. Adems, algunos factores con significado fsico y biolgico pueden atribuirse a las dos constantes; max es la velocidad especfica de crecimiento mxima en un determinado medio de cultivo a una temperatura y pH especficos, y Ks es inversamente proporcional a la afinidad del microorganismo por el sustrato. Existen otros modelos que explican la relacin entre la velocidad de crecimiento y la concentracin de sustrato, pero el de Monod es el ms comnmente usado. El principal aporte de la determinacin de Ks se emplea en sistemas de cultivo continuo donde = D, por lo tanto:

y despejando S:

Lo cual establece la relacin fundamental entre la concentracin de sustrato y la tasa de dilucin. Durante el funcionamiento de un cultivo continuo en el cual se mantiene de una densidad de poblacin estabilizada, la concentracin del nutriente limitante (S) tambin permanece constante. Por lo tanto, la velocidad de adicin del nutriente debe igualar la velocidad a la cual es utilizado por el cultivo junto con la prdida por eliminacin de volumen excedente: (Sustrato Aadido) = (Sustrato Usado para Crecimiento) + (Sustrato Perdido por Exceso) es decir;

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donde Sr es la concentracin del nutriente limitante en el depsito y dc/dt es la velocidad de utilizacin del nutriente limitante en el crecimiento. Sustituyendo dc/dt por (dX/dt) (dc/dX), y puesto que dX/dt=X y ds/dx=1/Y, se tiene:

Durante un estado estable, D=, por lo que al despejar X se obtiene:

lo que determina la relacin fundamental entre la densidad de poblacin (X) y la concentracin del nutriente limitante (S) en el recipiente de cultivo. Cuando la tasa de dilucin se aproxima a max, la densidad de poblacin desciende rpidamente a cero, y la concertacin de nutriente limitante se aproxima a su concentracin en el depsito (Sr).

6.6. Metabolitos Primarios y SecundariosLos metabolitos primarios se forman durante la fase exponencial del crecimiento microbiano y constituyen productos finales de las rutas metablicas, de bajo peso molecular y que son usados como bloques constituyentes de macromolculas esenciales. Los de mayor importancia son los aminocidos, nucletidos de purinas y pirimidinas, y las vitaminas. Los intermediarios en las rutas biosintticas de estos productos finales tambin son considerados metabolitos primarios, por ejemplo los intermediarios de la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas, la ruta de las pentosas fosfato y el ciclo de los cidos tricarboxlicos. Mediante esta interpretacin, los cidos orgnicos como el cido ctrico y fumrico son considerados metabolitos primarios. La sobreproduccin de metabolitos primarios es evitada por muchos microorganismos pues representa un desgaste innecesario de energa y nutrientes disminuyendo su habilidad o capacidad de sobrevivir en la naturaleza. Sin embargo, algunos organismos pueden sobrevivir al controlar defectos en su mecanismo regulatorio, y estos sobreproductores son los cultivos elegidos en programas designados al aislamiento de cepas con potencial fermentativo y biotecnolgico-industrial, sometindose a estudios intensivos de desarrollo en los cuales se emplean modificaciones genticas y ambientales para disminuir su regulacin e incrementar la sobreproduccin. 37

Los metabolitos secundarios se generan durante la fase estacionara del crecimiento y son molculas sintetizadas por ciertos microorganismos, usualmente lentos en su ciclo de crecimiento. Aunque no se requieren para el desarrollo, es decir no son indispensables para el crecimiento, estos metabolitos pueden tener valor para la supervivencia de los organismos que los producen. Comnmente son producidos como mezclas de sustancias qumicas estrechamente relacionadas que pertenecen a la misma familia. Por ejemplo, existen 3 neomicinas, 5 mitomicinas, 10 bacitracinas, 6 tirocidinas, 8 aflatoxinas, 10 polimixinas, ms de 20 penicilinas y 20 actinomicinas. Cada una es producida por un estrecho rango taxonmico de organismos y su habilidad de produccin puede perderse fcilmente por mutacin (degeneracin de cepas). Entre los metabolitos secundarios mejor conocidos se encuentran antibiticos,

micotoxinas y pigmentos. Se han identificado alrededor de 2 000 antibiticos, de los cuales 1500 son producidos por actinomicetos. Algunas especies se identifican y son reconocidas por su habilidad de producir antibiticos, por ejemplo las cepas de Streptomyces griseus producen ms de 40 antibiticos.

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EXPERIMENTOS

I. BACTERIASBacterias del cido Lctico Las bacterias del cido lctico (BAL) comprenden los gneros Lactococcus, Lactobacillus, Carnobacterium, Streptococcus, Enterococcus y Pediococcus (tabla I.I), entre otros, y poseen la habilidad de producir grandes cantidades de ste cido a partir del azcar. El descenso del pH resultante hace que el medio en que han crecido sea inadecuado para la mayora de los otros microorganismos, por lo que el desarrollo de las bacterias acidolcticas constituye una manera de conservacin de alimentos, adems, producen componentes del aroma.Tabla I.I Principales bacterias acidolcticas Microorganismo Involucrado Lactobacillus bulgaricus Fermentacin de cido lctico Lactobacillus bulgaricus Streptococcus thermophilus Fermentacin de cido lctico e hidrlisis de protenas Streptococcus lactis, bulgaricus S. lactis o S. cremoris (35C) Lactobacilos acidolcticos varios (42C) Propionibacterium spp. Fermentacin del cido propinico Queso suizo L. Fermentacin de cido lctico cido lctico inicial Quesos en general Kefir Yogur Mantequilla Proceso Producto

Estas bacterias son dbilmente proteolticas y lipolticas, con una ligera tendencia a producir sabores pungentes. Estn presentes de manera natural en el intestino, por lo que actualmente son denominadas como probiticos. Los probiticos son organismos, principalmente lactobacilos y bifidobacterias, las cuales son agregados a la dieta para por enriquecer el nivel de la densidad de la microflora intestinal, un ejemplo de ello es 40 su incorporacin al yogurt.

Junto con las levaduras empleadas en panificacin y cervecera, las bateras del cido lctico son catalogadas como microorganismos GRAS, sin embargo, algunas cepas son patgenas. Joseph Lister fue el primero en aislar una bacteria acidolctica en 1873. Este organismo al que actualmente se hace referencia como Lactococcus lactis es una de las especias de mayor importancia en la fermentacin de productos lcteos. Existen 16 gneros de BAL, de las cuales 12 presentan actividad en contextos relacionados a alimentos. Son bacterias Gram-positivas, en forma de bacilos. La mayora son mesfilos, pero algunos pueden crecer a temperaturas tanto bajas (4C) como altas (45C). Generalmente prefieren el rango de pH de 4.0-4.5, pero determinadas cepas pueden tolerar y crecer a pHs mayores a 9.0 o menores a 3.2. Necesitan factores de crecimiento como purinas, pirimidinas, aminocido y vitaminas. Las bacterias del cido lctico no presentan un ciclo de los cidos tricarboxlicos funcional o una cadena respiratoria de transferencia de electrones, emplean la fosforilacin a nivel de sustrato para generar la energa que requieren. Su metabolismo puede ser clasificado de dos maneras: homofermentativo, donde el cido representa el 95% del total de los productos finales; o heterofermentativo, en el cual se produce cido actico, etanol y dixido de carbono junto con el cido lctico. Se ha encontrado que muchas BAL secretan pequeos pptidos de sntesis ribosomal con actividad antimicrobiana, a los cuales se les ha denominado bacteriocinas. En mayor medida, estos pptidos son catinicos de carcter anfiptico que se insertan en las membranas de bacterias estrechamente relacionadas, causando la formacin de poros, evitando el mantenimiento del metabolismo, y propiciando finalmente la muerte. De estos agentes, el mejor conocido es la nisina, la cual ha sido sustancialmente empleada como un agente antimicrobiano natural. Adems de secretar bacteriocinas muchas de las bacterias de este tipo tiene la capacidad de inhibir el desarrollo de microorganismos patgenos a travs de compuestos como cido lctico, diacetilo y perxido de hidrogeno. Una de las ventajas de emplear estas bacterias es que se han usado por siglos en la elaboracin de alimentos fermentados, considerndose como inocuas por la FDA (Food and Drug Administration), lo cual permite su aplicacin en la 41 industria alimentaria.

I.I Aislamiento y Obtencin de Cultivos AxnicosI.I.I Objetivos Objetivo General Obtener de manera aislada y en forma de cultivo puro cepas de bacterias Grampositivas y Gram-negativas mediante la tcnica de siembra en placa por estra cruzada. Objetivos especficos A partir de heces fecales obtener un cultivo axnico de Escherichia coli. Aislar cepas de bacterias acidolcticas a partir de muestras de leche sin pasteurizar o de productos lcteos como quesos frescos o yogurt. Identificarlas las especies microbianas en base a parmetros bioqumicos y morfolgicos macro- y microscpicos. I.I.II Materiales Material Biolgico 10 g de heces fecales de animales domsticos 10 g de leche sin pasteurizar o de un producto lcteo

Material y Equipo Algodn Asa de platino Cuchara estril Tubos de ensaye Cajas de Petri estriles Matraces Erlenmeyer de 250 mL Mecheros Fisher Incubadora Autoclave Estufa

Medios de Cultivo Agar EMB Caldo nutritivo Agar Lactobacillus MRS Caldo para bacterias acidolcticas 43

Medios Para Pruebas Bioqumicas Agar Hierro Triple Azcar (TSI) Agar Hierro-Lisina (LIA) Agar Citrato de Simmons Medio Voges Proskauer Medio SIM Urea I.I.III Mtodos 1.- Empleando una cuchara estril, colocar 5 g de muestra en 45 mL de caldo nutritivo (heces fecales) o en 45 mL de caldo para bacterias acidolcticas (producto lcteo) segn sea el caso. Incubar a 37C por 24 h. 2.- Dependiendo de la muestra, sembrar por estra cruzada 2 cajas de Petri con agar EMB (heces fecales) o agar Lactobacillus MRS (producto lcteo). Incubar a 37C por 24 h. 3.- Examinar las colonias presentes. En el caso de la muestra de origen fecal identificar colonias aisladas de color verde brillante con centro negro caractersticas de bacterias coliformes (Escherichia coli). Respecto a la muestra de origen lcteo, las colonias de inters se presentan de color blanco-amarillo con aspecto cremoso. Elegir una colonia con las caractersticas mencionadas, y empleando un asa de platino perfectamente esterilizada a la flama del mechero, inocular con ella 15 mL de caldo nutritivo o caldo para bacterias acidolcticas segn sea el caso. Incubar a 37C por 24 h. 4.- A partir del nuevo cultivo, sembrar nuevamente por estra cruzada 2 cajas de Petri con el medio de cultivo correspondiente (EMB o Lactobacillus MRS). Incubar a 37C por 24 h. Pasado el tiempo de incubacin, examinar las colonias presentes confirmando que tengan la misma morfologa, sugiriendo que se trata de un cultivo puro o en su defecto semipuro. 5.- Al trmino de los pasos 1 y 4 tomar una gota del cultivo y una colonia aislada respectivamente, observar en fresco directamente al microscopio y enseguida realizar tincin de Gram. 44

-

6.- Aplicar pruebas bioqumicas para identificar el microorganismo en cuestin. 7.- Una vez comprobado que se trata de un cultivo puro, sembrar en tubo inclinado con agar nutritivo para las especies de origen fecal y agar Lactobacillus MRS para las de origen lcteo. Incubar a 37C por 24 h y almacenar a una temperatura de 5-10C.

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I.II Cintica de Crecimiento BacterianoI.II.I Objetivos Objetivo General Obtener la representacin grfica e identificar las fases del crecimiento bacteriano para un cultivo por lotes mediante tcnicas turbidimtricas. Objetivos Especficos Establecer el tiempo de duracin de la fase Lag y Exponencial de dos microorganismos de distinta naturaleza y comparar ambos comportamientos. Determinar la velocidad especfica de crecimiento mxima (max) y el tiempo de generacin (g) durante la fase exponencial de ambos microorganismos. I.II.II Materiales Material Biolgico Cultivo axnico de Escherichia coli Cepa previamente aislada de bacteria acidolctica

Material y Equipo Algodn Perillas Pipetas estriles de 10 mL Matraz Erlenmeyer de 125 mL Matraz Erlenmeyer de 300 mL Mecheros Fisher Incubadora Autoclave Estufa Espectrofotmetro

Medios de Cultivo Caldo nutritivo Caldo para bacterias acidolcticas

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I.II.III Mtodos 1.- Inocular 10 mL de medio de cultivo con el microorganismo correspondiente (caldo nutritivo para Escherichia coli y caldo para bacterias acidolcticas en el caso de una cepa de este tipo). Incubar a 37C durante 24 h. 2.- Transferir 1 mL del cultivo anterior a un matraz Erlenmeyer con 100 mL del mismo caldo (tiempo cero). 3. Homogenizar el inculo en el medio y mantenerlo en incubacin a 37C con una velocidad de agitacin de 100 rpm. 4.- Medir la variacin de la densidad ptica (absorbancia en funcin del tiempo) cada 20 minutos en un Espectrofotmetro, a una longitud de onda de 540 nm durante 300 minutos aproximadamente. Como blanco emplee una muestra estril del medio de cultivo correspondiente. 5.- Registrar los datos en la tabla siguiente y graficar el logaritmo natural de la absorbancia (Ln A540nm)

en funcin del tiempo, colocando el primer valor en el eje de

las ordenadas y el segundo en el eje delas abscisas. Determinar max y g en base a la ecuacin de la recta para la fase de crecimiento exponencial.Tiempo (minutos) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 Absorbancia 540 nm

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I.III Elaboracin de YogurtI.III.I Objetivos Objetivo general Llevar a cabo la fermentacin de leche entera previamente pasteurizada empleando bacterias productoras de cido lctico. Objetivo especfico Comparar las capacidades fermentativas de las bacterias acidolcticas que se encuentran de manera natural en leche entera sin pasteurizar con las de un cultivo comercia para la elaboracin de yogurt. I.III.II Materiales Material Biolgico Cultivos de bacterias acidolcticas previamente aisladas e identificadas a partir

de leche entera (Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus) Cultivo comercial para la elaboracin de yogurt.

Nota: En caso de no contar con cultivos liofilizados de alguna casa comercial, es posible aislar los microorganismos de yogurt natural comercial para realizar el anlisis comparativo. Material y Equipo Perillas Algodn Pipetas estriles de 10 mL Matraz Erlenmeyer de 250 mL Matraz Erlenmeyer de 1 000 mL Mecheros Fisher Incubadora Autoclave Estufa Potencimetro Bureta o bureta automtica

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Medios de Cultivo Leche entera

Reactivos NaOH 0.1 N I.III.III Mtodos 1.- Por duplicado, pasteurizar 50 mL de leche entera en matraces Erlenmeyer esterilizados de 250 mL. 2.- Asegurando que la leche se encuentre a una temperatura entre 42-44C inocular uno de los matraces con bacterias acidolcticas provenientes de leche entera (cepas silvestres), y el matraz restante con el cultivo comercial liofilizado o aislado a partir de yogurt natural. Incubar durante 24 horas a una temperatura de 43C. Esto constituir el preinculo. 3.- En matraces Erlenmeyer esterilizados de 1 000 mL, pasteurizar por duplicado 600 mL de leche entera. 4.- Despus de la pasteurizacin mantener los matraces a una temperatura de 43C. Verter el contenido de los matraces de 250 mL al interior de los matraces de 1 000 mL, agitar para asegurar una incorporacin homognea del preinculo. Colocar en incubacin a una temperatura de 43C. Considerar este momento como el tiempo cero. 5.- Realizar determinaciones de pH y acidez titulable cada 30 minutos durante 7 horas o hasta obtener un valor de pH entre 4.0-4.5. 6.- Representar grficamente los datos obtenidos, colocando en el eje de las ordenadas los valores de pH o acidez titulable y en el eje de las abscisas el tiempo.

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I.IV Influencia de la Composicin del Medio de Cultivo en el Crecimiento BacterianoI.IV.I Objetivos Objetivo general Comparar el crecimiento de E. coli, en medios de cultivo cuyo sustrato disponible como fuente de carbono y energa sea distinto. Objetivos especficos Obtener los perfiles de crecimiento de E. coli en medios de cultivo de composicin distinta, al emplear glucosa y sacarosa como nica fuente de carbono y energa. Determinar y comparar los perfiles de consumo bacteriano de glucosa y sacarosa.

I.VI.II Materiales Material Biolgico Cultivo previamente aislado de E. coli

Material y Equipo Perillas Algodn Pipetas estriles de 5 y 10 mL Matraz Erlenmeyer de 250 mL Mecheros Fisher Espectrofotmetro Incubadora Autoclave Estufa

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Reactivos Glucosa Sacarosa NH4Cl K2SO4 MgCl2 K2HPO4

I.VI.III Mtodos 1.- Prepare un preinculo de E. coli en caldo nutritivo, como se describe en el punto nmero 1 de la metodologa del experimento I.II. 2.- En matraces Erlenmeyer de 250 mL prepare por triplicado 100 mL de un medio de cultivo con glucosa como nica fuente de carbono y otro con sacarosa como nica fuente de carbono (al final deber contarse con seis matraces, tres de cada medio de cultivo). Considere la siguiente composicin celular y una concentracin celular final de 1 g/L.Elemento Carbono Nitrgeno Fsforo Azufre Magnesio Porcentaje en la Clula 50 14 2 1 0.5 Fuente Glucosa o Sacarosa NH4Cl K2HPO4 K2SO4 MgCl2

Una vez preparados mantngalos a una temperatura de 37C. De estos seis matraces, dos sern conservados para emplearse como blancos en las determinaciones turbidimtricas. 3.- Inocule cuatro matraces con 1 mL del preinculo preparado anteriormente (tiempo cero), y colquelos en incubacin a 37C y agitacin de 100 rpm.

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4.- A dos de los matraces (uno de cada medio de cultivo), determine la variacin de la densidad ptica (absorbancia en funcin del tiempo) cada 20 minutos en un Espectrofotmetro, a una longitud de onda de 540 nm durante 300 minutos aproximadamente. Grafique el logaritmo natural de la absorbancia (Ln A540nm)

en

funcin del tiempo, colocando el primer valor en el eje de las ordenadas y el segundo en el eje delas abscisas. Determine max y g para cada uno de los medios de cultivo. 5.- A los dos matraces restantes determine, cada 30 minutos y por el mismo periodo de tiempo, la concentracin de azcares reductores por el mtodo DNS. Grafique los datos obtenidos de concentracin con respecto al tiempo, colocando de igual manera el tiempo en el eje de las abscisas y la concentracin de azcares reductores en el eje de las ordenadas. Investigue como determinar el valor aproximado de Ks para un cultivo por lotes.

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II. MOHOSLos hongos se encuentran ampliamente distribuidos por todo el globo terrestre y viven en cualquier sitio que presente material orgnico, agua y una temperatura apropiada, comprendida generalmente entre 4 y 60 C, desde el nivel del mar hasta altitudes de ms de 4 000 m, en donde se encuentran los ltimos vestigios de vegetacin, en los lugares ms hmedos hasta los sitios semidesrticos y an desrticos en las pocas en que puede haber ligera humedad en los suelos. A nivel industrial los hongos presentan usos muy diversificados, como son la obtencin de alimentos, bebidas, condimentos, complementos alimenticios, alcohol industrial, cidos orgnicos, antibit