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Chapitre 5 : l’eau et les liaisons Les liaisons covalentes résultent du partage d’électrons entre deux atomes, elles les maintiennent dans une position fixe et sont à l’origine des caractéristiques de molécules qu’elles forment. Elles possèdent une énergie de liaison élevée (200-850 kJ/mol), ce sont des liaisons fortes dont l’énergie est très supérieure à l’agitation thermique du milieu biologique . Les liaisons non covalentes ont des énergies de liaisons environ 10 fois plus faibles que des liaisons covalentes. On reconnaît quatre types de liaisons non covalentes : les liaisons hydrogène, les liaisons ioniques, les interactions de Van der Waals et les intercations dues à l’effet hydrophobe. L’importante différence d’électronégativité entre l’oxygène et l’hydrogène d’une molécule d’eau donne à cette molécule un caractère polaire très marqué, c’est-à-dire qu’un côté de la molécule est chargé positivement alors que l’autre est chargé négativement. Cette polarité permet à la molécule d’eau d’établir des liaisons hydrogène avec d’autres molécules d’eau et des substances possédant des groupes polaires avec lesquelles elles tissent un réseau de liaisons hydrogène qui sont en permanence renouvelées. Dans une liaison hydrogène, un atome d’hydrogène lié par une liaison covalente est attiré par les électrons non appariés d’un atome électronégatif (O, N) qualifié d’accepteur d’hydrogène, cette attraction constitue la liaison hydrogène. Les molécules capables d’établir des liaions hydrogène sont solubles dans l’eau, elles sont dites hydrophiles, les molécules chargées et les ions se dissolvent également dans l’eau avec laquelle ils interagissent par des forces électrostatiques. Les molécules non polaires ne peuvent établir de liaisons hydrogène avec l’eau, elles sont dites hydrophobes, elles se dissolvent très mal dans ce liquide ; de plus, elles forcent les molécules d’eau à adopter une disposition énergétiquement défavorable (diminution de l’entropie) qui ne peut se maintenir. Les molécules hydrophobes se regroupent en micelles dans lesquelles les parties les plus hydrophobes sont au centre et les parties plus ou moins hydrophiles sont en périphérie, minimisant ainsi la baisse d’entropie dans l’environnement. Les liaisons ioniques sont des liaisons faibles en milieu aqueux, elles résultent de l’attraction électrostatique entre les charges négatives et positives des ions. Elles concernent les ions métaliques et les groupements ionisables des molécules. En milieu aqueux, les ions sont solvatés et doivent être désolvatés pour passer dans les canaux ioniques. Certaines chaînes latérales des acides aminés sont ionisables ce qui permet d’avoir des liaisons ioniques au sein des protéines. Les interactions de Van der Waals sont non spécifiques et ont lieu dès que des atomes sont proches l’un de l’autre. Elles résultent de l’attraction entre dipôles temporaires, de signes opposés, générés par la répartition des nuages électroniques négatifs par rapport aux noyaux positifs. L’effet hydrophobe résulte de la répulsion de l’eau par les parties hydrophobes de certaines molécules qui, de ce fait, se regroupent en excluant l’eau de leurs interfaces. Ce regroupement des parties non polaires des molécules favorisent les interactions de Van der Waals entre parties hydrophobes qui maintiennent ensemble ces molécules qui sont aussi stabilisées par la cage de molécules d’eau qui entoure ces regroupements. La complémentarité des surfaces de deux molécules leur permet de se lier par des liaisons faibles plus ou moins nombreuses, plus le nombre de liaisons établies est important, plus l’affinité est élevée.

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La forme la plus stable d’un acide nucléique ou d’une protéine est celle où le nombre de liasion hydrogène est maximal dans la molécule (hélice et feuillet) et entre la molécule et le solvant. Le fonctionnement cellulaire est fondé sur la stabilité des protéines assurée par des liaisons covalentes et par leur capacité à changer de forme, par réorganisation des différentes liaisons faibles, en réponse à la fixation réversible d’un ligand, qui modifie leur propriété et donc leur fonction. Chapitre 6 : les oses Les oses, molécules non hydrolysables, possèdent une fonction aldéhyde ou une fonction cétone et entre 2 et 6 fonctions alcool. Les oses possèdent un ou plusieurs carbones asymétriques à l’origine de nombreux épimères. Pour les oses d’au moins 5 atomes de carbone, la fonction aldéhyde du C1 ou la fonction cétone du C2 réagit avec le groupe hydroxyle du C5 donnant un cycle pyranose ou furanose à l’origine d’une anomérie α et β qui est interconvertible. Le carbone anomérique est facilement oxydée (liqueur de Fehling), il permet de mettre en évidence les sucres réducteurs. Certains goupements des oses sont modifiables (oses acides, oses aminés, oses actéylés, oses phosphorylés, oses sulfatées, oses méthylés, désoxyoses…) et donnnent une grande diversité à ces monomères. Un groupe –OH d’un ose peut réagir (enzyme + NTP) avec le carbone anomérique d’un autre ose et donner un diholoside ; dans cette configuration le carbone anomérique n’est plus oxydable (saccharose), mais dans certains diholosides (maltose, lactose), le carbone anomérique n’est pas impliqué dans la liaison glycosidique. L’existence de liaison α et β introduit de nouvelles propriétés chimiques et structurales chez les diholosides et les polyholosides par rapport à la nature de la liaison qui relie les monomères. La nomenclature des diholosides tient compte de la nature de la liaison et des oses qu’elle implique. Les polyholosides ramifiés (amylopectine, glycogène) ou non ramifiés (amylose) constituent des formes de stockage du glucose dont les unités sont liées par des liaisons α(1-4).

À cause de la rotation des résidus glucose de part et d’autre du cycle pyranose qui est rigide, l’amidon et le glycogène s’enroulent en hélice stabilisée par des liaisons hydrogène intrachaînes.

Les polyholosides du type cellulose ou chitine ont des unités identiques reliées entre elles par des liaisons β(1-4) qui permettent de former des liaisons intra- et interchaînes qui les rendent rigides. Des hétéropolyholosides et des homopolyholosides chargés très négativement sont sécrétés dans les matrices extracellulaires animales et végétales et leur donnent une partie de leurs propriétés. Les acides nucléiques sont des polymères d’hétérosisdes, les glycolipides et les glycoprotéines sont des hétérosides. Les glycoprotéines possèdent des chaînes oligosaccharidiques fixées par une liaison N-glycosidique ou O-glycosidique. La formation d’une chaîne oligosaccharidique se fait par des glycosyltransférases qui reconnaissent la chaîne en croissance et l’ose à ajouter. De très nombreuses protéines membranaires et de sécrétion sont glycosylées, la présence de ces chaînes participe à l’établissement de la structure tertiaire et à son maintien. Ces chaînes oligosaccharidiques sont portées aussi par des lipides membranaires (glycolipides).

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La diversité des liaisons, la diversité des oses et des branchements qui entrent dans ces oligosaccharides conduit à un nombre colossal de chaînes dont les rôles informationnels sont très importants (adressage des protéines, reconnaissance cellulaire, état fonctionnel de la cellule…). Les lectines sont des protéines de la surface membranaire qui reconnaissent de manière spécifique les chaînes oligosaccharidiques et permettent leur fixation. Les protéoglycanes sont formés par des protéines liées à un ou plusieurs glycanes qui représente la plus grosse partie de la molécule et assurent des fonctions de reconnaissance, d’adhérence et de transfert d’information entre cellules. Chapitre 7 : les lipides Les lipides constituent un groupe de substances hétérogènes, formées essentiellement de carbone et d’hydrogène, qui ont pour point commun de posséder une hydrophobicité plus ou moins marquée. Cette hydrophobicité leur permet d’être extraits par des solvants non polaires. Les lipides interviennent dans 3 rôles biologiques : réserves (triglycérides), lipides structuraux (lipides membranaires) et lipides à rôles physiologiques. Les lipides amphipathiques ont la capacité de s’assembler dans l’eau en micelles ou en feuillets ordonnés avec les parties hydrophiles au contact de l’eau et les parties hydrophobes au centre. Cette propriété a permis de former spontanément, par des interactions non covalentes entre les molécules amphipathiques, un compartiment isolé de l’environnement, à l’origine d’une vie cellulaire. Ces feuillets lipidiques sont imperméables aux ions et aux substances polaires. Les propriétés de la plupart des lipides résultent de la présence d’acides gras dans leur molécule. La longueur, le degré de saturation et la configuration des doubles liaisons des acides gras déterminent leurs propriétés physiques et notamment leut point de fusion qui conditionnent en partie la fluidité membranaire. Les triacylglycérols ou graisses neutres constituent, en raison de leur faible densité et de leur hydrophobicité marquée, une forme de stockage d’énergie très utilisée chez les animaux. En tant que molécules extrêmement réduites, les acides gras qui constituent un élément majeur de la majorité des lipides ont, à masse égale, une énergie potentielle double de celles des oses. Les lipides amphipathiques sont des lipides structuraux, ils possèdent une tête polaire hydrophile et des chaînes carbonées non polaires hydrophobes ; ils constituent l’essentiel des membranes biologiques. Les trois types de lipides membranaires sont les phospholipides, les glycolipides et le cholestérol. La partie polaire des diacylglycérols est chargée négativement à pH 7. Ce sont leurs deux acides gras qui forment la partie hydrophobe, ces molécules possèdent un phosphate et sont donc des phospholipides. Les sphingolipides ont une partie polaire qui contient un groupement phosphate (sphingophospholipides) et de la choline ou n’en contient pas (sphingoglycolipides) et sont neutres ; l’une des queues hydrophobes est constituée par un acide gras alors que l’autre correspond à celle de l’alcool, la sphingosine. Le cholestérol se fixe par son hydroxyle à la partie polaire des lipides membranaires et ses 4 cycles plans hydrophobes interagissent avec les queues hydrophobes des autres lipides membranaires et modifient la fluidité. Les lipides interviennent aussi dans la communication intercellulaire, le transport d’électrons et constituent certains pigments. Le phosphatidylinositol bisphophate membranaire est hydrolysée en réponse à l’action d’une hormone en deux molécules qui sont des messagers secondaires intracellulaires (voie des inositolphosphates).

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Le cholestérol est le précurseur de la synthèse de nombreuses hormones qui régulent la transcription de certains gènes. Les vitamines liposolubles (D, A, E, K) sont constituées d’unités isoprènes tout comme le cholestérol et la vitamine A est à l’origine de la synthèse du pigment visuel. Les caroténoïdes, dont la vitamine A et les xanthophylles, sont des pigments de couleurs jaune à rouge. Les transporteurs d’électrons ubiquinone et plastoquinone possèdent une longue queue hydrophobe (polymère d’unités isoprène) qui leur permet de se maintenir et de se déplacer dans la partie hydrophobe de la bicouche lipidique. Chapitre 8 : les protéines Les protéines sont des polymères linéaires constitués de 20 types d’acides aminés dont l’ordre d’agencement est défini par l’ARNm. Les acides aminés possèdent en commun une fonction acide carboxylique et un groupe amine dont l’état d’ionisation dépend du pH de la solution, ces deux groupes sont portés par un carbone asymétrique qui possède un atome d’hydrogène. Les acides aminés se différencient par le chaîne latérale qui permet de les classer en 5 types suivant leur polarité et leur charge à pH 7. Les acides aminés peuvent se lier entre eux au cours d’une réaction de condensation au cours de laquelle le groupe hydroxyle d’un acide aminé est éliminé par l’attaque nucléophile du groupement amine, mais le groupe hydroxyle est bien attaché et la réaction à pH physiologique n’est pas en faveur de la formation d’un dipeptide. La liaison peptidique est une liaison simple à caractère de liaison double, plus stable en position trans, non chargée, les 3 liaisons et les 4 atomes impliqués C–N, C = O, N–H sont situés dans un plan, les rotations sont permises entre Cα–C et N–Cα situés de par et d’autre de la liaison peptidique. Chaque liaison peptidique est à la fois un accepteur de liaison hydrogène par le groupe C=O et un donneur d’hydrogène par le groupe N–H, des liaisons hydrogène s’établissent donc entre les atomes de la liaison peptidique indépendamment de la nature des acides aminés. Elles sont à l’origine des hélices α et des brins β. La conformation des peptides dépend donc de l’encombrement des chaînes latérales et toutes les dispositions angulaires ne sont pas possibles compte tenu de l’encombrement de ces chaînes. La structure primaire d’une protéine correspond à la séquence des acides aminés, c’est-à-dire à leur ordre dans la molécule, cette séquence est directement mise en place au cours de la traduction de l’ARNm sur le ribosome, plus d’un million de séquences primaires de protéines sont conues, elles sont données de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale. La structure primaire est porteuse de l’information nécessaire à son propre reploiement dans l’espace. Les protéines chaperons ne font qu’accélérer ce processus. La structure secondaire d’une protéine correspond à l’hélice α et au feuillet β. Dans l’hélice α, la chaîne polypeptique est entroulée et forme un tube dont les parois sont constituées par les la succession des liaisons –Cα–C–N–Cα–C–N– Cα, les chaînes latérales se projettant à l’extérieur, l’ensemble étant stabilisé par des liaisons hydrogène entre le C=O d’un acide aminé et le N–H d’un aice aminé situé 4 résidus plus loin. Quand la chaîne polypeptidique est très étirée, elle forme le brin b qui se lie à d’autres brins du même type par des liaions hydrogène entre C=O et le N–H. Les domaines sont constituées par des regroupements de structures supersecondaires, plusieurs domaines forment une structure globulaire, la structure tertiaire.

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La structure tridimensionnelle d’une protéine correspond à son état d’énergie minimale. Les protéines hydrosolubles ont leur acides aminés hydrophobes au centre et les acides aminés hydrophiles en périphérie. La force à l’origine de ce reploiement est constituée principalement par les intercations hydrophobes entre acides aminés non polaires. Dans les protéines membranaires, la disposition inverse est adoptée ce qui autorise les interactions hydrophobes dans la membrane. La structure quaternaire correspond à l’assemblage de plusieurs chaînes polypeptidiques qui peuvent être identiques ou différentes, chacune correspond à une sous-unité. Les sous-unités sont maintenus le plus souvent entre elles par des liaisons faibles, mais dans certains protéines, comme les immunoglobulines, les différentes chaînes sont liées par des ponts disulfure. Certaines protéines connaissent des modifications post-traductionnelles : clivage de certaines séquences (zymogènes), adjonction de chaînes oligosaccharidiques (protéines de sécrétions), modification des acides aminés (colllagène), phophorylation de certains acides aminés (thréonine, sérine). La diversité structurale et fonctionnelle des protéines leur permet d’intervenir dans toutes les activités cellulaires. Chapitre 9 : les acides nucléiques Les acides nucléiques sont des hétérosides qui se différencient par l’ose sur lequel ils sont construits. L’ADN est construit sur le désoxyribose qui est plus stable que le ribose de l’ARN. Les acides nucléiques portent l’information génétique. L’ADN est la forme principale de stockage, mais l’ARN génomique se rencontre chez quelques virus. Les différents types d’ARN interviennent dans l’expression de l’information génétique portée par l’ADN. L’ADN est consituté de désoxyribose, d’acide phosphorique et de 4 bases azotéés (Thyminine, adénine, guanine, cytosine), l’ARN s’en différencie par le remplacement de la thymine par l’uracile et par le ribose. La molécule d’ADN est organisée en deux brins antiparallèles formés par une alternance de phosphates et de désoxyriboses liés par des liaisons phosphodiesters, c’est le squelette ose-phosphate. Les désoxyriboses portent les bases azotées qui sont liées entre elles perpendiculairement aux brins, par des liaisons hydrogène, 3 entre la guanine et la cytosine, 2 entre l’adénine et la thymine. Cette complémenatrité des bases azotées impose qu’un brin est complémentaire de l’autre. Cette caractéristique permet la réplication semiconservative de l’ADN. La molécule d’ADN B est donc une double hélice de 2,4 nm de diamètre où les bases azotées se succèdent à raison de 10,5 bases par tour, soit une base tous les 0,34 nm. Sa longueur atteint plusieurs centimètres. La taille de la molécule d’ADN permet son observation au microscope électronique. La molécule d’ADN existe sous forme linéaire ou circulaire, monocaténaire ou bicaténaire. Chez les Eucaryotes, chaque molécule d’ADN s’associe à des protéines et forme un chromosome visible au cours des divisions cellulaires. L’ADN chauffé se sépare en deux brins par rupture des liaisons hydrogène entre le sbases azotées. Les régions qui ont des contenus en G/C importants ont des points de fusion plus élevés que celles où ces bases sont plus rares. En refroidissant, les deux brins complémentaires se réassocient. L’ADN d’un organisme eucaryote coupé en séquences d’environ 1 000 paires de bases, puis dénaturé, se réassocient avec une cinétique qui révèle la présence de séquences hautement répétées, de séquences moyennent répétées et de séquences peu ou pas répétées. L’hybridation d’ADN monocaténaire de deux espèces permet de mesurer leur degré de divergence. De plus, l’hybridation entre ARN et ADN monocaténéaire est un très puissant outil pour localiser un gène dans un génome ou sur une plaque d’électrophorèse. Les techniques d’amplification d’ADN (clonage, PCR) ont permis de séquencer l’ADN d’organismes de plus en plus nombreux.

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Les différents ARN sont isolables par des centrifugations en gradient de densité. Cettte technique permet leur séparation en fonction de leur coefficient de sédimentation. On distingue les ARNr, les ARNt, les ARNpm, les ARN m et les petits ARN de découverte récente. Chapitre 10 : la membrane plasmique Les cellules sont limitées par une membrane plasmique qui les isole plus ou moins du milieu extracellulaire. Chez les eucaryotes, il existe un réseau membranaire interne, dont la surface est supérieure à celle de la membrane plasmique, qui délimite des compartiments (noyau, RER, REL, Golgi et ses vésicules, mitochondries, chloroplastes). Les membranes biologiques sont organisées en une bicouche de lipides dont les faces hydrophiles sont tournées vers l’extérieur et les parties hydrophobes sont cachées à l’intérieur. Les principaux lipides membranaires sont les phosphoglycérides, les sphingolipides et le cholestérol. Les caractéristiques des lipides déterminent la fluidité de la membrane, c’est-à-dire la capacité des molécules qui s’y trouvent à s’y déplacer latéralement. Le cholestérol et les sphingolipides diminuent la fluidité membranaire alors que les phosphoglycérides l’augmentent. La composition chimique (longueur des chaînes, degré de saturation) des lipides membranaires et la température l’influencent. La composition lipidique globale des membranes change d’une cellule à l’autre. De plus, la répartition des lipides est asymétrique entre les deux feuillets. La sphyngomyéline et la phosphatidylcholine sont plutôt sur le feuillet externe, alors que la phosphatidylsérine, la phosphatyidilethanolamine et le phosphatydilinositol sont plutôt dans le feuillet cytosolique. Les premiers forment des feuillets moins fluides que les seconds. Le cholestérol est réparti de manière plus homogène entre les deux feuillets. Des radeaux de lipides (cholestérol + sphingolipides) forment des domaines dans le feuillet externe de la membrane. Ils contiennent des protéines impliquées dans les phénomènes de transduction de messages. Les membranes biologiques possèdent de nombreuses protéines qui leur donnent une partie de leurs spécificités fonctionnelles. Selon la nature de la liaison entre les lipides et les protéines, on distingue les protéines périphériques et les protéines intégrales. Les protéines périphériques sont associées à la membrane par des liaisons faibles avec des lipides membranaires, par des protéines intrinsèques ou par des liaisons covalentes avec certains lipides membranaires. Certaines protéines périphériques ne s’attachent à la membrane qu’en réponse à un signal extérieur, les charges positives qu’elles contiennent sont attirées par les charges négatives des groupes phosphate. La plupart des protéines intrinsèques possèdent des hélices α transmembranaires hydrophobes qui interagissent avec les parties hydrophobes de la bicouche lipidique ; les porines, en forme de tonneau ont leur canal bordé par des feuillets β. Les chaînes polypeptidiques des protéines sécrétées par exocytose, les protéines membranaires, les enzymes du RE, de l’appareil de Golgi et des vésicules qui en dérivent sont synthétisées sur des ribosomes libres qui se fixent ensuite sur la membrane du réticulum. L’apparition d’une séquence signal sur la chaîne en élongation est le signe distinctif qui permet au ribosome qui la fabrique de se fixer sur la membrane du réticulum par l’intermédiaire de la SRP et de son récepteur membranaire associé. Une fois fixé sur la membrane du réticulum, le ribosome poursuit la traduction se et la chaîne polypeptidique entre dans la lumière du RER. Il s’agit d’une translocation cotraductionnelle. Pour les protéines de la membrane du RER, il existe des séquences signal différentes qui indiquent comment elles doivent s’insérer dans la membrane du RER.

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Une fois la chaîne polypeptidique entrée dans la lumière du RER, elle est glycosylée sur certaines asparagines par le groupemement NH2 (liaison N-glycosidique) et sur le groupement OH (liaison O-glycosidique) de certaines sérines et thréonines. Un oligosaccharide ramifié à 14 résidus porté par le dolichol est greffé sur certaines asparagines, puis modifié dans le Golgi. Les oligosaccharides portés par les liaisons N-glycosidiques sont plus courts. La PDI présente dans la lumière du RER est responsable de la formation des ponts disulfure et de leurs réarrangements. De nombreuses protéines participent à la formation de la structure tertiaire et quaternaire des protéines du RER. Seules les protéines correctement repliées passent dans le Golgi pour la suite de leur maturation. Les protéines incorrectes sont retournées dans le cytosol où elles sont détruites. Dans les différents compartiments du Golgi, l’oligosaccharide ramifié porté par le dolichol qui a déjà perdu 5 résidus dans le réticulum est progressivement modifié. C’est dans le trans-Golgi que se fait l’addition de résidus osidiques par l’intermédiaire de glycosyl-transférases spécifiques. La cohérence mécanique et fonctionnelle d’un tissu dépend de la nature des contacts entre les cellules et leur environnement immédiat, la matrice extracellulaire (MEC). Dans les tissus épithéliaux, les cellules sont liées les unes aux autres et certaines d’entre elles à la MEC. Dans les tissus conjonctifs, les cellules sont liées uniquement à la MEC. Les cellules musculaires cardiaques et lisses ont des points communs avec les cellules épithéliales. Les cellules épithéliales possèdent 3 types de jonctions cellulaires : étanches, d’ancrage et communicantes. Les jonctions étanches (imperméables, serrées, tight junctions) sont typiques des épithéliums unistratifiés. Elles accolent les membranes de deux cellules adjacentes par des protéines spécifiques (claudines, occludines et Junction adhesion molecules) et contrôlent le passage des molécules entre les deux compartiments que sépare l’épithélium. Les jonctions étanches empêchent aussi le déplacement latéral des protéines membranaires ce qui maintient la spécialisation de la membrane apicale et de la membrane baso-latérale. Les jonctions d’ancrage sont des liaisons particulièrement solides qui sont développées dans les cellules soumises à des contraintes mécaniques importantes. Elles lient les cellules entre elles par l’intermédiaire des domaines extracellulaire de protéines intrinsèques les cadhérines et les CAM, qui sont elles-mêmes liées au cytosquelette par leur domaine cytosolique. Les cadhérines des jonctions adhérentes sont liées à l’actine (filaments fins) et celles des desmosomes à de la kératine (filaments intermédiaires). Les jonctions communicantes laissent passer de petites molécules et des ions de cellule à cellule. Chaque cellule de la jonction possède 6 connexines disposées en hexamère qui forme un connexon dont le centre est traversé par un canal de 2 nm. Un connexon d’une cellule qui fait face à un connexon d’une autre cellule constitue une jonction communicante. Les hémidesmosomes et les différentes formes d’adhérence cellulaire entre les cellules et la matrice extracellulaire comptent une autre catégorie de protéines transmembranaires, les intégrines. Par leur domaine extracellulaire, elles se fixent à différentes protéines de la MEC (interactions hétérophiles), par leur domaine intracellulaire, elles se lient et des protéines de liaisons qui s’attachent solidement aux filaments d’actine. Les changements d’adhérence cellulaire entre les cellules d’un même tissu ou d’un tissu avec la MEC sont à la base du développement embryonnaire. Les cellules embryonnaires sont liées entre elles par des interactions homophiles entre cadhérines ou CAM identiques. Si une cellule n’exprime plus la même CAM, elle se sépare alors de ses voisines et s’engage dans une nouvelle voie de développement. Chapitre 11 : Les matrices extracellulaires animales et végétales : organisation et rôles Les organes des animaux bougent. Les tissus qui les constituent sont soumis à des forces et à des changements de formes. Certains tissus animaux ont une matrice extracellulaire abondante (tendons, ligaments, tissus conjonctifs, os, cartilages) qui supporte les déformations mécaniques.

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Dans les tissus qui produisent peu de MEC (tissus épithéliaux, tissus musculaires), les cellules sont liées les unes aux autres par des jonctions cellulaires spécialisées. La tension mécanique est transmise au cytosquelette (actine, kératine) par les protéines transmembranaires. La matrice extracellulaire animale est un maillage de protéines et de glucides qui lient les cellules entre elles mais aussi intervient sur leur forme, leur place, leur activité métabolique, leur différenciation. Dans les tissus conjonctifs, le volume de la MEC est très supérieur à celui des cellules. Les principales protéines de la matrice sont les collagènes, l’élastine, la laminine et la fibronectine qui baignent dans un gel hydraté formé principalement de glycosaminoglycanes. Les différentes isoformes de ces molécules matricielles et leur proportion relative déterminent les caractéristiques mécaniques des matrices. Le collagène fibrillaire est synthétisé en plusieurs étapes dans les fibroblastes. Des chaînes pro-α sont produites dans le RER, certaines prolines et lysines sont hydroxylées, puis des hydroxylysines sont glycosylées. Trois chaînes pro-α sont associées en triple hélice stabilisées par les liaisons hydrogène interchaînes. Les propeptides terminaux sont liés par des ponts disulfures. Les triple hélices avec leurs propeptides terminaux constituent le procollagène qui finit sa maturation dans les différents compartiments du Golgi. Les molécules de procollagène sont sécrétées et les peptides terminaux sont clivés. Les molécules de collagène s’auto-assemblent et se lient par des liaisons covalentes les unes aux autres, elles forment des fibrilles, puis des fibres. Chaque molécule de collagène I mesure 300 nm de longueur et 1,5 nm de diamètre. Les molécules se placent côte à côte avec un décalage de 64-67 nm. Ce décalage est à l’origine de l’aspect strié si caractéristique de cette molécule. Les molécules de collagène se lient entre elles par des liaisons covalentes qui s’établissent entre les lysines qui ont acquis une fonction aldéhyde (ce type des liaisons covalentes apparaît aussi au sein des triples hélices). Ces liaisons covalentes situées aux extrémités non torsadées des molécules de collagène assurent la résistance à l’étirement de la fibrille de collagène dont le diamètre atteint entre 10 et 300 nm. Ces fibrilles se groupent à leur tour, par des liaisons covalentes, en fibres de 0,5 à 3 µm de diamètre. L’élastine est une protéine hydrophobe qui donne aux tissus leur élasticité. Mélangée au collagène, son étirement est limité. La proportion de ces deux molécules aux propriétés mécaniques opposées confère aux tissus sa capacité à s’étirer et à reprendre sa taille initiale. La fibronectine est un dimère dont les molécules s’associent en fibrilles et en réseau. Elles possèdent de nombreux sites de fixation à des molécules de la matrice (collagène, fibronectine, GAG) mais aussi aux intégrines des cellules. La fibronectine attache les cellules à la MEC. La laminine est une protéine qui possède de nombreux sites de liaisons avec des molécules de la MEC (collagènes…) et des intégrines et lipides membranaires. Elle est plus abondante dans les lames basales des épithéliums qu’elle contribue à organiser. Les protéoglycanes constituent de gigantesques assemblages de glycoaminoglycanes reliés par des protéines. Les GAG sont des polymères de dimères comme l’acide hyaluronique (DP jusqu’à 25 000) qui atteint plusieurs micromètres de longueur. Le dermatane, le kératane, la chondroïtine et l’héparane sont des polymères d’unités disaccharidiques sulfatés. Ces GAG s’associent par dizaines voire centaines à des protéines formant ainsi des aggrécanes. Des dizaines de ces aggrécanes se fixent sur une très longue molécule d’acide hyaluronique et constituent un gigantesque protéoglycane qui a la taille d’une bactérie. Les protéoglycanes fixent de nombreuses molécules d’eau et des cations. Ils forment des gels hydratés qui remplissent l’espace entre les protéines de la MEC. D’un point de vue mécanique, ils s’opposent à la compression (charges négatives se repoussant et forte hydratation).

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Les protéoglycanes fixent de nombreux messagers, agissent comme co-récepteurs à la surface des cellules, régulent la sécrétion de certaines protéines. Des protéoglycanes comme le perlécane des lames basales se lient à d’autres molécules de la MEC et aux intégrines. Les tissus végétaux sont plus ou moins rigides, leurs cellules sont entourées par une paroi cellulaire dont l’ensemble constitue la matrice extracellulaire végétale. À la limite entre les deux parois se trouve la lamelle moyenne très riche en pectines et en enzymes. La paroi primaire est constituée par des microfibrilles de cellulose à disposition en contreplaqué noyées dans une matrice de pectine, d’hémicelluloses et de protéines. Elle est capable de croissance en longueur et se rencontre autour des cellules des tissus en croissance. Les hémicelluloses assurent, par des liaisons hydrogène, la cohésion des microfibrilles de cellulose. Les pectines fortement négatives et hydratées remplissent les espaces à la manière des GAG. En présence de Ca2+ et d’autres cations, elles se lient (structure dite en boîte à œufs) entre elles et forment un gel semi-rigide. Chez certaines cellules des tissus de soutien ou soumis à des contraintes importantes, il existe une paroi secondaire qui se dépose entre la membrane plasmique et la paroi primaire quand celle-ci à terminer sa croissance en longueur. La paroi secondaire est formée de 3 couches où les microfibrilles de cellulose sont parallèles et à disposition en contreplaqué. Les parois secondaires et parfois primaires peuvent être imprégnées par de la lignine qui remplace la pectine et se lient par des liaisons covalentes à la cellulose. La lignine a permis aux végétaux d’acquérir une grande taille en milieu aérien. Les protéines ne comptent que 5% de la masse sèche de la paroi. Les enzymes et les protéines structurales sont les deux catégories les plus importantes. Les enzymes participent au remodelage permanent de la paroi. Les glycoprotéines de structure comme l’HRGP relient les microfibrilles de cellulose entre elles. Ces changements de configuration sous l’effet de l’auxine briseraient les liaisons au sein de la paroi et favoriseraient l’élongation sous l’effet de la pression de turgescence. Deux processus différents participent à la formation de la MEC. Les microfibrilles de cellulose sont synthétisées par des celluloses synthases qui se déplacent dans l’épaisseur de la membrane plasmique entre des rails de microtubules. L’appareil de Golgi secrètent des vésicules qui contiennent les hémicelluloses, les pectines et les protéines qui se lient aux microfibrilles de cellulose une fois sécrétées dans la paroi. Chapitre 12 : Echanges transmembranaires Par sa composition lipidique, la membrane plasmique est très imperméable à la plupart des molécules polaires. À l’exception de quelques petites molécules et des petites molécules non-polaires, la plupart des substances ne diffusent pas au travers d’une bicouche lipidique. Il existe trois catégories de protéines transmembranaires qui assurent le passage d’ions, d’eau, et de petits métabolites : les canaux, les transporteurs et les pompes ATP-dépendantes. Selon les modalités de passage, on distingue : – la diffusion simple ou les substances se dissolvent directement dans les lipides ; – la diffusion facilitée où les ions et les molécules passent par des protéines transmembranaires. Selon la source d’énergie utilisée, on distingue : – les transports actifs primaires qui utilisent l’hydrolyse d’ATP pour passer une substance contre son gradient de concentration ; – les transports actifs secondaires ou cotransports (symports, antiports) dans lesquels la substance est déplacée contre son gradient de concentration grâce à la diffusion d’une autre substance dans le sens de son gradient ; Une différence de concentration ionique représente une source d’énergie avec une composante reflétant la concentration (= composante chimique) et une composante représentant une différence de potentiel électrique (composante électrique). Le passage d’ions dans le sens du gradient électrochimique libère de l’énergie utilisable pour un transport contre le gradient d’une autre substance.

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Toutes les cellules animales présentent une différence de potentiel transmembranaire (- 50 à – 70 mV) reflétant la différence de perméabilité à différents ions et plus particulièrement au Na+ et au K+. La membrane plasmique possède des canaux de fuite au K+ qui sont ouverts en permanence. Ils présentent un filtre de sélectivité qui empêche les autres ions de passer au travers. Cette différence de potentiel, avec la face cytosolique négative, est maintenue sur le long terme par des pompes K+/Na+ ATP-dépendante. Seules les cellules excitables (cellules musculaires, neurones) propagent une différence de potentiel née sur leur membrane. Dans les cellules végétales la différence de potentiel électrique (- 100 à – 200 mV) et surtout maintenue par une pompe ATP-dépendante qui expulse des protons à l’extérieur de la cellule. Les porines sont des canaux en feuillets β ouverts en permanence. Elles laissent passer de l’eau (aquaporine) ou de l’eau et des substances dissoutes chez les bactéries, chloroplastes et mitochondries. Les perméases ou transporteurs sont des protéines transmembranaires qui fixent un substrat spécifique d’un côté de la membrane et le transporte de l’autre côté. Ces transporteurs alternent entre deux états, l’un avec le site exposé d’un côté, l’autre avec le site exposé de l’autre côté. La cinétique de diffusion est comparable à celle d’un enzyme michaélien. Les différents transporteurs au glucose possèdent des Km différents. Les cotransporteurs utilisent l’énergie d’un gradient de H+ ou de Na+ pour transporter des substances contre leur gradient. De nombreux exemples illustrent les mécanismes et l’importance de cette forme de transport. Le symporteur Na+/glucose importe le glucose issu de la digestion dans les entérocytes contre son gradient de concentration. Dans le myocyte cardiaque, l’antiporteur Na+/Ca2+ éjecte 2 Ca2+ contre son gradient en échange de 3 Na+ qui diffusent du milieu extracellulaire. Dans les cellules végétales, l’entrée de saccharose, de Ca2+ ; de Na+ dans la vacuole où ils sont stockés est couplée par des antiporteur à un gradient de protons généré et maintenu par des pompes à protons ATP-dépendantes. Il existe d’autres types canaux ioniques dont l’ouverture est régulée soit par la fixation d’un ligand (canaux ligand-dépendants), soit par un changement du potentiel de membrane (canaux voltage-dépendants). Dans les deux cas, ces canaux en changeant de conformation s’ouvrent et laissent passer les ions dans le sens de leur gradient électrochimique. Chapitre 13 : Endocytose et exocytose En fonction de la nature des substances internalisées, on distingue plusieurs types d’endocytose : – la pinocytose est non-spécifique, elle prélève un petit volume de liquide du milieu extracellulaire ; – l’endocytose par récepteurs interposés est spécifique de certaines molécules ou agrégats moléculaires ; – la phagocytose est non-spécifique mais aussi intervenir des récepteurs de faibles affinités et internalise des cellules ou des particules de grande taille selon des modalités différentes des autres formes. La pinocytose est constitutive, c’est-à-dire que des petites vésicules membranaires se forment en permanence indépendamment de tous facteurs déclenchants. Certaines cellules renouvellent ainsi en permanence leur membrane plasmique. Les vésicules d’endocytose fusionnent ensuite avec des lysosomes. L’endocytose par récepteurs interposés est déclenchée quand un ligand (LDL, ferrotransferrine, complexe antigène-anticorps) se fixe à son récepteur qui change alors de conformation. Il est alors piégé dans un puits tapissé de clathrine qui déclenche la formation de la vésicule d’endocytose. Le mécanisme de formation de la vésicule (pinocytose ou endocytose) repose sur l’existence de puits tapissé. Ces puits sont des petits creux de la membrane qui contiennent les récepteurs transmembranaires dont le côté cytosolique est lié à une protéine spécifique, l’adaptine, elle-même liée à des molécules de clathrine. La polymérisation progressive des triskélions de clathrine des puits tapissés impose à la membrane une courbure de plus en plus prononcée qui conduit à la formation d’une vésicule retenue simplement par le cou. La séparation de la vésicule de la membrane d’origine se fait par l’intervention de la dynamine.

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La vésicule tapissée perd alors son revêtement de clathrine et d’adaptine et devient un endosome précoce qui fusionne avec une autre vésicule à pH acide, l’endosome tardif. Dans le cas du récepteur à LDL, le pH acide de l’endosome tardif entraîne un changement de conformation du récepteur à LDL qui libère la particule. L’endosome tardif se coupe. La partie qui contient les récepteurs, repart vers la membrane plasmique avec laquelle elle fusionne, le pH neutre du milieu extracellulaire lui redonne sa conformation à forte affinité. L’autre partie de l’endosome tardif fusionne avec un lysosome, l’activité enzymatique y conduit à la libération du cholestérol, des acides gras et des acides aminés. Le trafic vésiculaire est une caractéristique de la cellule eucaryote. La membrane plasmique est sans cesse renouvelée par les processus d’endocytose et d’exocytose. Les vésicules issues de l’endocytose fusionnent avec des vésicules issues du Golgi. Le RER bourgeonne des vésicules qui fusionnent avec le Golgi. Les différentes citernes du Golgi produisent à leur tour des vésicules dont certaines fusionnent avec la membrane plasmique, d’autres donnent les lysosomes ou d’autres compartiments. Il existe trois sortes de vésicules qui se différencient par la nature des protéines qui les recouvrent et les parcours qu’elles effectuent. Les vésicules de clathrine, les vésicules COPI et les vésicules CPII. Toutes ces vésicules sont formées à partir d’une membrane préexistante qui se détachent à la suite de la polymérisation d’une cage constituée de protéine cytosolique (clathrine ou coatmères de COPI ou COPII). Les vésicules à clathrine sont responsables de la formation des vésicules d’endocytose et du bourgeonnement de vésicule à partir du du trans-Golgi. Les vésicules COPII assurent le transport des vésicules formées par bourgeonnement du RER ; les vésicules COPI sont responsables du transport de vésicules dans le sens rétrograde (du trans-Golgi au réticulum golgien, et vers le RER). Les vésicules se déplacent le long des microtubules par l’intermédiaire de moteurs moléculaires (dynéine, kinésine). L’accrochage de la bonne vésicule avec la bonne membrane nécessite l’intervention de protéines de reconnaissance, les SNARE. Il existe une SNAREv sur la vésicule qui est complémentaire d’une SNAREt portée par la membrane cible. Ch. 14. Principes de la thermodynamique appliqués aux êtres vivants Les cellules sont des systèmes thermodynamiques ouverts qui échangent de la matière et de l’énergie avec leur environnement. En utilisant de la matière organique, de la matière minérale, de l’énergie et de l’information, ils maintiennent en leur sein un état organisé. Cet état structuré nécessite le déroulement en permanence de réactions chimiques. Les enzymes sont des catalyseurs biologiques spécifiques qui augmentent les vitesses de réaction, mais n’en modifient pas l’équilibre. Ils permettent aux réactions biochimiques de se dérouler en fonction des besoins de la cellule. Ces réactions obéissent aux lois de la thermodynamique. Les réactions biochimiques se caractérisent par des variables d’état au nombre de trois : – l’enthalpie du système (H), c’est-à-dire la quantité totale d’énergie que contient le système ; – l’enthalpie libre (G) correspond à la part de l’enthalpie H utilisable pour réaliser un travail ; – l’entropie (S) qui est une mesure du désordre. La première loi de la thermodynamique stipule que la quantité d’énergie dans l’Univers est constante, elle est ni détruite, ni créée, mais simplement transformée. Cette première loi ne conditionne pas la spontanéité d’une réaction. Une réaction enzymatique est spontanée si elle évolue sans apport énergétique supplémentaire fournit par le milieu si ce n’est l’énergie d’activation qui est nécessaire à l’amorcer. Par exemple, la combustion d’un liquide inflammable libère plus d’énergie ∆H que la chaleur apportée par l’allumette qui l’a enflammé.

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La seconde loi de la thermodynamique stipule que dans les toutes les réactions spontanées, l’entropie S de l’Univers augmente. L’entropie se mesure en joules.K–1, elle quantifie le désordre, le hasard statistique et la vitesse des molécules. La tendance de l’entropie de l’Univers à s’accroître est une des forces qui pousse les systèmes vers leur équilibre thermodynamique. Un être vivant crée de l’ordre dans ses structures, c’est-à-dire qu’il y diminue l’entropie. En ne considérant que l’être vivant, on pourrait penser que les êtres vivants violent le second principe de la thermodynamique. Il n’en est rien. En ordonnant ses structures, il utilise de l’énergie dont les sous-produits (CO2, H2O et chaleur) augmentent de manière plus importante l’entropie dans l’environnement. La spontanéité d’une réaction dépend donc de l’importance relative du changement d’entropie entre le système et son environnement associé à l’absorption ou à la libération de chaleur au cours de la réaction. On définit l’enthalpie libre ∆G d’une réaction en combinant ces deux contributions : ∆G = ∆H – T∆S. La variation d’enthalpie libre est la part de l’énergie ∆H qui est transformable en travail. Ainsi, un ∆H suffisamment négatif (forte libération de chaleur) contrebalance la diminution d’entropie dans le système et rend la réaction spontanée. Une réaction biochimique qui se déroule conduit à un état d’équilibre qui se caractérise par une constante Kéq. L’équilibre est atteint quand les quantités de substrats et de produits ne changent plus. Dans une réaction spontanée, le système (substrats) qui se réorganise libère de la chaleur dans le milieu tant que la réaction progresse. À la fin de la réaction, c’est-à-dire quand les concentrations en produits et en substrats n’évoluent plus, il n’y a plus d’énergie qui est libérée, ∆G de la réaction = 0. Certaines réactions se déroulent spontanément. Une molécule se transforme en une autre d’enthalpie libre (G) plus faible (∆G < 0). Cette transformation ne nécessite pas d’énergie du milieu extérieur, elle est dite exergonique ; il y a au contraire libération d’énergie dans le milieu extérieur au cours de la réaction. D’autres réactions ne se produisent pas spontanément, elles ont besoin que le milieu leur fournisse en permanence de l’énergie, pour qu’une molécule se transforme en une autre. Ces réactions sont endergoniques (∆G > 0). Dans les cellules, les conditions standard ne sont pas satisfaites, les concentrations en substrats et en produits de la réaction ne sont pas égales à une mole par litre. Ainsi, l’enthalpie libre d’une réaction en conditions biologiques dépend des caractéristiques chimiques des molécules (∆G°’) mais aussi de leurs concentrations réelles soit : RTln [C] [D] [A] [B] ∆G réaction = ∆G°’ + RTln [C] [D] [A] [B] À l’équilibre, dans les conditions standard, quand les concentrations des substrats et des produits de la réaction n’évoluent plus, ∆G réaction = 0. Le signe de ∆G°’ indique le sens de la réaction. À l’équilibre dans les conditions cellulaires, la réaction enzymatique se déroule si la variation d’enthalpie libre de la réaction est négative. Le facteur fondamental qui la contrôle est le rapport entre les concentrations des produits à celles des substrats (Kéq). Plus les concentrations en produits de la réaction sont faibles par rapport à celles des substrats, plus la constante d’équilibre contribue à rendre cette réaction spontanée. C’est donc ∆G qui sert à prédire la spontanéité d’une réaction et non pas ∆G°’. Le contrôle de ce rapport par la cellule est un puissant moyen de régulation du métabolisme. Chapitre 15 : catalyse enzymatique Les enzymes sont des protéines qui catalysent la plupart des réactions biochimiques dans l’organisme. Ces molécules sont très spécifiques et ne reconnaissent qu’un ou qu’un très faible nombre de substrats. Elles augmentent considérablement la vitesse d’une récation biochimique thermodynamiquement possible. Les enzymes michaéliens se caractérisent par trois constantes Vmax, Km et Kcat ainsi que par une cinétique hyperbolique. Vmax est la vitesse maximale de la réaction , elle n’augmente plus même si la concentration en substrat s’élève. Km est la concentration en substrat pour laquelle Vo, la vitesse initiale est ½ Vmax : Vo = Vmax [S].

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Km + S On appelle Kcat une constante dont l’unité est l’inverse d’un temps, c’est le turnover ou nombre de molécules de substrats transformées par molécule d’enzyme et par unité de temps. Une réaction enzymatique se déroule jusqu’à un équilibre qui correspond au moment où les concentrations en substrats et en produits n’évoluent plus. L’équilibre représente la différence d’enthalpie libre entre les produits et les substrats. En conditions standard, la réaction spontanée se déroule que parce que le ∆G°’ des produits est inférieur à celui des substrats. La vitesse d’une réaction spontanée dépend de l’importance de la barrière énergétique que les substrat doivent atteindre pour réagir. Pour qu’une réaction ait lieu, il faut que cette barrière soit franchie, autrement dit que le substrat gagne de l’énergie. Dans une réaction chimique, les molécules obtiennent cette énergie par la chaleur du milieu. Quand elles sont à leur état énergétique maximale, elles ont atteint l’état de transition. Cette énergie correspond à l’énergie d’activation. Plus la quantité d’énergie pour atteindre l’état de transition est importante, plus la réaction est lente. Dans le milieu intracellulaire, les substrats se déplacent plus vite que les enzymes. Quand un substrat rencontre un enzyme, il se fixe dans le site actif de l’enzyme par des liaisons faibles, c’est la formation du complexe enzyme-substrat. Ce contact entraîne une modification de la forme de l’enzyme (ajustement induit) mais aussi entraîne une déformation du substrat qui lui fait atteindre l’état de transition. Cette fixation persiste tant que l’énergie de liaison, qui maintient le substrat sur l’enzyme, est supérieure à l’énergie thermique de l’environnement. L’enzyme abaisse l’énergie d’activation de la réaction et conduit le substrat à l’état de transition. Cette diminution de l’energie d’activation nécessaire s’explique par les caractéristiques du complexe enzyme-substrat. La fixation des substrats sur l’enzyme entraîne leur désolvatation, leur immobilisation, le positionnement correct des groupes réactionnels, la déformation des orbitales électroniques. Ainsi, l’enzyme place les substrats dans la meilleure position pour réagir. De plus, l’enzyme, en établissant des liaisons faibles leur fournit l’énergie néssessaire pour atteindre l’état de transition. Les enzymes michaéliennes se caractérisent par leur cinétique hyperbolique et par leur capacité à catalyser une réaction dans les deux sens S ↔ P. Pour qu’une réaction ait lieu spontanément, il faut que le ∆G de la réaction soit négatif, autrement dit qu’elle s’accompagne d’un dégagement d’enthalpie libre. Dans les cellules, les conditions physiologiques modifient en permanence les concentrations en substrats et en produits et donc la valeur de la constante d’équilibre qui contribue à conditionner le sens de la réaction. Plus les produits sont abondants par rapport aux substrats, plus la contribution de Kéq est grande et permet de surmonter une différence d’enthalpie libre entre ces deux molécules. Les enzymes régulateurs sont des enzymes dont l’affinité pour le substrat varie en fonction de la liaison avec une molécule appelée effecteur. L’activité d’un enzyme est contrôlée par 4 types de mécanismes dont les trois premiers sont réversibles : – les enzymes allostériques sont contrôlés par la liaison, noncovalente, d’un métabolite régulateur, le modulateur dont la fixation entraîne un changement conformationnel qui soit augmente, soit diminue l’affinité de l’enzyme pour le substrat ; – certains enzymes sont contrôlés par la fixation covalente d’un groupement phosporyle qui l’active ou l’inhibe ; – d’autres enzymes sont contrôlés par la fixation non covalente d’une protéine régulatrice (calmoduline), qui est elle-même activée par la fixation de Ca2+ ; – certains enzymes sont activés par une coupure protéolytique irréversible. À ces modes de régulations s’ajoutent les changements de conformations liés à des changements de pH ou de température qui modifient également l’affinité de l’enzyme pour le susbstrat. Les enzymes allostériques possèdent une cinétique de type sigmoïde ; ce sont des enzymes à structure quaternaire. Ces enzymes possèdent un ou plusieurs sites allostériques différents du site de fixation du substrat. Les enzymes dont le substrat et le modulateur sont identiques sont dits homotropes, ceux pour qui ils sont différents sont dits hétérotropes. Certaines molécules modifient la cinétique enzymatique sans pour autant être des modulateurs. Les inhibiteurs compétitifs sont en compétition avec le susbtrat pour le site actif de l’enzyme, leur présence se traduit par une

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augmentation du Km et aucun effet sur la Vmax. L’inhibiteur compétitif est d’autant plus efficace qu’il ressemble au substrat et qu’il établit de nombreuses liaisons avec l’enzyme. Les inhibiteurs non compétitifs se lient à un autre site que le site actif ; ils le déforment ce qui empêche la liaison du substrat. Leur présence réduisent le nombre d’enzymes fonctionnels et donc diminue la Vmax, mais pas le Km. Les enzymes sont codés par des gènes et un individu hétérozygote à un locus donné posède deux allèles différents qui codent deux enzymes légérement différents en terme de séquences et donc de propriétés cinétiques, ce sont les allozymes. Ils assurent, dans la même cellule, la même fonction. Des cellules différentes expriment des enzymes de séquences très proches, qui ont la même fonction mais des propriétés différentes, ils sont codés par des gènes différents (non allèles), ce sont des isozymes. Ces isozymes, présents dans des cellules différentes sont aussi produits par épissage différentiel. Chapitre 16 : structure générale du catabolisme et rôles des coenzymes Les cellules utilisent de l’énergie prélévée dans le milieu extérieur pour maintenir leur état ordonné, assurer leur croissance et leur reproduction. Cette énergie est soit d’origine physique (lumière), soit d’origine chimique ; elle est alors contenue dans des molécules minérales ou organiques plus ou moins réduites. L’entretien et la construction de la cellule nécessite l’utilisation de matière qui est soit minérale, soit organique. La combinaison entre les différentes sources d’énergie et les différentes sources de molécules conduit à 6 types trophiques. Le catabolisme du glucose conduit à la fabrication d’ATP, de transporteurs réduits et de pyruvate dans le hyaloplasme, c’est la glycolyse. Elle est la voie commune à tous les êtres vivants. En conditions anaérobies, le pyruvate réoxyde les transporteurs réduits avec formation de lactate (fermentation lactique). En conditions aérobie, le pyruvate, après décarboxylation oxydative et déhydrogénation, entre dans le cycle de Krebs sous forme d’acétyl-CoA. L’acétyl-CoA est un métabolite qui est aussi formé lors de l’oxydation des acides gras et des acides aminés. L’oxydation des acides aminés se fait par transamination qui conduit à du pyruvate qui suit alors la même voie que celui issus de la glycolyse. L’oxydation complète du radical acétyl par déhydrogénations et décarboxylations oxydatives successives produit de nouveaux transporteurs réduits et un peu d’ATP par phosphorylation liée au substrat. En conditions aérobies, les transporteurs réduits (NADH, FADH2) au cours des étapes précédentes sont réoxydés dans la chaîne respiratoire de la membrane interne des mitochondries. Cette réoxydation libère de l’énergie (énergie d’oxydation) qui permet de transloquer des protons dans l’espace intermembranaire. La variation d’énergie libre en conditions standard (∆G°’ = − n F∆E°’) est liée au transfert d’électron d’une molécule réduite à une molécule oxydée appartenant à deux couples rédox. Ce gradient de protons représente une source d’enthalpie libre qui est utilisée par l’ATP synthase pour la synthèse endergonique de l’ATP, à partir d’ADP et de Pi. Le dioxygène récupère les électrons arrachés par les différents transporteurs de la chaîne aux coenzymes réduits ainsi que les protons que l’oxydation a libéré, il y a alors formation d’eau. Ce processus de fabrication de l’ATP par catalyse rotationnelle est une phosphorylation oxydative ou respiration. Chapitre 17 : la photosynthèse eucaryote Les hétérotrophes au carbone oxydent du glucose ou d’autres nutriments qu’ils ont directement pérélevés dans le milieu extérieur. Ils dépendent donc de matière organique préexistante. En revanche, les autotrophes au carbone fabriquent leurs propres matières organiques à partir de matière minérale et d’énergie solaire, ils sont phototrophes. L’énergie solaire est convertie en énergie chimique (ATP) et en pouvoir réducteur (NADPH) dans les thylacoïdes des chloroplastes éclairés. L’ensemble de ces réactions constituent les étapes photochimiques de la photosynthèse. En présence de ces deux composés, les enzymes du stroma du chloroplaste assurent la fixation du CO2, sa réduction et la phosphorylation des molécules ainsi formées, c’est le cycle de Calvin qui conduit à la formation de matière organique au cours de réactions dites non photochimiques.

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La matière organique ainsi formée est véhiculée dans la plante sous forme de saccharose. Les différentes cellules le polymérisent (amidon, celluose) ou l’oxydent (glycolyse, cycle de Krebs). Cette oxydation conduit à la formation d’ATP. La fabrication d’ATP en permaence est une condition nécessaire à la vie. L’hydrolyse spontanée (exergonique) de cette molécule libère une grande quantité d’enthalpie libre qui est utilisée par la cellule pour réaliser toutes ces réactions endergoniques. Le couplage d’une réaction exergonique avec une réaction endergonique correspond, d’un point de vue thermodynamique, à une seule réaction où ∆G < 0. La cellule utilise trois types de couplage : le couplage chimio-osmotique (hydrolyse d’ATP pour transférer un soluté contre son gradient de concentration), un couplage osmo-osmotique (libération d’énergie par un gradient électrochimique qui permet le passage d’un soluté contre son gradient) et un couplage osmochimique (libération d’énergie par un gradient électrochimique qui permet à une réaction endergonique de se dérouler). La photosynthèse consiste en la formation de matière organique (glucose) à partir de matière minérale (H2O, CO2) et d’énergie solaire. Deux ensembles de réactions sont nécessaires pour assurer cette fabrication de matière organique, c’est-à-dire de carbone réduit. Le premier ensemble, qui comprend 3 étapes, correspond à la fabrication d’ATP et de pouvoir réducteur ; le second utilise ces molécules pour intégrer et réduire le dioxyde de carbone. Dans une première étape, l’énergie solaire est captée par des pigments de la membrane du thylacoïde absorbants différentes longueurs d’onde Cette énergie est transférée par résonance à des chlorophylles a appartenant à un ensemble moléculaire, le photosystème II. Les chlorophylles a excitées perdent chacune un électron au profit d’une quinone. Les chlorophylles oxydées oxydent l’eau et compensent ainsi les électrons perdus. La phodissociation de l’eau conduit à la libération de dioxygène. Dans une deuxième étape, les électrons captés par les quinones sont transférés selon le sens des potentiels croissants (du plus négatif vers le plus positif) jusqu’à un accepteur final, le NADP+ qui devient alors réduit en NADPH. Au cours de ce transport, les électrons perdent progressivement de l’énergie (ils en regagnent dans le photosystème I) qui est utilisée pour transloquer des protons dans la lumière du thylacoïde. Ce transfert est à l’origine d’une force proton-motrice. Dans une troisième étape, les protons regagnent le stroma en se déplaçant dans le sens de leur gradient électrochimique. Ils passent au travers des sphères pédonculées et font tourner le rotor ce qui entraîne un changement de conformation des sites de l’ATP synthase. Ces changements de conformation sont associés à la synthèse endergonique et à la libération de l’ATP (catalyse rotationnelle). Au cours de l’étape non photochimique, le CO2 est fixé par la rubisco sur le rudi-P. Il y a alors formation de deux trioses (phosphoglycérate). La photosynthèse est dite en C3. Ces oses sont ensuite phosphorylés par l’ATP produit par catalyse rotationnelle, puis réduits et déphosphorylés en glycéraldéhyde 3-phosphate. Une de ces molécules participe à la régénération du rudi-P, l’autre sert à la formation d’une nouvelle molécule de glucose. Il faut l’intégration de 6 molécules de CO2 dans le cycle de Calvin pour avoir un gain d’une molécule de glucose. Chez les plantes en C3, une partie de la matière organique est oxydée par la rubisco qui, en présence de dioxygène et de faibles quantités de CO2, différencie mal ces deux molécules. Il y a alors consommation de dioxygène et libération de CO2, c’est la photorespiration. Chez les plantes en C4, il existe une différenciation tissulaires dans les feuilles. Les cellules de la couronne fixent le CO2 (en fait HCO3

−) sur le phosphoénol pyruvate (PEP) (C3) par l’intermédiaire d’un enzyme, la PEP-carboxylase, il y a production de malate (C4). Le malate arrive dans les cellules du mésophylle où il est décarboxylé dans le hyaloplasme. Le CO2 passe dans les stromas des chloroplastes où il est intégré dans le cycle de Benson par la rubisco. Le cycle se poursuit alors comme dans les plantes en C3. Les plantes en C4 possèdent un avantage adaptatif sur les plantes en C3 dans les régions arides. Elles fixent le CO2 même à très faibles concentrations quand les stomates sont fermés. Cette fermeture limite la perte d’eau par transpiration. Chapitre 18 : le catabolisme oxydatif

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La cellule produit de l’ATP en oxydant essentiellement du glucose et des acides gras. Dans le hyaloplasme, la glycolyse conduit en dix étapes à la production de 2 ATP patr phosphorylation liée au substrat, deux transporteurs réduits (NADH) et un déchet le pyruvate. La glycolyse est la voie primitive de production d’ATP présente dans toutes les cellules, eucaryotes et procaryotes, en condition aérobie ou anaérobie. Dans des conditions anaérobies, certaines cellules se servent du pyruvate pour réoxyder les transporteurs réduits dans la glycolyse. Le pyruvate est alors un accepteur interne d’électrons et de protons. Il y a production de lactate au cours de ce processus (fermentation lactique) ou d’éthanol si, au préalable, il y a eu une décarboxylation oxydative (fermentation alcoolique des levures). La membrane externe des mitochondries est perméable à de nombreux métabolites. En présence de dioxygène, le pyruvate passe dans la matrice mitochondriale où il est décarboxylé et réduit en acéyl-CoA par le complexe de la pyruvate déshydrogénase. L’acétyl-CoA se condense avec l’oxaloacétate et forme du citrate, molécule à 6 carbones, qui est décarboxylée, déshydrogénée et hydratée. Ces réactions régénèrent l’oxaloacétate, elles s’accompagnent de la réduction de coenzymes et de la synthèse d’ATP par phosphorylation liée au substrat. Les transporteurs (coenzymes) réduits contiennent de l’énergie sous forme d’électrons à haut potentiel réducteur. Ces électrons voyagent dans la membrane interne de la mitochondrie et passent successivement de molécules réduites à des molécules oxydés. Le passage se fait dans le sens des potentiels redox croissants. L’énergie libérée au cours de ces transferts est à l’origine d’une translocation de protons dans l’espace intermembranaire. Cette différence de concentration est à l’origine d’une force proton-motrice qui, par l’intermédiaire de l’ATP synthase, est à l’origine de la synthèse d’ATP par phosphorylation oxydative. Ce processus de fabrication de l’ATP correspond à la respiration cellulaire. Les acides gras sont oxydés dans la matrice mitochondriale. Leur oxydation conduit à la formation de transporteurs réduits et de plusieurs molécules d’acétyl-CoA qui entrent dans le cycle de Krebs (hélice de Lynen). Tous ces transporteurs produits directement ou indirectement sont réoxydés par les chaînes mitochondriales et conduisent à la synthèse d’ATP. Dans les cellules eucaryotes, les acides gras à très longues chaînes (> 20 C) ne sont pas oxydés dans les mitochondries, mais dans les peroxysomes. Faute de chaînes respiratoires, la réoxydation des transporeturs ne conduit pas à la synthèse d’ATP, mais l’énergie est libérée sous forme de chaleur. La production d’ATP dans la cellule est contrôlée par l’inhibition et l’activation de plusieurs enzymes de la glycolyse et du cycle de Krebs. La PFK-1 est un enzyme clé dans cette régulation. De fortes concentrations d’ATP et de citrate l’inhibent ce qui diminue le nombre de molécules de fructose 6-phosphate qui entre dans la glycolyse et donc la quantité d’ATP produite. Chapitre 19 : Gène, un brève historique La génétique mendélienne et sa prolongation par l’établissement des cartes factorielles chez la drosophile a fait du gène une unité abstraite portée par les chromosomes qui servait à prédire les phénotypes et les proportions de chaque catégorie d’individus de la descendance. Par ailleurs, cette approche expérimentale a précisé l’existence de certains gènes et leur localisation quand ceux-ci n’étaient pas encore connus. Ainsi chaque gène était responsable de l’établissement d’un caractère et, en fonction de l’allèle de ce gène, le caractère s’exprimait différemment dans le phénotype. Avec les expériences de Beadle et Tatum, le caractère phénotypique possède un support biochimique, les enzymes. Dans les années Quantante gène devient alors une partie du chromosome qui code une protéine spécifique dont le fonctionnement cellulaire est responsable du phénotype observé. Avec la découverte de la structure de l’ADN et la démonstration que cette molécule est le support de l’hérédité, le gène devient dans les années Soixante une séquence, d’ADN qui code une protéine ou, d’une manière plus générale, un ARN (ARNm, ARNt, ARNr pour ne citer que les catégories d’ARN connue à l’époque). Le gène représente une unité de fonction (codage d’un ARN), une unité de mutation (plusieurs allèles existent pour certains gènes) et une unité de recombinaison (réassociation d’allèles de gènes différents issus des deux parents au cours de la méiose). Selon François Jacob, les gènes sont « les atomes de l’hérédité ».

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Cette vision du gène qui conciliait les résultats des expériences de croisements avec les données moléculaires disponibles à l’époque sur la synthèse des protéines a prévalu jusqu’à la fin des années Soixante-dix. Le gène codait le plus souvent un ARNm dont la traduction donnait une chaîne polypeptidique. Les chamboulements dans cette vision simple du gène sont apparus avec la découverte inatttendue en 1977 des gènes en mosaïque ou gènes morcelés. Ces gènes se caractérisent par la présence de séquences dans l’ARN issu de la transcription qui sont éliminées avant de quitter le noyau. Ces séquences retirées de l’ARN initial appelé ARN prémessager (ARNpm) sont les introns, celles qui sont conservées constituent les exons. Ainsi, l’ARN arrivant dans le hyaloplasme est plus court que celui qui a été transcrit. Les gènes en mosaïque sont associés à un processus appelé épissage différentiel qui conduit, à partir du même ARNpm, à des ARNm différents donnant naissance à des protéines différentes mais apparentées (isoformes). Les gènes ne sont donc plus les atomes de l’hérédité. Le séquençage des génomes a pour l’instant apporté plus de questions que de réponses. La recherche de séquences codantes dans les banques de données est conduite en utilisant des programmes informatiques qui repèrent des séquences multiples de 3, de longueurs suffisantes (au moins 100 codons) et qui commencent par un codon initiation (AUG) et qui se terminent par un des trois codons stop. Cette recherche est menée sur chaque brin d’ADN. Selon le programme de recherche utilisé, le nombre de ces séquences ainsi comptabilisées est variable. Ces recherches ont conduit à la notion de cadre ouvert de lecture ou ORF (Open Reading Frame). Quand on énonce le nombre de gènes dans un organisme, il s’agit en fait du nombre de cadres ouverts de lecture, c’est-à-dire des séquences qui potentiellement possèdent les éléments nécessaires à la synthèse d’une chaîne polypeptidique. La comparaison des séquences d’ADN d’un organisme avec celles d’organismes déjà séquencés, et dont on a attribué des séquences à des protéines, permet de définir, en raison des homologies, des fonctions cellulaires. En revanche, il existe de très nombreux ORF dont on ne connaît pas le rôle des protéines auxquelles ils pourraient donner éventuellement naissance. Cette découverte des gènes en mosaïque rend compte, en partie, de la différence de complexité entre des organismes ayant approximativement le même nombre de gènes (ORF) mais des niveaux d’organisations extrêmement différents. Ainsi, chez l’homme, les quelque 26 000 ORF actuellement reconnus donneraient naissance à quelque 100 000 protéines en admettant une capacité d’épissage alternatif moyenne de 4 ARNm par ARNpm. En revanche, la levure de boulanger avec ces quelque 6 000 ORF ne coderait que quelque 6 000 protéines en raison de la quasi inexistance de gènes à épissage différentiel. Depuis sa naissance avec les facteurs de Mendel, le gène a connu bien des avatars. Il est arrivé à un stade qui nous éloigne de l’équivalence : un gène un enzyme (ou d’une manière générale, une chaîne polypeptidique). Doit-on privilégier l’approche qui donne à une séquence d’ADN : – la capacité d’être transcrite en ARNpm (ou en ARNt et ARNr) ; – la capacité de donner un ARNpm qui connaît un épissage différentiel et donne naissance à plusieurs protéines ; – la capacité pour un ARNpm d’avoir plusieurs promoteurs et donc plusieurs sites de démarrage de transcription ; – la capacité à être transcrite dans ces nouvelles catégories d’ARN à rôles régulateurs ; – la capacité à former des signaux de type silenceur, appelé aussi atténuateur ou amplificateur ou autres séquences sur lesquelles se fixent des protéines ou des ARN ? Dans cette vision, chaque séquence ci-dessus est porteuse d’une information nécessaire au fonctionnement de la cellule et ou de l’organisme. La complexité structurale et fonctionnelle d’un être vivant est liée à la quantité d’information, c’est-à-dire d’instructions dont il dispose, mais pas nécessairement à la nature des protéines qui assurent une même fonction. Un gène peut être défini en termes moléculaires par l’ensemble des séquences nécessaires pour la synthèse d’une chaîne polypeptidique complète ou d’un ARN fonctionnel. Dans cette définition, le gène comprend les parties codantes, les régions de contrôle (promoteurs,enhanceurs) et parfois des introns. Le terme de gène, si clair pour les généticiens non molécularistes, est devenu de plus en plus obscur à mesure du séquençage des génomes. Le faible nombre de gènes (ORF) reconnu chez l’homme en comparaison avec ceux qui ont été obtenus pour des espèces de niveau d’organisation plus simple montre que la complexité ne se situe

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pas dans le nombre d’ORF ou dans la taille du génome, mais dans les interactions géniques, les capacités de régulation et le protéome. La complexité du protéome (nombre de protéines et capacité d’interaction), qui est plus imputable à la capacité d’épissage différentiel qu’à la taille du génome, est sans doute un meilleur reflet de la biodiversité passée et présente. Chapitre 20 : nature moléculaire de l’information génétique Chez toutes les cellules et de très nombreux virus, le support moléculaire de l’information génétique est constitué par de l’ADN ; quelques virus échappent à cette règle et possèdent de l’ARN à la place de l’ADN. L’ADN monocaténaire est un très long polymère de 4 nucléotides reliés par des liaisons covalentes qui assurent le maintien de la structure primaire porteuse de l’information génétique. Deux brins d’ADN s’associent en raison de la complémentarité des bases, cette association où l’adénine se lie à la thymine et la cytosine à la guanine conduit à la structure secondaire hélicoïdale où les brins sont antiparallèles. Les liaisons hydrogène qui relient les deux brins et les interactions hydrophobes assurent le maintien de la structure de la double hélice. Sous l’action de différentes protéines, la molécule d’ADN s’ouvre par rupture des liaisons faibles, la réplication et la transcription se déroulent. Chez les eucaryotes, les molécules d’ADN s’organisent en chromosome avant la division cellulaire. La forme et la taille des chromosomes sont variables. Les chromosomes se différencient également par la position du centromère et la taille de leurs bras. Certains possèdent une constriction secondaire qui contient les organisateurs nucléolaires à l’origine des nucléoles. L’ensemble des chromosomes métaphasiques constitue le caryotype. Des techniques de coloration (Giemsa, FISH) sont utilisées pour différencier des bandes ou localiser des séquences précises sur les chromosomes. Les télomères forment l’extrémité des bras des chromosomes, ils attachent la cellule aux lamines nucléaires, fixent des protéines motrices nécessaires à leur déplacement au cours des divisions et protègent les gènes contre le raccourcissement de la molécule d’ADN à chaque cycle cellulaire. Durant l’interphase, les chromosomes, localisés à des territoires précis du noyau sont sous forme de chromatine. La chromatine est constituée par de l’ADN et des protéines qui lui sont associées. On distingue l’hétérochromatine dans laquelle l’ADN est fortement condensée et l’euchromatine où l’ADN est moins condensée. Les gènes transcrits sont situés dans l’euchromatine. L’ADN est enroulé autour des nucléosomes constitués par des protéines basiques, les histones. Les nucléosomes sont disposés à intervalles réguliers, soit tous les quelque 200 nucléotides, 146 faisant le tour du nucléosome et 40 étant de l’ADN intercalaire. Cette structure constitue la fibre nucléosomique. Une fibre nucléosomique ne contient qu’une molécule d’ADN et forme un seul chromosome. La formation du chromosome nécessite l’enroulement hiérarchique de plusieurs centimètres d’ADN en une structure de l’ordre de quelques micromètre. La fibre nucléosomique mesure 11 nm de diamètre, elle s’enroule en un solénoïde de 30 nm de diamètre dans lequel 6 nucléosomes sont disposés selon un cercle maintenu par les histones H1. Cette fibre forme des boucles de 50 kb en moyenne attachées à des protéines de la charpente du chromosome. La base des boucles est associée à une topoisomérase II. Les boucles contiennent les gènes. Leur transcription nécessite que la fibre de 30 nm soit décondensée. Chapitre 21 : Organisation des génomes des procaryotes et des eucaryotes Le génome constitue l’ensemble de l’information génétique d’un individu que ce soit ses séquences codantes ou non codantes. Le séquençage de génomes de plus en plus nombreux est à l’origine d’une nouvelle approche, la génomique, qui débouche sur les comparaisons des transcriptomes et des protéomes. Les génomes bactériens sont les plus simples, l’information génétique est répartie entre le chromosome bactérien et des plasmides qui portent des gènes utiles mais non indispensables à la bactérie (résistance aux antibiotiques, facteur de fertilité,…). Certains plasmides s’intègrent aux chromosomes bactériens. Les plasmides conjugatifs passent d’une bactérie à une autre. Les transferts horizontaux de gènes semblent avoir été assez fréquents dans l’histoire du monde bactérien.

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La taille du génome des bactéries varie d’environ 480 ORF à plus de 4 300 ORF. Les gènes sont en copies uniques et très souvent organisés en unités transcriptionnelles, les opérons. Les opérons sont constitués par plusieurs gènes de structure placés sous le contrôle du même promoteur dont l’accessibilité à l’ARN polymérase est facilitée ou empêchée par des protéines codées par des gènes dits de régulation. Les ORF des eubactéries sont continus alors que certains gènes des archées possèdent des séquences transcrites qui sont éliminées de l’ARN fonctionnel. Les virus constitue un monde à part. On distingue les virus à ADN et les virus à ARN. Le nombre de gène varie de un à 300. Le génome des eucaryotes se caractérise par sa grande taille, son faible nombre d’ORF, par rapport à sa complexité, et sa grande quantité d’ADN non codant. Il n’existe pas de différences significatives telles que le laissaient supposer les niveaux de complexité entre les différents phylums d’organismes pluricellulaires pour ce qui concerne le nombre d’ORF (13 000 pour la drosophile, 25 000 pour les vertébrés, homme compris). Le génome des vertébrés contient environ 1,5 % de sa longueur qui code des protéines et des ARN directement fonctionnels. Les différences dans la taille des génomes de vertébrés, exprimée en paires de base, sont dues essentiellement à la présence d’une quantité plus ou moins importante d’ADN apparemment non fonctionnel. L’ADN d’un eucaryote se répartit en séquences codant les protéines et les ARN associés à leurs séquences régulatrices, les séquences répétitives d’origines diverses et les séquences espaceurs. Environ la moitié des gènes codant les protéines sont en séquences uniques, l’autre moitié sont des gènes dupliqués qui proviennent d’une duplication d’un gène ancestral dont les copies ont divergé par accumulation de mutations indépendantes à l’origine de nouvelles propriétés. Ces copies légèrement différentes sont en général situées à proximité, elles constituent des familles multigéniques. Les familles de gènes codant des ARNr, les ARNt et les histones sont souvent répétées de très nombreuses fois avec des dispositions souvent en tandem. Il existe des séquences hautement répétitives (minisatellites et microsatellites) dans les centromères, les télomères et à d’autres localisations chromosomiques spécifiques de chaque individu qui sont utilisées comme empreintes génétiques. Parmi les séquences répétées non codantes, on définit les séquences ou éléments mobiles qui forment la fraction moyennement répétitive de l’ADN, elles sont dispersées dans tous les génomes des eucaryotes pluricellulaires. On distingue les transposons à ADN qui sont dupliqués et déplacés dans tous le génome des rétrotransposons viraux et non viraux qui passent par un ARN avant d’être rétrotranscrits en ADN avant de s’insérer n’importe où dans le génome. Les transposons à ADN se caractérisent par des séquences terminales inversées répétées nécessaires à leur insertion. Ces éléments génétiques mobiles codent la transposase nécessaire à leur propre intégration. Les transposons rétroviraux dériveraient de différents rétrovirus, ils possèdent une transcriptase inverse et une intégrase nécessaires à leur propagation et se caractérisent par leurs extrémités (LTR). Ils comptent pour plus de 8 % de l’ADN de l’homme. Les transposons non rétroviraux ne possèdent pas de LTR, leurs séquences donnent naissance à une transcriptase inverse et une endonucléase nécessaires à leur intégration. Selon la longueur de la séquence, on distingue les SINES et les LINES. Les SINES représentent 20 % du génome humain et les LINES 13 %. La séquence Alu est un SINE qui, à elle seule, compte 10,6 % du génome humain. Plus de 42 % du génome humain est constitué par des éléments génétiques mobiles n’ayant aucun rôle. L’insertion de ces séquences dans le génome est à l’origine de mutations et de différentes recombinaisons génétiques dont l’importance évolutive reste à préciser. Les mitochondries et les chloroplastes possèdent chacun un génome dérivé du génome des symbiotes ancestraux dont une partie des gènes est passée dans le noyau de la cellule eucaryote. Chapitre 22 : mécanismes moléculaires de conservation de l’information génétique La réplication de l’ADN des procaryotes débute dans une zone appelée OriC qui s’ouvre progressivement et donne naissance à l’œil de réplication qui s’agrandit en sens opposés par l’intermédiaire de deux fourches de

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réplication qui avancent et finissent par ce rejoindre en point diamétralement opposé à l’origine. À chaque fourche, la vitesse de réplication est de l’ordre du millier de bases à la seconde. La réplication de la double hélice nécessite plus d’une vingtaine de protéines différentes. Les protéines DnaA sont responsables de l’ouverture de la double hélice dans laquelle se glisse une hélicase et une primase constituant le primosome responsable de la synthèse de l’amorce d’ARN. Les protéines SSB empêchent la reformation de la double hélice. La synthèse des brins complémentaires démarre à chaque fourche quand le complexe de l’ADN polymérase III s’associe au primosome constituant ainsi le réplisome. Chaque brin de la double hélice parentale se comporte comme une matrice pour la synthèse du nouveau brin qui lui est complémentaire et demeure apparié avec le brin parental, la réplication de l’ADN est donc semi-conservative. Les caractéristiques biochimiques des ADN polymérases imposent que le nouveau brin soit synthétisé dans le sens 5’ → 3’. Les nouveaux nucléotides sont ajoutés à l’extrémité 3’-OH du brin en croissance. L’ADN polymérase nécessite une amorce d’ARN pour la synthèse d’un brin d’ADN, elle est incapable de démarrer un brin d’ADN à partir d’une matrice. À une fourche de réplication, l’ADN fils est synthétisé, par l’ADN polymérase III, nucléotide par nucléotide à la suite de l’amorce d’ARN mise en place par la primase, cette synthèse est dite continue, le brin ainsi formé est appelé brin précoce. En revanche, à l’autre fourche, en raison de l’orientation antiparallèle des deux brins parentaux, la synthèse de l’ADN fils se fait par fragments, appelés fragments d’OKazaki, de quelques centaines de bases, chacun étant initié par une amorce d’ARN. La synthèse est dite discontinue et le brin formé est le brin retardé. Les amorces d’ARN sont d’abord éliminées par l’activité exonucléasique de la polymérase I puis remplacées par des nucléotides synthétisés par cette même enzyme. La ligase soude deux fragments d’Okazaki adjacents. À chaque fourche de réplication, il n’existe qu’un réplisome. Le complexe de l’ADN polymérase III contient deux sous-unités responsables de la réplication, une sous-unité synthétise le brin précoce alors que l’autre synthétise le brin retardé. Ces deux sous unités sont côte à côte, le brin matrice donnant naissance au brin retardé fait une boucle qui inverse son sens physique mais pas son sens biochimique. Au niveau d’une fourche, les deux brins matrices sont parallèles et les deux sous-unités de la polymérase placent les nucléotides aux extrémités 3’-OH qui sont orientées dans le même sens pour les deux brins en croissance. À cause de la boucle, la synthèse du brin complémentaire se réalise avec un léger décalage temporel par rapport à la réplication de la séquence complémentaire de l’autre brin. Chaque fois que l’ADN polymérase III bute contre l’extrémité 5’ du fragment d’Okazaki précédent, elle se détache, une nouvelle boucle se forme et un nouveau fragment d’Okazaki est synthétisé. Au cours de la synthèse d’un nouveau brin, l’ADN polymérase III apparie des nucléotides erronés en raison de l’existence de forme tautomère des bases azotées. L’ADN polymérase III possède un double système de vérification. Le premier système consiste en un détachement du nucléotide incorrect à la suite d’un changement de conformation de la polymérase lorsque celui-ci se lie à la base du brin matrice. Le second système intervient quand le premier a été pris en défaut, la base erronée reprend sa forme tautomère plus stable et rompt donc ses liaisons hydrogène avec la base précédemment complémentaire. L’ADN polymérase ne peut plus poursuivre la synthèse faute d’une extrémité 3’-OH libre, son activité exonucléasique retire le nucléotide incorrect, c’est la correction sur épreuve. La synthèse du brin complémentaire se poursuit. Ces deux systèmes conduisent à une incorporation erronée par gigabase. Ces erreurs de réplication conduisent à des mutations ponctuelles faux sens, non-sens ou silencieuses. Les effets diffèrent selon le site qu’elles touchent dans le génome et selon l’importance de la substitution de l’acide aminé qui en découle. Il existe aussi des mutations du cadre de lecture dont les effets sont plus importants (délétion, duplication ).

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La cellule est aussi soumise à des attaques de mutagènes chimiques et physiques qui sont aussi à l’origine de mutations. Par ailleurs, il existe aussi des lésions spontanées de l’ADN (déamination, dépurination) qui sont aussi à l’origine de mutations. La cellule possède des systèmes de réparation de son ADN comme l’excision généralisée des nucléotides qui détecte les déformations de la molécule d’ADN induite par des appariements anormaux. Ce système utilise l’information portée par le brin possédant la base correcte pour replacer sur le brin antiparallèle la base complémentaire convenable. Chapitre 23 : mécanismes de l’expression génétique chez les procaryotes, transcription, traduction L’expression des gènes correspond à l’utilisation de l’information stockée dans l’ADN pour la fabrication de protéines mais aussi d’ARN directement fonctionnels (ARNt, ARNr). La transcription correspond au passage d’une séquence codante d’ADN à une séquence complémentaire d’ARNm, la traduction correspond à la synthèse d’une chaîne polypeptidique dont l’ordre des acides aminés est spécifié par la séquence d’ARN. L’expression d’un gène est conditionnée par l’initiation de la transcription. Chez les procaryotes, la transcription démarre quand une petite protéine, le facteur sigma, qui est une sous-unité mobile de l’ARN polymérase se fixe à une séquence amont, le promoteur, de la séquence codante. Un gène est d’autant plus transcrit que le facteur sigma se fixe fréquemment sur le promoteur qui lui est associé, les promoteurs fort ont une très grande affinité pour le facteur sigma, ils sont associés à des gènes transcrits quasiment en permanence alors que les promoteurs faibles fixent moins fréquemment le facteur sigma. Les promoteurs possèdent deux séquences consensus ou boîtes qui orientent le promoteur. Le facteur sigma positionne et stabilise l’ARN polymérase en se liant aux régions − 35 et − 10, la double hélice est alors ouverte à − 10 nucléotides. Le premier ribonucléotide a être placé par l’ARN polymérase est noté + 1, la synthèse se poursuit sur une dizaine de nucléotides, la polymérase change alors de forme et libère sigma. L’élongation se réalise dans le sens 5’→ 3’ à la vitesse de 50 nucléotides par seconde. La transcription se poursuit jusqu’à la synthèse d’une séquence dont la présence dans l’ARNm entraîne le détachement de la polymérase. Dès que le promoteur est libre et en fonction de sa force, un nouveau facteur sigma se fixe dessus et une nouvelle molécule d’ARNm est synthésée. L’ARNm bactérien possède trois séquences fonctionnelles. La première séquence est située en amont à environ − 7 nucléotides du nucléotide + 1 et correspondant à la transcription d’une partie du promoteur, c’est la séquence de Shine-Dalgarno (non traduite) qui positionne l’ARNm dans le ribosome, la deuxième débute au codon d’initiation AUG (A étant le nucléotide + 1) et se termine au codon stop, la troisième est une région non traduite qui débute après le codon stop, elle détache la polymérase et intervient dans la durée de vie de l’ARNm. En plus des ARNm, l’ARN polymérase forme les ARNt et les ARNr. Par ailleurs, les ARNm bactériens, issus de la transcription des gènes de structure des opérons, contiennent souvent plusieurs cadres ouverts de lecture qui sont traduits en plusieurs protéines. La traduction d’un ARNm en chaîne polypeptidique repose sur le code génétique qui est universel. À chaque ensemble de 3 bases contiguës, appelé codon, correspond un unique acide aminé. Il existe 64 codons pour spécifier les 20 acides aminés présents dans les protéines. Le code génétique est redondant et dégénéré, plusieurs codons spécifiant le même acide aminé. Trois codons sont des codons stop et ne spécifient pas d’acides aminés. Le codon AUG est le codon d’initiation, c’est cet acide aminé qui est le plus souvent placé à l’extrémité N terminale de la chaîne polypeptidique. La séquence traduite est située entre le codon initiation et un des trois codons stop. Le mécanisme et la fidélité de la traduction reposent sur deux ensembles de molécules, les ARNt-aminoacyl synthétases et les ARNt. Les ARNt-aminoacyl synthétases associent un acide aminé particulier avec le ou les ARNt possédant un des anticodons correspondant. Il existe donc 20 types de ces synthétases. Les ARNt une fois chargée de leur acide aminé se lie par leur anticodon au codon de l’ARNm. La liaison entre l’acide aminé et l’ARNt est riche en énergie nécessaire à la formation de la liaison peptidique suivante.

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En raison de la troisième base flottante de l’anticodon qui présente souvent des appariements moins stricts, un ARNt donné caractérisé par un anticodon et un acide aminé qui lui est spécifique reconnaît plusieurs codons synonymes. Inversement, un codon donné est lu par plusieurs ARNt différents. Dans tous les cas l’acide aminé placé correspond à celui qui est spécifié par le code génétique compte tenu du codon. La traduction d’un ARNm nécessite une étape d’initiation où les sous-unités du ribosome s’associent autour de l’ARNm, une étape d’élongation où la chaîne d’acides aminés s’allonge et une étape de terminaison qui libère la chaîne polypeptidique achevée. Chaque étape demande du GTP et des facteurs spécifiques. Chez les procaryotes, les ribosomes s’assemblent sur l’ARNm alors que celui-ci est en cours de synthèse. L’ARNt, associé à des facteurs d’initiation, portant la formyl-méthionine se lie au premier codon AUG qui se trouve en face du site P. Puis un deuxième ARNt se place dans le site A, l’hydrolyse de GTP permet la synthèse d’une liaison peptidique entre les deux acides aminés à la suite d’un premier changement conformationnel du ribosome. Une nouvelle hydrolyse d’ATP entraîne un second changement conformationnel qui provoque le départ de l’ARNt qui portait la méthionine dans le site E du ribosome et le transfert du deuxième ARNt portant les deux acides aminés dans le site P, le site A devenant libre pour recevoir un troisième ARNt chargé. Ce cycle se poursuit jusqu’à l’apparition d’un codon stop dans le site A. La terminaison correspond à l’entrée d’un facteur de libération dans le site A quand celui-ci présente un des trois codons stop. L’hydrolyse du GTP associé au facteur de libération entraîne la rupture de la liaison qui relie la chaîne polypeptidique terminée au dernier ARNt, l’éjection du facteur de libération et la dissociation des sous-unités du ribosome. Chez les procaryotes, la transcription du même gène par plusieurs ARN polymérases agissant avec un léger décalage, le démarrage de la traduction alors que la transcription n’est pas achevée par plusieurs ribosomes se fixant à mesure de la libération de leurs sites de fixation contribuent à une production rapide et en grandes quantités des protéines. Chapitre 24 : quelques caractères de l’expression génétique dans la cellule eucaryote Les eucaryotes possèdent des ARN polymérases spécifiques de leurs différentes catégories de gènes. La polymérase I synthétise les préARNr, la polymérase III synthétise uniquement les petits ARN (ARNt, 5S) qui ne donnent pas lieu à traduction et la polymérase II synthétise tous les ARNpm et les petits ARN nucléaires. Les gènes d’eucaryote possèdent deux catégories de séquences régulatrices, les promoteurs et les enhanceurs, ces séquences ne donnent pas lieu à transcription, mais sont des sites de fixation pour différentes protéines régulatrices. Elles sont appelées séquences cis car leurs actions portent sur des gènes situés sur la même molécule d’ADN. Les promoteurs des gènes fréquemment transcrits contiennent une boîte TATA qui place correctement l’ARN polymérase II. Les bases du promoteur situées en amont de la boîte sont responsables de la force du promoteur . La transcription d’un gène nécessite la mise en place du complexe de transcription qui se réalise par la fixation successive des facteurs de transcription généraux communs à tous les gènes. Le premier (TBP) se lie à la boîte TATA située dans le promoteur, puis TFIIB, suivi par le complexe de l’ARN polymérase II associé à TFIIF, TFIIE et TFIIH. Ce dernier possède une activité hélicase qui ouvre la double hélice en hydrolysant de l’ATP. L’extrémité carboxyterminale de la polymérase est phosphorylée après que l’ARN polymérase ait transcrit quelques courtes séquences, puis les facteurs de transcription généraux se détachent, l’ARN polymérase II progresse alors le long du brin matrice. Deux catégories de protéines interviennent dans la stabilisation de l’ARN polymérase. Le complexe du médiateur module l’activité de l’ARN polymérase et du TFIIH et les TAF stabilise le TBP qui assure la liaison de la polymérase avec la boîte TATA. En plus de ces trois catégories de facteurs nécessaires à la transcription, il existe des activateurs et des facteurs spécifiques qui contribuent à la stabilisation du complexe de transcription et donc à son efficacité. L’ARN formé par l’ARN polymérase II est appelé ARNpm, il est associé à des ribonucléoprotéines, son extrémité 5’ est prolongée par une coiffe de guanosine et son extrémité 3’ par une polyadénylation. Avant de quitter le noyau, l’ARNpm connaît un phénomène d’excision-épissage au cours duquel certaines séquences, les introns, sont retirées du transcrit primaire et les séquences conservés, les exons sont liés entre eux.

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Un grand nombre d’ORF connaît un épissage différentiel qui conduit, à partir du même transcrit primaire, à un nombre plus ou moins important d’ARNm qui sont traduits en des protéines différentes mais apparentées, les isoformes. L’épissage différentiel fournit donc une grande quantité de protéines, responsable, plus que le nombre d’ORF, des différences observées entre les êtres vivants. D’autres modifications posttranscriptionnelles comme l’édition contribuent à l’augmentation du nombre de protéines produit à partir d’un seul ARNpm. Les chaînes polypeptidiques qui possèdent une séquence signal, sont dirigées vers le réticulum endoplasmique où elles subissent des modifications posttraductionnelles qui se poursuivent dans les différentes citernes de l’appareil de Golgi. Ces protéines demeurent dans des vésicules membranaires (lysosomes), sont intégrées à la membrane plasmique ou sont simplement exportées dans le milieu extracellulaire. Les autres protéines restent dans le cytosol où elles voyagent vers différentes parties de la cellule, quelques unes entrent dans les mitochondries ou les chloroplastes. Chapitre 25 : Contrôle de l’expression génétique : l’opéron lactose d’Escherichia coli Les gènes des bactéries dont les produits appartiennent à une même voie métabolique sont organisés en opérons. Les opérons métaboliques sont inductibles ou répressibles. Leurs gènes ne sont transcrits que lorsque certaines conditions du milieu sont satisfaites. Par exemple, en l’absence de lactose, l’opéron lactose ne produit pas les enzymes nécessaires à son utilisation, ce diholoside est donc un inducteur. L’opéron lactose comprend plusieurs types de séquences : – les trois séquences contiguës correspondant aux trois gènes de structure, codant la β-galactosidase, la perméase et la transacétylase ; – les opérateurs qui fixent le répresseur ; – le promoteur sensu stricto sur lequel se fixe le facteur sigma et donc l’ARN polymérase ; – le site CAP, situé en amont du promoteur, sur lequel se fixe la protéine CAP ; – la séquence codant le répresseur, elle correspond au gène I ; – la séquence codant la protéine CAP, elle correspond au gène crp. En l’absence de lactose (et de glucose), le répresseur lac codé par le gène I est lié aux opérateurs (formation d’une boucle de répression) bloquant ainsi la transcription des trois gènes de structure. Le lactose qui entre dans la bactérie se fixe sur le répresseur qui change de conformation et quitte l’opérateur, la voie est alors libre pour la transcription. Il s’agit d’une régulation négative. En présence de glucose et en l’absence de lactose, l’opéron n’est pas transcrit à cause du répresseur. En présence de glucose et de lactose, l’opéron est faiblement transcrit. Cette situation s’explique par la présence d’une régulation positive qui implique l’intervention d’un autre régulateur et qui favorise donc l’utilisation du glucose moins coûteuse en énérgie. Quand le glucose est absent, l’AMPc s’accumule, il se fixe sur une protéine, la protéine activatrice du catabolisme (CAP) qui se lie à une région amont du promoteur et stabilise le complexe de transcription. En présence de lactose, le répresseur étant absent, l’ARN polymérase transcrit les gènes de structure à un taux élevé. Quand le glucose est présent, l’AMPc est en faible concentration et la protéine CAP ne se lie pas à l’ADN, le complexe de transcription est moins stabilisé et la transcription moins fréquente. Ce système de régulation conduit à la synthèse des enzymes qu’en cas de réels besoins. Le complexe CAP-AMPc se fixe sur de nombreuses séquences du génome d’E. coli qui contrôlent différentes enzymes intervenant dans le catabolisme. Chapitre 26 : État de condensation de la chromatine et expression génétique chez les eucaryotes, rôle du complexe d’initiation de la transcription Chez les eucaryotes, le contrôle de l’expression génétique est nettement plus complexe que celui qui est développé par les procaryotes chez lesquels tous les gènes sont exprimés, mais à des taux différents, dans la bactérie au cours des quelque 20-30 minutes qui séparent une division.

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Chez les eucaryotes pluricellulaires, le contrôle de l’expression des gènes conditionne quand et à quel moment tel gène est exprimé au cours du développement embryonnaire, de la différenciation cellulaire et du fonctionnement quotidien des différentes cellules. Tous les gènes présents dans le génome ne sont pas transcrits dans toutes les cellules de l’organisme. L’expression des gènes des eucaryotes est essentiellement contrôlée par l’initiation de la transcription. Les séquences de régulation de l’expression des gènes d’eucaryotes appartiennent à deux catégories, les promoteurs généralement contigus à la séquence codante et les enhanceurs situés à plusieurs kilobases du promoteur qu’ils contrôlent. Ces séquences d’ADN sont appelées séquences cis et se situent sur la même molécule d’ADN que le gène qu’elles contrôlent. Les régulateurs trans sont des protéines codées par des gènes situés dans n’importe quelle partie du génome et qui se fixent sur les séquences cis et le complexe de transcription. L’ADN ayant fixé des facteurs trans, se replie et amène au contact des protéines fixées sur le promoteur un ou plusieurs facteurs de transcription qui se sont fixés à distance (ces sites sont parfois même à l’intérieur du gène). Les activateurs, liés aux enhanceurs, relient, en courbant la molécule d’ADN, le promoteur au complexe de transcription, par l’intermédiaire d’autres protéines (médiateur). La transcription d’un gène dans une cellule particulière demande la présence d’un ensemble d’activateurs nécessaires à son expression. Les activateurs et les répresseurs qui se lient aux différentes séquences des enhanceurs s’associent par un ou plusieurs autres domaines à un complexe appelé médiateur multiprotéique qui participent à la stabilisation de l’ARN polymérase. l’amplificateur est une séquence d’ADN qui active l’utilisation du promoteur, les amplificateurs ne peuvent activer que des promoteurs situés en cis (c’est-à-dire sur la même molécule d’ADN), les amplificateurs fonctionnent par la liaison de protéines spécifiques, les régulateurs trans qui sont les facteurs de transcription. La fixation de l’ARN polymérase n’a lieu que si la chromatine est décondensée. La décondensation de la chromatine nécessite des facteurs de remodelage de la chromatine qui rendent les promoteurs accessibles aux facteurs de transcription. L’acétylation des histones diminue la force de la liaison entre les nucléosomes et l’ADN et facilite la transcription. Les protéines qui se lient à l’ADN se caractérisent par différents motifs structuraux responsables de cette liaison. On distingue les protéines à domaine hélice-tour-hélice, à homéodomaine, à doigts de zinc, à tirettes à leucine et hélice-coude-hélice. En plus de ces domaines de reconnaissance de l’ADN, toutes ces protéines possèdent un ou plusieurs domaines pour reconnaître d’autres protéines présentent dans le complexe d’initiation. Les amplificateurs, fixés sur les enhanceurs, contrôlent dans l’espace et dans le temps le fonctionnement des gènes. Ainsi des gènes actifs dans des cellules différentes possèdent des amplificateurs différents qui se fixent sur des enhanceurs différents. L’interaction entre les facteurs de transcription associés aux sites de l’amplificateur et de l’appareil de transcription assemblés au niveau du promoteur contrôlent la transcription et donc la spécificité tissulaire (souvent liée à un taux élevé de transcription de certains gènes). Les hormones stéroïdes en se fixant sur des récepteurs nucléaires participent au contrôle du taux de transcription de certains gènes en se fixant sur des séquences cis appelées éléments de réponse aux hormones. Plus un gène est méthylé, moins il est exprimé. La méthylation est un moyen de rendre silencieux certains gènes. Les profils de méthylation sont spécifiques des tissus. Des petits ARN interviennent aussi dans la régulation de l’expression des gènes en se fixant sur des ARNm, en réprimant la traduction et en les dégradant, ce phénomène est appelé interférence à ARN. Les micro ARN sont aussi responsables de l’extinction de certains gènes en bloquant leur traduction. Chapitre 27 : les virus, parasites d’expression des cellules Les virus sont des parasites du système d’expression des cellules, ils sont incapables de se reproduire en dehors de leurs hôtes. Leur matériel génétique est constitué d’ADN ou d’ARN simple ou double brin. Le virion ou

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particule virale se trouve dans le milieu extérieur ; dans la cellule, le matériel génétique du virus est souvent intégré à l’ADN de l’hôte où il constitue le provirus. Les virus sont plus ou moins complexes, la complexité des virus dépend essentiellement du nombre de protéines présentes dans la capside qui protège le matériel génétique. Le phage lambda est un bactériophage qui parasite E. coli. Soit le phage détruit son hôte au cours de son cycle, c’est un phage virulent, soit son ADN reste intégré dans le génome de l’hôte, le phage est dit tempéré et la bactérie lysogène. L’état lysogène et le cycle lytique sont essentiellement sous contrôle de deux protéines, le répresseur lambda et la protéine Cro qui sont codés par deux gènes contigus, respectivement cI et cro, séparés par un promoteur commun présentant 3 opérateurs distincts. Dans la bactérie qui a intégré l’ADN du phage, le gène cI est transcrit, il code une protéine appelée répresseur λ. Ce répresseur se fixe sur les opérateurs droit et gauche de l’ADN du phage empêchant ainsi toute transcription de l’ADN viral et donc tout cycle lytique. Quand la quantité du répresseur λ diminue, la transcription de cI est inhibée, les gènes de lyse sont transcrits, la bactérie entre dans le cycle lytique. Quand le rapport des protéines cI/cro est élevé, le répresseur lambda se lie aux opérateurs et réprime la transcription de cro alors que la transcription de cI est activée, la lysogénie est maintenue. La protéine cI est à la fois un activateur de sa propre transcription et un inhibiteur de la transcription de cro. Le virus de la mosaïque du tabac est un virus à ARN positif qui sert donc directement d’ARNm. Parmi les trois protéines produites par son génome, une est l’élément de base de la capside. Les protomères s’associent en spirale et forment un bâtonnet dont le centre est occupé par une cavité qui contient l’ARN. Le virus du SIDA est un rétrovirus dont le matériel génétique est constitué de deux molécules identiques d’ARN simple brin. La capside contient aussi des enzymes (transcriptase inverse, intégrase, protéase), l’ensemble est enveloppé dans une portion de la membrane plasmique de la cellule parasitée. Le VIH possède trois unités de transcription. Le gène env donne les deux protéines implantées dans la membrane plasmique prise à la cellule hôte, le gène gag donne 4 protéines structurales de la capside et le gène pol produit les transcriptases, la protéase et l’intégrase. En plus de ces 3 gènes donnant 10 protéines, il existe 6 autres gènes codant des protéines régulatrices. Le cycle du VIH est donné Fig. XXX. L’ARN après avoir été rétrotranscrit est converti en un ADN bicaténaire qui est intégré dans le génome de l’hôte. Il y reste un temps variable sous forme de prophage. Des événements cellulaires le font enter dans son cycle reproducteur qui conduit à la destruction des cellules. Le VIH se fixe sur les cellules qui possèdent des récepteurs complémentaires de la protéine gp120. Les lymphocytes T4 et quelques autres cellules du système immunitaire qui possèdent ces récepteurs sont des cibles de ce virus. Chapitre 28 Principes et analyse de résultats des technologies de l’ADN recombinant Les technologies de l’ADN recombinant correspondent à l’utilisation de certaines enzymes (enzymes de restriction, transcriptases, polymérases, ligases) et méthodes d’analyse (électrophorèse, Southern Blot, puce à ADN…) pour insérer de nouveaux gènes dans un organisme et pour en étudier le fonctionnement. Les enzymes de restriction coupent l’ADN à des séquences précises, appelées sites de restriction, qui sont des palindromes. La plupart des enzymes de restriction forment des bouts collants. Ainsi deux ADN différents coupés par la même enzyme se recollent spontanément par leurs extrémités monocaténaires. Les différents fragments obtenus sont séparables par électrophorèse. Le Southern blot est une technique qui permet de rechercher dans une électrophorèse la bande qui contient une séquence particulière grâce à l’hybridation par une sonde d’acide nucléique monocaténaire marquée. Les technologies de l’ADN recombinant demande de nombreuses copies d’une même séquence soit pour la séquencer soit pour l’introduire dans un autre génome. L’amplification de l’ADN est réalisée soit par clonage dans une bactérie, soit par réaction de polymérisation en chaîne (PCR).

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On réalise une banque d’ADN génomique en coupant le génome d’un individu par une seule enzyme de restriction. On construit des banques d’ADN complémentaires à partir du trancriptome. Pour construire ces banques, on mélange ses fragments d’ADN avec des plasmides qui possèdent le même site de restriction, mais situé au sein d’un gène de résistance à un antibiotique. Les plasmides sont ensuite réintégrés dans des bactéries. Les bactéries forment des colonies qui sont transférées ensuite sur un milieu contenant l’antibiotique, Seules, les colonies qui ne se développent pas ont intégré les plasmide recombiné. Dans cette banque d’ADN génomique, il est possible de chercher avec une sonde une séquence particulière afin d’isoler le clone possédant le gène d’intérêt. Les plasmides sont isolés et la séquence d’intérêt est récupérée pour insérer dans un génome étranger ou pour être complètement séquencée. Les copies nécessaires au séquençage d’un fragment d’ADN sont obtenues à partir d’une colonie qui possède dans ses plasmides la même séquence qu’il faut isoler ou par PCR. La PCR est une technique de polymérisation in vitro qui permet, à partir d’une molécule d’ADN, d’en obtenir 2n à chaque cycle de réplication. Cette technique est maintenant automatisée dans des thermocycleurs. Le séquençage de l’ADN est réalisé de manière automatique dans des séquenceurs qui fournissent automatiquement, grâce à la combinaison d’une électrophorèse dont la capacité de résolution est la séparation de fragments ne se différenciant que par un nucléotide et d’un jeu de 4 fluorochromes, la base située à une position donnée du fragment. Les puces à ADN sont des plaques de verre qui permettent des analyses comparatives très rapides et très précises des transcriptomes et des génomes. Elles sont particulièrement utiles pour rechercher les différences dans l’expression des gènes entre différentes catégories de cellules. Les OGM ou organismes génétiquement modifiés ou organismes transgéniques sont une des applications fondamentales de cette technologie. La fabrication d’un OGM nécessite l’isolement du ou des gènes d’intérêt à partir d’un ou de plusieurs donneurs, leur insertion dans un vecteur de clonage, l’entrée du vecteur de clonage dans une cellule, l’insertion du vecteur de clonage dans l’ADN et l’expression du gène d’intérêt sans qu’il ne perturbe le fonctionnement de la cellule. Chez les végétaux, le plasmide Ti d’Agrobacterium tumefasciens est utilisé comme vecteur après modifications. Les cellules cible sont des cellules foliaires qui forment un cal à l’origine duquel se forme une nouvelle plante qui possède le gène d’intérêt dans toutes ces cellules, d’autres modifications génétiques permettent de rendre l’OGM stérile. Ces techniques de l’ADN recombinant ont conduit à l’analyse des mini- et microstallites par l’étude du polymorphisme des fragments de restriction qui permet de réaliser une empreinte génétique unique de n’importe quel individu. Chapitre 29 : transmission de l’information lors de la mitose La mitose correspond à la forme de la division cellulaire rencontrée chez les plantes et les animaux pluricellulaires. La mitose est une division équationnelle qui répartit le matériel génétique à égalité entre les deux cellules filles après qu’il se soit répliqué durant la phase S de l’interphase. Le reste du cytoplasme se répartit entre les deux cellules filles. L’ensemble de la division cellulaire est divisée en 6 phases : prophase, prémétaphase, métaphase, anaphase, télophase et cytodiérèse. Au cours de la prophase, le centrosome se divise et migre aux deux extrémités de la cellule où ils génèrent les microtubules du fuseau de division, la chromatine s’individualise progressivement en se condensant en chromosomes. L’enveloppe nucléaire se fragmente et disparaît, les chromosomes apparaissent sous la forme de fins bâtonnets constitués de deux chromatides reliées ensemble par le centromère et maintenues collées l’une à l’autre par un ensemble de protéines.

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Une fois l’enveloppe nucléaire rompue, les fibres du fuseau rencontrent les kinétochores et sont responsables du ballet des chromosomes qui finissent par s’immobiliser à l’équateur de la cellule. La prométaphase correspond à cette phase de déplacement des chromosomes et la métaphase à l’achèvement de ces mouvements. Les centromères des chromosomes se situent alors au milieu de la cellule, dans un plan perpendiculaire au fuseau de division, c’est la plaque métaphasique. La métaphase se caractérise par la séparation de chaque chromosome à deux chromatides en chromosomes à une chromatide. La séparation est provoquée par la division du centromère et par la rupture des ptotéines maintenant les deux chromatides collées l’une à l’autre. La dépolyémérisation des microtubules kinétochoriens est responsable de la montée anaphasique (anaphase A). Au cours de cette montée, la cellule s’allonge (anaphase B) par glissement des microtubules polaires et traction des asters sous l’effet de moteurs moléculaires. La télophase marque la fin de la mitose. Les chromosomes se décondensent, l’enveloppe nucléaire se reforme à partir du réticulum autour de chaque chromosome, l’appareil mitotique se dépolymérise, le nucléole réapparaît. La cytodiérèse correspond à la division du cytoplasme qui soit débute à l’anaphase ou à la télophase soit à la fin de la mitose. Dans les cellules animales, la séparation des cellules est réalisée par un anneau contractile d’actine et de myosine, dans les cellules végétales par le phragmoplaste. D’une manière générale, le cytoplasme est également réparti entre les deux cellules filles. En l’absence de cytodiérèse, les cellules deviennent plurinuclées. La condensation de la chromatine en chromosomes assure la compaction de l’information génétique et facilite sa répartition équitable entre les cellules filles. Il existe cependant des accidents chromosomiques qui conduisent à des garnitures chromosomiques déséquilibrées à l’origine de graves problèmes. Durant la mitose, il existe parfois des recombinaisons entre fragments de chromosomes. La recombinaison est dite homologue quand un fragment d’ADN est remplacé par un fragment possédant à peu près la même séquence. Cette technique est utilisée pour remplacer un gène par un autre dans un animal de laboratoire. La recombinaison hétérologue correspond à l’insertion d’une séquence d’ADN à n’importe quel endroit du génome. Le mécanisme des recombinaisons est lié à la ressemblance entre les séquences et aux mécanismes de réparation de l’ADN. Le cycle cellulaire se divise en 4 phases, la phase G1 s’étend de la fin de la mitose précédente au début de la phase de synthèse de l’ADN, la phase de synthèse de l’ADN (S) et la phase G2 qui débute une fois que tout l’ADN est répliqué et se poursuit jusqu’au début de la mitose. Le passage d’une phase à l’autre nécessite que la phase précédente se soit correctement déroulée. Le cycle cellulaire est marqué par l’existence de points de contrôle qui sont des étapes où la cellule vérifie son état physiologique. Si celui-ci est incorrect, la cellule est arrêtée dans le déroulement du cycle cellulaire. La réalisation de chaque phase est sous le contrôle de complexes protéiques constitués par une cycline et une cycline dépendante kinase (cdk). Chaque phase se caractérise par un assortiment cycline-cdk spécifique. Les kinases associées aux cyclines sont responsables de la phosphorylation de certaines protéines responsables des événements caractéristiques d’une phase. Par exemple le MPF (cyline B-cdk1) phosphoryle les lamines nucléaires en début de prophase ce qui conduit à la dissociation du réseau et à la rupture de l’enveloppe nucléaire. La phosphorylation des condensines par MPF est à l’origine de la condensation des chromosomes. La destruction des cyclines d’une phase met fin aux actions des complexes cycline-cdk. La reformation de l’enveloppe nucléaire se fait par déphosphorylation des lamines par des phosphatases constitutives.

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