Chapitre III Physiologie Bactérienne

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Chapitre III : physiologie bactérienne I. les besoins nutritifs bactériens. Relation avec le type trophique...................................... 3

1. les besoins élémentaires ..................................................................................................... 3 2. les facteurs de croissance ................................................................................................... 4 3. les besoins énergétiques ..................................................................................................... 4 4. la source d’électrons........................................................................................................... 4 5. la classification des bactéries ............................................................................................. 4

II. les milieux de culture .......................................................................................................... 4

1. les constituants fondamentaux des milieux de culture ....................................................... 5 2. la classification des milieux de culture .............................................................................. 5 3. le développement bactérien................................................................................................ 9

III. les facteurs physiques influençant la croissance bactérienne ...................................... 10

1. la température................................................................................................................... 10 2. le pH ................................................................................................................................. 11 3. l’oxygène.......................................................................................................................... 13 4. la pression osmotique ....................................................................................................... 14 5. la pression mécanique ...................................................................................................... 15 6. l’humidité ......................................................................................................................... 15

IV. les techniques d’études de la croissance bactérienne.................................................... 16

1. la multiplication bactérienne ............................................................................................ 16 2. la mesure du nombre de cellules ...................................................................................... 16 3. la mesure de la biomasse.................................................................................................. 17

V. la croissance en milieu non renouvelé.............................................................................. 17

1. la courbe de croissance..................................................................................................... 17 2. les paramètres d’états de la croissance............................................................................. 18

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3. physiologie des phases de la croissance........................................................................... 18 4. modélisation mathématique.............................................................................................. 18

VI. mode de vie des bactéries ................................................................................................ 18

1. recherche de nourriture par chimiotactisme ..................................................................... 19 2. les biofilms ....................................................................................................................... 19

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Chapitre III : physiologie bactérienne

I. les besoins nutritifs bactériens. Relation avec le type trophique Pour se développer, les microorganismes ont besoins de 3choses.

• source d’énergie • source de carbone • source d’hydrogène et d’électrons

1. les besoins élémentaires les éléments majeurs Représente 95% du poids sec de la bactérie.

Carbone, azote, hydrogène, oxygène, soufre, phosphore Ces éléments majeurs sont de concentrations proches du g.L Carbone, oxygène, hydrogène : besoin qui est satisfait à partir d’une même molécule. Un microorganisme autotrophe est capable de synthétiser es métabolites à partir d’éléments minéraux. Il n’a pas besoin de substances organiques. La source de carbone sera le dioxyde de carbone. Un microorganisme hétérotrophe exige une source de carbone plus complexe afin de synthétiser tous ces métabolites. Il est incapable de synthétiser tous ces métabolites à partir d’éléments minéraux. Azote : synthèse acides aminés et des bases azotées et certains glucides. Soit elle est commune à la source de carbone soit une molécule spécifique. Certaines bactéries sont capables de fixer l’azote atmosphérique. Soufre et phosphore : le soufre sert à la synthèse des acides aminés et vitamine. Le phosphore sert à la synthèse des phospholipides. La source principale est le phosphate inorganique. Les éléments mineurs Fer, calcium, sodium, potassium Rentre dans la synthèse de cofacteurs et rentre dans la composition de la chaîne respiratoire. Les microéléments Célénium, cuivre, nickel Eléments indispensables pour la synthèse de ces cofacteurs et coenzymes.

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2. les facteurs de croissance Définition Molécules indispensables au développement des microorganismes mais il n’arrive pas à les synthétiser. Il va falloir amener ce facteur de croissance dans le milieu. Acides aminés ou vitamines Relation avec les types trophiques Microorganismes prototrophe capable de produire tous ses constituants carbonés à partir d’une seule source de carbone. Une souche prototrophe est capable de synthétiser tous ces constituants cellulaires sur un milieu minimum. Microorganisme auxotrophe : bactérie incapable de synthétiser une ou plusieurs molécules. En général, on précise l’auxotrophie.

3. les besoins énergétiques Microorganisme phototrophe : microorganisme photosynthétique utilisant l’énergie du rayonnement lumineux. Microorganisme chimiotrophe : utilisent l’énergie de l’oxydation de produits chimiques, organiques ou minéraux.

4. la source d’électrons Litotrophe : utilisent des substances minérales comme source d’électrons. Organotrophe : extraient les électrons de composants organiques.

5. la classification des bactéries

• Photolitotrophes : se développent sur un milieu minéral • Photoorganotrophes : nécessite la présence de matières organiques • Chimiolitotrophe : bactéries intervenant dans les cycles de matières • Chimioorganotrophes : grosse catégorie de bactéries

II. les milieux de culture Ce sont des préparations qui vont permettre le développement de la bactérie. Le milieu doit apporter :

• Tous les éléments dont la bactérie a besoin

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• Une source d’énergie et des facteurs de croissance • Un pH correct • Une force ionique optimale

Les milieux de culture doivent permettre d’isoler les bactéries, les identifier, les compter et les conserver. Un milieu qui ne contient que ce qui est absolument nécessaire au développement de la bactérie se nomme un milieu minimum.

1. les constituants fondamentaux des milieux de culture Les extraits de viande : viande finement hachée mis dans de l’eau et porter à ébullition. Après filtration, on garde le liquide. Bonne source d’acides aminés, de vitamines, et minéraux. Les extraits de levures : levures de boulangerie hydrolysées. Bonne source d’acides aminés et de vitamines. Peptones et hydrolysats : matières protéiques hydrolysées par des enzymes. Bonne source de carbone, hydrogène, oxygène, acides aminés Les produits biologiques : ne doivent pas contenir des antibiotiques ; ils ne sont pas toujours autoclaves. Les indicateurs colorés : ils changent de couleur en fonction du pH. Au départ la couleur de la gélose dépend du type d’indicateurs et dépend du pH de la gélose. Lors du développement du microorganisme, le pH du milieu peut :

• Rester stable • Descendre : cas des bactéries qui utilisent des sucres et rejettent des acides • Monter : la bactérie ne peut pas utiliser le sucre mais métabolise des acides aminés

L’agar : extrait d’algues rouge ayant des propriétés gélifiantes. Elle possède 3 propriétés :

• Gélifie les milieux dans lequel elle a été incorporée. • Jamais dégradé par les bactéries • Se dissout dans l’eau à 90°C reste e surfusion jusqu’à 45°C. A température basse, il y

a gélification.

2. la classification des milieux de culture Classification selon la consistance

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Classification selon leur composition

Milieux solides

Milieux liquides

Milieux semi solides

Classification selon la

consistance

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Classification selon la complexité

Milieux synthétiques

(connait exactement la composition)

Milieux naturels

(connait à peu près la

composition)

Milieux semi synthétique

(fraction connue et fraction inconnue)


composition

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Classification selon leur utilisation

Milieux usuels (préparation et composition

simple)

Milieux enrichis

(composition et préparation

complexe)


complexité

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3. le développement bactérien En milieux liquides : apparition d’un trouble. Le développement peut apparaître sous différentes formes :

• Trouble homogène • Sédiment au fond du tube • Voile en surface • Limpide

En milieux solide : formation de colonies. Observation macroscopique. Plusieurs critères :

• Taille • Couleur • Relief • Contour • Consistance

Milieux non sélectifs

Milieux d’orientations

et d’identificatio

ns

Milieux d’enrichissem

ents

Milieux de conservations

Milieux sélectifs

Classification selon leur utilisation

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• Transparence Quand on mixe ces critères on obtient 3 types de colonies :

• R • S • N

III. les facteurs physiques influençant la croissan ce bactérienne La plupart des cellules animales sont organisées en structure multicellulaire immergées dans un liquide isotonique qui les maintient à un pH optimal. Les cellules végétales sont souvent soumises à des agressions mais ont une organisation multicellulaires et se spécialisent. Les bactéries sont des organismes unicellulaires qui vivent dans des environnements qui changent brutalement. Ces modifications vont avoir un impact direct sur la physiologie bactérienne. Les bactéries vont devoir s’adapter très rapidement à des changements d’environnements. Certaines bactéries sont devenues totalement indépendantes de leur environnement.

1. la température Impact de la température : la température va avoir un effet direct sur la vitesse des réactions métaboliques. Chaque augmentation de 10°C augmente par 2 la vitesse de réaction enzymatique. Au-delà d’une certaine température, il y a dénaturation des protéines, destruction des membranes cellulaires et mort de la bactérie. Les températures cordinales

• Minimale : pas de développement • Optimale • Maximale

Ces températures changent selon le type de bactéries. La température optimale est très proche de la température maximale. Les catégories

• Mésophiles : température optimale entre 30 et 37°C température moyenne de croissance 20 et 40°C

• Psychrophiles : température optimale : 10°C • Psychrotrophes : température optimale : 25°C mais peuvent se développer à 0°C • Thermophiles : température optimale : 45 à 55°C • Thermophile extrêmes : températures optimales : 70°C • Thermotrophes : température optimale : 30°C mais peuvent se développer à 50°C

Les mécanismes moléculaires de l’adaptation à la température

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S’il y a baisse importante de température il y a risque de gélification de membrane. Les bactéries vont synthétiser de nouveaux acides gras au niveau des phospholipides, ces acides gras sont insaturés et vont permettre de maintenir la fluidité. Si la température augmente, il y a risque e dénaturation des enzymes. Les bactéries vont synthétiser de nouvelles protéines qui vont résister à la chaleur. Les techniques de laboratoire Pour cultiver une bactérie, on va se placer à température optimale et constante. On peut utiliser le bain marie et des étuves, des frigos, boucles de régulation (fermenteur).

2. le pH Impact du pH

• influence sur l’activité métabolique. La synthèse de l’ATP dépend du fonctionnement de certaines pompes anioniques. Une modification de pH altère le fonctionnement de ces pompes.

• Perméabilité de la membrane : modification de l’équilibre ionique de part et d’autre de la membrane.

• Le milieu de culture contient des molécules intéressantes pour le microorganisme. La modification du pH peut changer la charge de ces molécules. Si la charge des molécules change, il peut y avoir des problèmes de transport.

Les catégories Le pH intracellulaire des microorganismes est d’environ 7.

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Techniques de laboratoire On ajuste le pH du milieu de culture au pH de la bactérie que l’on veut faire pousser. Lors de la croissance, le microorganisme :

• Métaboliser un sucre et relarger des déchets acides donc le pH va baisser • Métaboliser les acides aminés et relarger des déchets basiques donc le pH monte

Plus le microorganisme, plus le milieu devient toxique. On ajoute lors de la fabrication du milieu un tampon qui va minimiser les variations de pH. 3 cas :

• Culture non renouvelée : culture en tube ou en erlenmeyer. Le pH va évoluer au bout de quelques heures de culture et au bout de 24h le milieu devient toxique.

• Culture non renouvelée en fermenteur : capteur de pH qui va mesurer le pH en continu. On a des pompes qui permettent d’injecter soit des produits alcalins soit acides. Le pH va rester constant.

• Culture renouvelée : ajout sans arrêt du milieu de culture. Le pH varie très peu.

Acidophile (1et 5.5)

Neutrophile (5.5 et8)

Alcalophile (8.5 et11.5)

Classification des bactéries

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3. l’oxygène Les catégories

Détermination du type respiratoire Gélose solide présentée en tube crayon

• Chauffer le tube à 100 °C • Laisser refroidir le tube à 50 °C • Ensemencer le tube avec la bactérie sur toute la gélose • Incuber

Les effets de l‘oxygène

Anaérobie aérotolérante

Aérobies strictes

Anaérobies strictes

Micro aérophile

Aéro anaérobies facultative


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Aérobies strictes : l’oxygène est l’accepteur final d’électrons. Chez les bactéries, il existe de la respiration anaérobie, l’accepteur final d’électrons est autre chose que l’oxygène. Pour les autres, l’oxygène est plus ou moins toxique. Les techniques au laboratoire Pour les bactéries aérobies strictes et les anaérobies facultatives, on injecte de l’oxygène en fermenteur. Pour les anaérobies strictes, on va les cultiver en absence d’oxygène en ajoutant un réducteur. On cultive ces bactéries dans un sac hermétique, en jarre anaérobie.

4. la pression osmotique Les effets de la pression osmotique. Les bactéries sont très résistantes aux variations de pression osmotique. Si on met la bactérie dans un milieu hypotonique, l’eau va rentrer mais la bactérie va être protégée grâce à sa paroi. Si on met la bactérie dans un milieu hypertonique, la bactérie va synthétiser des solutés à très forte concentration et donc l’eau arrête de sortir. Les catégories

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5. la pression mécanique Les bactéries qui vivent dans des milieux à fortes pression sont des barophiles. Toutes les bactéries sont résistantes aux fortes pressions. Les bactéries barophiles devront être cultivées e laboratoire sous fortes pressions.

6. l’humidité Utilisation de l’eau L’eau sert de solvant pour le transport des molécules. L’eau va être utilisée pour les réactions d’hydrolyse. Quantification de l’humidité Utilisation de Aw (activité de l’eau)

Les non halophile

[NaCl] <0.2M

Les halophiles 0.2< [NaCl]

<5.2M

Les halotolérantes


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Aw = nombre de molécules de solvant / nombre de molécules de solvant + nombre de

molécules de soluté

Technologie de laboratoire Pour les milieux liquides, l’eau n’est pas un facteur limitant. Pour les milieux solides, après 72h d’incubation, l’eau devient un facteur limitant.

IV. les techniques d’études de la croissance bactér ienne

1. la multiplication bactérienne Le processus de division Pas de mitose chez les bactéries. Au moment de la division, il y a :

• Réplication de l’ADN bactérien • Allongement de la bactérie • Synthèse de membrane et de la paroi • Formation de 2 cellules filles qui peuvent se séparer ou rester attaché ensemble

Dans tous les cas, les cellules filles sont identiques à la cellule mère d’un point de vue morphologique, physiologique et génétique (reproduction asexuée) La croissance bactérienne Lors de la croissance, il y a augmentation du nombre de cellules. Cette croissance suit une progression géométrique de raison 2. Le suivi de la croissance Lors de la croissance, on va avoir 2 changements :

• Accroissement du nombre de cellules • Modification de la composition du milieu de culture et modification physico-

chimique. Pour suivre une croissance, on peut mesurer

• Le nombre de cellules • Les modifications physico-chimiques

2. la mesure du nombre de cellules Les cellules de comptage

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Pour chaque cellule, on connaît la surface du quadrillage et la profondeur Dénombrement après culture sur gélose A partir d’un échantillon de concentration inconnue, on réalise des dilutions en cascade. On ensemence certaines de ces dilutions sur des milieux gélosés. Chaque bactérie va donner une colonie.

• Ensemencement en surface : dépôt de 0.1 mL d’une dilution à la surface d’une gélose • Ensemencement en masse : dépôt de 1 mL d’une dilution au fond d’une boîte de Pétrie

vide puis ajout de gélose à 50°C. • Méthode par filtration : réservé à des milieux liquides faiblement concentrée en

bactéries. Filtrage d’un certains volume liquide. Le filtre laisse passer l’échantillon mais retient es bactérie. On récupère le filtre qu’on dépose sur une gélose et chaque bactérie donne une colonie.

3. la mesure de la biomasse Plus l’échantillon est trouble, plus l’absorbance est grande.

V. la croissance en milieu non renouvelé

1. la courbe de croissance On suit l’évolution du nombre de cellules en fonction du temps. On peut également suivre la concentration ou l’absorbance. Il est difficile de tracer cette courbe sur une échelle arithmétiques on utilise plutôt une échelle logarithmique. Fonction de la coure de croissance Connaitre la vitesse de multiplication d’un microorganisme Situer certaines propriétés bactériennes Mesurer le degré d’activité des antibiotiques Description de la courbe de croissance On sépare la courbe en plusieurs phases :

• Phase de latence • Phase d’accélération • Phase exponentielle de croissance • Phase de ralentissement • Phase stationnaire • Phase de déclin

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Chaque microorganisme a sa propre courbe de croissance. La courbe dépend des conditions du milieu et dépend des paramètres physico-chimiques.

2. les paramètres d’états de la croissance La vitesse spécifique de croissance Vitesse spécifique Vx exprimée en T-1. Plus v est grand, plus la vitesse du microorganisme est grande. La vitesse change en fonction des phases. Le temps de génération (g) Temps de dédoublement de la population bactérienne. Il est déterminé à partir de la détermination de Vx.

3. physiologie des phases de la croissance Phase de latence : les bactéries se préparent à utiliser le milieu de culture. Elles synthétisent les enzymes puis synthèse d’ADN. Augmentation de la taille des bactéries. Idéalement, cette phase ne dépasse pas 3h. Phase exponentielle de croissance : la vitesse spécifique est la plus grande. A l’intérieur de la bactérie, l’activité métabolique tourne à fond. Production d’exotoxines. En général, c’est une phase relativement courte. Phase stationnaire : les bactéries continuent à consommer du milieu de culture et libèrent des déchets. Il y autant de nouvelles bactéries que de bactéries qui meurent. C’est une phase qui dure longtemps pour les bactéries résistante et court pour les bactéries sensibles. Les bactéries commencent à changer de forme. Apparition de spores. A la fin de cette phase, les bactéries vivent sur leurs réserves. Phase de déclin : le nombre de bactéries diminue. Il y a plus de bactéries qui meurent que de bactéries qui naissent. Libération de grosses quantités d’endotoxines. De temps en temps, la croissance reprend car les bactéries se nourrissent des bactéries mortes.

4. modélisation mathématique

µ = LN X2 / T2 – LN X1 /T1

g = Ln 2/ µ

VI. mode de vie des bactéries

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1. recherche de nourriture par chimiotactisme Définition Mouvement orienté des bactéries soit vers des substances attractives ou en sens opposé de substances répulsives. Mise en évidence Préparation d’une suspension bactérienne de concentration connue. Introduction dans un capillaire des substances à tester. Mise en contact des capillaires avec la suspension bactérienne. Détermination de la concentration de bactéries dans le capillaire. Mécanisme de détection La bactérie possède des récepteurs qui sont capables de déterminer la concentration dans le milieu de la bactérie. Le déplacement des bactéries Les chimiorécepteurs sont couplés aux flagelles. En absence de gradient de concentration, la bactérie nage tout droit et sinon elle change de direction. Globalement la bactérie reste dans la même région. Avec un gradient de concentration, les courses sont plus longues et les culbutes sont orientées.

2. les biofilms Les biofilms peuvent vivre sous 2 formes :

• Forme libre • Cessile

Définition Communauté microbienne immobilisées sur une surface et enfuit dans une matrice constituée de polymères. Formation du biofilm

• Une bactérie libre se fixe sur une surface • Le contact avec la surface induit un stress à la bactérie qui va synthétiser des

glycoprotéines. Renforce l’adhésion • Multiplication des bactéries et synthèse d’exopolysaccharides qui va former un gel.

Spécialisation des cellules. • Développement du biofilm. Certaines bactéries se décrochent et se dispersent.

Composition du biofilm

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La structure du biofilm est adaptée aux conditions environnementales. A l’intérieur du biofilm, il y a un réseau de canaux. Les bactéries à l’intérieur du biofilm forment des microcolonies. Ce biofilm est très stable et résiste aux stress.

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Chapitre III Physiologie Bactérienne