CHAPTER FIVE Amplifying DNA : PCR and cell-based DNA cloning 면역학 실험실 석사 1 년 지혜진

CHAPTER FIVECHAPTER FIVE

Amplifying DNA : Amplifying DNA : PCR and cell-based PCR and cell-based

DNA cloningDNA cloning

면역학 실험실면역학 실험실석사석사 11 년 지혜진년 지혜진

Chapter contentsChapter contents

5.1 The importance of DNA cloning5.1 The importance of DNA cloning 5.2 PCR : basic features and applications5.2 PCR : basic features and applications 5.3 Principles of cell-based DNA cloning5.3 Principles of cell-based DNA cloning 5.4 Cloning systems for amplifying different 5.4 Cloning systems for amplifying different si si

zed fragmentszed fragments 5.5 Cloning systems for producing single-5.5 Cloning systems for producing single- s s

tranded and mutagenized DNAtranded and mutagenized DNA 5.6 Cloning systems designed to express 5.6 Cloning systems designed to express g g

enesenes

5.1 The importance of DNA 5.1 The importance of DNA cloningcloning

5.2 PCR : basic features and 5.2 PCR : basic features and applicationsapplications

PCR : Polymerase Chain ReactionPCR : Polymerase Chain Reaction 의 의 약자로 유전체에 있는 특정 약자로 유전체에 있는 특정 DNADNA 서열을 서열을 대량으로 증폭시킬 수 있는 방법이다대량으로 증폭시킬 수 있는 방법이다 ..

PCRPCR 방법은 방법은 Kary MullisKary Mullis 에 의해 에 의해 고안되었으며 이 업적으로 고안되었으며 이 업적으로 19931993 년 년 노벨상을 수상하였다노벨상을 수상하였다 ..

PCRPCR 은 클로닝 과정 동안 살아있는 세포를 은 클로닝 과정 동안 살아있는 세포를 이용하지 않고 시험관 내에서 원하는 이용하지 않고 시험관 내에서 원하는 DNADNA서열을 클로닝 하기 위해 사용된다서열을 클로닝 하기 위해 사용된다 ..

5.2.1 principles of basic PCR and 5.2.1 principles of basic PCR and

reverse transcriptase (RT)PCRreverse transcriptase (RT)PCR

(1) PCR(1) PCR 의 원리 의 원리 주형이 되는 주형이 되는 double strand DNAdouble strand DNA 의 표적부분의 의 표적부분의

양끝 염기배열정보로부터 상류와 하류의 양끝 염기배열정보로부터 상류와 하류의 DNA prDNA primerimer 를 합성하고 내열성 를 합성하고 내열성 DNA polymerase (Taq pDNA polymerase (Taq polymerase)olymerase) 와 와 thermocyclerthermocycler 를 이용해 를 이용해 PCRPCR반응에 따른 특정 유전자 영역의 증폭을 반응에 따른 특정 유전자 영역의 증폭을 실시한다실시한다 . . 이론적으로는 반응 사이클의 이론적으로는 반응 사이클의 22nn 으로 으로 증폭이 가능하다증폭이 가능하다 ..

5.2.1 principles of basic PCR 5.2.1 principles of basic PCR and reverse transcriptase and reverse transcriptase

(RT)PCR(RT)PCR(2) PCR(2) PCR 의 구성요소의 구성요소① ① temple DNA : temple DNA : 증폭대상이 되는 증폭대상이 되는 DNA.DNA.② ② Primer : DNA Primer : DNA 중합효소가 중합효소가 DNA DNA 합성을 개시하게 하는 짧은 합성을 개시하게 하는 짧은 외가닥 외가닥 DNADNA 로 증폭할 부분을 결정한다로 증폭할 부분을 결정한다 . . 일반적으로 일반적으로 17-30mer17-30mer 가 가 primerprimer 의 크기로 적당하다의 크기로 적당하다 . . ③ ③ dNTPs : dATP, dCTP, dGTP, dTTPdNTPs : dATP, dCTP, dGTP, dTTP 로서 로서 DNADNA 를 합성하는 를 합성하는 재료가 되는 각 뉴클레오티드 염기들재료가 되는 각 뉴클레오티드 염기들 ..④ ④ Taq polymerase : Taq polymerase : 열에 특별히 강한 열에 특별히 강한 DNADNA 중합효소중합효소 ..

Taq polymerase Taq polymerase 은 은 94℃94℃ 까지 올라가는 까지 올라가는 PCRPCR 과정에서도 과정에서도 변성이 변성이

되지 않지만 되지 않지만 proof-readingproof-reading 기능이 없어서 기능이 없어서 error rateerror rate 가 매우 가 매우 높다높다 . .

그래서 최근엔 그래서 최근엔 proof-reading exonucleaseproof-reading exonuclease 활성을 지닌활성을 지닌 Pfu polymerasePfu polymerase 를 많이 사용한다를 많이 사용한다 ..


(RT)PCR(RT)PCR(3) PCR(3) PCR 의 과정의 과정

① ① denaturation : denaturation : 반응액을 가열하여 주형반응액을 가열하여 주형 DNADNA 를 를 single stransingle strandd 로 만든다로 만든다 . . 일반적으로 일반적으로 94℃94℃ 정도에서 정도에서 11 분간 진행된다분간 진행된다 ..

② ② primer annealing : primer annealing : 적정 온도적정 온도 (Tm)(Tm) 로 냉각하여 두 가닥으로 로 냉각하여 두 가닥으로

분리된 분리된 DNADNA 에 에 primerprimer 를 결합시키는 과정이다를 결합시키는 과정이다 . . 적정온도는 적정온도는 primerprimer 의 길이와 그것을 이루는 염기의 종류에 따라 의 길이와 그것을 이루는 염기의 종류에 따라 달라지며 보통 달라지며 보통 50℃~70℃50℃~70℃ 로 냉각시킨다로 냉각시킨다 ..

Tm = (4x[G+C]) + (2x[A+T])Tm = (4x[G+C]) + (2x[A+T]) ③ ③ DNA synthesis : Taq polymeraseDNA synthesis : Taq polymerase 가 주형 가 주형 DNADNA 로 부터 로 부터

상보적인 새로운 상보적인 새로운 DNADNA 사열을 합성하는 과정이다사열을 합성하는 과정이다 . . 일반적으로 일반적으로 74℃74℃ 에서 에서 22 분간 진행되며 이 온도가 분간 진행되며 이 온도가 Taq polyTaq polymerasemerase 의 활성이 최대가 되는 온도이다의 활성이 최대가 되는 온도이다 ..


(RT)PCR(RT)PCR(1) RT-PCR(1) RT-PCR 의 원리의 원리 RT-PCRRT-PCR 법은 법은 PCRPCR 법과 역 전사 효소 반응을 혼합한 법과 역 전사 효소 반응을 혼합한

방법으로 세포에서 추출한 방법으로 세포에서 추출한 mRNAmRNA 에서 에서 cDNAcDNA 를 를 합성하고 이것을 주형으로 하여 합성하고 이것을 주형으로 하여 PCRPCR 법으로 증폭하는 법으로 증폭하는 기술이다기술이다 . .

이 방법은 이 방법은 Northern blot hybridizationNorthern blot hybridization 에 의한 에 의한 RNARNA

분석보다 실험방법이 더욱 간단할 뿐 아니라 유전자의 분석보다 실험방법이 더욱 간단할 뿐 아니라 유전자의 염기서열결정이 가능하기 때문에 주로 염기서열결정이 가능하기 때문에 주로 mRNAmRNA 의 의 염기서열 및 염기서열 및

전사량을 연구할 때 크게 도움이 된다전사량을 연구할 때 크게 도움이 된다 . .


(RT)PCR(RT)PCR(2) RT-PCR(2) RT-PCR 의 과정의 과정

① ① 세포 조직에서 추출한 세포 조직에서 추출한 mRNAmRNA 의 의 poly Apoly A 에 에 oligo dT primoligo dT primerer 를 결합시켜 역 전사 효소를 이용해 를 결합시켜 역 전사 효소를 이용해 cDNAcDNA 를 합성한를 합성한다다 . .

② ② 주형 주형 cDNAcDNA 에 대한 에 대한 DNA primerDNA primer 를 결합시켜 를 결합시켜 double strdouble strand DNAand DNA 를 합성한다를 합성한다 . .

③ ③ thermocyclerthermocycler 를 이용해 를 이용해 PCRPCR 법으로 증폭한다법으로 증폭한다

5.2.2 PCR has two major 5.2.2 PCR has two major limitation : short sizes and low limitation : short sizes and low

yields of productsyields of products

(1) short sizes (1) short sizes 일반적으로 일반적으로 PCRPCR 로 증폭시키고자 하는 로 증폭시키고자 하는 DNADNA 의 길이는 의 길이는 3kb3kb

이하여야 하며 이하여야 하며 1kb1kb 이하가 이상적이다이하가 이상적이다 . . 단편의 길이가 단편의 길이가 길어질수록 증폭 효율이 낮아지며 항상 일관된 결과를 얻기 길어질수록 증폭 효율이 낮아지며 항상 일관된 결과를 얻기 어려워진다어려워진다 ..

Long-range PCRLong-range PCR 을 사용하면 을 사용하면 5~40Kb5~40Kb 의 의 DNADNA 도 도 증폭할 수 있다증폭할 수 있다 ..

이 이 PCRPCR 법에서는 법에서는 polymerasepolymerase 를 두 개 사용하는데 그 중 를 두 개 사용하는데 그 중 하나가 하나가 minor-proofreadingminor-proofreading 을 할 수 있어서 긴 을 할 수 있어서 긴 DNADNA 를 를 증폭할 때 증폭할 때 error rateerror rate 을 감소시켜 준다을 감소시켜 준다 ..

5.2.2 PCR has two major 5.2.2 PCR has two major limitation : short sizes and low limitation : short sizes and low

yields of productsyields of products(2) low yields of products(2) low yields of products PCRPCR 산물의 말단은 클로닝 벡터에 쉽게 삽입될 수 있는 산물의 말단은 클로닝 벡터에 쉽게 삽입될 수 있는 blbl

unt unt 말단이 아니라 말단이 아니라 Taq polymeraseTaq polymerase 에 의해 각 사슬의 에 의해 각 사슬의 3’3’말단에 아데노신을 가진 말단에 아데노신을 가진 A overhangA overhang 말단이다말단이다 ..

이것은 이것은 PCRPCR 산물의 산물의 cloningcloning 을 어렵게 만든다을 어렵게 만든다 ..

이에 따른 두 가지 해결책은 추가적인 이에 따른 두 가지 해결책은 추가적인 TT 를 포함하고 있는 를 포함하고 있는 특수한 클로닝 벡터를 사용함으로써 증폭된 특수한 클로닝 벡터를 사용함으로써 증폭된 DNADNA 단편을 단편을 lligationigation 시키는 것과 시키는 것과 T4 polymeraseT4 polymerase 나 나 Pfu polymerasePfu polymerase 와 와 같이 같이 single nucleotidessingle nucleotides 를 가진 를 가진 overhangoverhang 말단을 제거할 말단을 제거할 수 있는 ‘수 있는 ‘ polishing’ polishing’ 효소를 사용하는 것이다효소를 사용하는 것이다 ..

5.2.3 General application of 5.2.3 General application of PCRPCR

It is very rapid and easy to performIt is very rapid and easy to perform

It is very sensitiveIt is very sensitive

It is very robustIt is very robust



▶▶ Allele-specific PCRAllele-specific PCR


Touchdown PCRTouchdown PCR 이 방법은 이 방법은 PCRPCR 할 때 할 때 TmTm 을 알기 위해서 하는 을 알기 위해서 하는 PCRPCR 방법이다방법이다 . .

PCRPCR 과정에서 매 과정에서 매 2 cycle2 cycle 마다 마다 annealing temperatureannealing temperature 을 을 1℃1℃ 낮춘다낮춘다 . .

일반적으로 일반적으로 annealing annealing 이 이 TmTm 에서 에서 1℃1℃ 만큼 차이가 난 만큼 차이가 난 온도에서 일어날 때 한 온도에서 일어날 때 한 cyclecycle 에 에 productproduct 의 양이 두 배정도 의 양이 두 배정도 차이가 난다차이가 난다 . .

Touchdown PCRTouchdown PCR 에서는 에서는 2 cycle2 cycle 마다 온도를 낮췄으므로 마다 온도를 낮췄으므로 1℃1℃ 에 에 productproduct 의 양이 의 양이 44 배가 차이 나는 셈이다배가 차이 나는 셈이다 . .

이것을 이용해서 이것을 이용해서 TmTm 을 알 수 있다을 알 수 있다 .. (( 즉 온도가 즉 온도가 1℃1℃ 내려갔을 때 내려갔을 때 productproduct 양이 양이 44 배 증가한 배 증가한

과정에서의 과정에서의 temperaturetemperature 가 가 TmTm 이 된다이 된다 .).)


Hot start PCRHot start PCR Taq1 polymeraseTaq1 polymerase 는 는 37℃37℃ 에서도 그 활성이 좋기 때문에 간혹 에서도 그 활성이 좋기 때문에 간혹

가다가 첫 번째 가다가 첫 번째 denaturation denaturation 과정이 완전히 진행되기도 전에 과정이 완전히 진행되기도 전에 primeprimerr 가 가 DNA moleculeDNA molecule 에 붙어서 에 붙어서 extensionextension 이 일어나는 경우가 있다이 일어나는 경우가 있다 ..

이렇게 낮은 온도에서 이렇게 낮은 온도에서 annealingannealing 이 일어날 경우 이 일어날 경우 primerprimer 가 가 mismatcmismatchh 할 확률이 높고 따라서 결과적으로 정확도가 떨어지는 할 확률이 높고 따라서 결과적으로 정확도가 떨어지는 bandband 를 를 얻게 된다얻게 된다 . .

이것을 막는 방법이 이것을 막는 방법이 Hot start PCRHot start PCR 을 이용하는 것이다을 이용하는 것이다 . Hot start PC. Hot start PCRR 에서는 에서는 primer primer 가 정확하게 원하는 가 정확하게 원하는 DNA siteDNA site 에만 붙을 수 있도록 에만 붙을 수 있도록 충분한 온도가 된 후에 충분한 온도가 된 후에 PCRPCR 이 일어나도록 필요한 물질을 넣어준다이 일어나도록 필요한 물질을 넣어준다


Inverse PCRInverse PCR 기존에 서열을 알고 있는 기존에 서열을 알고 있는 DNADNA 의 양 옆에 서열을 알지 못하는 의 양 옆에 서열을 알지 못하는 regionregion 이 있고이 있고 , ,

이것을 알고자 할 때 많이 이용된다이것을 알고자 할 때 많이 이용된다 .. 이 방법은 이 방법은 primerprimer 가 기존의 가 기존의 PCRPCR 과는 반대방향으로 실시하는 방법이다과는 반대방향으로 실시하는 방법이다 .. 제일먼저 제한효소로 자르고 자른 부위를 원으로 만든다제일먼저 제한효소로 자르고 자른 부위를 원으로 만든다 .. 그 원으로 된 곳에 그 원으로 된 곳에 primerprimer 를 붙이는데 이때 신장이 같은 방향으로 가도록 를 붙이는데 이때 신장이 같은 방향으로 가도록 primerprimer

를 붙인다를 붙인다 ..

Alu-PCRAlu-PCR 이 이 PCRPCR 법은 법은 human DNAhuman DNA 에서 에서 3kb3kb마다 생겨나는 서열인 마다 생겨나는 서열인 Alu repeatAlu repeat 에 에

특이적인 특이적인 primerprimer 를 사용하는 것이다를 사용하는 것이다 .. Alu repeat Alu repeat 부위들이 인접하게 되면 반대방향으로 향하게 되며 부위들이 인접하게 되면 반대방향으로 향하게 되며 single typesingle type 의 의 Alu Alu

primerprimer 들이 작용하여 이사이 서열을 증폭한다들이 작용하여 이사이 서열을 증폭한다 ..


5.3 principles of cell-based 5.3 principles of cell-based DNA cloningDNA cloning

5.3.1 An overview of cell-based DNA 5.3.1 An overview of cell-based DNA cloningcloning

(a)(a) Construction of recombinant DNA Construction of recombinant DNA moleculesmolecules

(b)(b) TransformationTransformation

(c)(c) Selective propagation of cell clonesSelective propagation of cell clones

(d)(d) Isolation of recombinant DNA clonesIsolation of recombinant DNA clones

5.3.1 An overview of cell-5.3.1 An overview of cell-based DNA cloningbased DNA cloning

5.3.2 Restriction endonucleases enable the target DNA to b5.3.2 Restriction endonucleases enable the target DNA to be cut into manageable pieces which can be joined to similare cut into manageable pieces which can be joined to similar

ly cut vector moleculesly cut vector molecules

Restriction endonucleasesRestriction endonucleases DNADNA 에 존재하는 특정한 염기서열을 인식하고 인식한 에 존재하는 특정한 염기서열을 인식하고 인식한

서열부위 또는 그 근처에 존재하는 특정부위를 절단한서열부위 또는 그 근처에 존재하는 특정부위를 절단한다다 . .

제한효소는 원래 세균이 자신의 세포 내로 침입해 제한효소는 원래 세균이 자신의 세포 내로 침입해 들어오는 바이러스 같은 외부 들어오는 바이러스 같은 외부 DNADNA 를 제거하기 위한 를 제거하기 위한 방어기전으로 가지고 있는 것이며방어기전으로 가지고 있는 것이며 , , 자신의 자신의 DNADNA 는 는 절단부위의 염기를 메칠화시켜서 자신의 제한효소가 절단부위의 염기를 메칠화시켜서 자신의 제한효소가 자신의 자신의 DNADNA 를 자를 수 없게 보호하고 있다를 자를 수 없게 보호하고 있다 ..

제한효소는 제한효소는 33 가지로 나눌 수 있으며가지로 나눌 수 있으며 , , 실험실에서 실험실에서 사용되는 것은 대부분 사용되는 것은 대부분 type IItype II이다이다 ..



Type II restriction nucleasesType II restriction nucleases ▶ ▶ Type I , Type III restriction enzymeType I , Type III restriction enzyme DNADNA 의 특정부위를 인식하긴 하지만 인식된 부위가 아닌 다른 부위를 의 특정부위를 인식하긴 하지만 인식된 부위가 아닌 다른 부위를

절단한다절단한다 . . 즉즉 , , 인식부위는 특이성을 가지지만 그로부터 약 인식부위는 특이성을 가지지만 그로부터 약 1,000 1,000 base pairbase pair 가 떨어진 부위를 절단하기 때문에 원하는 부위를 선택하여 가 떨어진 부위를 절단하기 때문에 원하는 부위를 선택하여 자르기가 어렵다자르기가 어렵다 . . 따라서 이 효소들은 박테리아의 기능에는 중요하지만 따라서 이 효소들은 박테리아의 기능에는 중요하지만 실험목적으로는 잘 사용되지 않는다실험목적으로는 잘 사용되지 않는다 ..

▶ ▶ Type II restriction enzymeType II restriction enzyme인식부위와 절단부위가 모두 특이성이 있는 제한효소이므로 분자생물학 인식부위와 절단부위가 모두 특이성이 있는 제한효소이므로 분자생물학 연구에 아주 유용하게 이용되고 있다연구에 아주 유용하게 이용되고 있다 . . 대부분의 대부분의 type II type II 제한효소는 제한효소는 44개개 , 5, 5 개개 , , 또는 또는 66 개의 염기서열을 인식하는데개의 염기서열을 인식하는데 , , 이에 따라 이에 따라 DNA DNA 상에 상에 인식부위가 나타나는 빈도가 달라지게 된다인식부위가 나타나는 빈도가 달라지게 된다 . .







Simple vectors for cloning in bacterial cellsSimple vectors for cloning in bacterial cells

▶ ▶ plasmidsplasmids 박테리아 세포내에서 독립적으로 존재하는 박테리아 세포내에서 독립적으로 존재하는

이중나선의 원형 이중나선의 원형 DNADNA 분자분자

▶ ▶ bacteriophagesbacteriophages 박테리아을 특별하게 감염시키는 바이러스박테리아을 특별하게 감염시키는 바이러스

5.3.3 introducing recombinant DNA into 5.3.3 introducing recombinant DNA into recipient cells provides a method for recipient cells provides a method for fractionating a complex starting DNA fractionating a complex starting DNA

populationpopulation

5.3.4 DNA libraries are a 5.3.4 DNA libraries are a comprehensive set of DNA clones comprehensive set of DNA clones

representing a complex starting DNA representing a complex starting DNA populationpopulation

Genomic DNA librariesGenomic DNA libraries

5.3.4 DNA libraries are a 5.3.4 DNA libraries are a comprehensive set of DNA clones comprehensive set of DNA clones

representing a complex starting DNA representing a complex starting DNA populationpopulation

cDNA librariescDNA libraries

5.3.5 Recombinant screening is often achiev5.3.5 Recombinant screening is often achieved by insertional inactivation of ed by insertional inactivation of

a marker genea marker gene▶▶PCR-based screeningPCR-based screening

5.3.5 Recombinant screening is often achiev5.3.5 Recombinant screening is often achieved by insertional inactivation of ed by insertional inactivation of

a marker genea marker gene▶▶PCR-based screeningPCR-based screening

5.4 Cloning systems for 5.4 Cloning systems for amplifying different sized amplifying different sized

fragmentsfragments

5.4.1 standard plasmid vectors provide a simple way of clo5.4.1 standard plasmid vectors provide a simple way of cloning small DNA fragments in bacterial (and simple eukaryotining small DNA fragments in bacterial (and simple eukaryoti

c)cellsc)cells

Plasmid vectorPlasmid vector 박테리아 세포 내에서 독립적으로 존재하는 이중나선의 박테리아 세포 내에서 독립적으로 존재하는 이중나선의

원형 원형 DNADNA 분자분자 플라즈미드는 항생제 저항유전자같이 하나 또는 플라즈미드는 항생제 저항유전자같이 하나 또는

하나이상의 유전자를 가지고 있으며 이러한 유전자는 숙주 하나이상의 유전자를 가지고 있으며 이러한 유전자는 숙주 박테리아 에서 나타나는 유용한 특성의 원인이 된다박테리아 에서 나타나는 유용한 특성의 원인이 된다 ..

모든 플라즈미드는 복제시작점을 가지고 있기 때문에 모든 플라즈미드는 복제시작점을 가지고 있기 때문에 박테리아 염색체와는 무관하게 세포 내 에서 늘릴 수 있다박테리아 염색체와는 무관하게 세포 내 에서 늘릴 수 있다 . .

일반적인 플라즈미드 벡터는 일반적인 플라즈미드 벡터는 0~5kb0~5kb 까지 삽입할 수 있다까지 삽입할 수 있다 . .

5.4.1 standard plasmid vectors provide a simple way of clo5.4.1 standard plasmid vectors provide a simple way of cloning small DNA fragments in bacterial (and simple eukaryotining small DNA fragments in bacterial (and simple eukaryoti

c)cellsc)cells

Map of plasmid vector pUC19Map of plasmid vector pUC19

5.4.2 Lambda and cosmid vectors provide an efficient mean5.4.2 Lambda and cosmid vectors provide an efficient means of cloning moderately large DAN fragments in bacterial cels of cloning moderately large DAN fragments in bacterial cel

lsls

Phage Phage λλ vector vector

▶ ▶ 용균성 감염 용균성 감염 : : 대부분의 박테리오파지는 대부분의 박테리오파지는 증식형 감염을 일으킬 때 숙주세포를 죽이면서 증식형 감염을 일으킬 때 숙주세포를 죽이면서 병원성을 나타내는 감염 특징을 가짐병원성을 나타내는 감염 특징을 가짐 ..

▶ ▶ 용원성 감염 용원성 감염 : : 또 다른 박테리오파지는 증식형 또 다른 박테리오파지는 증식형 감염뿐만 아니라 숙주세포를 죽이지 않고 감염뿐만 아니라 숙주세포를 죽이지 않고 지속적인 감염 특징을 가짐 지속적인 감염 특징을 가짐 (Persitent infection).(Persitent infection).


lsls Phage Phage λλ vector vector


lsls

Phage Phage λλ vector vector


lsls

Cosmid vectorCosmid vector

▶▶플라즈미드와 람다파아지로 이루어진 혼성체로서 플라즈미드와 람다파아지로 이루어진 혼성체로서 플라즈미드에 플라즈미드에 cos sitecos site 가 삽입된 클로닝 벡터이다가 삽입된 클로닝 벡터이다 ..

그러므로 대장균세포에서 자율적으로 복제하는 그러므로 대장균세포에서 자율적으로 복제하는 플라스미드능력과 시험관내에서 람다염색체를 싸는 플라스미드능력과 시험관내에서 람다염색체를 싸는 능력을 가진다능력을 가진다 ..

▶▶게놈의 클로닝을 보다 용이하게 한 것으로 파아지 벡터가 게놈의 클로닝을 보다 용이하게 한 것으로 파아지 벡터가

수용할 수 있는 크기보다 수용할 수 있는 크기보다 33 배정도 큰 배정도 큰 30~44kb30~44kb 정도의 정도의 DNADNA절편을 수용할 수 있다절편을 수용할 수 있다 ..


lsls

Cosmid vectorCosmid vector

5.4.3 Large DNA fragments can be cloned in bacterial cells 5.4.3 Large DNA fragments can be cloned in bacterial cells using vectors based on bacteriophage P1 and F factor plasusing vectors based on bacteriophage P1 and F factor plas

midsmids

Bacteriophage P1 vector and P1 artificial chromoBacteriophage P1 vector and P1 artificial chromosomes (PACs)somes (PACs)

▶ ▶ Bacteriophage P1Bacteriophage P1 은 은 110kb110kb 의의 DNADNA 를 그것의 캡 시드 를 그것의 캡 시드 구조에 끼워 넣을 수 있는 것이 람다에 비해 큰 장점이다구조에 끼워 넣을 수 있는 것이 람다에 비해 큰 장점이다 ..

P1P1 에 기초한 코스미드벡터는 에 기초한 코스미드벡터는 70~100kb70~100kb 크기까지의 크기까지의 DDNANA 단편을 클론하는데 사용되었다단편을 클론하는데 사용되었다 ..

5.4.3 Large DNA fragments can be cloned in bacterial cells 5.4.3 Large DNA fragments can be cloned in bacterial cells using vectors based on bacteriophage P1 and F factor plasusing vectors based on bacteriophage P1 and F factor plas

midsmids

Bacterial artificial chromosome(BAC) vectorsBacterial artificial chromosome(BAC) vectors ▶ ▶박테리아의 박테리아의 [fertility(F)][fertility(F)] 요소로부터 만들어졌다요소로부터 만들어졌다 .. 300kb300kb 이상의 큰 크기의 이상의 큰 크기의 DNADNA 단편을 넣을 수 있으며 단편을 넣을 수 있으며 플라즈미드나 람다 코스미드 벡터와 같이 대장균에서 플라즈미드나 람다 코스미드 벡터와 같이 대장균에서 복제한다복제한다 ..

YACsYACs 보다 덜 복잡해서 만들기가 더 쉬워서 전체염색체의 보다 덜 복잡해서 만들기가 더 쉬워서 전체염색체의

물리적인 지도를 만드는 경우와 같이 거대 삽입물체를 물리적인 지도를 만드는 경우와 같이 거대 삽입물체를 필요로 하는 연구에서 필요로 하는 연구에서 YACYAC 벡터를 대신하기 시작했다벡터를 대신하기 시작했다 ..

5.4.4 Yeast artificial chromosomes(YACs) en5.4.4 Yeast artificial chromosomes(YACs) enable cloning of megabased fragmentsable cloning of megabased fragments

YAC(yeast artificial chromosome)YAC(yeast artificial chromosome)

▶ ▶ 효모의 인위적인 염색체로서 효모의 인위적인 염색체로서 200~500kb200~500kb 의 외래의 외래 DNADNA를 삽입할 수 있다를 삽입할 수 있다 ..

▶ ▶ YAC YAC 클로닝 벡터는 거대 클로닝 벡터는 거대 DNADNA 삽입으로 완전한 삽입으로 완전한 유전체를 포함하는 클론을 동정하고 특성화 하기 쉽게 유전체를 포함하는 클론을 동정하고 특성화 하기 쉽게 되어졌다 되어졌다

5.4.4 Yeast artificial chromosomes(YACs) enable cl5.4.4 Yeast artificial chromosomes(YACs) enable cloning of megabased fragmentsoning of megabased fragments

5.5 Cloning systems for producing single str5.5 Cloning systems for producing single stranded and mutagenized DNAanded and mutagenized DNA

5.5.1 Single stranded DNA for use in DNA sequencing is 5.5.1 Single stranded DNA for use in DNA sequencing is obtained using M13 or phagemid vectors or by linear PCR obtained using M13 or phagemid vectors or by linear PCR amplificationamplification

▶ ▶ M13 vectorM13 vector 섬유형파아지의 한 예로서 원형의 단일가닥섬유형파아지의 한 예로서 원형의 단일가닥 DNADNA 로 구성되어있다로 구성되어있다 . . 세포내에서단일가닥세포내에서단일가닥 DNADNA 는 상보사슬합성의 주형역할을 하여 는 상보사슬합성의 주형역할을 하여

일반적인 이중가닥일반적인 이중가닥 DNADNA 로 된다로 된다 . . 이 분자는 박테리아유전체 속으로 이 분자는 박테리아유전체 속으로 삽입되지는 않지만 그 대신에 삽입되지는 않지만 그 대신에 100100 개 이상의 사본체가 생길 때까지 개 이상의 사본체가 생길 때까지 사본된다사본된다 ..

Rolling circleRolling circle복제에 따라 새로운 단일가닥복제에 따라 새로운 단일가닥 DNADNA 가 생성되고 새로운가 생성되고 새로운 ccoatoat 단백질에 포장되고 숙주세포를 죽이지 않고 세포외피를 통해 단백질에 포장되고 숙주세포를 죽이지 않고 세포외피를 통해 방출된다방출된다 ..

5.5.1 Single atranded DNA for use in DNA sequencing is obt5.5.1 Single atranded DNA for use in DNA sequencing is obtained using M13 or phagemid vectors or by linear PCR amplained using M13 or phagemid vectors or by linear PCR ampl

ificationification

▶ ▶ Phagemid vectorsPhagemid vectors Phage+PlasmidPhage+Plasmid 의 혼성화 벡터이다의 혼성화 벡터이다 .. 이는 플라스미드 복제 원점을 가짐으로써 이는 플라스미드 복제 원점을 가짐으로써 helper phagehelper phage 가 없는 가 없는

상태에서는 일반적인 이중가닥 플라스미드로써 대장균에서 상태에서는 일반적인 이중가닥 플라스미드로써 대장균에서 복제되어진다복제되어진다 ..

파아지파아지 M13M13복제원점을 가짐으로써 복제원점을 가짐으로써 M13 helper phageM13 helper phage 가 첨가된 가 첨가된

이후엔 복제 파아지 형태로 전환되고 단일가닥의 이후엔 복제 파아지 형태로 전환되고 단일가닥의 DNADNA 가 가 만들어지고 파아지 코트로 포장되어 방출된다만들어지고 파아지 코트로 포장되어 방출된다 ..

5.5.1 Single atranded DNA for use in DNA sequencing is obt5.5.1 Single atranded DNA for use in DNA sequencing is obtained using M13 or phagemid vectors or by linear PCR amplained using M13 or phagemid vectors or by linear PCR ampl

ificationification

5.5.2 Oligonucleotide mismatch mutagenesis can c5.5.2 Oligonucleotide mismatch mutagenesis can create a predetermined single nucleotide change in reate a predetermined single nucleotide change in

any cloned geneany cloned gene

5.5.3 PCR-based mutagenesis includes 5.5.3 PCR-based mutagenesis includes coupling of desired sequences of chemical coupling of desired sequences of chemical

groups to a target sequence and site-specific groups to a target sequence and site-specific mutagenesismutagenesis

PCR mutagenesisPCR mutagenesis

5.6 Cloning systems designed 5.6 Cloning systems designed to express genesto express genes

5.6.1 large amounts of protein can be prod5.6.1 large amounts of protein can be produced by expression cloning in bacterial celluced by expression cloning in bacterial cellss

▶ ▶ Expression vectorExpression vector

적절한 유전자 조절 적절한 유전자 조절 DNA DNA 서열과 프로모터 서열과 프로모터 DNA DNA 서열을 서열을 가지고 있어서 세포내에서 단백질을 암호화하는 가지고 있어서 세포내에서 단백질을 암호화하는 DNA DNA 삽입물을 효과적으로 전사시킬 수 있다삽입물을 효과적으로 전사시킬 수 있다 . . 그래서 이들 그래서 이들 벡터로부터 대량 합성된 벡터로부터 대량 합성된 mRNAmRNA 는 세포 안에서 단백질로 는 세포 안에서 단백질로

번역된다번역된다 ..

5.6.1 large amounts of protein can be 5.6.1 large amounts of protein can be produced by expression cloning in bacterial produced by expression cloning in bacterial

cellscells

Phage displayPhage display▶▶ Cell surface Cell surface displaydisplay 는 박테리아는 박테리아 , , 효모와 같은 미생물의 효모와 같은 미생물의

표면 단백질을 표면 단백질을 surface anchoring motif(surface anchoring motif( 표면 발현 모체표면 발현 모체 ))로 사용하여 외래 단백질을 미생물 표면에 안정적으로 로 사용하여 외래 단백질을 미생물 표면에 안정적으로 발현시키는 기술로서 최근에 등장한 새로운 분야이다발현시키는 기술로서 최근에 등장한 새로운 분야이다 . .

▶ ▶ phagephage 의 표면은 박테리아보다 단순하기 때문에 의 표면은 박테리아보다 단순하기 때문에 phagephage 표면에 외래 단백질을 발현시키는 연구가 먼저 표면에 외래 단백질을 발현시키는 연구가 먼저 진행되어졌다진행되어졌다 . .

Filamentous Filamentous phagephage 의 의 ssDNAssDNA 를 이용하여 를 이용하여 coat coat 단백질에 외부 단백질을 연결시켜 단백질에 외부 단백질을 연결시켜 host bacteria host bacteria 내에서 내에서 표현하고표현하고 , helper , helper phagephage 의 의 replication systemreplication system 과 부족한 과 부족한 phagephage coat coat 단백질을 이용해 단백질을 이용해 packagingpackaging 되면서 외부 되면서 외부 단백질을 단백질을 phagephage surface surface 표현할 수 있다표현할 수 있다 . .

5.6.2 Phage display is a form of expression 5.6.2 Phage display is a form of expression cloning in which protein are expressed on cloning in which protein are expressed on

bacterial cell surfacesbacterial cell surfaces

5.6.2 Phage display is a form of expression 5.6.2 Phage display is a form of expression cloning in which protein are expressed on cloning in which protein are expressed on

bacterial cell surfacesbacterial cell surfaces

5.6.3 Eukaryotic gene expression is 5.6.3 Eukaryotic gene expression is carried out with greater fidelity in carried out with greater fidelity in

eukaryotic cell lineeukaryotic cell line

▶ ▶ TransdutionTransdution 숙주세포 형질의 유전적 형질이 박테리오 숙주세포 형질의 유전적 형질이 박테리오 파지의 중개로 하나의 세포에서 다른 세포로 파지의 중개로 하나의 세포에서 다른 세포로 옮겨가는 것을 말합니다옮겨가는 것을 말합니다 ..

▶ ▶ TransfectionTransfection

DNADNA 를 를 culture culture 중인 중인 cell cell 내로 유입시켜 외부 내로 유입시켜 외부 DNADNA 가 세포 내에서 발현되도록 하는 것가 세포 내에서 발현되도록 하는 것



CellCell 에 에 expression vectorexpression vector 를 삽입했을 경우에를 삽입했을 경우에

Stable expressionStable expression vectorvector 가 가 genomegenome 에 에 integration integration 되어 되어 expressionexpression 을 을

하게 되는 경우하게 되는 경우

Transient expressionTransient expression genomegenome 에 에 integration integration 되지 않고 되지 않고 episomeepisome등으로 등으로 존재하게 되는 경우존재하게 되는 경우







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CHAPTER FIVE Amplifying DNA : PCR and cell-based DNA cloning 면역학 실험실 석사 1 년 지혜진