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Chvez Ornela Colunga, Ral Domnguez, Fernando Fedrigo, Mara E. Gaona, Romina Marassi, M. Lorena

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Investigacin en biotecn0loga forestal 1) Avances en estrategias y herramientas genmicas Principales estrategias en genmica Situacin en Argentina 2) Organismos genticamente modificados Objetivos Ejemplos en Amrica Latina

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1) Avances en estrategias y herramientas genmicas (Principales estrategias) Las tcnicas de marcadores moleculares para la localizacin de genes simples y loci involucrados en caractersticas cuantitativas (QTLs) han permitido identificar intervalos genmicos relativamente amplios, y por lo tanto decenas o centenas de genes, y no los genes efectivamente involucrados en el control de la caracterstica.

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Slo una estrategia de mapeo de polimorfismos de secuencia que estn suficientemente prximos a una mutacin funcional revelar asociaciones entre marcadores moleculares y caracteres de inters, mas precisas. Informacin de estos mapas, conjuntamente con la generada por diversos proyectos genmicos de Arabidopsis thaliana, Populus trichocarpa y Eucalyptus grandis, permitieron el desarrollo de nuevas estrategias para la identificacin de genes involucrados en caractersticas de inters

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Con la info. Genmica disponible, se ha utilizado la estrategia del anlisis del gen candidato para la identificacin de genes subyacentes en QTLs, por ej. En el pino, genes involucrados en la sintesis de lignina. En Eucalipto, mediante la estrategia de gentica genmica se vio que QTLs para crecimiento colocalizaron con eQTLs (expressed QTLs) para genes relacionados a contenido de lignina, sugiriendo que crecimiento y lignina estaran controlados por los mismos loci. En lamo, se estudiaron combinadamente QTLs, microarreglos y genes candidatos para identificar genes involucrados en tolerancia a sequa

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Para determinar loci y alelos responsables de las diferencias fenotpicas, se emplea el mapeo de asociacin a partir de la busqueda de variantes de genes candidatos. En contraste con el mapeo de QTLs, los marcadores que muestran asociacin con un carcter fenotpico, estn muy cerca o directamente en el gen que influye en el carcter

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Estas estrategias se refieren al estudio de la variabilidad de los fenotpos naturales para la bsqueda de las variantes genticas que los causan. Pero no son las unicas, existen otras alternativas que consisten en la modificacin de un fenotipo, a travs de los anlisis de anulacin (knock out) o sobreexpresin de un gen mediante plantas transgnicas

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Independientemente de las estrategias utilizadas, una vez identificados los fenotipos beneficiosos, pueden seguirse dos caminos: 1) identificar genotipos que contengan estos alelos de inters e introducirlos en los programas de mejoramiento/conservacin 2) modificar genticamente clones elite con estas variantes

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SITUACIN EN ARGENTINA: Estudios de Gentica Ecolgica Forestal La desforestacin a nivel mundial y en Argentina avanza constantemente, por lo cual urge actuar rpidamente en la conservacin del bien comn forestal, ya que de el depende la conservacin de la diversidad gentica y el uso adecuado de la misma en procesos productivos.

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Los diferentes marcadores moleculares en funcin de su utilidad para reflejar el verdadero nivel de variacin gentica a diferentes escalas espacio temporales son: Marcadores A) Procesos evolutivos a grandes escalas espaciotemporales B) Procesos evolutivos recientes C) Impacto actual de disturbios de diversidad gentica en escala local

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A)Se destaca el uso de marcadores geneticos de ADNm o ADNcp La organizacin molecular del genoma de cloroplasto es extremadamente conservada por lo que diferentes taxones mantienen un mismo arreglo lineal de sus genes Esto permite el monitoreo de la distribucin espacial de su variacin y en grandes escalas y la reconstruccin de su historia evolutiva y rutas migratorias.

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B) Para los objetivos del segundo grupo de marcadores, se utiliza principalmente la informacin del ADN nuclear, sujeta a una mayor tasa de mutacin, herencia biparental y recombinacin de la info. Gentica Ejemplo: Estudios realizados en Austrocedrus chilensis permitieron encontrar que las poblaciones de esta especie, fuera de los parques nacionales, son las que contienen la mayor diversidad gentica

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C) El tercer grupo de marcadores es utilizado en estudios de procesos de importancia evolutiva y de gentica espacial a escala local, los cuales requieren marcadores hipervariables, codominantes o dominantes. Entre estos procesos figuran estimaciones de flujo polnico actual, estructuracin gentica en diferentes estratos generacionales, impacto del uso silvcola en la diversidad gentica, etc.

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Un huerto semillero constituye una plantacin de clones o progenies seleccionados intensivamente sobre la base de caractersticas de importancia econmica Marcadores de utilidad en la produccin y mejora, en huertos semilleros de especies forestales de rpido crecimiento

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Para la PRODUCCION, los marcadores mas utilizados son los microsatelites, tambin llamados SSRs, con el objeto de: Correcta identificacin de clones elite Identificacin de los progenitores Estimar el nivel de contaminacin de polen de fuentes externas en huertos semilleros. Conservar nicamente aquellos clones o individuos que han sido de importancia econmica Los cuales constituyen factores crticos en la produccin de especies comerciales.

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Otra importancia de los marcadores en huertas como por ejemplo de Eucalyptus, es evitar la endogamia, suceso que conlleva a consecuencias desfavorables en la produccin como son: Reduccin de los niveles de produccin de semillas Reduccin de la altura y volumen de la planta Deformacin de las hojas y de tallos. Para lo cual el uso de los marcadores es imprescindible, permitiendo evitar la implantacin de clones genticamente relacionados en bloques continuos..

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En cuanto a la MEJORA de poblacin se utilizan junto a los SSR, los AFLP con la finalidad de disear clones a partir de la seleccin de un organismo con caracteres morfometricos de inters que maximicen el progreso en la mejora gentica, optimizar la estructura de las poblaciones de MEJORA y PRODUCCION y desarrollar nuevas estrategias de seleccin.

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EVALUACION DE VARIABILIDAD FUNCIONAL EN PROGRAMA DE MEJORAMIENTO Y DOMESTICACION En los programas de mejoramiento y domesticacin de Argentina, se incorporaron y desarrollaron nuevas estrategias dirigidas a optimizar la calidad de la madera en especies del gnero Eucalyptus, como as tambin analizar caractersticas adaptativas en especies nativas. FINALIDAD: Detectar variantes allicas responsables de la expresin del carcter.

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2 ejemplos: 1) El contenido y composicin de lignina es importante en la produccin de pulpa para la industria del papel, pero por otro lado, el bajo contenido de este polmero tambin es importante para la utilizacin de los residuos forestales en la generacin de biocombustible (bioetanol).

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En una primera etapa se caracterizo un huerto semillero clonal (27 arboles) de E. grandis. Tanto la variabilidad de los genes candidatos involucrados en la va metablica como en el contenido y composicin de lignina, se encontraron escasas diferencias fenotpicas entre individuos y algunas variantes allicas diferentes. En cuanto a la bsqueda de QTLs asociados a densidad de madera se trabaj en poblaciones segregantes locales de E. grandis y en el desarrollo de marcadores funcionales de tipo EST-SSR a partir de secuencias publicadas de E. globulus.

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2) Segunda aplicacin del programa: estudio de la variabilidad a nivel de nucletidos de genes involucrados en tolerancia a estrs tales como sequia y salinidad. Los genes seleccionados se estudiaron en las poblaciones de Austrocedrus chilensis y Prosopis spp. (siendo stas especies forestales nativas de importancia econmica, de rpido crecimiento y con un alto potencial adaptativo)

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A partir de ESTs de Pinus pinaster, P. taeda, Prosopis juliflora y genes de Arabidopsis y Criptomeria japonica, se diseo de cebadores, amplificacin y anlisis de fragmentos con alto porcentaje de similitud a los depositados en la base de datos. En Austrocedrus chilensis se analizaron porciones de los genes Pal 3, LP3-1 y Aquaporinas en genotipos contrastantes sin detectar aun asociacin. En Prosopis se evaluaron 5 genes en genotipos de las especies Prosopis flexuosa, P. chilensis Y P.alba con comportamientos contrastantes frente al estrs hdrico.En los genes HAK3P, ERD 15, PHD finger y Rab7 se detectaron SNPs diferenciales entre especies que habitan las distintas regiones.

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Conclusiones y perspectivas Marcadores moleculares para manejo asistido de poblaciones de mejora y en gentica ecolgica, han sido aplicados en Arg. Avances logrados mundialmente a nivel genmico en especies modelo podrn ser utilizados en otras especies con el fin de explotar la variacin gentica de poblaciones de mejora o nativas. Para el descubrimiento de nuevos genes, ser tambin necesario generar e incorporar en bases de datos publicas, secuencias de ESTs, logradas a travs de experimentos en gneros y especies en las que las disponibilidad actual de proyectos de secuenciacin no este prevista o sea difcil por la complejidad del genoma (conferas). A partir de estas bases de datos y de las metodologas de alto desempeo se podrn detectar gran cantidad de SNPs en forma paralela, a un costo razonable y finalmente podrn utilizarse en estudios de asociacin gentica.

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Por lo tanto, la gentica de asociacin promete ser la estrategia elegida en todos los gneros y en donde el objetivo es correlacionar la distribucin de los genotipos de los genes candidatos como secuencias de ADN, y los fenotipos relevantes. Por esta razn, seguirn siendo clave la seleccin de los genes candidatos, la capacidad de caracterizar apropiadamente los fenotipos y la habilidad de utilizarlos para manipular va mejoramiento molecular o transgnesis. Todas estas metodologas, adems de mejorar el conocimiento del control gentico de caractersticas de inters(alelos de importancia econmica y ecolgica), reduciran los costos y tiempos de mejoramiento y ayudaran en la conservacin.

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2-Modificacin Gentica de Especies Forestales Sistemas de transformacin: Agrobacterium tumefaciens en Angiospermas y bombardeo de partculas en Gimnospermas Problemas: regeneracin de plantas Una de las aplicaciones mas importantes es: investigacin biolgica de los rboles. Utilizacin comercial: es esencial disponer de marcos reglamentarios para el ensayo, seguimiento y gestin de OGM, utilizando reproduccin controlada.

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Objetivos estudio de la funcionalidad de los genes Aumento en la produccin de biomasa Cambios en la estructura de la madera Aumento de la tasa de crecimiento Incremento del volumen del tronco Periodo de reposo Introducir resistencia a insectos y hongos tolerancia a herbicidas tolerancia a estrs bitico y abitico

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Para ello: - Se han modificado la expresin de genes que participan en la sntesis de hormonas vegetales por ejemplo: gen ipt de Agrobacterium tumefaciens, que codifica una enzima para la produccin de citocininas. -se han sobreexpresado o inhibido genes involucrados en la sntesis de lignina. Por ejemplo en lamo, pino y eucaliptus, reduciendo la expresin del gen 4cl y aumentando la del gen f5h se redujo un 45% el contenido de lignina y se aumento de 15% de celulosa -se ha logrado rboles tolerantes a suelos cidos y sequia, con el gen DREB1A de Arabidopsis thaliana en hbridos de Eucalyptus grandis x E. urophylla

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Modificacin de la floracin: esterilidad reproductiva, utilizando gen PTD de Populus trichocarpa Utilizacin de plantaciones fitorremediar: hbridos de Populus usando gen de mamferos del citocromo P450 para detoxificar tricloroetileno; se ha sobreexpresado un gen de fitoquelatinas para la eliminacion de cadmio

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rboles transgnicos en Amrica Latina En algunos pases de Amrica Latina se estn desarrollando proyectos de transformacin gentica de rboles para su comercializacin: En chile se est tratando de obtener pinos resistentes a la mariposa del brote. investigadores brasileos, han participado en el desarrollo de lamos y eucaliptos transgnicos. Empresas brasileas estn desarrollando eucaliptos con la cantidad de lignina modificada, para la produccin de papel. -En Mxico se estn ensayando nuevos genes para incrementar el crecimiento en Pawlonia sp. En Argentina, tanto el INTA como la UNLP han iniciado proyectos de modificacin gnica de clones de lamos para modificar la lignina, para tolerancia a herbicidas y resistencia a insectos.

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Conclusiones La modificacin gentica en el sector forestal es mas que una cuestin tcnica hay que tener en cuenta: -los valores socio culturales los mltiples usos e los bosques la aceptacin de la opinin publica Se necesitan protocolos fiables, experimentados y convenidos para evaluar los riesgos de los arboles forestales genticamente modificados. En consecuencia el desarrollo, ensayo y aprobacin de los arboles forestales genticamente modificados, para una utilizacin mas general puede sufrir costos elevados y tener plazos muy largos.

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La manipulacin gentica a nivel forestal se realiza en al menos 25 pases. En china se establecieron plantaciones de arboles genticamente modificados, con genes de resistencia a insectos. Si se decide liberar comercialmente estos arboles es condicin utilizar materiales con reproduccin controlada. La madera es vital para la economa mundial, pero la presin del desarrollo humano y el crecimiento de la demanda estn contribuyendo a la degradacin de ecosistemas forestales naturales. La modificacin gentica y otras biotecnologas pueden tener una funcin importante en las plantas forestales.