Chiral HPLC Manual

HPLC Hewlett Packard 1100

Program info Chemstation for LC 3D Rev.A.09.03

1. 기기 및 프로그램 준비

1) sample 준비

HPLC용 vial에 분석하려는 물질의 solution을 준비한다. 1 mg/ml 농도의 solution을 vial에 1~1.5ml 정도

담는다. Solvent가 너무 polar한 경우 분석에 영향을 미치기 때문에 주의한다. (일반적으로 hexane 권장)

2) 분석에 필요한 column을 선택한다.

작성일 현재 사용되고 있는 column은 IA, OD-H, silica 총 3개이며, 오른쪽 서랍에 다수의 column들이

있으나 고장 여부가 확인되지 않으므로 사용을 권장하지 않음.

Figure 1 [1]eluent in [2]filter (각 필터는 장착한 컬럼관에 맞는 모델입니다. 바뀌지 않게 주의하세요) [3]eluent out, [4]보관용나사

- 위부터 순서대로 OD-H, IA, silica

Chulbom Lee

Group

3) HPLC를 켜기 전에 필요한 column이 연결되어 있는지를 확인한다.

만일 필요한 column이 아닌 경우 교체를 해주어야 한다. 사진에 표시된 나사를 풀어 원하는 column에

연결해주면 된다. 교체된 column은 보관용 나사를 사용하여 양 끝이 막혀있도록 해주어야 한다. 연결

할 때에는 eluent를 흘려주는 방향에 맞춰서 연결해야 하기 때문에, 연결 전에 방향이 제대로 연결되었

는지를 확인해야 한다. (오른쪽에서 왼쪽으로 흐르는 방향)

4) HPLC의 전원을 켠다.

파트별로 총 4개의 전원 스위치가 있으며, 각각 눌러서 모두 전원을 켠다. 물론, 연결된 컴퓨터의 전원

도 켠다. (부팅 비밀번호 : synmed)

5) HPLC 프로그램을 실행한다.

프로그램을 실행하기 이전에 자동으로 실행 돼 있는 CAG Bootp Server를 클릭해서 아래와 같이

finished임을 확인한 뒤 바탕화면의 1100SeriesOnline을 더블클릭한다.

Chulbom Lee

Group

6) 메뉴창의 Instrument → System On 을 누른다.

누른 뒤 가운데 그림의 회색이 초록색으로 바뀔 때 까지 기다린다.

7) 컬럼관을 씻고 시료를 분석할 eluent조성으로 안정화 시켜준다. (컬럼관이 깨끗하면 생략)

Chulbom Lee

Group

주사기 옆의 화살표를 클릭하여 Set up Pump를 누르면 다음과 같은 창이 나타난다.

2 번 solvents 항목에서 eluent 조성을 바꿀 수 있다. (system on 을 한 이후에는 여기서 선택한 조성으로

항상 eluent 가 흐르고 있다.) Hex:IPA= 80:20 으로 30 분간 컬럼관을 세척한 후 실제 분석에 사용할 eluent

조성으로 30 분간 흘려준다.

1

2

Chulbom Lee

Group

2. 시료분석-sample 이 하나일 때

1) 하나찍기모드 선택

2) Sample 정보를 입력한다.

프로그램 좌측의 바이알을 클릭한 뒤 Sample Info를 누르면 측정하고자 하는 Sample의 정보를 입력하는

창이 나타난다. 다 작성한 뒤 OK 클릭.

Chulbom Lee

Group

○1 Operator Name : 사용자 이름

○2 Prefix / Counter : 저장되는 data file의 이름, 보통 해당 날짜, counter는 같은 prefix 하에서 sample

찍을 때마다 자동으로 바뀜

○3 Subdirectory : data가 저장되는 폴더

○4 Location : sample vial의 위치

○5 Sample Name : sample의 이름, 길이 제한이 있음.

○6 Comment : 주로 eluent, flow rate, column의 종류를 기록함.

3) injection 정보 입력

주사기를 클릭하여 Set up Injector를 누르면 다음과 같은 창이 나타난다.

1

3

2

4

5

6

Chulbom Lee

Group

○1 Injection: 별도의 washing을 해줄 경우 두 번째, 아닌 경우 standard injection으로.

○2 Injection Volume: 보통 5.0 또는 10.0

○3 Wash Vial: ○1 에서 두 번째에 체크한 경우 needle을 씻어 줄 washing solution(일반적으로 hexane)이

있는 vial 위치

4) Elution 조건 설정하기

주사기 옆의 화살표를 클릭하여 Set up Pump를 누르면 다음과 같은 창이 나타난다.

○1 Control: flow rate, stop time(분석시간), post time(분석이 끝나고 다음 분석까지의 시간 sequence 이용

시 필요)

○2 Solvent: eluent 조절

○3 Timetable: 시간대별 eluent 조성 조절.

5) 측정 파장 선택

DAD를 클릭하여 Set up DAD Signals를 누르면 측정 파장대를 선택할 수 있다.

1

2

3

Chulbom Lee

Group

6) 분석시작 및 정지

화면 좌측 상단의 Start를 눌러 측정을 시작한다.

측정을 시작하기 전에 signal 창을 확인하여 측정하고자 하는 eluent setting 하에서 signal이 수평으로

유지되는지를 확인한다.

측정이 끝나면 Stop을 눌러 수동으로 정지시킨다.

Set up Pump에서 Stop time을 지정해두었으면 자동으로 측정이 중지된다.

Chulbom Lee

Group

3. 시료분석-sample 이 여러개 일 때

1) 여러개찍기모드 선택

2) method 만들기

2. 시료분석-sample이 하나일 때 에서 수행했던 3)injector, 4)pump, 5)파장을 설정해준다.

메뉴의 method탭에서 save method as버튼을 눌러 원하는 method를 생성한다.

Chulbom Lee

Group

3) sequence table 설정

바이알을 눌러서 sequence table창을 연다.

○1 location: sample vial의 위치

○2 Sample Name: sample의 이름, 길이 제한이 있음.

○3 method: 사용할 method를 선택한다.

○4 inj/Location: 해당 sample을 injection하는 횟수 (가령 2를 선택하면 하나의 샘플을 두 번 측정한다.)

○5 sample info: 주로 eluent, flow rate, column의 종류를 기록함.

Chulbom Lee

Group

4) data file 저장위치 설정

바이알을 눌러서 sequence parameters창을 연다.

○1 Operator Name : 사용자 이름

○2 Prefix / Counter : 저장되는 data file의 이름, 보통 해당 날짜, counter는 같은 prefix 하에서 sample

찍을 때마다 자동으로 바뀜

○3 Subdirectory : data가 저장되는 폴더

5) 측정하기

화면 좌측 상단의 Start를 눌러 측정을 시작한다.

Method를 만들 때 Set up Pump에서 Stop time을 지정해 두지 않으면 첫 번째 샘플을 무한정 찍으니 주

의한다.

Chulbom Lee

Group

4. Data Analysis

1) data analysis 모드

화면 좌측 상단의 Method and Run Control 바로 옆의 화살표를 눌러 2 Data Analysis를 누르면 data

analysis 모드를 열수 있다. (hplc측정을 하지 않고 data analysis만 하려면 바탕화면의 instrument1 offline

프로그램을 사용해도 된다.)

2) data 불러오기

Chulbom Lee

Group

표시된 버튼을 눌러 data를 불러온다. ○1 에서 data가 있는 폴더를 선택하고 ○2 에서 원하는 파일을 선택한

다.

3) peak integration

○1 보고 싶은 파장을 선택한다. 파일을 로드 하면 측정된 모든 파장에서의 spectrum이 보인다 특정 파장

을 선택해서 해당파장에서의 spectrum만 볼 수 있다.

○2 spectrum을 확대 축소한다.

○3 integration 한다.

○4 integration을 지운다. (파일을 불러오면 auto integration이 되어있어 모든 peak이 table에 나온다.)

○5 화면에 보이는 spectrum을 인쇄한다.

4) spectrum 범위 지정

Report 탭에 specify report를 누른다.

Chulbom Lee

Group

Specify report에서 signal option을 누른다. Signal option 창에서 ○1 에서 x축(time lange) ○2 에서 y축(peak

intensity)범위를 정한다.

5) 프린트

원하는 peak을 integration하고, spectrum의 x축 y축 범위를 지정한 후 ○5 프린트 버튼을 누른다.

5. 분석을 마치고

1) Washing Column

측정이 모두 완료되었으면 Hex/iPrOH=80:20 으로 설정을 바꾸고 약 30분간 eluent를 흐르게 하여

column 내부를 씻어준다.

2) Instrument → System Off를 누른다.

3) 프로그램 및 CAG Bootp Server를 끄고 컴퓨터 또한 종료시킨다.

CAG Bootp Server가 종료되지 않으면 컴퓨터가 꺼지지 않으니 주의한다.

4) HPLC 기기의 스위치 4개를 각각 눌러 기기의 전원을 끈다.

Chulbom Lee

Group