CHROMOSOME CHROMOSOME WALKINGWALKING

BARDZO TREŚCIWY SKRÓTBARDZO TREŚCIWY SKRÓT

PIĘĆ WYBRANYCH METOD PIĘĆ WYBRANYCH METOD SPACEROWANIA PO CHROMOSOMIESPACEROWANIA PO CHROMOSOMIE

T- LINKER PCRT- LINKER PCR

SITE FINDING PCRSITE FINDING PCR

BD GENOME WALKER PCRBD GENOME WALKER PCR

INVERSE PCRINVERSE PCR

TAIL PCRTAIL PCR

T -T -LINKER LINKER PCRPCR

PRZYKŁAD – NIE MÓJPRZYKŁAD – NIE MÓJ

SITE FINDER SITE FINDER PCRPCR

STRUKTURA PRZYKŁADOWEGO SITE FINDERASTRUKTURA PRZYKŁADOWEGO SITE FINDERA

SITE FINDING PCRSITE FINDING PCR

KNOWN SEQUENCEUNKNOWN SEQUENCE

GSP 3 GSP 1GSP 2

Site finder

NNNNNNNNNCGCGNNNNNNN

GCGC

TTAGAAC

AATCTTG

KNOWN SEQUENCE

GSP 3 GSP 2 GSP 1

KNOWN SEQUENCEUNKNOWN SEQUENCE

GSP 3 GSP 1GSP 2

Site finder

NNNNNNNNNCGCGNNNNNNN

GCGC

TTAGAAC

AATCTTG

KNOWN SEQUENCE

GSP 3 GSP 2 GSP 1

KNOWN SEQUENCEUNKNOWN SEQUENCE

GSP 3 GSP 1GSP 2

Site finder

NNNNNNNNNCGCGNNNNNNN

GCGC

TTAGAAC

AATCTTG

KNOWN SEQUENCE

GSP 3 GSP 2 GSP 1

CZY SITE FINDER JEST WAŻNY ?CZY SITE FINDER JEST WAŻNY ?

BD Genome BD Genome Walker Walker TMTM

STRUKTURA ADAPTORASTRUKTURA ADAPTORA

KONSTRUKCJA BIBLIOTEKIKONSTRUKCJA BIBLIOTEKI

32X

7X

 TEMPERATURA [ oC ] CZAS [ s ]

Denaturacja wstępna

98 120

Denaturacja właściwa

98 30

Annealing/polimeryzacja

72 180

DenaturacjaDenaturacja 98 30

AnAnnnealing/ ealing/ AmplifikacjaAmplifikacja

67 180

Wydłużanie Wydłużanie końcowekońcowe

67 300

PauzaPauza 4 ∞        

...ACATGGTCGATGCCTTATGGTCCTGAAAA...

CO ZROBIĆ Z OTRZYMANĄ CO ZROBIĆ Z OTRZYMANĄ SEKWENCJĄ ?SEKWENCJĄ ?

BLAST ALIGNMENT

ANALIZY ANALIZY LABORATORYJNELABORATORYJNE

I-PCR ( INVERSE PCR)I-PCR ( INVERSE PCR)

HI – TAIL PCRHI – TAIL PCR

(( High-efficiency thermal asymmetric interlacedHigh-efficiency thermal asymmetric interlaced )

SITE FINDING PCR

Low temp. Annealing

Site finding primer

-

High

90%>

0-4kb

low

PODSUMOWANIEPODSUMOWANIE