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Estudio de detección de genes de resistencia antibiótica en E. Coli , en medio ambiente de
granja: agua, suelo, cultivos y silo de maíz destinado a la alimentación de cerdos luego
del fertirriego
Alejandro L. Soraci MV.; Dr. Cs Vet.; Ph.D. *
Raúl Lasorella . Agr.**
Nora lía Padola MV.; Dr. Ciencia Animal***
Daniel Fernández MV,; Dr. Ciencia Animal***
Susana N. Dieguez Lic. Bilog.; M.Sc. *****
(*) Laboratorio de Toxicología Dpto. Fisiopatología FCV-UNCPBA -CIVETAN
(**) Establecimiento Las Taperitas S.A. Producción Porcina. Rafaela. Santa Fe.
(***) Inmunoquímica y Biotecnología, Laboratorio de ADN, FCV. UNCPBA
(*****) Laboratorio de Toxicología Dpto. Fisiopatología FCV-UNCPBA - CICPBA
Introducción
Con el advenimiento de nuevas técnicas de cultivo, automatización de equipamiento, manejo y
crianza de animales, la actividad porcina argentina se encuentra en franco crecimiento,
ampliando el número de animales y mejorando sus instalaciones. Dicho crecimiento conlleva
nuevas problemáticas, de las cuales la gestión medio ambiental de los subproductos (mal
llamados efluentes) de cada una de las instalaciones de la granja ocupa un lugar central. Los
volúmenes de producción en litros por animal por día dependen de la etapa fisiológica de los
animales. Así, cerdas en gestación y lactación producen alrededor de 15 y 19.6 L/ animal /día
respectivamente, mientras que durante la fase de post destete y terminación los valores
estimados son de 1.68 y 7.8 L/ animal/día respectivamente.
Los importantes volúmenes de subproductos provenientes de cada una de las instalaciones de
la granja, sumados al agua de lavado, constituyen una fuente de fertilizante orgánico muy
importante, fertirriego, que debe ser manejada racionalmente. En una primera instancia los
esfuerzos han sido dirigidos a controlar la concentración de nitrógeno y fósforo en los vertidos,
así como los olores y la calidad del aire. Sin embargo, dichos subproductos representan un riesgo
sanitario significativo, asociado con la diseminación de bacterias resistentes a los antibióticos. En
efecto, la utilización indiscriminada de antibióticos bajo la modalidad terapéutica, metafiláctica
o como factor de crecimiento, es causa de cambios en la flora intestinal porcina. Estos cambios
se relacionan con la generación de resistencia antibiótica en la microbiota comensal, con
capacidad de transmisión de material genético a otras comunidades bacterianas, entre ellas
patógenas, representando un importante riesgo para la salud pública.
Una de las formas de diseminación de resistencia se encuentra representada por integrones,
familia de elementos genéticos capaces de integrar y expresar genes de resistencia a los
antibióticos. La diseminación de estos genes aumenta considerablemente cuando ellos forman
parte de cassettes genéticos móviles, lo cual los habilita para su transferencia horizontal por
varios mecanismos.
El objetivo del presente trabajo fue determinar la persistencia de genes de resistencia antibiótica
(integrasas) en E. Coli, aislada de lagunas de permanencia de subproductos procedentes de
granjas de cerdos, en agua de bebida, en tierra destinada a cultivo luego de la descarga de los
subproductos través de fertirriego, en grano de maíz cosechado en dicho suelo y en el maíz
fermentado antes de ser administrado como alimento a animales en producción (cerdos o
bovinos de leche).
Protocolo Experimental
Manejo de subproductos de granja destinados a fertirriego: Sistema de Sedimentación-
Decantación-Permanencia-Fertilización (SDPF)
Los subproductos provenientes de cada una de las instalaciones de la granja fueron bombeados
a las lagunas de sedimentación durante 30 días. Luego se realizó la decantación mecánica
desde la laguna de sedimentación a la laguna de permanencia. En esta última el líquido
permaneció un mínimo de 120 días.
Figura 1 y 2 : Sistema SDPF (sedimentación-decantación-permanencia-fertilización)
Luego de este tiempo, se realizó la fertilización de los suelos previo a la siembra de maíz,
teniendo en cuenta el pronóstico meteorológico para asegurar la ausencia de precipitaciones en
los días posteriores. En este proceso se involucró fertilización líquida (agua de lagunas de
permanencia) y abono orgánico (subproducto de la limpieza de laguna de sedimentación).
Fertilización líquida: El fertirriego fue realizado en 2 aplicaciones mediante el empleo de
un sistema tipo cañón (big gun sprinkler), con una separación de 30 días entre la primera
y la segunda aplicación incorporando al suelo un total de 16 a 37 mm por hectárea (Fig 5).
Figura 3 : fertirriego.
Abono orgánico: Durante el primer y segundo fertirriego, se aplicó abono orgánico a razón
de 5mm por hectárea.
Figura 4 : Aplicación de abono orgánico.
Fig. 5: Zona de fertirriego y muestreo
Muestreos:
Los muestreos descriptos a continuación fueron realizados en ausencia de precipitaciones
durante 48 h previas a los mismos. Todas las muestras fueron colectadas en tubos estériles de
polipropileno tapa a rosca, refrigerada a 4 C ° e inmediatamente enviada al laboratorio para su
procesamiento y análisis.
Laguna de permanencia: Para el muestreo de laguna se consideraron los centros y
periferias de cada una de ellas. Se tomaron muestras de 50 ml a tres profundidades:
superficie, medio y fondo. Las muestras fueron rotuladas como SE: sureste, SO: suroeste,
C: Central, NE: noreste, NO: noroeste (Fig 1).
Tierra destinada al cultivo de maíz luego de fertirriego: Se utilizó la metodología propuesta
por el INTA. Las áreas de muestreo fueron lo más homogéneas posible. El muestreo
consistió en realizar un recorrido en zig-zag tomando en cada punto una muestra simple
(submuestra) con un total de 10 submuestras por hectárea. Para la extracción de cada
submuestra se eliminó la cobertura vegetal u hojarasca de cada punto elegido, evitando
eliminar la capa superficial de suelo. Cada muestra simple se obtuvo cavando 0-15 cm de
profundidad, y procediendo a sacar una porción de 3 cm de espesor aproximadamente.
Posteriormente se mezclaron las submuestras de los puntos sucesivos, formando una
muestra compuesta la cual fue considerada para el análisis.
Maíz cosechado: El muestreo fue realizado al momento de la cosecha. Se tomaron 5
muestras de 150 g c/u mediante el uso de un calador cilíndrico de grano, a 40 cm de la
pared del chasis de almacenamiento en los cuatro ángulos del mismo y una muestra
equidistante en la zona central.
Figura 6 : Cosecha de maíz.
Silo confeccionado: El grano cosechado húmedo fue sometido a un proceso de molienda
y almacenamiento en un sistema anaerobio. Se tomaron 5 muestras de 150 g c/u
mediante el uso de un calador cilíndrico a partir del centro y los laterales del silo.
Figura 7 : silo de maíz molido.
Silo destinado a la alimentación: Este muestreo se realizó luego de 45 días del proceso
de fermentación. Cinco muestras de 150 g c/u fueron tomadas al azar a partir del mixer.
Agua de pozo destinada al consumo de animales de granja: Se realizaron muestreos de
50 ml c/u, de los pozos de agua que se encontraban entre 200 y 500 m de los lotes
sembrados. Las muestras fueron recolectadas evitando la agitación y perturbación en el
sistema subterráneo, siguiendo las recomendaciones de la guía ASTM D 4448 Standard
Guide for Sampling Ground-Water Monitoring Wells.
Análisis: Detección de integrones en muestras de agua, suelo y alimento
Las muestras remitidas se suspendieron en 100 ml de solución fisiológica (0,85% de NaCl)
y se centrifugaron 2 min a 480 g. Se recuperó el sobrenadante y se centrifugó 4 min a 12000 g.
El precipitado se resuspendió con 1 ml agua bidestilada estéril. Una alícuota de cada muestra se
incubó en 100 ml de agua de peptona 18-24 h a 37 °C con agitación a 100 rpm. Para la obtención
de los templados se tomaron 500 µl en un tubo Eppendorf y se agregaron 250 µl de CHELEX al
10%, incubando 30 min a 60°C. El ADN se obtuvo hirviendo durante 10 min 10 µl de sobrenadante
en 500 µl de agua bidestilada estéril. La reacción de PCR se realizó para detectar genes
codificantes de integrasa (tipo 1, 2 y 3) según protocolo y primers estandarizados.
Resultados
En la tabla I se muestran los resultados obtenidos de diferentes zonas de las lagunas de
permanencia. Todas las muestras fueron todas positivas a integrones de tipo 1
Laguna Región de la
laguna
Resultado
1 NE Integrón 1
1 SO Integrón 1
1 NO Integrón 1
1 C Integrón 1
1 SE Integrón 1
2 C Integrón 1
2 NO Integrón 1
2 SE Integrón 1
2 NE Integrón 1
2 SO Integrón 1
3 C Integrón 1
3 SO Integrón 1
3 NE Integrón 1
3 SE Integrón 1
3 NO Integrón 1
Tabla I: Integrones hallados en las diferentes lagunas de permanencia
Referencias: Tabla I
SE: Sureste
SO: Suroeste
C: Central
NE: Noreste
NO: Noroeste
En las muestras de suelo sometidas a fertirriego y abono orgánico para siembra de maíz, de
maíz cosechado en grano entero, de silo confeccionado, de silo al momento de suministrar
como alimento a los animales y agua de pozo destinada a bebida, no se detectó la presencia
de integrasas de ningún tipo.
Discusión y conclusiones
Las bacterias coliformes y en particular E. coli comensal, tienen un tiempo de vida limitado fuera
de su ecosistema principal (intestino). En su hábitat primario (el tracto gastrointestinal), estas
bacterias encuentran la temperatura adecuada y el aporte de nutrientes necesarios para su
crecimiento, con un tiempo de multiplicación de dos días aproximadamente (Savageau, 1983).
Los sedimentos y agua de subproducto de granja son considerados para estos microorganismos
como un hábitat secundario desfavorable (Winfield y Groisman, 2003; Campos-Pinilla et al.,
2008). Según los resultados de nuestros estudios, los efectos de sedimentación/decantación no
eliminan la presencia E. coli portadora de genes de integrasa de tipo 1 en lagunas de
permanencia. Resultados similares fueron a los obtenidos por Mourra y cols., 2012.
La determinación de este gen en todas las muestras de agua de lagunas de permanencia
analizadas destaca la necesidad de una “gestión racional” de dicho subproducto para evitar la
potencial diseminación de bacterias resistentes a los antibióticos por utilización directa de estas
aguas.
La ausencia de gen integrasa de tipo 1 en E.coli en muestras de tierra, agua, grano entero y
fermentado se correlaciona con un pobre crecimiento de estas bacterias en estos hábitats
secundarios, donde el tiempo de vida media en suelo sin cobertura no supera los 3 días (Temple
et al., 1980). A pesar ello, este tiempo es muy variable, dependiendo del tipo de materia fecal
(fuertemente relacionado con la especie animal y su situación fisiológica), el tipo suelo y la
vegetación. Estos resultados muestran que E. coli comensal portadora de integrones no
sobrevive en medio ambientes secundarios aun cuando dichos hábitats reciben un aporte
importante y continuo de subproductos de las instalaciones de la granja mediante un manejo
controlado y racional de fertirriego. Así, el fertirriego realizado sobre suelos con poca vegetación
disminuye considerablemente la capacidad de adherencia de E. Coli a las partes vegetales,
permitiendo una rápida exposición de las bacterias a los rayos UV. Además, la falta de vegetación
exacerba los cambios diarios de temperatura, humedad y exposición a nutrientes, lo que puede
llegar a disminuir rápidamente hasta un 50% la carga total de E.coli liberada al medio ambiente.
La rizosfera es la parte del suelo que se encuentra bajo la influencia directa de las raíces vivas y
que puede influenciar la supervivencia de bacterias comensales liberadas al medio ambiente. Se
trata de una capa de tierra de aproximadamente 1 mm alrededor de las raíces. La importancia
cuantitativa de los sistemas de raíces (y por tanto de la rizosfera) varía según las características
del suelo, del clima y de la comunidad de plantas. En la rizosfera, la planta libera una parte de
sus productos de fotosíntesis que sumados a la disponibilidad de nutrientes orgánicos permite
una estimulación sobre los microorganismos asociados a la planta, alcanzando entre 108 y 109
bacterias/g. Otra propiedad de la rizosfera es limitar la habilidad de supervivencia de algunas
bacterias, en particular E. Coli, mediante:
La liberación de toxinas y otros compuestos antimicrobianos por las raíces
El agotamiento de los nutrientes minerales relacionados con la nutrición de las plantas
(absorción por las raíces)
La acidificación de la rizosfera por las raíces, generando un medio ambiente hostil para las
bacterias que se encuentran en un hábitat secundario
La competición con la flora indígena de la rizoesfera
La porosidad de las raíces que es generalmente favorable a la depredación por las
actividades de protozoarios.
El tipo de suelo puede influenciar la supervivencia de E. Coli comensal. Los suelos muy arcillosos
son generalmente más favorables. Este efecto positivo puede ser resultado de la adsorción a la
arcilla y la protección frente a depredadores, particularmente de protozoos, una mayor retención
de agua y nutrientes, como así también, una mejor estabilidad a las variaciones de pH del suelo.
En nuestro estudio el suelo sometido a fertirriego fue clasificado como un argiudol típico serie
Rafaela (RAF1), con una textura horizonte superficial: franco-limosa, de buen Drenaje y con una
Aptitud agropecuaria de 90%. Estas condiciones de suelo limitarían la persistencia de E. coli en
el mismo.
La ausencia de E.coli portadora de gen int1 en el agua de pozo, puede deberse a su corta vida
en un medio ambiente secundario, sumado a que la aplicación del ferti riego se realizó
atendiendo rigurosamente a los pronósticos meteorológicos, descartando la posibilidad de lluvias
en días previos a la aplicación. Ogden y cols., (2001) demostraron que luego de realizado un
fertirriego, los riesgos de polución de las aguas subterráneas (transporte de bacterias) dependen
fuertemente de la presencia de precipitaciones, particularmente si estas ocurren inmediatamente
luego del mismo. Si las condiciones meteorológicas son buenas luego de la aplicación de
fertirriego, en suelos bien trabajados, es poco probable que ocurran importantes procesos de
lixiviación.
La falta de nutrientes específicos, degradación aeróbica del material orgánico esparcido,
diferencias de temperaturas, presencia de elementos quelantes, rayos UV, diferente
disponibilidad de agua y de una microflora medio ambiental competitiva , entre otros factores,
harían que el proceso de diseminación de E. coli portadora de genes de resistencia a antibióticos,
bajo las condiciones enunciadas en el protocolo experimental, no alcancen el agua de bebida,
los cultivos de granos de maíz, como así tampoco sus formas procesadas . Por lo expuesto el
fertirriego racionalmente manejado constituye una fuente económica y segura de abono que hace
sustentables los sistemas intensivos de producción porcina
Referencias
Campos-Pinilla C., Cárdenas M., Guerrero A. Comportamiento de los indicadores de
contaminación fecal en diferentes tipos de agua de la sabana de Bogotá (Colombia). Universitas
Scientiarum. 2008; 13 (2): 103-108.
Mouraa, A., Pereirab, C .,Henriquesa, I., Correiaa, A. Novel gene cassettes and integrons in
antibiotic-resistant bacteria isolated from urban wastewaters. Research in Microbiology Volume
163, Issue 2, February–March 2012, Pages 92–100.
Ogden I.D., Fenlon D. R., Vinten A.J.A. et al. The fate of E. Coli O157 in soil and its potential to contaminate drinking water. Int J Food Microbiol, 2001, 66, 111-117
Savageau M.A. Escherichia coli habitats, cell types, and molecular mechanisms of gene control.
Am. Nat. 1983; 122 (2): 732-744.
Winfield M.D. y Groisman E.A. Role of nonhost environment in the lifestyle of Salmonella and
Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 2003; 69 (7): 3687-3694.
Temple K. L., Camper A. K., McFeters G. A. Survival of two enterobacteria in feces buried in soil
under field conditions. Appl. Environ. Microbiol. 1980; 40: 794-797.
