cija · Прилог 5/1 ПРИРОДНo - mАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Prof.

Sintm

Mentdr Niko S

teza i monot

tor: S. Radul

Pr

spektrerpen

M

lović

Ni

Univrirodno-m

Depart

ralna kskih iz

Master ra

š, 2016. g

verzitet u matematičtman za h

karakzotioci

ad

god.

Nišu čki fakulthemiju

kterizaijanat

K Magda

et

acija a

Kandidatalena M.

t: Tasić

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Maгдалена M. Тасић

Ментор, МН: Нико С. Радуловић

Наслов рада, НР: Синтеза и спектрална карактеризација монотерпенских

изотиоцијаната Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2016.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: 8 поглавља; 150 страна; 175 цитата; 22 табеле; 13 слика; 67 шема; 42 прилога

Научна област, НО: хемија

Научна дисциплина, НД: органска хемија и биохемија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО:

монотерпенски изотиоцијанати, монотерпенски оксими, монотерпенски амини, цитрал, нерал, геранијал, миртенал, куминалдехид, синтеза, NMR, МТТ тест, цитотоксичност, канцер дебелог црева

УДК 54.057:546.268.6 543.42:546.268.6

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН: /

Извод, ИЗ:

У овом мастер раду остварене су синтезе монотерпенских изотиоцијаната полазећи од комерцијално доступних монотерпенских алдехида (цитрала - смеше нерала и геранијала, миртенала и куминалдехида). Синтезе су изведене у три корака: грађењем одговарајућих оксима реакцијом без растварача, њиховом редукцијом литијумалуминијум-хидридом до амина и конверзијом у изотиоцијанате, реакцијом амина са угљен-дисулфидом и накнадном оксидацијом насталих дитиокарбамата водоник-пероксидом. Извршено је препаративно раздвајање свих стереоизомерних оксима 3,7-диметил-2,6-октадиеналâ, а сви стереоизомерни оксими, амини и изотиоцијанати су спектрално окарактерисани и потпуно асигнирани помоћу 1D и 2D NMR, МS, IR и UV метода. Добијени монотерпенски изотиоцијанати су испитани на потенцијалну цитотоксичност према ћелијској линији канцера дебелог црева, HCT-116, користећи МТТ тест.

Датум прихватања теме, ДП: 09.03.2016.

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО:

Председник: Гордана С. Стојановић

Члан: Полина Д. Благојевић

Члан, ментор: Нико С. Радуловић

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: university degree thesis

Author, AU: Маgdalena M. Tasić

Mentor, MN: Niko S. Radulović

Title, TI: Synthesis and spectral characterization of isothiocyanate monoterpenes

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2016.

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: 8 chapters; 150 pages; 175 ref.; 22 tables; 13 pictures; 67 schemes; 42 appendixes

Scientific field, SF: chemistry

Scientific discipline, SD: organic chemistry and biochemistry

Subject/Key words, S/KW: isothiocyanate monoterpenes, oxime monoterpenes, amine monoterpenes, citral, neral, geranial, myrtenal, cuminaldehyde, synthesis, NMR, cytotoxicity, MTT assay, cytotoxicity, colon cancer

UC 54.057:546.268.6 543.42:546.268.6

Holding data, HD: library

Note, N: /

Abstract, AB:

In this Master's Thesis, the syntheses of selected isothiocyanate monoterpenes were performed, starting from commercially available aldehyde monoterpenes (citral - a mixture of neral and geranial, myrtenal and cuminaldehyde). This was achieved in three steps by a solvent-free synthesis of the corresponding oximes, their reduction with lithium aluminum hydride to the corresponding amines, and a transformation of the amines into isothiocyanates, by their reaction with carbon disulfide and the hydrogen peroxide-induced oxidative cleavage of the corresponding dithiocarbamates. Additionally, the preparative separation of all stereoisomeric oximes of 3,7-dimetylocta-2,6-dienal was performed and all stereoisomeric oximes, amines and isothiocyanates were spectrally characterized by 1D and 2D NMR, MS, IR and UV methods and their NMR spectra were fully assigned. The synthesized isothiocyanate monoterpenes were tested for potential cytotoxicity against a colon cancer cell line, HCT-116, using MTT assay.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 09.03.2016.

Defended on, DE:

Defended Board, DB:

President: Gordana S. Stojanović

Member: Polina D. Blagojević

Member, Mentor: Niko S. Radulović

Eksperimentalni deo ovog master rada urađen je u Laboratoriji za organsku analizu i sintezu (Departman za hemiju, Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Nišu).

Radom je rukovodio dr Niko Radulović, redovni profesor Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu, kome se ovim putem zahvaljujem na izdvojenom vremenu, pomoći i sugestijama u toku

izrade i pisanja rada.

Ispitivanje citotoksičnosti sintetisanih izotiocijanata vršeno je na Departmanu za biomedicinske nauke, Državnog univerziteta u Novom Pazaru, pod nadzorom dr Nataše

Đorđević i dr Zane Dolićanin.

Najsrdačnije se zahvaljujem i članovima komisije, prof. dr Gordani Stojanović i prof. dr Polini Blagojević, na korisnim sugestijama i savetima u završnoj fazi rada.

Zahvaljujem se svim kolegama, istraživačima iz Laboratorije za organsku analizu i sintezu,

prijateljima i posebno svojoj porodici na podršci, motivaciji i ljubavi.

Oznake i skraćenice Nomenklatura

terc- tercijarni

TMS- TriMethylSilyl (trimetilsilil)

Cy Cikloheksil

Me ili CH3– Metil

Et ili C2H5– Etil

Bu ili C4H9– Butil

Ph Fenil

R Alkil

CoA Coenzyme A (koenzim A)

Cys Cysteine (cistein)

Cyt Cytochrome (citohrom)

DNK DezoksiriboNukleinska Kiselina

ESP EpitioSpecific Protein (epitiospecifični protein)

Glc Glucose (glukoza)

Glu Glutamic acid (glutaminska kiselina)

Gly Glycine (glicin)

Gsl-alk GlucoSinoLate Alkylation (alkilovanje glukozinolata)

Gsl-elong GlucoSinoLate Elongation (elongacija glukozinolata)

Gsl-OH GlucoSinoLate with hydroxyl (-OH) group (glukozinolati sa

hidroksilnom (-OH) grupom)

Gsl-oxid GlucoSinoLate Oxidation (oksidacija glukozinolata)

GST Glutathione-S-Transferase (glutation-S-transferaza)

GTP γ-Glutamyl TransPeptidase (γ-glutamil-transpeptidaza)

MAM MethylthioAlkylMalate synthase (metiltioalkilmalat sintetaza)

NADH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Hydrogen (redukovani oblik

nikotinamid-adenin-dinukleotida)

NADPH

Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Hydrogen (redukovani

oblik nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfata)

NAT N-AcetylTransferase (N-acetil-transferaza)

NNK Nicotine-derived Nitrosamine Ketone

PAP PhosphoAdenosinePhosphate (fosfoadenozin-fosfat)

PAPS PhosphoAdenosinePhosphoSulfate (fosfoadenozin-fosfosulfat)

TFP Thiocyanate-Forming Protein (protein koji učestvuje u formiranju

tiocijanata)

UDP Uridine DiPhosphate (uridin-difosfat)

UDPG ili

UDP-Glc Uridine DiPhosphate Glucose (uridin-difosfat glukoza)

n n CH2 grupa ili normalni niz

α alfa (1,2 položaj u odnosu na funkcionalnu grupu)

para 1,4-disupstituisano benzenovo jezgro

β

beta (stereodeskriptor za anomer šećera kod koga je grupa vezana za

anomerni centar sa iste strane kao i -CH2OH grupa ili 1,3 položaj u

odnosu na funkcionalnu grupu)

γ gama (1,4 položaj u odnosu na funkcionalnu grupu)

B baza

egzo stereodeskriptor

E ili trans Entgegen (stereodeskriptor, stereoizomer koji ima supstituente višeg

prioriteta sa suprotnih strane dvostruke veze)

Z ili cis Zusammen (stereodeskriptor, stereoizomer koji ima supstituente višeg

prioriteta sa iste strane dvostruke veze)

R Rectus (stereodeskriptor)

S Sinister (stereodeskriptor)

anti stereodeskriptor, stereoizomer aldoksima koji ima H i OH sa suprotnih

strana C=N dvogube veze

sin stereodeskriptor, stereoizomer aldoksima koji ima H i OH sa iste strane

C=N dvogube veze

syn adicija sa iste strane dvostruke veze

D Dexter

L Laevus

(–) levorotatorni

Reagensi i rastvarači

AIBN AzobisIsoButyroNitrile (azobis(izobutironitril))

BuLi butil-litijum

Bu3SnF Tributilfluorstanan

CDCl3 Deuterohloroform

CD3SOCD3 Deuterodimetilsulfoksid

CyN=C=NCy N,N'-Dicikloheksilkarbodiimid

DBPO DiBenzoyl PerOxide (dibenzoil-peroksid)

DME DiMethoxyEthane (dimetoksietan)

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

DMF N,N'-DiMethylFormamide (N,N'-dimetilformamid)

DMSO DiMetilSulfOksid (dimetil-sulfoksid)

Et2O Dietil-etar

MeCN Acetonitril

MTT 3-(4,5-diMethylThiazol-2-yl)-2,5-diphenylTetrazolium bromide ((3-(4,5-

dimetiltiјazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum-bromid)

NEt3 Trietilamin

NBS N-BromoSuccinimide (N-bromsukcinimid)

NCS N-ChloroSuccinimide (N-hlorsukcinimid)

PBS Phosphate-Buffered Saline (izotonični fosfatni pufer)

PhNCS fenil-izotiocijanat

PhNH2 anilin

Ph3P Trifenilfosfin

Ph3PBr2 Trifenilfosfin-dibromid

PhSeCl PhenylSelenyl Chloride (fenilselenil-hlorid)

THF TetraHydroFuran (tetrahidrofuran)

TMS TetraMethylSilane (Tetrametilsilan)

TMSCl TriMethylSilyl Chloride (Trimetilhlorsilan)

TMS-NCS Trimetilsilil-izotiocijanat

(TMSO)2SO2 Bis(trimetilsilil)sulfat

Hromatografija i masena spektrometrija

AMDIS

Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System

(automatizovani sistem za identifikaciju i dekonvoluciju masenih

spektara)

EI Electron Ionization (elektronska jonizacija)

GC Gas Chromatography (gasna hromatografija)

GC-MS

Gas Chromatography-Mass Spectrometry (gasna hromatografija -

masena spektrometrija)

M+ Molekulski jon

MS Mass Spectrometry (masena spektrometrija)

m/z Mass-to-charge-ratio (odnos mase i naelektrisanja)

NIST National Institute of Standards and Technology (Nacionalni institut za

standarde i tehnologiju)

rel. int. Relativni intenzitet

RI Retention Index (retencioni indeks)

Rt Retention Time (retenciono vreme)

TLC Thin-Layer Chromatography (tankoslojna hromatografija)

TIC Total Ion Chromatogram (ukupni jonski hromatogram)

Infracrvena spektroskopija i ultraljubičasta spektroskopija

ATR Attenuated Total Reflectance

IR InfraRed (infracrvena)

FT Fourier Transform (Fourier-ova transformacija)

FTIR

Fourier Transformed Infrared Spectroscopy (Furije-transformisana

infracrvena spektroskopija)

m medium (srednji intenzitet trake)

s strong (veliki intezitet trake)

UV UltraViolet (ultraljubičasta)

w weak (slab intenzitet trake)

ν Frekvencija valencione vibracije

ε Molarna apsorptivnost

λmax Talasna dužina maksimuma apsorpcije

Nuklearna-magnetna rezonantna spektroskopija

br broad (široki)

1D jednodimenzionalni

2D dvodimenzionalni 13C{1H} 13C NMR spektroskopija sa Waltz 16 1H širokopojasnim dekuplovanjem 13C NMR

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (nuklearna-

magnetna rezonantna spektroskopija ugljenika-13)

d dublet

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

FID Free Induction Decay

GIAO Gauge Invariant Atomic Orbitals

GSD Global Spectral Deconvolution

gHMQC Gradient-enhanced Heteronuclear Multiple Quantum Coherence 1H – 1H

gDQCOSY Gradient-enhanced Double Quantum Filtered Correlation Spectroscopy

1H – 13C

gHMBC Gradient-enhanced Heteronuclear Multiple Bond Correlation

1H NMR

Hydrogen-1 Nuclear Magnetic Resonance (protonska nuklearno-

magnetna rezonantna spektroskopija)

J Konstanta kuplovanja

m multiplet

NMR

Nuclear Magnetic Resonance (nuklearno-magnetna rezonantna

spektroskopija)

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

ps pseudo

s singlet

sep septuplet

sex sextuplet

t triplet

q quartet

quin quintet

δ Hemijsko pomeranje u NMR spektru

δH Hemijsko pomeranje u 1H NMR spektru

δC Hemijsko pomeranje u 13C NMR spektru

Citotoksičnost

ATCC American Type Culture Collection

IC50 half maximal Inhibitory Concentration

Merne jedinice

aq. Aqueous solution (vodeni rastvor)

et al. Et alia (i drugi)

eq. ekvivalent

ºC Celzijusov stepen

cm centimetar

eV electron Volt

g gram

h sat

Hz herc

IU International Unit

K Kelvinov stepen

kcal kilokalorija

m metar

mg miligram

MHz megaherc

min minut

mL mililitar

mm milimetar

nm nanometar

ppm parts per million

s sekunda

μg mikrogram

μL mikrolitar

μm mikrometar

μM mikromolarna koncentracija

Ostalo

% procenat

Δ zagrevanje

h ozračivanje

log logaritam

p.a. Pro Analysi

Tt tačka topljenja

v/v volume/volume

Sadržaj

1. Uvod i ciljevi rada ............................................................................................................. 1

2. Opšti deo ............................................................................................................................. 4

2.1. Izotiocijanati u prirodi i njihovi prekursori ..................................................................... 5

2.1.1. Rasprostranjenost i struktura glukozinolata ............................................................ 5

2.1.2. Biosinteza glukozinolata ........................................................................................... 9

2.1.3. Enzimska hidroliza glukozinolata........................................................................... 11

2.1.4. Metabolizam glukozinolata u ljudskom organizmu ................................................ 12

2.1.5. Antikancerogeno dejstvo izotiocijanata ................................................................. 13

2.2. Sinteza izotiocijanata ..................................................................................................... 17

2.2.1. Sinteza izotiocijanata iz primarnih amina .............................................................. 17

2.2.2. Sinteza izotiocijanata iz derivata amina................................................................. 21

2.2.3. Sinteza izotiocijanata iz organskih halogenida ...................................................... 22

2.2.4. Sinteza izotiocijanata iz alkena i alkina ................................................................. 23

2.2.5. Sinteza izotiocijanata iz N,S- i N-heterocikličnih jedinjenja ................................. 23

2.2.6. Sinteza izotiocijanata iz izonitrila .......................................................................... 25

2.2.7. Sinteza izotiocijanata iz aldehida i ketona ............................................................. 25

2.2.8. Ostale metode sinteze izotiocijanata ...................................................................... 26

3. Eksperimentalni deo ....................................................................................................... 28

3.1. Reagensi ........................................................................................................................ 29

3.2. Metode analize i razdvajanja ......................................................................................... 30

3.2.1. Nuklearna magnetna rezonanca (NMR) ................................................................. 30

3.2.2. Infracrvena spektroskopija (FTIR) ......................................................................... 31

3.2.3. Ultraljubičasta spektroskopija (UV) ...................................................................... 31

3.2.4. Gasna hromatografija - masena spektrometrija (GC-MS) i gasna hromatografija (GC) .................................................................................................................................. 31

3.2.5. Tankoslojna hromatografija (TLC) ........................................................................ 32

3.2.6. Dry flash hromatografija ........................................................................................ 32

3.2.7. Hromatografija na koloni ....................................................................................... 32

3.2.8. Određivanje tačke topljenja ................................................................................... 32

3.3. Opis sintetskih koraka ................................................................................................... 32

3.3.1. Opšta procedura za dobijanje oksima .................................................................... 32

3.3.2. Opšta procedura za dobijanje amina ..................................................................... 33

3.3.3. Opšta procedura za dobijanje izotiocijanata ......................................................... 34

3.4. Razdvajanje stereoizomernih oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ ............................... 35

3.5. Ispitivanje stabilnosti oksima ........................................................................................ 36

3.6. Ispitivanje citotoksičnosti izotiocijanata prema odabranoj liniji ćelija kancera ............ 36

3.6.1. Priprema i tretiranje ćelijske linije kancera debelog creva ................................... 36

3.6.2. MTT test .................................................................................................................. 37

3.6.3. Statistička analiza ................................................................................................... 37

3.7. Molekulsko modelovanje .............................................................................................. 37

3.8. 1H NMR iterativna potpuna spinska analiza (HiFSA) .................................................. 38

4. Rezultati i diskusija ........................................................................................................ 39

4.1. Sinteza izotiocijanata ..................................................................................................... 40

4.2. Razdvajanje stereoizomernih oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ ............................... 42

4.3. Termalna stabilnost oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ .............................................. 42

4.4. Asignacija spektara ....................................................................................................... 45

4.4.1. Asignacija spektara jedinjenja 11a - d, 12a i b, 13a i b ......................................... 45

4.4.2. Asignacija spektara jedinjenja 21a i b, 22 i 23 ...................................................... 64

4.4.3. Asignacija spektara jedinjenja 31a i b, 32 i 33 ...................................................... 72

4.5. Ispitivanje citotoksičnosti izotiocijanata ....................................................................... 76

5. Zaključak .......................................................................................................................... 81

6. Literatura .......................................................................................................................... 83

7. Prilozi ................................................................................................................................. 92

8. Biografija i bibliografija .............................................................................................. 136

1. Uvod i ciljevi rada

Uvod i ciljevi rada Sinteza i spektralna karakterizacija monoterpenskih izotiocijanata

2

Izotiocijanati, proizvodi enzimske hidrolize (autolize) glukozinolata biljaka, zajedno

sa svojim prekursorima, predmet su intenzivnih istraživanja više od 50 godina. Glukozinolat

sinalbin (4-hidroksibenzil-glukozinolat, šema 1a) izolovan je iz bele slačice (Sinapis alba L.,

Brassicaceae) još u prvoj polovini XIX veka (Robiquet & Boutron, 1831). Međutim,

interesovanje za ovu klasu sekundarnih metabolita se povećalo nakon otkrića da sulforafan

(šema 1c), izotiocijanat nastao hidrolizom iz glukorafanina (šema 1b), koga ima u velikoj

količini u brokoliju (Brassica oleracea var. italica, Brassicaceae), štiti organizam sisara od

kancerogenih supstanci (Zhang et al., 1992). Nakon toga, ispitana je aktivnost velikog broja

prirodnih i sintetisanih izotiocijanata.

Šema 1. Strukture sinalbina (a), glukorafanina (b) i sulforafana (c)

Veliko interesovanje je privukla činjenica da glukozinolati i izotiocijanati, naročito

sulforafan, imaju citotoksičko i citostatičko dejstvo i indukuju apoptozu ćelija kancera

debelog creva (Gamet-Payrastre et al., 1998, 2000). Seskviterpenski izotiocijanati su

pronađeni u morskim organizmima (Capon & MacLeod, 1988; He et al., 1992; König et al.,

1992; Sorek et al., 2008), a mnogi pokazuju citotoksično dejstvo na transformisane ćelijske

linije (Zubía et al., 2008a, 2008b).

U literaturi nisu pronađeni podaci o sintezi i aktivnostima monoterpenskih

izotiocijanata. Imajući u vidu poznatu biološku aktivnost monoterpenskih derivata,

osmišljena je sinteza izotiocijanata polazeći od komercijalno dostupnih monoterpenskih

aldehida: citrala (smeša geranijala i nerala), mirtenala i kuminaldehida (šema 2). Time bi se

dobili izotiocijanati alifatične, biciklične i aromatične strukture, kako bi se ispitala njihova

citotoksičnost u slučaju kancera debelog creva.

Šema 2. Strukture polaznih monoterpenskih aldehida: (a) geranijal, (b) neral,

(c) mirtenal i (d) kuminaldehid

Uvod i ciljevi rada Sinteza i spektralna karakterizacija monoterpenskih izotiocijanata

3

Za ciljeve ovog master rada postavljeni su:

sinteza monoterpenskih izotiocijanata: smeše neril- i geranil-, mirtenil- i kuminil-

izotiocijanata, u sekvenci reakcija: građenje oksima, redukcija do amina i konverzija u

izotiocijanate;

hromatografsko razdvajanje stereoizomernih oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ;

ispitivanje stabilnosti oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ pri uslovima gasne

hromatografije;

spektralna karakterizacija dobijenih jedinjenja 1D- i 2D-NMR, MS, IR i UV

metodama;

potpuna asignacija 1H i

13C NMR signala oksima, amina i izotiocijanata;

ispitivanje citotoksičnosti sintetisanih izotiocijanata prema ćelijama kancera debelog

creva, HCT-116;

utvrđivanje veze između strukture i uočenih aktivnosti.

2. Opšti deo

2.1. Izotiocijanati u prirodi i njihovi prekursori ............................................ 5

2.1.1. Rasprostranjenost i struktura glukozinolata ....................................... 5

2.1.2. Biosinteza glukozinolata ....................................................................... 9

2.1.3. Enzimska hidroliza glukozinolata ....................................................... 11

2.1.4. Metabolizam glukozinolata u ljudskom organizmu ............................ 12

2.1.5. Antikancerogeno dejstvo izotiocijanata .............................................. 13

2.2. Sinteza izotiocijanata ............................................................................... 17

2.2.1. Sinteza izotiocijanata iz primarnih amina .......................................... 17

2.2.2. Sinteza izotiocijanata iz derivata amina ............................................. 21

2.2.3. Sinteza izotiocijanata iz organskih halogenida .................................. 22

2.2.4. Sinteza izotiocijanata iz alkena i alkina ............................................. 23

2.2.5. Sinteza izotiocijanata iz N,S- i N-heterocikličnih jedinjenja ............. 23

2.2.6. Sinteza izotiocijanata iz izonitrila ...................................................... 25

2.2.7. Sinteza izotiocijanata iz aldehida i ketona ......................................... 25

2.2.8. Ostale metode sinteze izotiocijanata .................................................. 26

Opšti deo Sinteza i spektralna karakterizacija monoterpenskih izotiocijanata

5

2.1. Izotiocijanati u prirodi i njihovi prekursori

2.1.1. Rasprostranjenost i struktura glukozinolata

Mnoštvo biljnih taksona u okviru reda Brassicales (pre svega familije Brassicaceae,

Capparaceae, Caricaceae i Cleomaceae) sadrže i sintetišu β-tioglukozid-N-hidroksisulfate,

poznate pod nazivom glukozinolati. Sadržaj glukozinolata varira u različitim delovima biljke,

a direktno zavisi od dostupnosti sumpora iz zemljišta, kao i od faze razvoja i ekoloških

faktora. Određeni broj biljnih taksona sadrži jedan, većina 2-5 različitih glukozinolata, a

može ih biti i do 34, koliko je identifikovano u plodu i listu vrste Arabidopsis thaliana (L.)

Heynh. (Clarke, 2010).

Poznata je struktura oko 200 glukozinolata (Fahey et al., 2001; Mithen, 2001;

Bellostas et al., 2007; Clarke, 2010), sa jezgrom od N-hidroksiiminosulfatnog estra sa bočnim

lancem R koji je povezan sa β-D-tioglukopiranoznim ostatkom preko atoma sumpora (šema

3). Konjugovane kiseline glukozinolata imaju jako nisku pKa vrednost, pa u prirodi

glukozinolati postoje kao anjoni, hidrofilni su i nestabilni pri ekstremnim vrednostima pH

(Olsen & Sørensen, 1981).

Šema 3. Opšta formula glukozinolata (gde su R1 i R2 = H ili acil-grupa)

Strukturnom analizom pomoću x-zraka, utvrđeno je da je kod sinigrina (alil-

glukozinolat) konfiguracija oko C=N veze (Z)- (ili anti-) (Marsch & Waser, 1970). Za

glukozinolate kod kojih je R1 i R2 cinamoil-, sinapoil- ili izoferuloil-grupa, pretpostavlja se

da imaju (E)- konfiguraciju oko C=N veze (Andersson et al., 1999).

Glukozinolati se razlikuju po strukturi bočnog lanca ili strukturi grupa vezanih za β-

tioglukopiranozu (preko kiseonika u položajima C-2 i C-6). Bočni lanac R nastaje iz L-

aminokiselina, najčešće iz jedne od osam proteinskih (alanin, valin, leucin, izoleucin,

metionin, fenilalanin, tirozin, triptofan), ređe iz neproteinskih. Većina glukozinolata nastaje

različitim modifikacijama aminokiselinskih prekursora u okviru prve i/ili treće faze

biosinteze glukozinolata.

Klasifikacija glukozinolata se može izvršiti prema:

aminokiselinskom prekursoru:

o alifatični (izvedeni iz alanina, valina, leucina, izoleucina ili metionina),

o aromatični (izvedeni iz fenilalanina ili tirozina) i

o indolski (izvedeni iz triptofana);

strukturnoj sličnosti (npr. ketoni, alkoholi) (šema 4).


6

A. Glukozinolati sa sumporom u bočnom lancu

hidroksi-metilsulfanil-alkil-

hidroksi-metilsulfinil-alkil-

hidroksi-metilsulfonil-alkil-

okso-metilsulfanil-alkil-

okso-metilsulfinil-alkil-

metilsulfanil-alkenil-

metilsulfinil-alkenil-

alkilsulfonil-alkenil-

sulfanil-alkil-

S-alkil-cistein-

disulfanil-

B. Alifatični glukozinolati

nerazgranatih bočnih lanaca

razgranatih bočnih lanaca

Šema 4. Strukturna klasifikacija glukozinolata (Fahey et al., 2001; Clarke, 2010)


7

C. Olefinski glukozinolati

nerazgranatih i

razgranatih bočnih lanaca

alkoholi

D. Alifatični alkoholi

nerazgranati alkoholi

razgranati alkoholi

E. Alifatični ketoni i kiseline

ketoni

kiseline

F. Aromatični glukozinolati

G. Benzoati

Šema 4. Strukturna klasifikacija glukozinolata (nastavak)


8

H. Indolski glukozinolati

I. Glikozilovani glukozinolati

J. Cimetni glukozinolati

R1 i R2: H, cinamoil-, sinapoil- ili izoferuloil-grupa

K. Seleno-glukozinolati

L. Benzoilovani glukozinolati

Šema 4. Strukturna klasifikacija glukozinolata (nastavak)


9

2.1.2. Biosinteza glukozinolata

Biosinteza glukozinolata uključuje tri faze:

I. produžavanje (elongaciju) bočnog lanca (šema 5);

II. vezivanje glikozidnog ostatka za aminokiselinu, bez obzira da li je modifikovana u

prethodnoj fazi ili ne (šema 6), i

III. sekundarnu modifikaciju bočnog lanca.

Reakcije biosinteze su katalizovane multi-enzimskim kompleksima visoke

selektivnosti za aminokiselinske prekursore.

Prva faza u biosintezi podrazumeva produžavanje bočnog niza u aminokiselinskim

prekursorima (Bennett et al., 1995; Mithen et al., 1995, 2000; Halkier & Gerschenzon, 2006).

Aminokiselina podleže dezaminaciji i nastala 2-keto kiselina ulazi u ciklus elongacije, koji se

sastoji od tri osnovna koraka - adicije acetil-koenzima A, izomerizacije dobijene jabučne

kiseline i oksidacije-dekarboksilacije. Nakon svakog ciklusa, dobija se nova 2-keto kiselina

sa jednom metilenskom grupom više u odnosu na prethodnu, koja se može konvertovati u

aminokiselinu i započeti drugu fazu biosinteze ili ući u novi ciklus elongacije (Graser et al.,

2000).

Šema 5. Ciklus elongacije bočnog lanca aminokiselina

Broj ciklusa elongacije određuje dužinu lanca glukozinolata. Glukozinolati koji

nastaju iz metionina mogu proći kroz maksimalno 9 ciklusa elongacije (Halkier & Du, 1997).

Izvršeno je mapiranje određenog broja Gsl-elong lokusa koji određuju dužinu lanca (Magrath

et al., 1994), a MAM (metiltioalkilmalat sintetaza) enzimi katalizuju određeni broj ciklusa

elongacije metionina (Mithen, 2001; Textor et al., 2004, 2007).


10

Intermedijeri u sledećoj fazi biosinteze su isti za sve aminokiseline, uključujući N-

hidroksiaminokiseline, aldoksime, aci-nitro ili nitril-oksid jedinjenja (jako reaktivni, nisu

izolovani), S-alkilhidroksitioiminate, hidroksitioiminske kiseline i desulfoglukozinolate

(šema 6).

Prvi korak biosinteze katalizuje citohrom P450 koji pripada familiji CYP79, a drugi

korak konverzije aldoksima do aci-nitro ili nitril-oksid jedinjenja citrohrom P450 iz familije

CYP83 (Wittstock & Halkier, 2002), a svi su NADPH i O2 zavisni (Bennett et al., 1995).

Istraživanja koja su se bavila enzimima CYP83B1 i CYP83A1 su pokazala da su reakcije

alifatičnih aldoksima primarno katalizovane enzimom CYP83A1, dok oba enzima katalizuju

reakcije aromatičnih aldoksima (Naur et al., 2003). Nastali proizvod reaguje sa nukleofilnim

S-donorom, za koji se pretpostavlja da je cistein (Wetter & Chisholm, 1968), a reakcija je

enzimski katalizovana, verovatno pomoću glutation-S-transferaze (Halkier & Gerschenzon,

2006). Preostali koraci uključuju konverziju S-alkilhidroksitioiminata u hidroksitioiminsku

kiselinu pod dejstvom C-S liaze, S-glukozilaciju transferom glukoze sa UDP-glukoze pod

dejstvom UDPG - hidroksitioiminat glukotransferaze i sulfonovanje desulfoglukozinolata

visoko-energetskim sulfatnim donorom 3'-fosfo-adenozin-5'-fosfosulfatom (PAPS),

katalizovano enzimom PAPS - desulfoglukozinolat sulfotransferaza (Bennett et al., 1995;

Halkier & Du, 1997; Du & Halkier, 1998; Mithen et al., 2000; Grubb et al., 2004; Mikkelsen

et al., 2004).

Šema 6. Koraci u biosintezi glukozinolata (Wittstock & Halkier, 2002)

Nakon druge faze sinteze glukozinolata, sledi modifikacija bočnog lanca čime se

dobija glukozinolat. Ove modifikacije podrazumevaju (Bellostas et al., 2007):

formiranje dvostruke veze i/ili eliminaciju metilsulfanil- ili metilsulfinil-grupe;

stereospecifičnu oksidaciju metilsulfanil-grupe (Sørensen, 1990);

stereospecifičnu hidroksilaciju;

hidroksilovanje/oksidaciju aromatičnog bočnog lanca;


11

uvođenje metoksi-, sulfo- ili glukozidnih grupa;

acilovanje tioglukopiranozne grupe ili bočnog lanca.

Modifikacija bočnih lanaca se vrši kontrolom tri lokusa: Gsl-oxid (kontroliše

oksidaciju metilsulfanil- do metilsulfinil-grupe), Gsl-alk (kontroliše uklanjanje metilsulfinil-

grupe i nastanak dvostruke veze) i Gsl-OH (kontroliše hidroksilovanje) (Mithen et al., 1995;

Giamoustaris & Mithen, 1996). Najveći broj glukozinolata nastaje iz metionina različitim

transformacijama. Enzimi AOP2 i AOP3 su deoksigenaze, koje katalizuju reakcije konverzije

metilsulfanil/metilsulfinil-alkil-grupe do alkenil- i hidroksi-grupe (Klibenstein et al., 2001a,

2001b).

2.1.3. Enzimska hidroliza glukozinolata

Sve biljke koje sintetišu glukozinolate, sadrže i tioglukozid glukohidrolazu, dimerni

enzim mirozinazu. Mirozinaza zahteva prisustvo sulfatne grupe i hidroksilne grupe u

položaju C-2 β-D-tioglukopiranozne grupe u glukozinolatu kako bi se supstrat vezao za enzim

(Farey et al., 2001; Bellostas et al., 2007). Askorbinska kiselina predstavlja kofaktor

mirozinaze, pri čemu je „nekompetitivno” aktivira (Shikita et al., 1999; Burmeister et al.,

2000).

Glukozinolati i mirozinaza su u neoštećenom biljnom tkivu razdvojeni. Aktiviranjem

binarnog sistema glukozinolat - mirozinaza, usled mehaničke povrede biljke (npr. žvakanja

svežih biljaka, nagnječenja tkiva ili zamrzavanja, napada patogena ili insekata), dolazi do

hidrolize glukozinolata i nastanka glukoze i nestabilnog intermedijera 1 koji se spontano

raspada (Bones & Rossiter, 1996; Rosa et al., 1997). Uslovi pri kojima se intermedijer 1

raspada (pH, prisustvo Fe2+

jona ili epitiospecifičnog proteina, ESP), ali i struktura bočnog

lanca glukozinolata, utiču na formiranje različitih proizvoda (šema 7).

Šema 7. Proizvodi enzimske hidrolize glukozinolata (Galletti et al., 2001)


12

Izotiocijanati nastaju pri neutralnim uslovima Lossen-ovim premeštanjem (migracija

bočnog lanca sa ugljenikovog atoma na susedni elektrondeficitarni atom azota; Halkier &

Gerschenzon, 2006), a nitrili pri nižim pH vrednostima, u prisustvu Fe2+

jona (Uda et al.,

1986, Galletti et al., 2001) i u in vivo sistemima u prisustvu epitiospecifičnog proteina

(Lambrix et al., 2001). Epitionitrili nastaju iz glukozinolata sa terminalnom dvostrukom

vezom, a tiocijanati isključivo iz alil-, benzil- i 4-(metiltio)butilglukozinolata. Dokazano je da

izvesni protein, tzv. TFP (thiocyanate-forming protein), učestvuje u formiranju tiocijanata,

iako još uvek nije utvrđena njegova struktura (Hasapis & MacLeod, 1982; Burow et al.,

2007). Glukozinolati sa hidroksilnom grupom u položaju 2 u bočnom lancu daju nestabilne

izotiocijanate, koji ciklizuju u oksazolidin-2-tione, poznate po tome što izazivaju gušavost

(Halkier & Gerschenzon, 2006).

Indolski glukozinolati hidrolizom daju nestabilne izotiocijanate, čak i pri neutralnim i

kiselim uslovima, pa njihovim raspadanjem nastaju smeše proizvoda (Agerbirk et al., 1998;

Buskov et al., 2000).

2.1.4. Metabolizam glukozinolata u ljudskom organizmu

U biljakama se nalaze samo prekursori izotiocijanata, tj. glukozinolati (Ettlinger &

Kjær, 1968; Fahey et al., 1997). Za oštar miris i ukus svežih krucifera, kao što su karfiol,

kupus, brokoli i druge, odgovorni su izotiocijanati nastali mehaničnom povredom tkiva

biljke. Međutim, uglavnom se krucifere kuvaju pre konzumiranja, čime mirozinaza u biljci

biva denaturisana. Bakterije koje se povezuju sa ljudskom i životinjskom crevnom florom

sadrže mirozinazu (Rabot et al., 1993) i nakon konzumiranja glukozinolata β-tioglukozidaza

crevne mikroflore vrši hidrolizu do izotiocijanata (Shapiro et al., 1998; Getahun & Chung,

1999). Veća količina izotiocijanata nastaje kada se u organizam unose nekuvane krucifere sa

još uvek aktivnom mirozinazom, jer hidroliza počinje već u ustima povređivanjem tkiva

biljke (Getahun & Chung, 1999).

Nastali izotiocijanati bivaju resorbovani od strane epitelnih ćelija tankog ili debelog

creva, pri čemu odmah dolazi do reakcije sa različitim tiolima iz ćelija, pre svega sa

glutationom. Reakcija se može odvijati pasivno ili pod dejstvom enzima glutation-S-

transferaza (GST) i nastaje ditiokarbamat koji se transportuje u krvotok. Brzina reakcije sa

glutationom i transportnim proteinima zavisi od strukture bobočnog lanca izotiocijanata

(Zhang et al., 1995). Ditiokarbamat se može prevesti u merkapturičnu kiselinu 2 i izlučiti iz

organizma ili prevesti u biološki aktivni izotiocijanat (šema 8).

Metabolizam kiseline 2 obuhvata dve enzimski katalizovane reakcije raskidanja

peptidnih veza u polaznom ditiokarbamatu u kojima učestvuju glutamil- i glicil-grupa i

reakciju acetilovanja amino grupe cisteina pomoću acetil-koenzima A. Enzimi koji katalizuju

date reakcije su γ-glutamil-transpeptidaza (GTP), cisteinilglicinaza i N-acetil-transferaza

(NAT) (Brüsewitz et al., 1977). Nastala merkapturična kiselina se izlučuje iz organizma

urinom i može poslužiti kao metabolički marker prisustva izotiocijanata u organizmu.


13

Šema 8. Metabolizam glukozinolata u ljudskom organizmu

Jedan deo početnog ditiokarbamata se prevodi u izotocijanat, koji može u benignim

ćelijama smanjiti verovatnoću karcinogeneze i sprečiti dalji razvoj malignih ćelija, odnosno

širenje tumora. Pretpostavlja se da se ditiokarbamat razlaže u plazmi do izotiocijanata

(Thornalley, 2002) ili da dolazi do enzimske reakcije (Meyer et al., 1995). Istraživanja su

pokazala da 40 - 45% unete količine glukozinolata iz brokolija postoji u obliku slobodnih

izotiocijanata u plazmi (Gasper et al., 2005; Fahey et al., 2012).

2.1.5. Antikancerogeno dejstvo izotiocijanata

Glukozinolati i izotiocijanati pokazuju pozitivne efekte u zaštiti i lečenju kancera,

kardiovaskularnih i neuroloških oboljenja (Dinkova-Kostova & Kostov, 2012). Mnogobrojna

istraživanja su pokazala da izotiocijanati, odnosno konzumiranje povrća iz porodice

Brassicaceae, smanjuje učestalost pojave i dalji razvoj kancera (Talalay, 1999). Izotiocijanati

imaju uticaj na početnu fazu karcinogeneze, tj. inicijaciju. Antikancerogena aktivnost

izotiocijanata se odvija brojnim mehanizmima koji uključuju (Mithen et al., 2011):

inhibiciju: enzima faze 1, angiogeneze, polimerizacije tubulina i deacetilovanja

histona;

indukciju: enzima faze 2, apoptoze i usporavanja ćelijskog ciklusa;

antioksidativno dejstvo;

antiinflamatorno dejstvo.


14

Inhibicija enzima faze 1 i indukcija enzima faze 2 su jedan od osnovnih mehanizama

antikancerogenog dejstva krucifera (Block et al., 1992). Biološko dejstvo krucifera zavisi i od

genotipa osobe koja ih konzumira, pre svega od lokusa GSTM1 i GSTT1. Lokus GSTM1

kontroliše sintezu glutation-S-transferaze i konjugaciju glutationa sa izotiocijanatima (Zhang

et al., 1995). Kod 40% svetske populacije ne postoje ovi lokusi (Cotton et al., 2000), što

uzrokuje sporiju ekskreciju izotiocijanata iz organizma, veću koncentraciju u tkivima i krvi, i

time veći uticaj izotiocijanata na organizam te individue. London i saradnici (2000) su

pokazali obrnuto proporcionalnu vezu između povećane ekskrecije izotiocijanata putem urina

i smanjenja učestalosti pojave kancera pluća kod ljudi bez pomenutih lokusa.

U zavisnosti od strukture bočnog lanca, izotiocijanati mogu inhibirati enzime faze 1 i

indukovati enzime faze 2, dok degradacioni proizvodi indolskih glukozinolata mogu

indukovati enzime faze 1 (Mithen, 2001). Kancerogene supstance, kada se unesu u

organizam, prolaze kroz različite transformacije, npr. oksidacije, redukcije i hidrolize.

Reakcije oksidacije katalizuju enzimi faze 1, pre svega citohromi P450, čime liofilni

ksenobiotici postaju reaktivni hidrofilni metaboliti i vezuju se za druge biomolekule. U

slučaju vezivanja za makromolekule, dolazi do oštećenja DNK, nastanka DNK-adukata i

oksidativnog stresa, odnosno do citotoksičnosti, uz povećani rizik od nastanka kancera

(Mithen, 2001). Izotiocijanati smanjuju nivo DNK-adukata i rizik od nastanka kancera

suzbijanjem aktivnosti citohroma P450, kompetitivnom ili ireverzibilnom inhibicijom (Zhang

& Talalay, 1994).

Enzimi faze 2 prevode reaktivne hidrofilne metabolite ksenobiotika u neaktivne

metabolite koji se izlučuju iz organizma, njihovim vezivanjem za: glutation, sulfate,

glukuronsku kiselinu itd. Time sprečavaju reakciju ksenobiotika sa DNK. U enzime faze 2

ubrajaju se enzimi koji katalizuju veliki broj reakcija suzbijanja toksičnosti elektrofila i

reaktivnih kiseoničnih vrsta, između ostalih glutation-S-transferaza, NAD[P]H:glutation-

reduktaza i UDP-glukuronoziltransferaza. Istraživanja pokazuju da određeni glukozinolati

(npr. benzil-, p-hidroksibenzil- i 2-hidroksi-3-butenil-glukozinolat) indukuju enzime faze 2 in

vivo, usmeravajući metabolizam kancerogenih jedinjenja ka detoksikaciji (Farey et al., 1997).

Unošenjem velikih količina izotiocijanata u periodu od 4-5 dana povećava se aktivnost

enzima faze 2 u jetri, plućima, mlečnim žlezdama, pankreasu, tankom i debelom crevu

eksperimentalnih životinja (Zhang et al., 1992; Matusheski & Jeffery, 2001; Keck et al.,

2002).

Izotiocijanati nisu direktni antioksidansi ili prooksidansi, već povećavaju

antioksidativnu sposobnost i redukcioni kapacitet ćelija organizma. Antioksidativno dejstvo

izotiocijanata se može objasniti povećanjem sadržaja glutationa u tkivima, uticajem na

enzime faze 2 (pre svega glutation-S-transferaze, NAD[P]H:glutation-reduktaze i hem-

oksidaze 1) i redoks enzime (tioredoksin-reduktaze i glutamat-cistein-ligaze) (Zhang et al.,

2005). Enzimi glutation-S-tranferaza i NAD[P]H:glutation-reduktaza štite ćeliju od

oksidativnog stresa (Yanaka et al., 2005). Hem-oksidaza 1 ima antioksidativno i

antiinflamatorno dejstvo i indukuje apoptozu (Ryter et al., 2006), a izotiocijanati značajno

povećavaju sadržaj ovog enzima u ćeliji.


15

Redukcioni kapacitet ćelije zavisi od sadržaja redoks enzima i glutationa, koji štite ćeliju od

slobodnih radikala i održavaju oksido-redukcionu ravnotežu. Unošenje izotiocijanata

smanjuje sadržaj intracelularnog glutationa, pa je ćelija podložnija oksidativnom stresu (Kim

et al., 2003a). Međutim, oksidacija i smanjenje sadržaja glutationa u ćeliji je povezano sa

odgovorom redoks enzima i enzima faze 2, koji regenerišu redukovanu formu glutationa

(Scharf et al., 2003).

Apoptoza (organizovana ćelijska smrt) je važan zaštitni metabolizam, kojim se

sprečava dalji razvoj kancera, odnosno nastanak metastaza, eliminacijom oštećenih ili

nepotrebnih ćelija. Nepravilna regulacija apoptoze dovodi do autoimunih bolesti i kancera.

Veliki broj izotiocijanata može indukovati apoptozu različitim mehanizmima koji nisu u

potpunosti razjašnjeni. Pretpostavlja se da oksidativni stres, koji dovodi do smanjenja

sadržaja glutationa u ćeliji, pokreće niz događaja, uključujući i apoptozu (Keum et al., 2004).

Ovu pretpostavku podržava i istraživanje koje je pokazalo da smanjenje glutationa u ćeliji,

nakon tretiranja sulforafanom, uzrokuje iniciranje apoptoze (Kim et al., 2003a). Indukcija

enzima faze 2 i indukcija apoptoze su zavisni od količine sulforafanina, tj. od smanjenja

intracelularnog glutationa. Pri manjim količinama izotiocijanata, indukuju se samo enzimi

faze 2, a pri većim koncentracijama, apoptoza je značajno učestalija (Kim et al., 2003a).

Kada su molekuli DNK oštećeni nastankom adukata sa metabolitima kancerogenih

jedinjenja, dolazi do usporavanja ćelijskog ciklusa, sve dok se oštećenja ne poprave (Keum et

al., 2004). Međutim, ukoliko je oštećenje veliko i ne može se popraviti, dolazi do apoptoze

umesto usporavanja ćelijskog ciklusa. Izotiocijanati mogu inicirati usporavanje ćelijskog

ciklusa aktiviranjem kontrolnih tačaka, što je i dokazano u crevima, prostati, dojkama, bešici

i T-ćelijama (Mithen et al., 2011).

Jedan od mogućih mehanizama usporavanja ćelijskog ciklusa od strane izotiocijanata

se odnosi na inhibiciju polimerizacije tubulina (Jackson & Singletary, 2004a, 2004b; Øverby

et al., 2014). Mikrotubula je polimer subjedinica tubulina i učestvuje u mitozi, ćelijskom

kretanju i transportu, a subjedinice se mogu kretati u polimeru kao rezultat polimerizacije na

jednom i depolimerizacije na drugom kraju. Inhibicija polimerizacije tubulina dovodi do

stopiranja mitoze ćelije, što brojni antikancerogeni lekovi i izazivaju (Bhalla, 2003).

Istraživanja su pokazala da niske koncentracije izotiocijanata izazivaju delimičnu

depolimerizaciju vretena ćelija kancera u mitozi, a visoke koncentracije inhibiraju

polimerizaciju tubulina (Jackson & Singletary, 2004b). Pretpostavlja se da ihnibiciju izaziva

izotiocijanatna grupa (Jackson & Singletary, 2004a).

Pored ovoga, izotiocijanati utiču na acetilovanje histona, procesa koji kontroliše

ekspresiju gena izmenom strukture hromatina. In vivo, acetilovanje histona zavisi od

ravnoteže između enzima koji vrše acetilovanje i uklanjanje acetil-grupe (histon-deacetilaza)

(Struhl, 1998). Sadržaj histon-deacetilaze je često jako povišen u ćelijama i tkivima

zahvaćenim tumorom (Kim et al., 2003b). Tretiranje ćelija tumora izotiocijanatima smanjuje

aktivnost histon-deacetilaze i povećava sadržaj acetilovanog histona (Myzak et al., 2004), a

aktivnost se pripisuje metabolitima izotiocijanata (cistein-izotiocijanatu i N-acetilcistein-

izotiocijanatu).


16

Angiogeneza, formiranje novih krvnih sudova, preduslov je za rast tumora i

metastaza. Razvoj tumora je ograničen ukoliko se ne formira mreža kapilara unutar tumora

angiogenezom i može dostići maksimalnu veličinu prečnika od ~ 0,5 mm, što je određeno

difuzijom kiseonika i nutrijenata (Juge et al., 2007). Nastanak metastaza je proces u više

koraka, koji obuhvata prodiranje ćelija raka u okolno zdravo tkivo, prolaz kroz membrane

krvnih i limfnih sudova, cirkulaciju do drugih delova tela, gde ponovo prodiru u zdravo tkivo

i formiraju male tumore poznate kao mikrometastaze, u procesu koji se naziva proliferacija.

Studije pokazuju da izotiocijanati sprečavaju sve osnovne korake nastanka metastaza,

naročito inhibiraju angiogenezu (Thejass & Kuttan, 2006).

Brojni su primeri antikancerogenog dejstva izotiocijanata. Zaštita od kancerogenih

supstanci je uočena u brojnim organima, između ostalog u pankreasu, plućima, koži, crevima,

mlečnim žlezdama, bešici i jednjaku, a pored toga izotiocijanati smanjuju dalji rast tumora u

prostati, dojkama, jednjaku i debelom crevu (Myzak et al., 2007; Qazi et al., 2010;

Kanematsu et al., 2011; Chen et al., 2012). Fenetil-izotiocijanat inhibira metabolizam NNK

(4-(metilnitrozamino)-1-(3-piridil)-1-butanon), koji dovodi do kancera pluća kod pušača,

blokiranjem enzima faze 1 (Chung et al., 1998) i indukcijom aktivnost enzima faze 2

detoksikacije nikotinskih metabolita (Hecht et al., 1999). Pored toga, fenetil-izotiocijanat i

alil-izotiocijanat ispoljavaju antiproliferativno dejstvo, sprečavaju rast i indukuju apoptozu

ćelija leukemije (Adesida et al., 1996; Xu & Thornalley, 2000).

Za sulforafan (šema 1c), izotiocijanat koji je najviše proučavan, poznato je da

poseduje sledeće aktivnosti:

inhibira citohrome P450, enzime faze 1 (Morel et al., 1997);

povećava nivo enzima faze 2 (Zhang et al., 1992, 1994; Talalay et al., 1995; Talalay

& Zhang, 1996; Farey et al., 1997; Zhang & Talalay, 1998);

deluje kao indirektni antioksidans (Farey & Talalay, 1999);

smanjuje učestalost, odlaže pojavu i smanjuje veličinu tumora (Zhang et al., 1994;

Farey et al., 1997);

deluje citostatički i citotoksično na humane ćelije kancera debelog creva in vitro

(Gamet-Payrastre et al., 1998);

usporava ćelijski ciklus i izaziva apoptozu humanih ćelija kancera debelog creva in

vitro (Gamet-Payrastre et al., 2000).


17

2.2. Sinteza izotiocijanata

Izotiocijanati imaju -N=C=S funkcionalnu grupu, direktno vezanu za ugljenikov atom

koji je deo alkil-, alkenil-, alkinil-, aril- ili heteroaril-grupe (R1, šema 9a), ili za ugljenikov

atom karbonilne grupe ili srodnih grupa, npr. acil-, tioacil- ili imidoil-grupe (R2CX, šema 9b).

To su stabilne, bezbojne tečnosti, oporog mirisa i ukusa, slabije reaktivnosti od kiseoničnih

analoga - izocijanata. Podležu sporoj hidrolizi u dodiru sa vlagom iz vazduha ili zaostalom

vodom u rastvoru nakon sinteze. Predstavljaju korisne reagense u sintezi, pre svega u sintezi

tiourea i različitih heterociklusa koji sadrže sumpor ili azot (Braverman et al., 2005).

Šema 9. Struktura izotiocijanata

Njihova sinteza zavisi od dostupnog polaznog jedinjenja, kao i kompatibilnosti

reakcionih uslova sa ostalim funkcionalnim grupama u molekulu. Najčešće se kao polazna

jedinjenja koriste primarni amini ili halogenidi, ali mogu se koristiti i derivati amina (npr.

amidi), alkeni, alkini, izonitrili, aldehidi i ketoni, N,S- i N-heterociklična jedinjenja. Ponekad

se vrši samo modifikacija ostalih grupa u izotiocijanatu kako bi se dobilo željeno jedinjenje.

Podela sintetskih metodologija se vrši na osnovu prirode polaznog jedinjenja i korišćenog

reagensa (Drobnica et al., 1977; Gilmore & Gallagher, 1995; Aitken, 2005; Braverman et al.,

2005).

2.2.1. Sinteza izotiocijanata iz primarnih amina

Metode sinteze izotiocijanata iz primarnih amina se dele u tri grupe na osnovi

korišćenog tiokarbonilnog reagensa: reakcije sa tiofozgenom, ugljen-disulfidom i drugim

reagensima.

I. Reakcija primarnih amina sa tiofozgenom (Rathke, 1872) je dugo poznata, ali i

dalje popularna metoda za sintezu izotiocijanata zbog svoje jednostavnosti i blagih reakcionih

uslova, iako se rukuje sa toksičnim tiofozgenom, koji uz to i neprijatno miriše. Tiofozgen, za

razliku od fozgena, stabilan je u vodi i reakcija se izvodi u dvofaznom sistemu (organski

rastvarač - voda), a ukoliko je neophodno, reakcija se može izvoditi i u suvim aprotičnim

rastvaračima. Alifatični i aromatični izotiocijanati se mogu dobiti ovom metodom, a prinosi

su srednji ili dobri. Ukoliko dobijeni izotiocijanat sadrži i reaktivnu (nukleofilnu) grupu u

vicinalnom položaju, moguće su i reakcije ciklizacije (Braverman et al., 2005).

U reakciji prvo nastaje nestabilni tiokarbamoil-hlorid, koji gubitkom molekula

hlorovodonične kiseline daje izotiocijanat (šema 10) (Dyson & George, 1924).

Hlorovodonična kiselina se neutrališe dodatom slabom (nenukleofilnom) bazom (npr.

trietilamin ili kalcijum-karbonat). Jake baze se ne koriste, jer u alkalnoj sredini dolazi do

hidrolize izotiocijanata. Intermedijer ili proizvod mogu reagovati sa slobodnim aminom, pri

čemu nastaje tiourea, pa se mora koristiti višak tiofozgena, osim u slučaju kada je amin slabo

nukleofilan.


18

Šema 10. Nastajanje izotiocijanata u reakciji primarnih amina sa tiofozgenom

II. Reakcija primarnih amina sa ugljen-disulfidom je dobra alternativa prethodne

reakcije, iako je i ugljen-disulfid toksičan pri udisanju njegovih para, apsorpciji kroz kožu ili

oralnim unošenjem (Braverman et al., 2005). Odvija se u dva koraka, pri čemu amin u prvom

koraku reaguje sa ugljen-disulfidom u prisustvu organske ili neorganske baze, u vodi ili

organskom rastvaraču i daje ditiokarbamat. Baznost amina je jako važna za prvi korak, što i

ograničava primenu metode. Ukoliko je baznost amina, odnosno nukleofilnost, jako

mala/slaba (npr. nitroanilini), ditiokarbamat ne nastaje. Drugi korak uključuje raspadanje

ditiokarbamata pod dejstvom različitih dehidrosulfurizacionih reagenasa (šema 11).

Šema 11. Nastajanje izotiocijanata u reakciji primarnih amina sa ugljen-disulfidom u baznoj

sredini

Neki od reagenasa, odnosno od reakcionih uslova, koji se koriste za dobijanje

izotiocijanata su (Drobnica et al., 1977; Gilmore & Gallagher, 1995; Aitken, 2005;

Braverman et al., 2005):

a) soli metala - olova (Dains et al., 1941), žive (McElhinney, 1966; Loose & Weddige,

1960), gvožđa (LeCount et al., 1977) i bakra (Losanitsch, 1891). Soli metala se retko koriste,

zbog slabijih prinosa reakcija i njihove toksičnosti.

b) različita oksidaciona sredstva - jod (Braun & Deutsch, 1912; Elbert & Cerny, 1985;

Nath et al., 2011), vodonik-peroksid (Li et al., 1997; Tajima, 1997), natrijum-hipohlorit

(Schmidt et al., 1954) i natrijum-hlorit (Schmidt et al., 1955).

Za oksidaciju jodom koriste se dva ekvivalenta joda, pri čemu jedan ekvivalent

formira tiuramdisulfid, a drugi ekvivalent joda inicira njegovo razlaganje (dalju oksidaciju).

Češće se koristi modifikacija ove metode, kojom se oksidacija ditiokarbamata vrši viškom

joda u prisustvu natrijum-hidrogenkarbonata (šema 12).

Šema 12. Nastajanje izotiocijanata razlaganjem ditiokarbamata viškom joda u prisustvu

natrijum-hidrogenkarbonata


19

Metoda sa vodonik-peroksidom kao oksidacionim sredstvom se najčešće koristi, jer

vodonik-peroksid nije toksičan kao ostali reagensi, jeftin je i lako dostupan, a sama metoda je

jednostavna, ne zahteva posebne uslove, univerzalna je i može se primeniti u sintezi alkil- i

aril-izotiocijanata. Reakcija se izvodi u organskom rastvaraču koji se meša sa vodom,

najčešće tetrahidrofuranu, u prisustvu viška ugljen-disulfida i pri niskoj temperaturi (0 - 10

ºC). Mogu se koristiti različite baze, poput natrijum-hidroksida, amonijaka i trietilamina, u

odgovarajućim količinama. Mehanizam reakcije uključuje nastanak tiuramdisulfida, koji se

potom oksiduje vodonik-peroksidom do izotiocijanata (šema 13).

Šema 13. Nastajanje izotiocijanata oksidacijom ditiokarbamata vodonik-peroksidom

c) jedinjenja fosfora - fosfor-oksihlorid (Martin et al., 1965), fosfol (Martin et al.,

1965), difeniltiofosfinat-hlorid (Bodeker et al., 1985) i trifenilfosfin (Furukawa et al., 1988).

Fosfor-oksihlorid inicira razlaganje alkil- i aril-ditiokarbamata formiranih in situ, u

prisustvu trietilamina (šema 14). Prinosi su dobri, ali su još bolji kada se koriste fosforani.

Reakcija sa reagensom trifenilfosfin-ugljen-tetrahlorid se odvija pod blagim uslovima.

Šema 14. Nastajanje izotiocijanata razlaganjem ditiokarbamata fosfor-oksihloridom u

prisustvu trietilamina

d) alkil-hlorformijati (Kaluzova reakcija) - metil- i etil-hlorformijat (Hodgkins &

Ettlinger, 1956; Hodgkins et al., 1961). Prvobitno u rastvoru nastaje nestabilan

metoksikarbonil- ili etoksikarbonil-ditiokarbamat, koji se pod dejstvom baze razlaže na

izotiocijanat, karbonil-sulfid i metanol ili etanol (šema 15).

Šema 15. Nastajanje izotiocijanat razlaganjem ditiokarbamata alkil-hlorformijatom u


e) acil-halogenidi - acetil-hlorid, acetil-bromid i benzoil-hlorid (Trofimov et al., 1988).

Kako su acil-halogenidi stabilniji i manje toksični od alkil-hlorformijata, koriste se umesto

njih za acilovanje ditiokarbamata u sintezi izotiocijanata (šema 16).


20

Šema 16. Nastajanje izotiocijanata razlaganjem ditiokarbamata acil-halogenidom u


f) karbodiimidi - dicikloheksilkarbodiimid (Jochims & Seeliger, 1967). Razlaže se in

situ formirana ditiokarbaminska kiselina pod blagim uslovima, uz nastanak izotiocijanata i

1,3-dicikloheksiltiouree (šema 17). Glavni nedostatak je dugo reakciono vreme, pa se još

uvek traga za reaktivnijim sintetskim ekvivalentima dicikloheksilkarbodiimida.

Šema 17. Nastajanje izotiocijanata razlaganjem ditiokarbaminske kiseline

dicikloheksilkarbodiimidom

g) alkilovanje, pa termoliza - ditiokarbamati se transformišu u odgovarajuće alkil-estre,

koji se potom termički razlažu do tiola i izotiocijanata (šema 18). Prinosi reakcija su jako

visoki, a izotiocijanat se od tiola razdvaja destilacijom. Etil- i butil-estri alkil-ditiokarbamata

podležu pirolizi na temperaturama od 250 - 260 ºC (Blotny, 1982), a metil-estri aril-

ditiokarbamata na temperaturama od 180 - 200 ºC (Ottenbrite, 1972).

Šema 18. Nastajanje izotiocijanata termičkim razlaganjem alkil-estra ditiokarbamata

h) drugi reagensi - fozgen, organo-silicijumova jedinjenja, jake baze (npr. butil-litijum),

Grignard-ovi reagensi itd.

III. Reakcija primarnih amina sa ostalim reagensima za transfer tiokarbonilne

grupe. Ovi reagensi su manje toksični i lakši za rukovanje od prethodno navedenih. Veliki

broj manje toksičnih reagenasa je dobijen zamenom hlora u tiofozgenu nekom od odlazećih

grupa. Neki od reagenasa prikazani su na šema 19 (Gilmore & Gallagher, 1995; Aitken,

2005; Braverman et al., 2005).

Šema 19. Reagensi za transfer tiokarbonilne grupe u reakciji sa primarim aminima


21

2.2.2. Sinteza izotiocijanata iz derivata amina

Amidi, tioamidi, iminofosforani, karbonimidoil-dihloridi, N-sililamini su neki od

derivata amina koji se mogu koristiti u sintezi izotiocijanata, pri reakcionim uslovima koji su

slični kao i kod primarnih amina. U nastavku će biti predstavljena sinteza izotiocijanata iz N-

sililamina, sekundarnih amida i iminofosforana, kao i mogućnosti i ograničenja pomenutih

metoda.

Zaštićeni amini su vrlo česti u sintezi, ali zaštitna grupa ne predstavlja problem pri

daljoj sintezi izotiocijanata. N-Sililovani alkilamini reaguju sa ugljen-disulfidom i daju

nestabilne sililovane estre ditiokarbaminske kiseline, koji se razlažu pomoću trimetilsilil-

hlorida (TMSCl) i trietilamina (šema 20) (Kricheldorf, 1970).

Šema 20. Sinteza izotiocijanata iz N-sililovanih alkilamina

Natrijumove soli N-monosupstituisanih amida se mogu koristiti za sintezu

izotiocijanata. Nešto stariji pristup podrazumevao je reakciju odgovorajućih amida sa

natrijum-hidridom u suvim rastvaračima, a potom i reakciju sa ugljen-disulfidom na sobnoj

temperaturi (šema 21) (Shahak & Sasson, 1973). Na ovaj način se ne mogu dobiti alkil-

izotiocijanati, pa je sama metoda modifikovana. Kao polazna jedinjenja koriste se dostupni

N-alkil- ili N-ariltrifluoracetamidi, koji reaguju sa smešom anhidrovanog natrijum-hidroksida

i kalijum-karbonata u acetonitrilu na sobnoj temperaturi (Albanese, 1991).

Šema 21. Sinteza izotiocijanata iz anjona N-monosupstituisanih amida

Iminofosforani se dobijaju iz amina i trifenilfosfin-dibromida u prisustvu baze,

najčešće trietilamina. Podležu tiokarbonilaciji sa ugljen-disulfidom pod blagim uslovima i

daju izotiocijanate (šema 22) (Molina et al., 1982). Reakcijom se mogu dobiti alkil- i aril-

izotiocijanati, čak i aril-izotiocijanati koji imaju elektron-akceptorske supstituente, a prinosi

su dobri.

Šema 22. Sinteza izotiocijanata iz iminofosforana


22

2.2.3. Sinteza izotiocijanata iz organskih halogenida

Nukleofilna supstitucija organskih halogenida tiocijanatnim solima (amonijum-,

natrijum-, kalijum-, živa(II)- ili srebro(I)-rodanid) je jedna od najstarijih metoda za sintezu

izotiocijanata. Usled ambidentatne prirode tiocijanatnog (rodanidnog) anjona, reakcijom

skoro uvek nastaje smeša tiocijanata i izotiocijanata (šema 23). Kako su izotiocijanati

termodinamički stabilniji, izomerizacija tiocijanata u izotiocijanate se može postići

zagrevanjem, destilacijom reakcione smeše ili dodatkom cink(II)-hlorida (Smith & Emerson,

1960) ili bor-trifluorid - dietil-etar kompleksa (Cambie et al., 1979). Izomerizacija se vrši

jonskim mehanizmom i položaj ravnoteže zavisi od stabilnosti karb-katjona i polarnosti

rastvarača u kome se vrši reakcija (Smith & Emerson, 1960; Fava et al., 1965).

Šema 23. Sinteza izotiocijanata iz organskih halogenida

Alkil- i benzilni-halogenidi generalno daju tiocijanate, koji potom mogu u određenoj

meri izomerizovati u izotiocijanate. Uticaj stabilnosti karb-katjona na položaj ravnoteže

pokazuje činjenica da se terc-butil-izotiocijanat dobija u kvantitativnom prinosu

izomerizacijom tiocijanata pomoću zink(II)-hlorida (Schmidt et al., 1950), a za dobijanje

metil-izotiocijanata potrebni su drastičniji uslovi - refluktovanje reakcione smeše u DMF-u 2

sata (Anjaneyulu et al., 1985). Najbolji prinosi se dobijaju u DMF-u.

Tioacil-, oksikarbonil-, imidoil-, amidoil-, karbamoil- i tiokarbamoil-halogenidi u

reakciji sa rodanidima daju tiocijanate, koji mogu izomerizovati do izotiocijanata, dok acil-

halogenidi daju isključivo izotiocijanate. Reakcije se izvode u benzenu, toluenu, ksilenu,

acetonu ili acetonitrilu, a DMF se, u ovom slučaju, ne može koristiti zbog sporedne reakcije

sa proizvodom (Ruske & Keilert, 1961). Vrlo često se koristi tetrabutilamonijum-bromid kao

međufazni katalizator, koji smanjuje reakciono vreme i omogućava izvođenje reakcije u

dvofaznom sistemu (Reeves et al., 1981). Za reakciju sa acil-halogenidima se može koristiti i

trimetilsilil-izotiocijanat (TMS-NCS), a dobijaju se acil-izotiocijanati u visokom prinosu

(Fokin et al., 1972).

Neki autori su predlagali da se alil-tiocijanati mogu izomerizovati do alil-

izotiocijanata i [3,3]-sigmatropnim premeštanjem. Krotil-tiocijanat, destilacijom pod

atmosferskim pritiskom, daje α-metilalil-izotiocijanat umesto krotil-izotiocijanata (šema 24a)

(Mumm & Richter, 1940). Sa druge strane, cinamil-tiocijanat daje samo cinamil-izotiocijanat

jonskim mehanizmom (šema 24b) (Smith & Emerson, 1960).


23

Šema 24. Izomerizacija (a) krotil-tiocijanata i (b)cinamil-tiocijanata do odgovarajućih

izotiocijanata

2.2.4. Sinteza izotiocijanata iz alkena i alkina

Tiocijanatna kiselina generisana in situ se može syn adirati na aktivirane alkene, čime

nastaje smeša tiocijanata i izotiocijanata ili samo izotiocijanat (šema 25a). Aktivirani alkeni

su oni sa polarizovanim dvostrukim vezama ili cikloalkeni sa torzionim naponom (Cho &

Posner, 1992). Biciklični sistemi na šemi 25c reaguju sa tiocijanatnom kiselinom dajući egzo

dijastereoizomer izotiocijanata (Diveley et al., 1969). Reakcija se vrši tretiranjem smeše

biciklusa i kalijum-tiocijanata razblaženom sumpornom kiselinom u benzenu na 30-40 ºC. U

reakciji sa alkinima prvo nastaju tiocijanati, koji daljim zagrevanjem u prisustvu tiocijanatnog

anjona daju vinilni izotiocijanate (šema 25b) (Thieme & Hadicke, 1978).

Šema 25. Sinteza izotiocijanata iz (a) alkena, (b) alkina i (c) bicikličnih alkena

Postoji veliki broj metoda za sintezu 1,2-funkcionalizovanih jedinjenja iz alkena, a

jedna od takvih je i reakcija alkena sa smešom fenilselenil-hlorida i živa(II)-rodanida u

benzenu. Nastali β-(fenilseleno)alkil-izotiocijanat se oksidacijom prevodi u vinilni

izoticiocijanat, a kao sporedni proizvod nastaje mala količina alilnog izotiocijanata (šema 26)

(Toshimitsu et al., 1983).

Šema 26. Sinteza vinilnog izotiocijanata iz alkena

2.2.5. Sinteza izotiocijanata iz N,S- i N-heterocikličnih jedinjenja

Brojna heterociklična jedinjenja, lako dostupna, sintetisana ili generisana in situ,

mogu se koristiti u sintezi izotiocijanata. N,S-heterociklusi uglavnom reaguju sa fosfornim

jedinjenjima kao dehidrosulfurizacionim reagensima, a N-heterociklusi sa tiofozgenom.

Izotiocijanati mogu nastati iz nestabilnih 1,4,2-oksatiazola nastalih u reakciji tiouree i

nitril-oksida, polazeći od aldoksima (Kim & Ryu, 1993), hidroksimoil-hlorida (Kim et al.,

1997) ili nitroalkana (Kim et al., 1994). Raspadanjem oksatiazola nastaju izotiocijanat i urea

(šema 27).


24

Korišćenje aldoksima i hidroksimoil-hlorida je povoljno zbog dobrih prinosa, blagih

reakcionih uslova i kratkog reakcionog vremena, a urea se lako može ukloniti iz reakcione

smeše.

Šema 27. Sinteza izotiocijanata iz aldoksima, hidroksimoil-hlorida ili nitroalkana

Vinilni izotiocijanati se mogu sintetisati eliminacijom sumpora iz derivata tiazola

termički, fotolitički ili reagovanjem sa trimetoksifosfinom (šema 28a) (Hussein et al., 1978).

Iminoditiazoli mogu dati aril-izotiocijanate zagrevanjem u tetrahidrofuranu sa natrijum-

hidridom ili prevođenjem u cijanotioformanilide pomoću trifenilfosfina i potom reakcijom sa

etilmagnezijum-bromidom (šema 28b) (Besson et al., 1998).

Šema 28. Sinteza izotiocijanata iz (a) derivata tiazola i (b) iminoditiazola

Neki N-heterociklusi reaguju sa tiofozgenom u prisustvu baze (npr. trietilamin,

razblažen rastvor natrijum-hidroksida, kalcijum-karbonat, barijum-karbonat) i daju

izotiocijanate sa ovom grupom vezanom za sp2 hibridizovan ugljenikov atom. Ova reakcija se

može primeniti u slučaju velikog broja aromatičnih heterociklusa, kao što su piridin, hinolin,

izohinolin, benzoksazol, imidazol, benzimidazol i drugi. Hinolin reaguje sa tiofozgenom

dajući različite stereoizomere u zavisnosti od korišćene baze, a (Z)-izomer se zagrevanjem

prevodi u stabilniji (E)-izomer (šema 29a) (Hull, 1968). Heterociklusi koji nisu aromatični,

kao što su oksazoli, reaguju na sličan način sa tiofozgenom u prisustvu slabijih baza (šema

29b) (Gonda et al., 1986).

Šema 29. Sinteza izotiocijanata iz (a) hinolina i (b) oksazola


25

2.2.6. Sinteza izotiocijanata iz izonitrila

Još sedamdesetih godina prošlog veka je bilo poznato da aromatični izonitrili reaguju

sa elementarnim sumporom u ključajućem benzenu (Boyer & Ramakrishnan,1972), a reakcija

je poboljšana korišćenjem selena kao katalizatora u prisustvu tietilamina (Fujiwara et al.,

1991). Reakcija se odvija formiranjem izoselenocijanata i naknadnom supstitucijom selena

sumporom, što je i najsporiji korak u reakciji (šema 30). Ovo metodom se dobijaju alkil- i

aril-izotiocijanati u visokom prinosu.

Šema 30. Sinteza izotiocijanata reakcijom izonitrila i elementarnog sumpora

Druge komponente koje sadrže sumpor mogu reagovati sa izonitrilima. Reakcija

izonitrila sa disulfidima u hloroformu, u prisustvu talijum(I)- ili olovo(II)-acetata, daje skoro

kvantitativne prinose aril- i alkil-izotiocijanata (šema 31a) (Tanaka et al., 1977). Takođe, tioli

mogu reagovati sa izonitrilima u prisustvu radikalskog inicijatora (šema 31b) (Saegusa et al.,

1970).

Šema 31. Sinteza izotiocijanata reakcijom (a) izonitrila i disulfida i (b) izonitrila i tiola

2.2.7. Sinteza izotiocijanata iz aldehida i ketona

1-Cikloalkenil-izotiocijanati se mogu sintetisati reakcijom cikloalkanona sa silicijum-

izotiocijanatom, u prisustvu bis(trimetilsilil)sulfata i tributilfluorstanata (šema 32) (Mori et

al., 1984). Kao katalizator se može koristiti i zink(II)-izotiocijanat, ali prinosi su niži.

Reakcija zavisi od rastvarača koji se koristi i najveći prinosi se dobijaju u tetrahidrofuranu,

dioksanu ili dimetoksietanu.

Šema 32. Sinteza cikloalkenil-izotiocijanata

Alifatični aldehidi reaguju sa trimetilsilil-izotiocijanatom u prisustvu katalitičke

količine zink(II)-hlorida i daju u dobrom prinosu simetrične etre supstituisane dvema

izotiocijanatnim grupama (šema 33a) (Nishiyama & Oba, 1987). Aldolnom kondenzacijom

aldehida i/ili ketona u prisustvu kalijum-tiocijanata i fosforil-hlorida nastaju γ-

oksoizotiocijanati (šema 33b) (Bernat et al., 1988).

Šema 33. Sinteza (a) α,α'-diizotiocijanatoetara i (b) γ-oksoizotiocijanata


26

2.2.8. Ostale metode sinteze izotiocijanata

Mnogi izotiocijanati se mogu dobiti modifikacijom već sintetisanih ili lako dostupnih

izotiocijanata, različitim reakcijama supstitucije, eliminacije i adicije. Sterno zaštićeni aril-

izotiocijanati se dobijaju formalno reakcijom supstitucije aril-izotiocijanata (najčešće fenil-

izotiocijanat) odgovarajućim sterno zaštićenim anilinom. Reakcija je reverzibilna, izvodi se

bez prisustva rastvarača, uz zagrevanje i u višku aril-izotiocijanata. Intermedijer N,N'-

diariltiourea se razlaže na sterno zaštićeni aril-izotiocijanat i anilin, koji reaguje sa viškom

fenil-izotiocijanata (šema 34) (Habib & Rieker, 1984).

Šema 34. Sinteza sterno zaštićenih aril-izotiocijanata

Još jedna od metoda za sintezu vinilnih izotiocijanata je eliminacija

halogenovodonika iz izotiocijanata sa halogenim atomom u položaju 1. Ukoliko u β-položaju

postoji vodonikov atom, u prisustvu trietilamina dolazi do dehidrohalogenovanja (šema 35a)

(Hussein & Jochims, 1979). Uvođenje dvostruke C=C veze u izotiocijanat stvara mogućnost

za dalje transformacije (adicija hlora ili broma). Adicijom broma na alil-izotiocijanat nastaje

2,3-dibrompropil-izotiocijanat, a radikalskim bromovanjem alil-izotiocijanata pomoću N-

bromsukcinimida (NBS) i dibenzoil-peroksida (DBPO) nastaje smeša (Z)- i (E)-3-brom-1-

propenil-izotiocijanata (šema 35b) (Fedoseev & Litvinov, 1964; Kristian & Gonda, 1986).

Šema 35. Sinteza vinilnih izotiocijanata (a) dehidrohalogenovanjem i (b) bromovanjem

Kao što je u šemi 34 prikazano, N,N'-disupstituisane tiouree se razlažu na amin i

izotiocijanat. Razvijene su brojne metode za razlaganje tiourea, kako bi se primenile u sintezi,

a jedna od najboljih je ona koja se vrši pomoću N,N-dimetildihlormetaniminijum-hlorida i

organske baze na sobnoj temperaturi (šema 36a) (Vovk et al., 1991). Nešto drugačija metoda

je razlaganje pomoću etilmagnezijum-bromida ili butil-litijuma uz adiciju ugljen-disulfida,

čime nastaju dva mola izotiocijanata iz jednog mola tiouree (šema 36b) (Sakai et al., 1977).


27

Šema 36. Sinteza izotiocijanata reakcijom tiouree sa (a) N,N-dimetildihlormetaniminijum-

hloridom i (b) butil-litijumom i ugljen-disulfidom

Tercijarni alkoholi se mogu direktno prevesti u izotiocijanate korišćenjem fosforil-

izotiocijanata (šema 37) (Kniezo & Bernat, 1990), dobijenog reakcijom fosforil-hlorida i

kalijum-tiocijanata. Reakcija se vrši u alkoholu i daje dobre prinose i za alkil- i za benzil-

izotiocijanate, a koristi se i za sintezu acil-izotiocijanata iz karboksilnih kiselina. Nešto novija

metoda je reakcija tercijarnih alkohola sa trimetilsilil-izotiocijanatom u prisustvu BF3·Et2O

(šema 37) (Iwasawa et al., 1999). Primena ove metode je ograničena usled mogućnosti da

kod nekih alkohola dođe do eliminacije vode.

Šema 37. Sinteza izotiocijanata iz tercijarnih alkohola

3. Eksperimentalni deo

3.1. Reagensi .................................................................................................... 29

3.2. Metode analize i razdvajanja .................................................................. 30

3.2.1. Nuklearna magnetna rezonanca (NMR) ............................................. 30

3.2.2. Infracrvena spektroskopija (FTIR) ..................................................... 31

3.2.3. Ultraljubičasta spektroskopija (UV) ................................................... 31

3.2.4. Gasna hromatografija - masena spektrometrija (GC-MS) i gasna

hromatografija (GC)............................................................................ 31

3.2.5. Tankoslojna hromatografija (TLC) .................................................... 32

3.2.6. Dry flash hromatografija .................................................................... 32

3.2.7. Hromatografija na koloni ................................................................... 32

3.2.8. Određivanje tačke topljenja ................................................................ 32

3.3. Opis sintetskih koraka ............................................................................. 32

3.3.1. Opšta procedura za dobijanje oksima ................................................ 32

3.3.2. Opšta procedura za dobijanje amina .................................................. 33

3.3.3. Opšta procedura za dobijanje izotiocijanata ...................................... 34

3.4. Razdvajanje stereoizomernih oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ ..... 35

3.5. Ispitivanje stabilnosti oksima ................................................................. 36

3.6. Ispitivanje citotoksičnosti izotiocijanata prema odabranoj liniji

ćelija kancera ............................................................................................ 36

3.6.1. Priprema i tretiranje ćelijske linije kancera debelog creva ............... 36

3.6.2. MTT test .............................................................................................. 37

3.6.3. Statistička analiza ............................................................................... 37

3.7. Molekulsko modelovanje......................................................................... 37

3.8. 1H NMR iterativna potpuna spinska analiza (HiFSA) ......................... 38

Eksperimentalni deo Sinteza i spektralna karakterizacija monoterpenskih izotiocijanata

29

3.1. Reagensi

Za sintezu i prečišćavanje monoterpenskih izotiocijanata korišćene su sledeće

hemikalije:

I. monoterpenski aldehidi:

mirtenal;

kuminaldehid i

citral (smeša nerala i geranijala).

II. reagensi:

NH2OH·HCl, hidroksilamin-hidrohlorid;

NaOH(s), anhidrovani natrijum-hidroksid;

MgSO4(s), anhidrovani magnezijum-sulfat;

Na, natrijum;

LiAlH4, litijumaluminijum-hidrid;

CS2, ugljen-disulfid;

NEt3, trietilamin;

H2O2(aq), 30%-tni vodeni rastvor vodonik-peroksida;

HCl, koncentrovana hlorovodonična kiselina.

III. rastvarači:

Et2O, dietil-etar;

heksan;

metanol;

THF, tetrahidrofuran.

Za ispitivanje citotoksičnosti sintetisanih monoterpenskih izotiocijanata korišćene su

sledeće hemikalije:

I. reagensi:

DMEM medijum;

fetalni goveđi serum;

penicilin;

streptomicin;

cisplatina;

MTT, 3-(4,5-dimetiltijazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum-bromid.

II. rastvarač:

DMSO, dimetil-sulfoksid.


30

Sve korišćene hemikalije su p.a. čistoće, nabavljene iz komercijalnih izvora: Merck

(Nemačka), Carl Roth GmbH + Co. KG (Nemačka), Sigma-Aldrich (SAD) i Fluka (SAD), i

korišćene bez dodatnog prečišćavanja, osim rastvarača koji su neposredno pre korišćenja

predestilovani. U cilju dobijanja anhidrovanog etra, komercijalni etar je, nakon destilacije,

sušen anhidrovanim magnezijum-sulfatom i na kraju elementarnim natrijumom.

3.2. Metode analize i razdvajanja

3.2.1. Nuklearna magnetna rezonanca (NMR)

1D i 2D NMR spektri snimljeni su na Bruker Avance III 400 MHz spektrometru

(radna frekvenca 400,0 MHz za 1H, a 100,6 MHz za

13C NMR spektre), opremljenim sa 5

mm dvojnom 1H/

13C radnom glavom (probe head), na sobnoj temperaturi (298 K) i u dva

rastvarača (CDCl3 i CD3SOCD3). Masa od 10-15 mg supstance je rastvorena u 1 mL

rastvarača, pa je zatim 0,7 mL tog rastvora prebačeno u 5 mm Wilmad 528-TR-7 NMR

kivetu. Kao unutrašnji standard za 1H NMR korišćen je tetrametilsilan (TMS) (δH = 0,00

ppm), a pored njega za 13

C i heteronuklearne NMR spektre signali rastvarača - 13

CDCl3 (δC =

77,16 ppm) ili 13

CD3SOCD3 (δC = 39,52 ppm).

Uslovi snimanja

1H i

13C NMR spektara prikazani su u tabeli 1.

13C NMR spektri su

snimljeni sa i bez Waltz 16 1H širokopojasnog dekuplovanja (

13C{

1H} i

1H-kuplovani

13C).

Tabela 1. Uslovi snimanja 1H i

13C NMR spektara

1

H 13

C

broj skenova 16 12 000

relaksaciono vreme (s) 1 0,5

digitalna FID rezolucija (Hz) 0,244 0,5

FID veličina 65 536 65 536

spektralna širina (Hz) 8 012 24 038

vreme prikupljanja signala (s) 4,09 1,36

Vršeni su eksperimenti selektivnog dekuplovanja 1H NMR spektara u cilju

pojednostavljenja oblika signala. Snimljeni su DEPT90 i DEPT135 spektri, višepulsni

eksperimenti, u cilju razlikovanja stepena protonovanosti ugljenika. 2D NMR spektri (1H–

1H

gDQCOSY, gHMQC, 1H–

13C gHMBC i NOESY) snimani su uz primenu uobičajenih pulsnih

sekvenci, koje su sastavni deo softvera instrumenta, a korišćene su kvadratne sinusne funkcije

pomerene za π/2 duž F1 i F2 ose.

Dobijeni podaci su obrađeni u programu MestReNova (ver. 6.0.2-5475, Mestrelab

Research, Santiago de Compostela, Španija). Svaki od signala je okarakterisan hemijskim

pomeranjem (δ, ppm) u odnosu na pomeraj standarda, multiplicitetom (npr. s - singlet, d -

dublet, t - triplet), konstantom kuplovanja (J, Hz) i oznakom, koja pokazuje kom atomu ili

grupi atoma pripada dati signal. Signal u 1H NMR se označava sa δH i vrednosti su prikazane


31

sa dva decimalna mesta, a signali u 13

C NMR spektrima sa δC i vrednosti su prikazane sa

jednim decimalnim mestom.

3.2.2. Infracrvena spektroskopija (FTIR)

FT infracrveni spektri sintetisanih jedinjenja snimani su u obliku tankog sloja (neat),

pomoću dijamantske igle, na instrumentu Thermo Nicolet, model 6700 (Waltam, Masačusets,

SAD). Spektri su snimani detektovanjem reflektovane svetlosti sa površine uzorka (ATR -

attenuated total reflectance).

3.2.3. Ultraljubičasta spektroskopija (UV)

UV spektri sintetisanih jedinjenja su snimani u acetonitrilu na instrumentu Shimadzu

UV-1800 (Tokio, Japan). Merena je apsorpcija svetlosti talasnih dužina od 190 nm do 650

nm.

3.2.4. Gasna hromatografija - masena spektrometrija (GC-MS) i gasna

hromatografija (GC)

Gasna hromatografija - masena spektrometrija je instumentalna tehnika za analizu

isparljivih i delimično isparljivih organskih jedinjenja, pod uslovom da su jedinjenja stabilna

pri temperaturi analize. GC-MS analiza je izvedena pomoću Hewlett-Packard 6890N gasnog

hromatografa, koji je opremljen kapilarnom kolonom DB-5 (5% fenilmetilsiloksana, 30 m x

0,25 mm, debljina filma 0,25 μm, Agilent Technologies, USA), i direktno kuplovan sa 5975B

masenim detektorom iste kompanije, uz jonizacija elektronima energije 70 eV. Pun sken

masenog detektora beležen je u intervalu m/z 35-750, sa brzina skeniranja od 5 skenova u

sekundi, a vreme trajanja jednog skena je bilo 0,32 s. Korišćen je helijum kao noseći gas sa

konstantnim protokom od 1 mL/min. Temperaturni program, ukoliko nije drugačije

naznačeno, bio je sledeći: radna temperatura injektora 250 °C, a detektora 320 °C; linearni

temperaturni program zagrevanja kolone u opsegu od 70 °C do 315 °C, sa brzinom od 2

°C/min, a potom je temperatura održavana u toku 10 min na 315 ºC. Injektiran je 1 μl

rastvora uzorka u dietil-etru (5 mg reakcione smeše u 1 ml rastvarača) u „splitless” modu.

Procentni sastav reakcionih smeša je određen na osnovu površina pojedinačnih

pikova, bez korišćenja korekcionih faktora, a obrada TIC hromatograma i masenih spektara je

vršena u programu MestReNova (ver. 6.0.2-5475, Mestrelab Research, Santiago de

Compostela, Španija). Identifikacija sastojaka reakcionih smeša je izvršena u kombinaciji sa

AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, ver. 2.68) i

NIST MS Search programskim paketom (ver. 2.0d, Nacionalni institut za standarde i

tehnologiju (NIST), SAD), na osnovu analize fragmentacije ili poređenja njihovih masenih

skenova. AMDIS je korišćen za dekonvoluciju, tj. ekstrakciju masenih spektara iz

preklopljenih pikova, a NIST MS Search za pretragu biblioteka masenih spektara, Wiley

Registry of Mass Spectral Data 9th

Edition, NIST/EPA/NIH MassSpectral Library 11,

MassFinder 2.3 i Adams-ove biblioteke (Adams, 2007). Retencioni indeksi pojedinih

sastojaka izračunati su u odnosu na C8‒C40 n-alkane (Van den Dool & Kratz, 1963).


32

3.2.5. Tankoslojna hromatografija (TLC)

Tankoslojna hromatografija ili hromatografija na tankom sloju je korišćena za

određivanje sistema rastvarača za dry flash hromatografiju i hromatografiju na koloni silika-

gela, ali i za približno određivanje broja sastojaka u reakcionoj smeši i praćenje toka reakcije.

Kao stacionarna faza korišćen je silika-gel 60 UV254 (Merck, Darmštat, Nemačka), nanesen u

tankom sloju na alunijumsku ploču. Mrlje na pločicama su vizuelizovane pomoću UV lampe,

na talasnoj dužini od 254 nm.

3.2.6. Dry flash hromatografija

Preparativna dry flash hromatografija je korišćena za prečišćavanje izotiocijanata.

Stacionarna faza je bila kolona silika-gela 60 (20-45 μm, Carl Roth GmbH + Co. KG,

Karlsruhe, Nemačka), napakovana u sinterovanom staklenom levku srednje poroznosti i

veličine. Aparatura je bila povezana sa vodenom ili vakuum pumpom preko standardne

vakuum boce. Eluiranje je vršeno pri izokratskim uslovima heksanom.

3.2.7. Hromatografija na koloni

Preparativna gravitaciona hromatografija na koloni je korišćena za razdvajanje

stereoizomernih oksima citrala. Stacionarna faza je bila kolona silika-gela 60 (20-45 μm, Carl

Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Nemačka), napakovana u staklenu cev, dužine 70 cm i

prečnika 3 cm. Eluiranje je vršeno pri izokratskim uslovima smešom heksana i dietil-etra, u

zapreminskom odnosu heksan / dietil-etar = 4 : 1 (v/v).

3.2.8. Određivanje tačke topljenja

Tačka topljenja oksima dobijenog iz kuminaldehida je određena pomoću aparata za

određivanje tačke topljenja MPM-HV2 (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-

Konigshofen, Nemačka).

3.3. Opis sintetskih koraka

3.3.1. Opšta procedura za dobijanje oksima

(Damljanović et al., 2006)

Reaktanti, u molskom odnosu aldehid (ili smeša aldehida) / hidroksilamin-hidrohlorid

/ natrijum-hidroksid = 1:3:3, homogenizovani su u tarioniku pistilom 30 minuta, na sobnoj

temperaturi. Reakcionoj smeši je dodato 10 mL destilovane vode, a zatim je ekstrahovana

dietil-etrom (3 x 20 mL). Etarski ekstrakti su spojeni, isprani vodom i osušeni anhidrovanim

magnezijum-sulfatom. Nakon uklanjanja sredstva za sušenje filtracijom, rastvarač je uklonjen

na rotacionom vakuum uparivaču. Dobijeni oksimi su bili bezbojne ili bele supstance, oksim

kuminaldehida u kristalnom obliku, oksim mirtenal u vidu amorfne čvrste supstance ili u vidu

tečnosti (oksimi citrala). Korišćeni su kao polazna jedinjanja za dobijanje amina, bez

prethodnog prečišćavanja.


33

(1E,2E)-, (1Z,2E)-, (1E,2Z)- i (1Z,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal-oksim (11a, 11b,

11c i 11d): bezbojna tečnost, 1,61 g (91,0%); GC (DB-5): Rt 9,000 min, RI 1198; MS (EI, 70

eV) m/z (rel. int., %): 168 ([M+1]+, 0,7), 167 (M

+, 5,7), 166 ([M-1]

+, 6,5), 109 (65,4), 107

(17,0), 84 (65,4), 81 (20,0), 69 (100), 67 (44,3), 55 (31,9), 53 (15,9), 43 (74,6), 42 (19,1), 41

(75,0), 39 (24,6); FTIR (ATR, / cm-1

): 3150 - 3300w ((O-H), vodonično vezana

hidroksilna grupa), 2969m, 2925m, 2855m, 1675w ((C=C), izolovana dvostruka veza),

1640w ((C=N)), 1600m ((C=C), konjugovana dvostruka veza), 1438m, 1376m, 1295m,

1109m, 949m ((N-O)), 868s, 820m, 772s; UV (MeCN) λmax / nm (log ε): 242 (4,00), 296

(3,18).

1H- i

13C-NMR podaci su dati u tabelama 4 - 9.

(E)- i (Z)-(1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten-2-karbaldehid-oksim (21a i

21b): bela amorfna čvrsta supstanca, 790,6 mg (97,1%); GC (DB-5): Rt 13,281 min, RI 1358;

MS (EI, 70 eV) m/z (rel. int., %): 166 ([M+1]+, 2,9), 165 (M

+, 25,9), 164 ([M-1]

+, 1,6), 148

(46,0), 133 (22,9), 132 (30,9), 122 (100), 121 (35,8), 106 (28,0), 105 (32,4), 104 (26,9), 91

(39,4), 79 (30,4), 77 (58,8), 41 (23,0).

1H- i

13C-NMR podaci su dati u tabeli 14 i na šemi 59.

(E)- i (Z)-4-(1-metiletil)benzaldehid-oksim (31a i 32b): bela kristalna supstanca,

585,6 mg (90,4%); Tt 51,5 °C; GC (DB-5): Rt 15,786 min, RI 1471; MS (EI, 70 eV) m/z (rel.

int., %): 164 ([M+1]+, 5,0), 163 (M

+, 44,9), 162 ([M-1]

+, 0,9), 149 (10,0), 148 (100), 146

(10,1), 131 (10,9), 130 (28,6), 115 (7,7), 104 (13,3), 103 (26,1), 91 (12,5), 78 (7,3), 77 (15,6),

51 (6,2).

1H- i

13C-NMR podaci su dati u tabeli 17.

3.3.2. Opšta procedura za dobijanje amina

(Walter, 1952)

U suvi balon od 100 mL dodat je oksim, rastvoren u 20-30 mL anhidrovanog etra.

Litijumaluminijum-hidrid je dodat u velikom višku, sve dok se nije dobija siva boja

suspenzije. Balon je bio opremljen magnetnom mešalicom i refluks kondenzatorom sa

kalcijum-hloridnom cevčicom. Reakciona smeša je zagrevana pod refluksom 7 h, a potom

ohlađena pomoću ledenog kupatila. Višak litijumaluminijum-hidrida je uklonjen pažljivim

ukapavanjem 20 mL 10%-tnog vodenog rastvora kalijum-hidroksida. Beli voluminozni talog

je uklonjen filtriranjem, a filtrat je ekstrahovan dietil-etrom (3 x 20 mL). Etarski ekstrakti su

spojeni i osušeni anhidrovanim magnezijum-sulfatom. Nakon uklanjanja sredstva za sušenje

filtracijom, rastvarač je uklonjen na rotacionom vakuum uparivaču. Dobijeni amini su

bezbojne tečne supstance. Korišćeni su kao polazna jedinjenja za dobijanje izotiocijanata, bez

prethodnog prečišćavanja.

(E)- i (Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadien-1-amin (12a i 12b): bezbojna tečnost; 960,6 mg

(45,1%); GC-MS čistoća: 69,3%.


34

(E)-3,7-dimetil-2,6-oktadien-1-amin (12a): GC (DB-5): Rt 9,726 min, RI 1227; MS (EI, 70

eV) m/z (rel. int., %): 154 ([M+1]+, 0,1), 153 (M

+, 0,8), 152 ([M-1]

+, 1,4), 138 (30,7), 121

(37,4), 93 (44,9), 84 (69,0), 70 (90,8), 69 (80,2), 68 (47,0), 67 (30,1), 57 (63,4), 42 (28,7), 41

(100), 39 (25,8).

(Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadien-1-amin (12b): GC (DB-5): Rt 9,255 min, RI 1209; MS (EI, 70

eV) m/z (rel. int., %): 154 ([M+1]+, 0,2), 153 (M

+, 1,1), 152 ([M-1]

+, 1,4), 121 (34,5), 96

(69,0), 93 (83,8), 84 (36,2), 83 (53,0), 82 (36,1), 80 (36,4), 70 (82,9), 69 (60,4), 68 (45,6), 57

(39,7), 41 (100).

1H- i

13C-NMR podaci su dati u tabelama 10 i 11.

((1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten-2-il)metanamin (22): bezbojna tečnost;

611,3 mg (53,1%); GC-MS čistoća: 62.9%; GC (DB-5): Rt 10,057 min, RI 1229; MS (EI, 70

eV) m/z (rel. int., %): 152 ([M+1]+, 1,2), 151 (M

+, 11,3), 125 (51,6), 107 (11,4), 97 (100), 95

(16,9), 83 (36,0), 79 (37,1), 77 (18,5), 67 (33,3), 55 (37,8), 53 (15,8), 43 (14,2), 41 (42,9), 39

(26,9).

1H- i


(4-(1-metiletil)fenil)metanamin (32): bezbojna tečnost; 496,4 mg (57,1%); GC-MS

čistoća: 61,6%; GC (DB-5): Rt 10,901 min, RI 1274; MS (EI, 70 eV) m/z (rel. int., %): 150

([M+1]+, 0,7), 149 (M

+, 7,3), 148 ([M-1]

+, 24,7), 134 (7,9), 133 (12,2), 132 (14,9), 117

(11,7), 115 (5,7), 107 (8,9), 106 (100), 105 (12,0), 103 (4,3), 91 (9,8), 79 (15,6), 77 (9,3).

1H- i


3.3.3. Opšta procedura za dobijanje izotiocijanata

(Li et al., 1997)

U balon od 25 mL, koji je bio opremljen magnetnom mešalicom i refluks

kondenzatorom, dodat je amin rastvoren u 10 mL tetrahidrofurana. Uz neprekidno mešanje

reakcione smeše, dodata je katalitička količina trietilamina, a potom i ugljen-disulfid u

kapima, u molskom odnosu amin / trietilamin / ugljen-disulfid = 1 : 0,1 : 5. Reakciona smeša

je mešana oko 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon toga, smeša je ohlađena pomoću ledenog

kupatila, a temperatura održavana u opsegu 0 - 5 ºC, kada je ukapavan 30%-tni vodeni rastvor

vodonik-peroksida, u molskom odnosu amin / vodonik-peroksid = 1:3. Reaciona smeša je

zakišeljena koncentrovanom hlorovodoničnom kiselinom, THF je uklonjen na rotacionom

vakuum uparivaču, a ostatak ekstrahovan dietil-etrom (3 x 20 mL). Etarski ekstrakti su

spojeni i osušeni anhidrovanim magnezijum-sulfatom. Sredstvo za sušenje je uklonjeno

filtracijom, a dietil-etar na rotacionom vakuum uparivaču. Dobijena je žuto obojena smeša,

zbog prisustva sumpora, koji se dobija kao još jedan proizvod u reakciji. Čist izotiocijanat je

dobijen nakon dry flash hromatografije (eluiranje čistim heksanom). Dobijeni izotiocijanati

su bili bezbojne tečne supstance, oštrog mirisa.


35

(E)- i (Z)-1-izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-oktadien (13a i 13b): bezbojna tečnost,

166,2 mg (19,6%); ukupni prinos: 8,6%; FTIR (ATR, / cm-1

): 2966w, 2913w, 2855w, 2230

- 1950s ((N=C=S), asimetrične vibracije), 1668w ((C=C)), 1441m, 1376w, 1312m, 1247w,

1108w, 832w, 700w.

(E)-1-izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-oktadien (13a): GC (DB-5): Rt 18,562 min, RI 1578; MS

(EI, 70 eV) m/z (rel. int., %): 196 ([M+1]+, 0,8), 195 (M

+, 5,3), 194 ([M-1]

+, 2,4), 152 (5,8),

137 (6,3), 100 (7,9), 95 (8,0), 93 (11,6), 81 (8,5), 69 (100), 68 (22,5), 67 (16,3), 53 (9,3), 41

(40,9), 39 (8,6).

(Z)-1-izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-oktadien (13b): GC (DB-5): Rt 18,041 min, RI 1555; MS

(EI, 70 eV) m/z (rel. int., %): 196 ([M+1]+, 1,0), 195 (M

+, 7,1), 194 ([M-1]

+, 2,5), 137 (7,5),

125 (7,4), 95 (7,3), 93 (17,1), 81 (11,2), 80 (7,5), 69 (100), 68 (23,3), 67 (18,3), 53 (10,2), 41

(44,0), 39 (9,3).

1H- i

13C-NMR podaci su dati u tabelama 12 i 13.

(1R,5S)-2-(izotiocijanatometil)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten (23): bezbojna

tečnost, 138,4 mg (28,2%); ukupni prinos: 14,5%; GC (DB-5): Rt 17,395 min, RI 1528; MS

(EI, 70 eV) m/z (rel. int., %): 194 ([M+1]+, 0,4), 193 (M

+, 2,3), 192 ([M-1]

+, 1,4), 149 (5,4),

119 (12,0), 105 (7,1), 93 (12,6), 92 (18,1), 91 (100), 79 (15,8), 77 (14,3), 72 (25,5), 65 (5,6),

41 (10,1), 39 (7,0); FTIR (ATR, / cm-1

): 2985w, 2923m, 2826w, 2180 - 1950s ((N=C=S),

asimetrične vibracije), 1655w ((C=C)), 1474w, 1428m, 1365w, 1328m, 1303m, 1259w,

1204w, 1081w, 952w, 886w, 787w, 772w, 696m, 672m.

1H- i


1-(1-metiletil)-4-(izotiocijanatometil)benzen (33): bezbojna tečnost, 154,3 mg

(42,5); ukupni prinos: 20,3%; GC (DB-5): Rt 19,646 min, RI 1626; MS (EI, 70 eV) m/z (rel.

int., %): 192 ([M+1]+, 0,6), 191 (M

+, 5,0), 190 ([M-1]

+, 0,2), 134 (10,9), 133 (100), 118

(15,8), 117 (19,6), 116 (2,9), 115 (9,7), 105 (19,0), 103 (3,0), 91 (14,6), 89 (3,3), 77 (3,8), 65

(2,9); FTIR (ATR, / cm-1

): 3060w ((ar.C-H)), 3010w ((ar.C-H)), 2959m, 2924w, 2868w,

2220 - 1950s ((N=C=S), asimetrične vibracije), 1613 - 1513w ((ar.C=C)), 1462w, 1439w,

1420m, 1333m, 1299w, 1054w, 1018w, 814m ((ar.C-H), van ravni, para-supstituisano

benzenovo jegro), 749w, 680m; UV (MeCN) λmax / nm (log ε): 196 (4.93), 218 (4.24), 245

(4.26).

1H- i


3.4. Razdvajanje stereoizomernih oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ

Sintezom oksima bez prisustva rastvarača iz citrala, komercijalne smeše nerala i

geranijala ((Z)-, odnosno (E)-dijastereoizomer), po postupku opisanom u poglavlju 3.4.1.,

dobijena su četiri stereoizomerna oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ. Stereoizomerni oksimi


36

((1E,2E)-, (1Z,2E)-, (1E,2Z)- i (1Z,2Z)-) su razdvojeni izokratskom hromatografijom na

koloni silika-gela. Kao eluent korišćena je smeša heksan / dietil-etar = 4:1 (v/v).

(frakcija 1) (1E,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal-oksim (11a): bezbojna tečnost, 231,5

mg (21,0%). GC, MS, UV i FTIR podaci su isti kao za smešu oksima (11a - d).

(frakcija 2) (1E,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal-oksim (11c): bezbojna tečnost, 57,0


(frakcija 3) (1Z,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal-oksim (11d): bezbojna tečnost, 189,8


(frakcija 4) (1Z,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal-oksim (11b): bezbojna tečnost, 290,8


3.5. Ispitivanje stabilnosti oksima

U hromatogramima reakcionih smeša sintetisanih monoterpenskih oksima 3,7-

dimetil-2,6-oktadienalâ i primećeni su i pikovi odgovarajućih nitrila, nastali dehidratacijom

oksima pri uslovima gasne hromatografije.

Kako bi se utvrdile temperature pri kojima dolazi do značajne termalne degradacije,

oksimi su analizirani pomoću GC-MS-a sa izmenjenim temperaturnim programima, tj. pri

sniženim radnim temperaturama injektora (250, 235, 215, 200 i 180 ºC) i linearnim

temperaturnim programom zagrevanja kolone u opsegu od 70 °C do (temperatura injektora +

10) °C, sa brzinom zagrevanja od 8 °C/min.

3.6. Ispitivanje citotoksičnosti izotiocijanata prema odabranoj liniji ćelija

kancera

3.6.1. Priprema i tretiranje ćelijske linije kancera debelog creva

Citotoksičnost sintetisanih monoterpenskih izotiocijanata je ispitivana na humanoj

ćelijskoj liniji kancera debelog creva HCT-116 (ATCC, Manasas, Virdžinija, SAD). Ćelije

su kultivisane u medijumu DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Gibco, SAD), koji

sadrži i 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 IU/cm3 penicilina i 100 μg/cm

3 streptomicina, u

inkubatoru, pod standardnim uslovima (atmosfera zasićena vodenom parom, procentni

sadržaj CO2 5% (v/v) i temperatura 37 ºC). Sterilna mikrotitar ploča, kod koje je u svaki

bunarić dodato 100 μL medijuma sa 104 ćelija, inkubirana je u toku 24 h pri standarnim

uslovima. Nakon adherence ćelija, medijum je zamenjen sa 100 μL rastvora izotiocijanata

različitih koncentracija, a mikrotitar ploča je ponovo inkubirana 24 h i 72 h.

Osnovni rastvori izotiocijanata, koncentracija 40 i 100 mg/cm3, dobijeni su

rastvaranjem određene količine supstanci u dimetil-sulfoksidu, a njihovim razblaživanjem,

medijumom DMEM, dobijeni su rastvori koncentracija od 40 i 100 μg/cm3 do 0,04 i 0,01


37

μg/cm3. Paralelno sa rastvorima izotiocijanata, testirani su i rastvori cisplatine u medijumu

DMEM, koncentracija od 0,1 do 10 μg/cm3 (pozitivna kontrola). U određeni broj bunarića je

umesto rastvora test supstance, dodat je medijum DMEM u istoj količini da bi se potvrdila

vijabilnost ćelija (negativna kontrola).

3.6.2. MTT test

(Mosmann, 1983)

Nakon inkubiranja ćelija kancera debelog creva sa rastvorima izotiocijanata i

cisplatine 24 h i 72 h, citotoksičnost izotiocijanata je određena MTT testom ((3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum-bromid). Prvo su ćelije isprane pomoću 100 μL

PBS-a (phosphate-buffered saline, puferovani vodeni rastvor natrijum-hidrogenfosfata i

natrijum-hlorida), a potom je dodato 100 μL rastvora MTT soli koncentracije 5 mg/cm3 u

svaki bunarić, a ćelije su inkubirane 3 h, pri standardnim uslovima. Rastvor MTT soli je

uklonjen, a kristali formazana su rastvoreni u 150 μL dimetil-sulfoksida. Apsorbance uzoraka

su merene na čitaču mikroploča RT-6100, na talasnoj dužini od 550 nm. Za analizu je

korišćen Microplate reader RT-6100 (Rayto, Kina).

Eksperimenti su ponovljeni tri puta za svaku koncentraciju sintetisanih supstanci i

cisplatine, a prikazane su srednje vrednosti rezultata. Rezultat je prikazan kao procenat živih

ćelija, dobijen tako što se apsorbanca uzorka tretiranog rastvorom izotiocijanata određene

koncentracije podeli apsorbancom uzorka kontrolne grupe (negativna kontrola) i pomnoži sa

100. Citotoksičnost cisplatine i ispitivanih jedinjenja je prikazana i kao IC50, tj. vrednosti

koncentracije koja ubija 50% ispitivanih ćelija kancera. IC50 vrednosti se mogu izračunati na

osnovu podataka dobijenih iz grafika zavisnosti procenta živih ćelija od koncentracije

jedinjenja. Obrada rezultata i izračunavanje IC50 je izvršeno u programu OriginPro 8 (ver.

8.0724, OriginLab Corporation, Nortampton, Masačusetc, SAD).

3.6.3. Statistička analiza

Izračunata je srednja vrednost i standardna devijacija rezultata. Upareni Studentov t-

test korišćen je za statističku obradu dobijenih podataka i utvrđivanja značajnosti razlike

između srednjih vrednosti tretiranih i kontrolnih uzoraka. U svim statističkim analizama,

interval poverenja bio je 95%. Dobijeni podaci su obrađeni u programu IBM SPSS Statistics

(ver. 17.0.0, Čikago, Ilinois, SAD).

3.7. Molekulsko modelovanje

Preliminarna pretraga konformacionog prostora oksima citrala (11a - d) je izvršena

pomoću softverskog paketa Chem3D, opcija dihedral driver. Odabrana geometrija, koja

odgovara energetskom minimumu dobijenom nakon MMFF94 optimizacije, je dalje

optimizovana na DFT nivou teorije (B3LYP funkcional i 6-31G basis set). Vibracionom

analizom je potvrđeno da optimizovane geometrije oksima citrala predstavljaju energetske

minimume. Svi DFT proračuni su vršeni pomoću softverskog paketa Gaussian 09 (ver. 7.0,

Gaussian, Valingford, Konektikat, SAD). Za svaku od optimizovanih geometrija su


38

korišćenjem GIAO metode (specijalizovani WP04 funkcional (DFT nivo teorije) i aug-cc-

pVDZ basis set) izračunata 1H i

13C NMR hemijska pomeranja u odnosu na TMS.

3.8. 1H NMR iterativna potpuna spinska analiza (HiFSA)

Polazeći od odgovarajućih očitanih i izračunatih (na osnovu Karplus-ove jednačine)

vrednosti, vrednosti H i J su manuelno korigovane. Korigovane H/J vrednosti su poslužile

kao početna tačka za dalju optimizaciju koja je vršena pomoću MestReNova (ver. 6.0.2-5475,

Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Španija) softvera. Podešavanje H i J vrednosti

je vršeno sve dok ishod simulacije nije bio u saglasnosti sa eksperimentalnim spektrima.

4. Rezultati i diskusija

4.1. Sinteza izotiocijanata ............................................................................... 40

4.2. Razdvajanje stereoizomernih oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ ..... 42

4.3. Termalna stabilnost oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ ..................... 42

4.4. Asignacija spektara ................................................................................. 45

4.4.1. Asignacija spektara jedinjenja 11a - d, 12a i b, 13a i b ..................... 45

4.4.2. Asignacija spektara jedinjenja 21a i b, 22 i 23 .................................. 64

4.4.3. Asignacija spektara jedinjenja 31a i b, 32 i 33 .................................. 72

4.5. Ispitivanje citotoksičnosti izotiocijanata ................................................ 76

Rezultati i diskusija Sinteza i spektralna karakterizacija monoterpenskih izotiocijanata

40

4.1. Sinteza izotiocijanata

Sinteza monoterpenskih izotiocijanata je osmišljena na osnovu dole prikazane

retrosintetičke šeme (šema 38). Izotiocijanat bi se dobio iz amina, koji bi se dobio iz aldehida

(RCH2 je ostatak monoterpena), a preko intemedijarnih oksima.

Šema 38. Retrosintetička analiza izotiocijanata

Prateći retrosintetičku šemu (šema 38), prvi korak sinteze izotiocijanata predstavlja

reakciju konverzije aldehida u oksim bez prisustva rastvarača (solvent-free), drugi korak

redukciju oksima do amina litijumaluminijum-hidridom i treći korak prevođenje amina u

izotiocijanat reakcijom sa ugljen-disulfidom i oksidacijom nastalih ditiokarbamata pomoću

vodonik-peroksida. Kao polazni aldehidi korišćeni su komercijalno dostupni monoterpenski

aldehidi - smeša geranijala i nerala (citral), mirtenal i kuminaldehid (šema 39).

Šema 39. Opšta šema sinteze monoterpenskih izotiocijanata

Smeša geranil- i neril-izotiocijanata (13a i 13b), mirtenil-izotiocijanat (23) i kuminil-

izotiocijanat (33) su uspešno sintetisani u tri koraka (šema 39). Mase intermedijera i prinosi

pojedinačnih koraka i ukupne sinteze su prikazani u tabeli 2, a strukture svih sintetskih

intermedijera, njihove oznake i odnosi stereoizomera u smeši su prikazani u tabeli 3.

Tabela 2. Mase polaznih aldehida (mg), mase sintetskih intermedijera (mg) i prinosi (%)

pojedinačnih koraka i ukupne sinteze izotiocijanata

geranil- i neril-

izotiocijanati

mirtenil-

izotiocijanata

kuminil-

izotiocijanat

masa aldehida 2 500 740 588

masa (prinos) oksima 2 490* (91,0) 790,6 (97,1) 585,6 (90,4)

masa (prinos) amina 960,6 (45,1)** 611,3 (53,1)** 496,4 (61,6)**

masa (prinos) izotiocijanata 166,2 (19,6)*** 138,4 (28,2)*** 154,3 (42,5)***

ukupan prinos 8,6 14,5 20,3

* od toga je 1,61 g iskorišćeno za sintezu amina

** uračunat je i sadržaj u reakcionoj smeši na osnovu GC-MS analize (69,3, 62,9 i 61,6%)

***prinos izotiocijanata izračunat u odnosu na masu amina u reakcionoj smeši


41

Tabela 3. Strukture svih sintetskih intermedijera, njihove oznake i odnosi u smeši

Aldehid(i) Oksim(i) Amin(i) Izotiocijanat(i)

geranijal : neral = 1,4 : 1 11a : 11b : 11c : 11d = 3,2 : 2,1 : 1,4 : 1,0

12a : 12b = 1,4 : 1,0

13a : 13b = 1,7 : 1,0

21a : 21b = 61,3 : 1,0

31a : 31b = 18,1 : 1

Sinteza oksima je izvršena reakcijom bez prisustva rastvarača (solvent-free), mešanjem u tarioniku odgovarajućeg monoterpenskog aldehida, hidroksilamin-hidrohlorida i natrijum-hidroksida, u molskom odnosu 1 : 5 : 5, trideset minuta. Prinosi ove reakcije su bili jako visoki (90 - 97%), a dobijeni su svi stereoizomerni oksimi. Od ukupno dobijenih 2,49 g oksima citrala, 882,2 mg je iskorišćeno za hromatografsko razdvajanje stereoizomera (poglavlje 4.2.), a ostatak za dalju sintezu amina. U reakcionoj smeši oksima citrala, na osnovu 1H NMR spektra smeše, bilo je četiri stereoizomerna oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienala ((1E,2E)-, (1Z,2E)-, (1E,2Z)- i (1Z,2Z)), u odnosu 3,2 : 2,1 : 1,4 : 1,0. Sinteza oksima iz (-)-mirtenala dala je dva stereoizomera, (E)- i (Z)-(1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten-2-karbaldehid oksim, čiji je odnos, na onovu 1H NMR spektra smeše, 61 : 1. Jako mala količina (Z)-stereoizomera oksima mirtenala onemogućila je potpuno asignaciju ovog stereoizomera. Slično tome, iz kuminaldehida dobijena su dva stereoizomera, (E)- i (Z)-4-(1-metiletil)benzaldehid oksim, čiji je odnos (18 : 1) utvrđen na osnovu 1H NMR spektra smeše.

Amini su dobijeni redukcijom oksima bez prečišćavanja litijumaluminijum-hidridom u velikom višku, refluktovanjem smeše 7 h. Prinos ovog koraka je bio 45 - 57% u odnosu na polaznu smešu oksima, jer je sadržaj amina u izolovanom ostatku bio između 60 i 70%. Prečišćavanje reakcione smeše je izvršeno tek nakon sinteze izotiocijanata, kako bi se

11aR1 H

NHO

R1 H

NOH

11b

11cR2 H

NHO

R2 H

NOH

11d

R3 HO


42

smanjila količina potrebnog rastvarača i silika-gela. Redukcijom smeše oksima citrala dobijena je smeša geranil- i neril-amina, u odnosu 1,4 : 1,0.

Ditiokarbamatne soli su sintetisane reakcijom amina sa ugljen-disulfidom (u molskom odnosu 1 : 5) u tetrahidrofuranu, u prisustvu katalitičke količine trietilamina. Nakon mešanja reakcione smeše 1 h i hlađenja smeše pomoću ledenog kupatila, ukapavan je višak vodonik-peroksida (molski odnos amina i vodonik-peroksida 1 : 3), pri čemu su se ditiokarbamati prvo oksidovali do intermedijernih tiuramdisulfida, a potom do izotiocijanata i elementarnog sumpora. Utvrđeno je da je najbolji eluent za prečišćavanje smeše dry flash hromatografijom čisti heksan. Dry flash hromatografijom dobijene su bezbojne tečne supstance, karakterističnog mirisa, koji podseća na miris kupusa. Prinosi ovog koraka su bili između 19 i 42%, pri čemu je prinos opadao u nizu: kuminil-izotiocijanat > mirtenil-izotiocijanat > smeša geranil- i neril-izotiocijanata. Odnos geranil- i neril-izotiocijanata u smeši je bio 1,7 : 1,0. Strukture svih oksima, amina i izotiocijanata potvrđene su MS, IR, UV i NMR spektroskopijom (poglavlje 4.4.).

4.2. Razdvajanje stereoizomernih oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ

Smeša (1E,2E)-, (1Z,2E)-, (1E,2Z)- i (1Z,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal oksima (882,2 mg) je uspešno razdvojena pomoću preparativne kolonske hromatografije. Na osnovu TLC-a, utvrđeno je da je najbolji eluent smeša heksana i dietil-etra u zapreminskom odnosu 4 : 1. Izokratskom hromatografijom dobijeni su uzorci sva četiri čista stereoizomerna oksima: (1E,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal oksim (11a, 231,5 mg, 21,0%), (1E,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal oksim (11b, 57,0 mg, 5,2%), (1Z,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal oksim (11c, 189,8 mg, 17,4%) i (1Z,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal oksim (11d, 290,8 mg, 26,5%). Čisti oksimi su čuvani na -20 °C i bili su stabilni u periodu od nedelju dana. Struktura i čistoća jedinjenja potvrđena je TLC analizom i NMR spektroskopijom, a svaki od oksima je potpuno spektralno okarakterisan (poglavlje 4.4.1.).

4.3. Termalna stabilnost oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ

Prilikom analize smeše oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ gasnom hromatografijom - masenom spektrometrijom, primećeno je da su se u hromatogramima, pored očekivanih pikova oksima, pojavili pikovi koji potiču od nitrila nerične i geranične kiseline, na retencionim vremenima 8,132 min i 7,591 min. Pretragom literature je pronađeno da se oksimi citrala raspadaju u gasno-hromatografskoj koloni (Ouédraogo et al., 2009). Da bi se pronašli uslovi pri kojima je njihovo raspadanje minimalno, zarad kvantitativne analize i određivanja retencionih indeksa, vršena je GC-MS analiza pri čemu su varirani parametri analize. Ouédraogo i saradnici su primenili kompleksni program (temperatura injektora: 250 °C, linearno povećanje temperature od 55 °C do 150 °C, brzinom 1 °C/min, a potom povećanje temperature do 250 °C, brzinom 5 °C/min) pri analizi oksima citrala.

Smeša oksima citrala je analizirana sa izmenjenim temperaturnim programima, tj. pri sniženim radnim temperaturama injektora (250, 235, 215, 200 i 180 ºC). Korišćen je linearni


43

temperaturni program zagrevanja kolone u opsegu od 70 °C do (temperatura injektora + 10) °C, sa brzinom od 8 °C/min. Dobijeni hromatogrami pri ovakvim uslovima su prikazani na slici 1. Sadržaj nitrila se kreće od tragova pri temperaturi injektora od 180 ºC, do 0,91% pri temperaturi injektora od 250 ºC. Međutim, pri temperaturi injektora od 180 ºC uzorak nije bio u potpunosti isparljiv, što se vidi na osnovu pojave novih pikova pri višim temperaturama injektora. Interesantno, javio se samo jedan pik koji je odgovarao oksimima citrala, iako su Ouédraogo i saradnici detektovali četiri odvojena pika, ali nisu mogli da odrede vrednosti retencionih indeksa zbog postojanja dve rampe u programu.

Slika 1. Termaalna stabilnost okksima 3,7-dimetttil-2,6-oktadienatemperatura pren

alâ: TIC hromatonosne linije, prog

ogrami pri različgram zagrevanja

itim uslovima sna)

nimanja (temper

4

ratura injektora,

44


45

4.4. Asignacija spektara

Sva jedinjenja su potpuno spektralno okarakterisana pomoću 1H i

13C (

13C{

1H} i

1H-

kuplovani 13

C) u kombinaciji sa 2D NMR spektrima (1H–

1H gDQCOSY, gHMQC,

1H–

13C

gHMBC i NOESY), selektivno homodekuplovanim 1H, DEPT90 i DEPT135 spektrima.

Uzorci su snimani u deuterohloroformu (CDCl3), osim spektara oksima citrala 11a - d koji su

snimljeni i u perdeuterodimetilsulfoksidu (CD3SOCD3). Dobijeni podaci su potvrdili

predviđene strukture (tabela 3).

4.4.1. Asignacija spektara jedinjenja 11a - d, 12a i b, 13a i b

Reakcione smeše jedinjenja 11a - d, 12a i b, 13a i b su prvo analizirane gasnom

hromatografijom kuplovanom sa masenim detektorom. U hromatogramu uzorka oksima

citrala pojavio se jedan pik, dok su se kod uzoraka amina i izotiocijanata pojavila dva pika, sa

jako sličnim masenim spektrima, koji se očekuju za geometrijske izomere. U masenim

spektrima ovih jedinjenja prvo su uočeni molekulski joni i to na vrednostima 167, 153 i 195.

Na šemi 40, prikazane su verovatne fragmentacije koje objašnjavaju nastanak nekih od

uočenih fragmentnih jona, a koje su u saglasnosti sa predloženim strukturama oksima citrala i

geranil-/neril-amina i izotiocijanata.

Šema 40. Pretpostavljene odabrane MS fragmentacije jedinjenja 11a, 12a i 13a

Najbitnije informacije o strukturi i stereohemiji ciljnih jedinjenja i sintetskih

intermedijera dobijene su analizom NMR spektara. Numeracija ugljenikovih atoma jedinjenja

11a - d, 12a i b i 13a i b i za njih vezanih vodonikovih atoma, korišćena pri analizi NMR

spektara, prikazana je na šemama 46 - 55.

U 1H i

13C NMR spektrima ovih jedinjenja, hemijska pomeranja i multiplicitet se

razlikuje za ugljenike, odnosno protone 1, 2, 3, 4, 5, 10 i proton hidroksilne grupe kod

oksima, odnosno amino grupe kod amina. Signali protona i ugljenika 6, 7, 8 i 9 su u svim

spektrima jako slični, uz minimalne razlike u vrednostima konstanti kuplovanja. Proton 6 je

na hemijskom pomeranju 5,09 ppm i predstavlja pseudo triplet septupleta, jer pored

vicinalnog kuplovanja sa vodonicima iz CH2 grupe 5, on se alilno kupluje sa protonima iz

metil-grupa 8 i 9 konstantama koje su vrlo bliske po vrednosti. Protoni dve metil-grupe 8 i 9

su asignirani na osnovu NOESY spektara, u kojima se može uočiti interakcija protona 8 sa

protonima 5 i protona 9 sa protonom 6 (šema 41). Vodonici iz amino-grupe su se u 1H NMR

spektru javili kao široki singlet, pa je njihovo uočavanje bilo otežano. Oni su nedvosmisleno


46

asignirani na osnovu NOESY spektara, uočavanjem cross-pikova izmene (suprotne faze u

odnosu na ostale cross-pikove) sa tragovima vlage u uzorku (1,6 ppm u CDCl3).

U odnosu na proton 6, na višem hemijskom pomeranju nalazi se signal protona 2, koji

je na približno 5,30 ppm kod amina i izotiocijanata, a kupluje se vicinalno sa protonima 1 i

alilno sa protonima 10 i 4. Hemijsko pomeranje protona metil-grupe 10 zavisilo je od

konfiguracije C=C veze i kod oksima je hemijsko pomeranje kod (2E)-stereoizomera manje

za 0,4 ppm od pomeranja kod (2Z)-stereoizomera. Kod amina i izotiocijanata se može uočiti

isti trend, ali sa nešto većom razlikom (0,8 i 0,9 ppm). Proton 2 je na pomeranju 3,25,

odnosno 4,05 ppm, kod amina, odnosno izotiocijanata, što se i očekuje na osnovu različite

elektronegativnosti sp3, odnosno sp

2 hibridizovanog azotovog atoma.

Šema 41. Odabrane NOESY (isprekidana linija) i gHMBC (puna linija) interakcije

(oksim: R1 i R2: =NOH, amin: R1: H, R2: -NH2, izotiocijanati: R1: H, R2: -NCS)

Signali protona 4 i 5 su kod svih jedinjenja bili multipleti višeg reda. Kako su u NMR

spektrima smeša geranil- i neril-amina i izotiocijanata ovi signali preklopljeni, odlučeno je da

se izvrši spin simulacija signala protona 4 i 5 kod četiri stereoizomerna oksima citrala 11a -

d. Pretpostavljamo da će kod geranil- i neril-amina i izotiocijanata vrednosti konstanti

kuplovanja biti jako slične sa onim dobijenim spin simulacijom za oksime citrala. Polazne

vrednosti konstanti kuplovanja i hemijskih pomeranja za protone 4 i 5 su bile one koje su

mogle da se očitaju iz NMR spektara u deuterodimetilsulfoksidu. Podešavanje parametara

(konstante kuplovanja, hemijsko pomeranje, spektralna širina) je vršeno sve dok se nije

dobilo najbolje slaganje simuliranog i eksperimentalnog oblika signala (slike 2 i 3). (2E)-

stereoizomeri oksima citrala predstavljaju AA'BB' multiplete, sa velikim vrednostima

geminalnih (-10 Hz za protone 4 i -12 Hz za protone 5) i vicinalnih konstanti kuplovanja (6 i

9 Hz). Jedina razlika kod (2E)-stereoizomera je hemijsko pomeranje protona 4 i 5 (tabele 4 i

5). U slučaju (2Z)-stereoizomera signali su, na prvi pogled, složeniji, međutim, spin

simulacijom je utvrđeno da su to AA'XX' multipleti, kod kojih su je došlo do usrednjavanja

konstanti kuplovanja. (1Z,2Z)-oksim citrala ima nešto višu konstantu kuplovanja protona 4 i 5

(7,9 Hz) u odnosu na (1E,2Z)-oksim citrala (7,6 Hz). Poznavanje vrednosti vicinalnih

konstanti J4,5 omogućava izračunavanje zastupljenosti anti- i gauche-konformera duž C-4 -


47

C-5 veze korišćenjem Karplus-ove jednačine, uz pretpostavku da je konformaciona ravnoteža

veoma brza (slika 4).

Slika 2. Eksperimentalni (gore) i simulirani (dole) signala protona 4 i 5 u 1H NMR spektru

kod (1E,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal oksima (levo, 11a) i (1Z,2E)-3,7-dimetil-2,6-

oktadienal oksima (desno, 11b)

Slika 3. Eksperimentalni (gore) i simulirani (dole) signali protona 4 i 5 u 1H NMR spektru

kod oksima (1E,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienala (levo, 11c) i oksima (1Z,2Z)-3,7-dimetil-2,6-

oktadienala (desno, 11d)

Slika 4. Izračunavanje zastupljenosti anti- i gauche-konformera duž C-4 - C-5 veze

korišćenjem Karplus-ove jednačine


48

Za sve ugljenike koji imaju vezan makar jedan proton, asignacija je izvršena na osnovu gHMQC spektara, dok su neprotonovani ugljenici i ugljenici CH2 grupa 4 i 5, asignirani na osnovu njihovih korelacija u gHMBC spektrima (šema 41). U slučaju NMR spektara smeša amina, odnosno izotiocijanata, intenzitet bliskih signala u 13C NMR spektrima je korišćen pri asignaciji. DEPT135 je pokazao da postoje tri metil- i dve metilenske grupe, što je u skladu sa strukturama jedinjenja. Pored dekuplovanih 13C NMR spektara, za oksime i izotiocijanate snimljeni su i 1H-kuplovani 13C NMR spektri. Konstante kuplovanja su imale očekivane vrednosti: 1Jsp3-C,H 125 - 128 Hz, 1Jsp2-C,H 150 - 172 Hz, 2JC,H i 3JC,H 2 - 9 Hz. Interesantno je da je 1JC,H za formalno sp3 hibridizovani ugljenik 1 izotiocijanata po vrednosti između sp3 i sp2 hibridizovanih ugljenika (143,9 Hz).

NMR spektri oksima citrala su bili jako informativni o njihovoj stereohemiji. Uočeno je da su vrednosti konstanti kuplovanja 1J1C,1H u 1H-kuplovanim 13C NMR spektrima oksima 11a - d kod dva stereoizomera za oko 10 Hz manje od istih vrednosti kod druga dva stereoizomera. Ovo zapažanje se može objasniti orbitalnom interakcijom σ*(C1-H) i slobodnog elektronskog para u sp2-orbitali atoma azota (šema 42), koje su u antiperiplanarnom položaju kod (1E)-stereoizomera (Gil & Teixeira-Dias, 1968; Yonezawa et al., 1969; Hansen, 1981; Seidl & Dias, 2010). Ova interakcija vodi ka slabljenju C1-H veze, a samim tim i ka smanjenju odgovarajuće konstante kuplovanja. Na osnovu ovoga izvršena je asignacija stereohemije, oni sa manjim vrednostima konstanti kuplovanja bili su (1E)-stereoizomera, a sa većim vrednostima (1Z)-stereoizomera. Slično tome, uočeno je i smanjenje vrednosti konstanti kuplovanja J2C,2H kod (1E)-stereoizomera za oko 3,5 Hz (šema 42). Pored toga, hemijska pomeranja protona 1 i 2 kod oksima se razlikuju u zavisnosti od stereohemije C=N veze: 8,0 i 5,9 za (1E)-stereoizomere i 7,3 i 6,5 za (1Z)-stereoizomere.

R NOH

R N

OH

R

N

OH

R

NOH

H

H

J1C,1H = 161,7 HzJ2C,2H = 156,4 Hz

J1C,1H = 161,6 HzJ2C,2H = 156,3 Hz

J1C,1H = 171,5 HzJ2C,2H = 160,1 Hz

J1C,1H = 171,7 HzJ2C,2H = 159,6 Hz

H

H

NOH

H

NOH

H

H

H

H

H

8,07 ppm

7,37 ppm

8,04ppm

7,34ppm

5,93ppm

6,53ppm

5,91 ppm

6,52 ppm

Šema 42. Odabrani spektralni podaci za oksime 11a - d

Velika vrednost konstante kuplovanja protona 1 i 2 (oko 10 Hz), kod 11a - d, ukazuje da je geometrija oko σ veze između ugljenika 1 i 2 s-trans, kao što je i prikazano na šemi 42. Ova pretpostavka je potvrđena preliminarnom pretragom konformacionog prostora oksima citrala, vršenoj na MM2 nivou teorije, korišćenjem opcije dihedral driver implementirane u


49

Chem3D softver. Sistematski su menjane vrednosti pomenutog torzionog ugla za 1°, čime je

simulirana rotacija oko ove veze za 360°. Kao primeri, grafici zavisnosti energije

konformacije od torzionog ugla oko σ veze između C-1 i C-2 kod (1E,2E)-3,7-dimetil-2,6-

oktadienal oksima (11a) i (1Z,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal oksima (11b) i strukture

konformacija koja odgovaraju minimumima energije prikazane su na slikama 5 i 6.

Konformacija s-cis je prema proračunu manje stabilna za 8,76 kcal/mol kod (1E,2E)-,

odnosno za 38,18 kcal/mol kod (1Z,2E)-stereoizomera oksima citrala.

Slika 5. Zavisnost energije (1E,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal oksima (11a) od torzionog

ugla oko σ veze između C-1 i C-2 i konformacija koja odgovara minimumu energije

Slika 6. Zavisnost energije (1Z,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal oksima (11b) od torzionog

ugla oko σ veze između C-1 i C-2 i konformacija koja odgovara minimumu energije


50

Odabrane, energetski najpovoljne konformacije oksima 11a - d dalje su iskorišćene

kao polazne geometrije za optimizaciju struktura na višem nivou teorije (DFT: B3LYP

funkcional, 6-31G basis set). Kako bi se potvrdila asignacija, izračunate su vrednosti

hemijskih pomeranja za oksime citrala na DFT nivou teorije. Hemijska pomeranja su

izračunati korišćenjem GIAO metode, uz specijalno parametrizovani WP04 funkcional (DFT

nivo teorije) i aug-cc-pVDZ basis set (Jain et al., 2009). Kako bi se utvrdilo u kojoj se meri

izračunate vrednosti za hemijska pomeranja slažu sa onim koja su eksperimentalno određena,

izvršena je korelacija izračunatih i eksperimentalnih vrednosti 1H i

13C NMR hemijskih

pomeranja (slike 7 i 8). Pomenute vrednosti odlično korelišu: koeficijenti korelacije su u svim

slučajeva veći od 0,99. Pored toga, vrednosti za RMSE (Root Mean Square Error) su

relativno male: manje od 0,1 ppm za 1H, i oko 2,6 ppm za

13C hemijska pomeranja.

Slike 7. Linearna korelacija između proračunatih (y-osa) i eksperimentalnih (x-osa) vrednosti

za 1H i

13C NMR hemijska pomeranja (1E,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal oksima (gore, 11a)

i (1Z,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal oksima (dole, 11b)


51

Slike 8. Linearna korelacija između proračunatih (y-osa) i eksperimentalnih (x-osa) vrednosti

za 1H i

13C NMR hemijska pomeranja (1E,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal oksima (gore, 11c)

i (1Z,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal oksima (dole, 11d)

U NOESY spektrima oksima, snimljenih u deuterohloroformu, primećene su

interakcije (bold oznake u tabelama 4 - 7, šema 43) koje nisu očekivane za datu stereohemiju

(npr. interakcija vodonika 1 i 2 kod (1E,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal oksima, 11a).

Nasuprot tome, ove interakcije se ne javljaju u NOESY spektrima ovih jedinjenja snimljenih

u deuterodimetilsulfoksidu (ovde se javljaju samo očekivani cross pikova za datu

stereohemiju). U hloroformu i dimetilsulfoksidu, molekuli oksima su različito solvatisani. U

dimetilsulfoksidu, molekuli rastvarača grade jake vodonične veze sa oksimima (CD3)2SO ---

HON=R. Kako molekuli hloroforma ne mogu da grade jake vodonične veze sa molekulima

oksima, molekuli oksima se međusobno povezuju vodoničnim vezama i to u obliku dimera ili

oligomera (šema 43). U ovakvim dimerima/oligomerima, vodonik 2 iz jednog molekula

interaguje sa N-OH iz drugog molekula oksima. Postojanje oligomera je utvrđeno na osnovu

interakcije vodonika 1 i 2, odnosno 5 i 9, iz različitih molekula. Na osnovu ovoga je

zaključeno da se u hloroformskom rastvoru uspostavlja ravnoteža između monomernih,

dimernih i oligomernih vrsta, koje su stabilizovane vodoničnim vezama. Još jedna potvrda za

ovakvu pretpostavku je opadanje intenziteta neočekivanih interakcija sa smanjenjem

koncentracije rastvorene supstance.


52

Šema 43. NOESY interakcije u dimernim i oligomernim aduktima oksima

(1E,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienala (11a)

Na osnovu promene 1H NMR spektara 11a - d sa vremenom, uočeno je da ova

jedinjenja izomerizuju za jedan dan, kada se postiže ravnotežni odnos u prvobitnoj smeši

oksima za izomere sa istom konfiguracijom C=C veze. Kako bi se odredio odnos sin- i anti-

stereoizomera oksima, odnosno (E)- i (Z)-, a pored toga da bi se utvrdilo da li je došlo do

promene konfiguracije C=C veze u toku reakcije građenja oksima, izvršena je dekonvolucija


53

signala primenom GSD funkcije programa MestReNova, koja je omogućila razdvajanje

delimično preklopljenih signala u 1H NMR spektru polazne smeše oksima (slika 9).

Poređenjem odnosa površine signala protona iz aldehidne grupe u geranijalu i neralu i odnosa

površina signala protona 1 u odgovarajućim oksimima, utvrđeno je da najverovatnije nije

došlo do promene konfiguracije C=C veze pri uslovima građenja oksima (odnos površina

(E)/(Z) aldehida je 1,43, a (2E)/(2Z) oksima je 1,48).

Slika 9. GSD pikovi signala protona 1 oksima 11a - d

GSD funkcija je omogućila određivanje i ravnotežnog odnosa sin- i anti-

stereoizomera oksima citrala, tj. izračunavanje Krav, ravnotežne konstante reakcije

izomerizacije.

Šema 44. Izomerizacija sin- i anti-oksima citrala u rastvoru

Konstanta ravnoteže između sin- i anti- oksima geranijala, odnosno nerala iznosi 2,35,

odnosno 2,10, što pokazuje da su u rastvoru termodinamički stabilniji (1E)-stereoizomeri.

Međutim, izolovane mase čistih stereoizomernih oksima ukazuju na to da je na koloni SiO2

došlo do izomerizacije (1E)-stereoizomera u (1Z)-stereoizomere, koji najverovatnije

uspostavljaju jače vodonične veze sa silika-gelom, jer se (1Z)-stereoizomeri duže zadržavaju

na koloni silika-gela (sistem adsorbovanog (1Z)-stereoizomera i silika-gela je stabilniji od

sistema adsorbovanog (1E)-stereoizomera i silika-gela, pa se položaj ravnoteže sin- i anti-

stereoziomera se menja).

Šema 45. Interakcija sin- i anti-stereoizomera oksima citrala i silanolnih-grupa na površini

silika-gela

54

Šema 46. Struktura jedinjenja 11a i numeracija korišćena pri asignaciji NMR spektara

Tabela 4. 1H- i 13C-NMR spektralni podaci za jedinjenje 11a snimljeno u CDCl3. Uočene NOESY i gHMBC interakcije

Pozicija (1E,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal (11a)

1H 13C NOESY* gHMBC**

1 8,07 (d) J1,2 = 10,4 149,0 (d) J1C,1H = 161,7 2, 4, 5, 10, OH 2, 3

2

5,93 (br dq) J2,1 = 10,4 J2,10 = 1,2 117,9 (ps dquin) J2C,2H = 156,4 J2C,1H = 5,1 J2C,10H = 5,1

1, 4, 5, 10, OH 1, 3, 4, 10

3 / 147,9 (m) / /

4

2,1552# (m, AA'BB') JA',B = 12,0 JA,A' = -10,0 JA',B' = 9,0 JA,B = 6,0 JA,B' = 6,0

40,1 (br t) J4C,4H = 127,7 1, 2, 6, 8, 9, 10

2, 3, 4, 5, 6, 7, 10

5

2,164# (m, AA'BB') JB,A' = 12,0 JB,B' = -12,0 JB',A' = 9,0 JB,6 = 7,1 JB',6 = 7,1 JB,A = 6,0 JB',A = 6,0

26,2 (ps tq) J5C,5H = 128,0 J5C,4H = 5,0 J5C,6H = 5,0

6

5,08 (ps tsep) J6,A = 7,1 J6,A' = 7,1 J6,8 = 1,2 J6,9 = 1,2 123,3 (ps dtsep) J6C,6H = 150,6 J6C,5H = 5,1 J6C,8H = 2,2 J6C,9H = 2,2

4, 5, 9 4, 5, 8, 9

7 / 132,3 (ps sep) J7C,8H = 5,7 J7C,9H = 5,7 / /

8 1,61 (br d) J8,6 = 1,2 17,7 (qdq) J8C,8H = 125,3 J8C,6H = 8,2 J8C,9H = 4,2 5, 9 6, 7, 9

9 1,68 (br d) J9,6 = 1,2 25,7 (qdq) J9C,9H = 125,2 J9C,6H = 7,2 J9C,8H = 4,2 5, 6, 8 6, 7, 8

10 1,83 (br d) J10,2 = 1,2 17,2 (qdt) J10C,10H = 126,5 J10C,2H = 8,2 J10C,4H = 4,1 1, 2, 4, 5 2, 3, 4, 5

OH 9,24 (s) / 1, 2 /

* bold oznake predstavljaju interakcije vodonika dimera/oligomera ** interakcija vodonika iz kolone „Pozicija” sa ugljenicima iz kolone gHMBC # konstante kuplovanje određene spin simulacijom

11a

4

5

6 2

3

10

1

N

7

8

9

OH

55

Šema 47. Struktura jedinjenja 11b i numeracija korišćena pri asignaciji NMR spektara

Tabela 5. 1H- i 13C-NMR spektralni podaci za jedinjenje 11b snimljeno u CDCl3. Uočene NOESY i gHMBC interakcije


Pozicija (1Z,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal (11b)


1 7,37 (d) J1,2 = 9,9 145,7 (d) J1C,1H = 171,5 2, 4, 5, 10, OH 2, 3

2 6,53 (br dq) J2,1 = 9,9 J2,10 = 1,3 112,9 (ps dquint) J2C,2H = 160,1 J2C,1H = 4,9 J2C,10H = 4,9

1, 4, 5, 10, OH 1, 3, 4, 10

3 / 150,2 (m) / /

4 2,18# (m, AA'BB') JA',B = 12,0 JA,A' = -10,0 JA',B' = 9,0 JA,B = 6,0 JA,B' = 6,0

40,3 (ps tdsex) J4C,4H = 127,9 J4C,2H = 5,2 J4C,5H = 2,7 J4C,10H = 2,7

1, 2, 6, 8, 9, 10 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10 5

2,1725# (m, AA'BB') JB,A' = 12,0 JB,B' = -12,0 JB',A' = 9,0 JB,6 = 7,1 JB',6 = 7,1 JB,A = 6,0 JB',A = 6,0

26,2 (ps tq) J5C,5H = 127,6 J5C,4H = 4,8 J5C,6H = 4,8

6 5,09 (ps tsep) J6,B = 7,1 J6,B' = 7,1 J6,8 = 1,2 J6,9 = 1,2

123,3 (ps dtsep) J6C,6H = 150,8 J6C,5H = 5,2 J6C,8H = 4,5 J6C,9H = 4,5

4, 5, 9 4, 5, 8, 9

7 / 132,3 (ps sepd) J7C,8H = 5,9 J7C,9H = 5,9 J7C,6H = 2,0

/ /


9 1,69 (br d) J9,6 = 1,2 25,7 (qdq) J9C,9H = 125,4 J9C,6H = 7,2 J9C,8H = 4,4 5, 6, 8 6, 7, 8

10 1,88 (br d) J10,2 = 1,3 17,2 (qdt) J10C,10H = 126,6 J10C,2H = 8,1 J10C,4H = 3,6 1, 2, 4, 5 2, 3, 4

OH 9,00 (s) / 1, 2 /

11b

4

5

6 2

3

10

1

N

7

8

9

OH

56

Šema 48. Struktura jedinjenja 11c i numeracija korišćena pri asignaciji NMR spektara

Tabela 6. 1H- i 13C-NMR spektralni podaci za jedinjenje 11c snimljeno u CDCl3. Uočene NOESY i gHMBC interakcije

* bold oznake predstavljaju interakcije vodonika dimera/oligomera ** interakcija vodonika iz kolone „Pozicija” sa ugljenicima iz kolone gHMBC *** preklopljeni signali # konstante kuplovanje određene spin simulacijom

Pozicija (1E,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal (11c)


1 8,04 (d) J1,2 = 10,4 148,8*** (d) J1C,1H = 161,6 2, 4, 5, 10, OH 2, 3

2 5,91 (dqt) J2,1 = 10,4 J2,10 = 1,3 J2,4 = 0,6

118,7 (ps dquint) J2C,2H = 156,3 J2C,1H = 5,4 J2C,10H = 5,4 J2C,4H = 1,8

1, 4, 10, OH 1, 3, 4, 10

3 / 148,0*** (m) / /

4 2,225# (m, AA'XX') J4,5 = 7,6 J4,2 = 0,6 J4,6 = 0,2


1, 2, 5, 6, 10 2, 3, 5, 6, 10

5 2,124# (m, AA'XX') J5,4 = 7,6 J5,6 = 7,1 J5,9 = 0,8 26,8 (tdt) J5C,5H = 126,7 J5C,6H = 7,0 J5C,4H = 4,9 1, 4, 6, 8, 9, 10 3, 4, 6, 7

6

5,08 (ps tsept) J6,5 = 7,1 J6,8 = 1,2 J6,9 = 1,2 J6,4 = 0,2


4, 5, 9, 10 4, 5, 8, 9

7 / 132,7 (ps sep) J7C,8H = 5,9 J7C,9H = 5,9 / /


9 1,69 (br dt) J9,6 = 1,2 J9,5 = 0,8 25,7 (qdq) J9C,9H = 125,3 J9C,6H = 7,2 J9C,8H = 4,1 5, 6, 8 6, 7, 8

10 1,87 (br d) J10,2 = 1,3 24,2 (qdt) J10C,10H = 126,4 J10C,2H = 6,5 J10C,4H = 4,9 1, 2, 4, 5, 6 2, 3, 4

OH 8,66 (s) / 1, 2 /

11c

45

6

23

10

1 N7

8

9

OH

57

Šema 49. Struktura jedinjenja 11d i numeracija korišćena pri

asignaciji NMR spektara

Tabela 7. 1H- i 13C-NMR spektralni podaci za jedinjenje 11d snimljeno u CDCl3. Uočene NOESY i gHMBC interakcije


Pozicija (1Z,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal (11d)


1 7,34 (d) J1,2 = 10,0 145,4 (d) J1C,1H = 171,7 2, 4, 5, 10, OH 2, 3

2 6,52 (dqt) J2,1 = 10,0 J2,10 = 1,4 J2,4 = 0,5

113,7 (ps dsep) J2C,2H = 159,6 J2C,1H = 5,2 J2C,4H = 5,2 J2C,10H = 5,2

1, 4, 5, 10, OH 1, 3, 4, 10

3 / 150,4 (m) / /

4 2,274# (m, AA'XX') J4,5 = 7,9 J4,2 = 0,5 J4,6 = 0,5


1, 2, 5, 6, 10 2, 3, 5, 6, 10

5 2,142# (m, AA'XX') J5,4 = 7,9 J5,6 = 7,1 J5,9 = 0,4 J5,8 = 0,2

26,8 (tdt) J5C,5H = 127,3 J5C,6H = 9,0 J5C,4H = 4,8 1, 2, 4, 6, 8, 9, 10 3, 4, 6, 7

6

5,09 (ps tsept) J6,5 = 7,1 J6,8 = 1,2 J6,9 = 1,2 J6,4 = 0,5


4, 5, 9, 10 4, 5, 8, 9

7 / 132,8 (ps sep) J7C,8H = 5,9 J7C,9H = 5,9 / /

8 1,61 (br dt) J8,6 = 1,2 J8,5 = 0,2 17,7 (qdq) J8C,8H = 125,4 J8C,6H = 8,3 J8C,9H = 4,1 5, 9 6, 7, 9

9 1,69 (br dt) J9,6 = 1,2 J9,5 = 0,4 25,7 (qdq) J9C,9H = 125,5 J9C,6H = 6,7 J9C,8H = 4,1 5, 6, 8 6, 7, 8

10 1,91 (br d) J10,2 = 1,4 24,5 (qdt) J10C,10H = 126,2 J10C,2H = 6,6 J10C,4H = 4,9 1, 2, 4, 5, 6 2, 3, 4

OH 8,67 (s) / 1, 2 /

11d

45

6

23

10

1 N7

8

9

OH

58

Šema 50. Struktura jedinjenja 11a i b i numeracija korišćena pri asignaciji NMR spektara

Tabela 8. 1H- i 13C-NMR spektralni podaci za jedinjenja 11a i b snimljena u CD3SOCD3. Uočene NOESY i gHMBC interakcije

Pozicija (1E,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal (11a) (1Z,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal (11b)

1H 13C NOESY gHMBC* 1H 13C NOESY gHMBC*

1 7,96 (d) J1,2 = 10,2 146,9 10, OH 2, 3 7,34 (d) J1,2 = 9,8 143,9 10 2, 3

2

5,84 (br dq) J2,1 = 10,2 J2,10 = 1,1

118,6 4, 5 4, 10

6,38 (br dq) J2,1 = 9,8 J2,10 = 1,2

113,2 4, 5, OH 4, 10

3 / 144,3 / / / 146,7 / /

4 2,10 (m)

39,2 2, 6, 8, 10 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10 2,11 (m)

39,5 2, 6, 8, 10 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10

5 25,7 25,7

6 5,07 (m) 123,5 4, 5, 9 4, 5, 8, 9 5,07 (m) 123,5 4, 5, 9 4, 5, 8, 9

7 / 131,1 / / / 131,2 / /

8 1,58 (br s) 17,5 5, 9 6, 7, 9 1,58 (br s) 17,5 5, 9 6, 7, 9

9 1,65 (br s) 25,4 6, 8 6, 7, 8 1,65 (br s) 25,4 6, 8 6, 7, 8

10 1,77 (br d) J10,2 = 1,1 16,5 1, 4, 5 2, 3, 4, 5 1,82 (br d) J10,2 = 1,2 16,6 1, 4, 5 2, 3, 4, 5

OH 10,72 (s) / 1 1 10,85 (s) / 2 1

* interakcija vodonika iz kolone „Pozicija” sa ugljenicima iz kolone gHMBC

11a

4

5

6 2

3

10

1

N

7

8

9

OH

11b

4

5

6 2

3

10

1

N

7

8

9

OH

59

Šema 51. Struktura jedinjenja 11c i 11d i numeracija korišćena pri asignaciji NMR spektara

Tabela 9. 1H- i 13C-NMR spektralni podaci za jedinjenja 11c i d snimljena u CD3SOCD3. Uočene NOESY i gHMBC interakcije

Pozicija (1E,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal (11c) (1Z,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienal (11d)

1H 13C NOESY gHMBC* 1H 13C NOESY gHMBC*

1 7,91 (d) J1,2 = 10,3 146,5 4, 5, OH 2, 3 7,28 (d) J1,2 = 9,8 143,4 4, 5 2, 3

2 5,85 (dqt) J2,1 = 10,3 J2,10 = 1,3 119,5 10 4, 10 6,40 (dq) J2,1 = 9,8 J2,10 = 1,4 114,1 10, OH 4, 10

3 / 144,5 / / / 146,8 / /

4 2,18 (t) J4,5 = 7,4 31,9 1, 5, 6, 10 2, 3, 5, 6, 10 2,24 (t) J4,5 = 7,6 31,7 1, 5, 6, 10 2, 3, 5, 6, 10

5 2,09 (ps q) J5,4 = 7,4 J6,5 = 7,1 26,2 4, 6, 8 3, 4, 6, 7 2,07 (ps q) J5,4 = 7,6 J6,5 = 7,1 26,3 4, 6, 8 3, 4, 6, 7

6

5,09 (ps tsep) J6,5 = 7,1 J6,8 = 1,4 J6,9 = 1,4

123,4 4, 5, 9 4, 5, 8, 9

5,09 (ps tsep) J6,5 = 7,1 J6,8 = 1,4 J6,9 = 1,4

123,4 4, 5, 9 4, 5, 8, 9

7 / 131,4 / / / 131,4 / /

8 1,57 (br d) J8,6 = 1,4 17,4 5, 9 6, 7, 9 1,57 (br d) J8,6 = 1,4 17,4 5, 9 6, 7, 9

9 1,64 (br d) J9,6 = 1,4 25,4 6, 8 6, 7, 8 1,64 (br d) J9,6 = 1,4 25,4 6, 8 6, 7, 8

10 1,81 (br d) J10,2 = 1,3 23,6 2, 4, 5 2, 3, 4 1,83 (br d) J10,2 = 1,4 23,9 2, 4, 5 2, 3, 4

OH 10,70 (s) / 1 1 10,83 (s) / 2 1


11c

45

6

23

10

1 N7

8

9

OH11d

45

6

23

10

1 N7

8

9

OH

60



Pozicija (E)-3,7-dimetil-2,6-oktadien-1-amin (12a)

1H 13C NOESY gHMBC**

1 3,28 (br dq) J1,2 = 6,8 J1,10 = 0,9 39,6* 2, 10, NH2 2, 3

2 5,25 (ps tsep) J2,1 = 6,8 J2,4 = 1,3 J2,10 = 1,3 125,7* 1, 4, 5, NH2 1, 4, 10

3 / 136,5* / /

4 2,13 - 1,96 (m)

39,4 2, 6, 8, 10 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10

5 26,5*

6 5,10 (ps tsep) J6,5 = 6,1 J6,8 = 1,3 J6,9 = 1,3 124,1* 4, 5, 9 4, 5, 8, 9

7 / 131,6* / /

8 1,61 (br d) J8,6 = 1,3 17,7* 5, 9 6, 7, 9

9 1,69 (br d) J9,6 = 1,3 25,7* 6, 8 6, 7, 8

10 1,63 (br dt) J10,2 = 1,3 J10,1 = 0,9 16,1 1, 4, 5 1, 2, 3, 4

NH2 1,90/2,04*** (br s) / H2O /

* na osnovu intenziteta signala u 13C spektru ((E)-stereoizomer je bio više zastupljen) ** interakcija vodonika iz kolone „Pozicija” sa ugljenicima iz kolone gHMBC *** asignirano na osnovu NOESY interakcije sa rezidualnom vodom u uzorku

12a

4

5

6 2

3

10

1

NH2

7

8

9

61



Pozicija (Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadien-1-amin (12b)

1H 13C NOESY gHMBC**

1 3,24 (dq) J1,2 = 7,0 J1,10 = 0,9 39,6* 2, 4, 5, NH2 2, 3

2 5,26 (ps tsep) J2,1 = 7,0 J2,4 = 1,4 J2,10 = 1,4 126,7* 1, 10, NH2 1, 4, 10

3 / 136,6* / /

4 2,13 - 1,96 (m)

31,9 1, 6, 8, 10 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10

5 26,6*

6 5,10 (ps tsep) J6,5 = 6,1 J6,8 = 1,3 J6,9 = 1,3 124,0* 4, 5, 9 4, 5, 8, 9

7 / 131,9* / /

8 1,61 (br d) J8,6 = 1,3 17,6* 5, 9 6, 7, 9

9 1,69 (br d) J9,6 = 1,3 25,7* 6, 8 6, 7, 8

10 1,71 (br dt) J10,2 = 1,4 J10,1 = 0,9 23,4 2, 4, 5 1, 2, 3, 4

NH2 1,90/2,04*** (br s) / H2O /

* na osnovu intenziteta signala u 13C NMR spektru ((Z)-stereoizomer je bio manje zastupljen) ** interakcija vodonika iz kolone „Pozicija” sa ugljenicima iz kolone gHMBC *** asignirano na osnovu NOESY interakcije sa rezidualnom vodom u uzorku

12b

45

6

23

10

1 NH27

8

9

62



Pozicija (E)-1-izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-oktadien (13a)

1H 13C NOESY HMBC

1 4,08 (ps dsex) J1,2 = 6,9 J1,4 = 0,9 J1,10 = 0,9

42,7* (td) J1C,1H = 143,9 J1C,2H = 3,5 2, 10 2, 3, NCS

2 5,31 (ps tsex) J2,1 = 6,9 J2,4 = 1,4 J2,10 = 1,4

116,8 (ps dsex) J2C,2H = 159,9 J2C,1H = 5,3 J2C,10H = 5,3

1, 4, 5 1, 4, 10

3 / 142,1 (m) / /

4 2,15 - 2,01 (m)

39,2 (br t) J4C,4H = 127,4 2, 6, 8, 10 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10

5 26,1* (tdt) J5C,5H = 126,2 J5C,6H = 8,3 J5C,4H = 4,7

6 5,07 (ps tsep) J6,5 = 6,7 J6,8 = 1,3 J6,9 = 1,3

123,4* (ps dtsep) J6C,6H = 151,4 J6C,5H = 4,5 J6C,8H = 1,7 J6C,9H = 1,7

4, 5, 9 4, 5, 8, 9

7 / 132,2* (ps sep) J7C,8H = 5,8 J7C,9H = 5,8 / /

8 1,61 (br dt) J8,6 =1,3 J8,5 = 0,5 17,7* (qdq) J8C,8H = 125,2 J8C,6H = 8,2 J8C,9H = 4,0 5, 9 6, 7, 9

9 1,70 (ps q) J9,6 = 1,3 J9,5 = 1,3 25,7* (qdq) J9C,9H = 125,2 J9C,6H = 7,6 J8C,9H = 3,8 6, 8 6, 7, 8

10 1,68 (dt) J10,2 = 1,4 J10,1 = 0,9 16,4 (qdt) J10C,10H = 126,2 J10C,2H = 8,2 J10C,4H = 3,9 1, 4, 5 1, 2, 3, 4, 5

NCS / 130,2 (m) / /

* na osnovu intenziteta signala u 13C spektru ((E)-stereoizomer je bio više zastupljen) ** interakcija vodonika iz kolone „Pozicija” sa ugljenicima iz kolone gHMBC

13a

4

5

6 2

3

10

1

NCS

7

8

9

63



Pozicija (Z)-1-izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-oktadien (13b)

1H 13C NOESY HMBC

1 4,06 (dq) J1,2 = 7,1 J1,10 = 0,9 42,6* (td) J1C,1H = 143,9 J1C,2H = 3,2 2, 4, 5 2, 3, NCS

2 5,31 (ps tsex) J2,1 = 7,1 J2,4 = 1,5 J2,10 = 1,5

117,6 (ps dsex) J2C,2H = 158,9 J2C,1H = 5,4 J2C,10H = 5,4 1, 10 1, 4, 10

3 / 142,1 (m) / /

4 2,15 - 2,01 (m)

32,0 (tdsex) J4C,4H = 128,2 J4C,2H = 5,3 J4C,5H = 3,2 J4C,10H = 3,2 1, 6, 8, 10 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10

5 26,2* (tdt) J5C,5H = 126,2 J5C,6H = 8,3 J5C,4H = 4,7

6 5,07 (ps tsep) J6,5 = 6,7 J6,8 = 1,3 J6,9 = 1,3

123,1* (ps dtsep) J6C,6H = 151,2 J6C,5H = 6,3 J6C,8H = 3,6 J6C,9H = 3,6 4, 5, 9 4, 5, 8, 9

7 / 132,7* (ps sep) J7C,8H = 5,5 J7C,9H = 5,5 / /

8 1,61 (br dt) J8,6 =1,3 J8,5 = 0,5 17,7* (qdq) J8C,8H = 125,2 J8C,6H = 8,2 J8C,9H = 4,0 5, 9 6, 7, 9

9 1,70 (ps q) J9,6 = 1,3 J9,5 = 1,3 25,8* (qdq) J9C,9H = 125,2 J9C,6H = 7,6 J8C,9H = 3,8 6, 8 6, 7, 8

10 1,77 (br dt) J10,2 = 1,5 J10,1 = 0,9 23,2 (ps qq) J10C,10H = 126,6 J10C,2H = 4,6 J10C,4H = 4,6 2, 4, 5 1, 2, 3, 4

NCS / 130,7 (m) / /

* na osnovu intenziteta signala u 13C spektru ** interakcija vodonika iz kolone „Pozicija” sa ugljenicima iz kolone gHMBC

13b

45

6

23

10

1 NCS7

8

9


64

4.4.2. Asignacija spektara jedinjenja 21a i b, 22 i 23

Reakcione smeše jedinjenja 21a i b, 22 i 23 su prvo analizirane gasnom

hromatografijom kuplovanom sa masenim detektorom, pri čemu se u svim hromatogramima

dominantno pojavio jedan pik. Molekulski joni u masenim spektrima su odgovarali

molekulskim masama, i to na vrednostima m/z 165, 151 i 193. Na šemi 56, prikazane su

verovatne fragmentacije koje objašnjavaju nastanak nekih od uočenih fragmentnih jona, a

koje su u saglasnosti sa predloženim strukturama oksima mirtenala i mirtenil-amina i

izotiocijanata.

Šema 56. Pretpostavljene odabrane MS fragmentacije jedinjenja 21a, 22 i 23

1H NMR spektri ovih jedinjenja su na prvi pogled jako složeni, zbog postojanja

velikog broja daljinskih kuplovanja i jako sličnih hemijskih pomeranja. Kod amina, za razliku

od izotiocijanata, dijastereotopni vodonici 10a i 10b su bili različitih hemijskih pomeranja. U

svim spektrima, vodonik 9b je dublet i kupluje se samo sa 9a, jer je torzioni ugao između H-1

i H-9b, kao i H-5 i H-9b, približno 90°, pa su očekivane vicinalne konstante kuplovanja jako

malih vrednosti ili su u potpunosti izostale. Nasuprot tome, signal vodonika 9a, koji se

geminalno kupluje sa 9b, je mnogo složeniji multiplet, koji se može približno opisati kao

pseudo dublet tripleta. Pored kuplovanja sa vodonicima 1 i 5, sa konstantom slične vrednosti,

kod mirtenil izotiocijanata određeno je spin simulacijom da postoji i W konstanta kuplovanja

između vodonika 9b i 2b, koja rezultuje u širenju ovog signala, jer je male vrednosti (J ~ 0,7

Hz). Metil-grupe 7 i 8 su bile jasno uočljive u spektrima, na hemijskim pomeranjima oko 1,3

i 0,8 ppm. Njihova potpuna asignacija izvršena je tek nakon analize NOESY spektra, u kome

se javlja interakcija 7 - 9a i 8 - 2b (šema 57). Ova asignacija je u skladu sa anizotropnom

zaštitom metil-grupe 8 od strane dvogube veze, koja je u povoljnom geometrijskom odnosu

(slična zaštita od strane dvogube veze se može uočiti u razlici hemijskih pomeranja vodonika

9a i 9b). Većem hemijskom pomeranju vodonika 9a, odnosno vodonika metil-grupe 7,

doprinosi i efekat sterne kompresije (tzv. disperziona interakcija). Signali vodonika 10 su

lako prepoznati na osnovu nešto višeg hemijskog pomeranja, usled blizine heteroatoma i

dvogube veze. Asignacija preostalih signala je bila znatno složenija, zbog brojnih konstanti

kuplovanja / preklopljenosti signala. Uz pomoć selektivno homodekuplovanih 1H NMR

spektara, utvrđeno je da signal vodonika 5 mora biti dublet dubleta dubleta, sa konstantama

kuplovanja od 5,7 i 5,5 Hz sa vodonicima 9a i 1 (W konstanta kuplovanja) i alilnom

konstantom kuplovanja male vrednosti (1,3 Hz) sa vodonikom 3, što se i očekuje za 4J alilnog


65

tipa za približno koplanarne sin-nalik vodonike ovog tipa, tj. W konstantu. Signal vodonika 3

je, a koji je na hemijskom pomeranju (5,3 - 5,9 ppm) u skladu sa očekivanim za vodonike

vezane za sp2 ugljenikov atom, kod amina i izotiocijanata pseudo triplet kvinteta usled

sprezanja: vicinalnog sa vodonicima 2a i 2b (gotovo identičnom vrednošću J), W kuplovanja

sa 1 i 5 i alilnog sa 10 (sve tri konstante kuplovanja su približno jednakih vrednosti), ili

pseudo triplet tripleta kod oksima. Preliminarnom pretragom konformacionog prostora

oksima mirtenala 21a, vršenoj na MM2 nivou teorije, korišćenjem opcije dihedral driver

implementirane u Chem3D softver, simulirana je rotacija oko σ veze C-4 - C-10, dobijen je

grafik zavisnosti energije konformacije od torzionog ugla oko ove veze (slika 10). Postoje

dve geometrije koje odgovaraju energetskim minimumima, od kojih je konformacija sa s-

trans σ vezom između C-4 - C-10 niža po energiji od s-cis konformacije (za 1,99 kcal/mol).

Međutim, energija aktivacije za interkonverziju stabilnijeg u manje stabilan konformer iznosi

50,62 kcal/mol. Kako u NMR spektrima nije uočena konstanta kuplovanja između vodonika

3 i 10, verovatno je dominanta geometrija oko σ veze C-4 - C-10 s-cis, jer bi se za s-trans

očekivala konstanta oko 1 Hz.

Slika 10. Zavisnost energije oksima (E)-(1R,5S)-6,6-

dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten-2-karbaldehida (21a) od

torzionog ugla oko σ veze između C-4 i C-10 i

geometrije koje odgovaraju minimumima energije

Vodonici 2a i 2b su jako geminalno spregnuti, pri čemu je očitana vrednost, čak i iz

selektivno homodekuplovanih 1H NMR spektara, uvek bila manja od vrednosti dobijene

simulacijom (oko -19 Hz u odnosu na -23 Hz za ove signale kod mirtenil-izotiocijanata, slika

11). Pored ovog kuplovanja, oni se kupluju i sa vodonicima 1 i 3, vicinalno, i sa 10,


66

homoalilno. Multipletnost preostalog signala vodonika 1 je, znajući sva navedena kuplovanja,

lako određena, kao pseudo triplet tripleta dubleta. Asignacija vodonika iz amino grupe je

izvršena na osnovu uočenih interakcija u NOESY spektru NH2 vodonika sa vlagom u uzorku.

Slika 11. Eksperimentalni (gore) i simulirani (dole) signala protona 2a i 2b u 1

H NMR

spektru mirtenil-izotiocijanata (23)



gHMQC spektri su poslužili za povezivanje vrednosti hemijskih pomeranja vodonika

sa ugljenicima za koje su direktno vezani, a asignacija neprotonovanih ugljenika je izvršena

na osnovu njihovih interakcija uočenih u gHMBC spektrima (šema 57). Za oksime i

izotiocijanate su snimljeni 1H-kuplovani

13C NMR spektri. Konstante kuplovanja su imale

očekivane vrednosti: 1Jsp3-C,H 124 - 128 Hz,

1Jsp2-C,H 150 - 163 Hz,

2JC,H i

3JC,H 2 - 10 Hz, osim

za protonovane ugljenike koji su deo četvoročlanog prstena, u čvorovima biciklusa 1 i 5, gde

su konstante kuplovanja 1Jsp3-C,H oko 146 Hz, i ugljenika mosta 9, gde je konstanta iznosila

139 Hz, kao i kod ugljenika 10 kod izotiocijanata (1Jsp3-C,H = 144,3 Hz). Ove vrednosti

sugerišu da je hibridizacija ugljenika četvoročlanog prstena negde između sp2 i sp

3.

Stereohemija oksima mirtenala je određena na osnovu vrednosti hemijskih pomeranja,

jer, kako je i ranije pomenuto u poglavlju 4.4.1., vrednost hemijskog pomeranja vodonika 10

i ugljenika 10 kod (1E)-stereoizomera je za oko 0,7 ppm, odnosno 3,5 ppm, veća od iste


67

vrednosti za (1Z)-stereoizomera oksima. U NMR spektrima su bili vidljivi dominantni signali

jednog stereoizomera koji su odgovarali (1E)-stereoizomera, dok su signali (1Z)-

stereoizomera uglavnom bili preklopljeni sa signalima (1E)-stereoizomera, osim u slučaju

signala vodonika i ugljenika 3, 5 i 10 (šema 59).

Prvobitna pretpostavka je bila da je nastao (E)-dijastereoizomer oksima 21a kao

glavni proizvod, što je potvrđeno prisustvom jake interakcije vodonika u poziciji 10 sa

vodonikom N-OH grupe, ali uočena je i interakcija vodonika u položaju 5 i vodonika N-OH

grupe. Kako se slično moglo uočiti i u NOESY spektrima oksima citrala, ova činjenica se

ponovo može objasniti postojanjem vodonično vezanih adukata oksima mirtenala u

hloroformskom rastvoru. Pošto su jedino ovih signali uočeni u NOESY spektru (interakcija

vodonika 5 i vodonika N-OH grupe), verovatno je, pored monomera, jedina vrsta koja postoji

u rastvoru uzorka u deuterohloroformu dimer (šema 58). Postojanje oligomera je verovatno

otežano većom voluminoznošću jezgra mirtenala u odnosu na aciklični neril/geranil-lanac.

Šema 58. Dimerna forma oksima 21a i uočena NOESY interakcija koja

ide u prilog građenju ovog dimera

Kako bi se odredio odnos sin- i anti-stereoizomera oksima, odnosno (E)- i (Z)-,

primenjena je GSD funkcija programa MestReNova, koja je omogućila integraljenje površina

signala vodonika 10 u oba stereoizomera. Na osnovu ovoga, izračunata je ravnotežna

konstanta izomerizacije (šema 44). Konstanta ravnoteže između sin- i anti- oksima mirtenala

iznosi 63,1, što pokazuje da su u rastvoru termodinamički stabilniji (1E)-stereoizomeri, kao i

kod oksima citrala.

68

Šema 59. Struktura jedinjenja 21a i b, numeracija korišćena pri asignaciji NMR spektara i

spektralni podaci za jedinjenje 21 b (u CDCl3)

Šema 60. Struktura jedinjenja 22 i numeracija korišćena pri asignaciji NMR spektara

Šema 61. Struktura jedinjenja 23 i numeracija korišćena pri asignaciji NMR spektara

21a

6 2

49

CH3

8

H3C7

10H

N9b

OH

H9a H

H5

H1

H 2a

H2b

H 3

21b

3

CH3

H3C

10H

NHO

H H

H5

H

H

H

H H5: 2,78 ppm (ps ddd) J5,9a = 5,7 J5,1 = 5,5 J5,3 = 1,3C5: 45,2 ppm

H3: 6,53 ppm (ps tt) J3,2a = 3,3 J3,2b = 3,3 J3,1 = 1,4 J3,5 = 1,3C3: 134,6 ppm

H10: 6,73 ppm (s)C10: 146,7 ppm

22

6 2

49

CH3

8

H3C7

10NH2

9bH9a H

H5

H1

H 2a

H2b

H 3

23

6 2

49

CH38

H3C7

10NCS

9bH9a H

H5

H1

H 2a

H2b

H 3

69


Pozicija (E)-(1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten-2-karbaldehid oksim (21a)


1

2,14 (ps ttd) J1,9a = 5,8 J1,5 = 5,5 J1,2a = 3,2 J1,2b = 2,6 J1,3 = 1,4

40,7 (br d) J1C,1H = 146,2 2a, 2b, 7, 8, 9a 2, 3, 5, 6, 7, 9

2

2a: 2,45 (ps dt) J2a,2b = -19,5 J2a,3 = 3,3 J2a,1 = 3,2 32,4 (tdd) J2C,2H = 127,6 J2C,3H = 9,7

J2C,1H = 4,1

1, 3, 8, 9b 1, 3, 4, 6, 9

2b: 2,38 (ps dt) J2b,2a = -19,5 J2b,3 = 3,3 J2b,1 = 2,6

1, 3, 8 1, 3, 4, 9

3

5,90 (ps tt) J3,2a = 3,3 J3,2b = 3,3 J3,1 = 1,4 J3,5 = 1,3

131,7 (ps dtq) J3C,3H = 159,9 J3C,2H = 7,5 J3C,1H = 3,8 J3C,5H = 3,8 J3C,10H = 3,8

2a, 2b, 8, 10 1, 2, 4, 5, 10

4 / 142,7 (m) / /

5 2,73 (ddd) J5,9a = 5,7 J5,1 = 5,5 J5,3 = 1,3 40,6 (br d) J5C,5H = 146,5 7, 8, 9a, OH 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10

6 / 37,7 (m) / /

7

1,32 (s) 26,0 (ps qsex) J7C,7H = 124,8 J7C,1H = 4,0 J7C,5H = 4,0 J7C,8H = 4,0

1, 5, 8, 9a 1, 5, 6, 8

8

0,81 (s) 20,9 (ps qquin) J8C,8H = 124,1 J8C,1H = 4,3 J8C,7H = 4,3

1, 2b, 3, 5, 7, OH 1, 5, 6, 7

9 9a: 2,45 (ps dt) J9a,9b = -9,0 J9a,1 = 5,8 J9a,5 = 5,7 31,1 (br t) J9C,9H = 138,6

1, 5, 7, 9b 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10

9b: 1,16 (d) J9b,9a = -9,0 2, 9a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10

10 7,73 (s) 151,4 (br d) J10C,10H = 163,4 3, OH 3, 4, 5

OH 8,74 (s) / 5, 10 10 * bold oznake predstavljaju interakcije vodonika dimera ** interakcija vodonika iz kolone „Pozicija” sa ugljenicima iz kolone gHMBC

70

Tabela 15. 1H- i 13C-NMR spektralni podaci za jedinjenje 22 snimljeno u CDCl3. Uočene NOESY i gHMBC interakcije

* interakcija vodonika iz kolone „Pozicija” sa ugljenicima iz kolone gHMBC ** asignirano na osnovu NOESY interakcije sa rezidualnom vodom u uzorku

Pozicija ((1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-heptaen-2-il)metanamin (22) 1H 13C NOESY gHMBC*

1 2,10 (ps ttd) J1,9a = 5,8 J1,5 = 5,5 J1,2a = 2,5 J1,2b = 2,5 J1,3 = 1,5 40,9 2a, 2b, 7, 8, 9a 2, 3, 5, 6, 7, 9

2 2a: 2,29 (ps dquin) J2a,2b = -17,5 J2a,3 = 3,0 J2a,1 = 2,5 J2a,10 = 2,3

31,0 1, 3, 9b 1, 3, 4, 6, 9

2b: 2,21 (ps dquin) J2b,2a = -17,5 J2b,3 = 3,0 J2b,1 = 2,5 J2b,10 = 2,5 1, 3, 8 1, 3, 4, 5, 6, 9

3 5,34 (ps tqiun) J3,2a = 3,0 J3,2b = 3,0 J3,1 = 1,5 J3,5 = 1,5 J3,10 = 1,5 115,6 2a, 2b, 8, 9b, 10a, 10b 1, 2, 5, 10

4 / 149,2 / /

5 2,06 (ddd) J5,9a = 5,7 J5,1 = 5,5 J5,3 = 1,5 44,3 7, 8, 9a, 10a, 10b 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10

6 / 37,9 / /

7 1,29 (s) 26,2 1, 5, 8, 9a, 10a, 10b 1, 5, 6, 8, 9

8 0,83 (s) 21,1 1, 2b, 3, 5, 7, 10a, 10b 1, 5, 6, 7, 9

9 9a: 2,39 (ps dt) J9a,9b = 8,6 J9a,1 = 5,8 J9a,5 = 5,7

31,6 1, 5, 7, 9b, 10a, 10b 1, 2, 4, 5, 6, 7, 10

9b: 1,16 (d) J9b,9a = 8,6 2a, 9a 1, 2, 4, 5, 6, 8

10 10a: 3,18 (ps dq) J10a,10b = -15,2 J10,2b = 2,5 J10,2a = 2,3 J10,3 = 1,5

47,0 3, 5, 7, 8 3, 4, 5

10b: 3,15 (ps dq) J10a,10b = -15,2 J10,2b = 2,5 J10,2a = 2,3 J10,3 = 1,5 3, 5, 7, 8 3, 4, 5

NH2 1,96** (br s) / H2O /

71

Tabela 16. 1H- i 13C-NMR spektralni podaci za jedinjenje 23 snimljeno u CDCl3. Uočene NOESY i gHMBC interakcije

Pozicija (1R,5S)-2-(izotiocijanatometil)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten (23)

1H 13C NOESY gHMBC*

1 2,12 (ps ttd) J1,9a = 5,9 J1,5 = 5,4 J1,2a = 2,5 J1,2b = 2,5 J1,3 = 1,5

40,5 (br d) J1C,1H = 144,9 2a, 2b, 7, 8, 9a 2, 3, 5, 6, 7, 9

2 2a: 2,328# (ps dquin) J2a,2b = -23,0 J2a,3 = 3,0 J2a,1 = 2,5 J2a,10 = 1,9

31,0 (tdd) J2C,2H = 127,4 J2C,3H = 9,3 J2C,1H = 4,3 1, 3, 9b 1, 3, 4, 6, 9

2b: 2,275# (ps dquind) J2b,2a = -23,0 J2b,3 = 3,0 J2b,1 = 2,5 J2b,10 = 2,5 J2b,9a = 0,7

1, 3, 8 1, 3, 4, 5, 6, 9

3 5,59 (ps tquin) J3,2a = 3,0 J3,2b = 3,0 J3,1 = 1,5 J3,5 = 1,5 J3,10 = 1,5

120,6 (ps dttd) J3C,3H = 159,5 J3C,2H = 6,0 J3C,10H = 5,1 J3C,1H = 1,8

2a, 2b, 8, 9b, 10 1, 2, 5, 10

4 / 141,1 (m) / /

5 2,11 (ddd) J5,9a = 5,7 J5,1 = 5,4 J5,3 = 1,5 43,7 (br d) J5C,5H = 144,6 7, 8, 9a, 10 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10

6 / 38,3 (m) / /

7 1,31 (s)

26,0 (ps qsex) J7C,7H = 124,9 J7C,1H = 3,9 J7C,5H = 3,9 J7C,8H = 3,9

1, 5, 8, 9a, 10 1, 5, 6, 8

8 0,86 (s)

21,0 (ps qquin) J8C,8H = 124,5 J8C,1H = 4,4 J8C,7H = 4,4

1, 2b, 3, 5, 7, 10 1, 5, 6, 7

9 9a: 2,44 (ps dtd) J9a,9b = -8,8 J9a,1 = 5,9 J9a,5 = 5,7 J9a,2b = 0,7 31,4 (ps tt) J9C,9H = 138,7

J9C,1H = 2,8 J9C,5H = 2,8

1, 5, 7, 9b, 10 1, 2, 4, 5, 6, 7, 10

9b: 1,19 (d) J9b,9a = -8,8 2a, 9a 1, 2, 4, 5, 6, 8

10

3,97 (ps q) J10,2b = 2,5 J10,2a = 1,9 J10,3 = 1,5

49,5 (ps tt) J10C,10H = 144,3 J10C,3H = 4,8 J10C,5H = 4,8

3, 5, 7, 8 3, 4, 5, NCS

NCS / 131,2 (m) / /

* interakcija vodonika iz kolone „Pozicija” sa ugljenicima iz kolone gHMBC # konstante kuplovanje određene spin simulacijom


72

4.4.4. Asignacija spektara jedinjenja 31a i b, 32 i 33

Prve potvrde da su glavna jedinjenja u reakcionim smešama jedinjenja 31a i b, 32 i 33

bili su maseni spektri najvećih pikova u hromatogramima sa karakterističnim vrednostima

m/z osnovnih jona (šema 63). U masenom spektru su se mogli uočiti i joni na vrednostima

m/z 163, 149 i 191, koji odgovaraju molekulskim jonima jedinjenja 31a i b, 32 i 33. Na šemi

63, prikazane su verovatne fragmentacije koje objašnjavaju nastanak nekih od uočenih

fragmentnih jona, a koje su u saglasnosti sa predloženim strukturama oksima kuminaldehida,

kuminil-amina i izotiocijanata.

Šema 62. Pretpostavljene odabrane MS fragmentacije jedinjenja 31a i b, 32 i 33

1H-NMR spektri jedinjenja 31a i b, 32 i 33, sadržali su četiri signala prvog reda i dva

multipleta višeg reda u području 7,18 - 7,92 ppm, koji potiču od protona sa benzenovog

jezgra. Oblik signala 2 i 3 je potvrdio da je u pitanju para-supstituisano benzenovo jezgro.

Vrednosti integrala su pokazali da signal na 1,25 ppm pripada vodonikovim atomima iz

metil-grupa, koji se, na osnovu dekuplovanih spektara, kupluje samo sa protonom 5. Na

najvišem hemijskom pomeranju se nalaze signali koji potiču od vodonika 7 i vodonika iz

hidroksilne grupe. Na osnovu gHMQC spektara izvršena je asignacija svih protonovanih

ugljenika, a neprotonovani ugljenici 1 i 4, kao i ugljenici 2 i 3, asignirani su na osnovu

gHMBC signala (šema 64).



Stereohemija oksima je određena na osnovu analize NOESY spektra. Zaključeno je da

je glavni proizvod (E)-dijastereoizomer oksima 31a, a na osnovu jake interakcija vodonika u


73

položaju 7 i vodonika N-OH grupe. Pored signala (E)-stereoizomera, uočeni su i slabo

intenzivni signali u 1H,

13C NMR i gHMBC spektrima, koji odgovaraju (Z)-stereoizomeru.

Dodatno je potvrđena stereohemijska asignacija oksima kuminaldehida na osnovu: 1) manje

vrednosti konstante kuplovanja 1J1C,1H u

1H-kuplovanim

13C NMR spektru (1E)-

stereoizomera oksima (166,3 Hz za (1E)-stereoizomera, a 172,6 Hz za (1Z)-stereoizomera

oksima kuminaldehida), usled postojanja već pomenute orbitalne interakcije σ*(C1-H) i

slobodnog elektronskog para u sp2-orbitali atoma azota, i 2) veće vrednosti hemijskih

pomeranja vodonika 7 i ugljenika 7 kod (1E)-stereoizomera (8,15 i 150,3 ppm kod (1E)-

stereoizomera, u odnosu na 7,38 i 146,7 ppm kod (1Z)-stereoizomera).

Slično kao kod oksima mirtenala, uočeno je prisustvo vodonično vezanih dimera

(šema 65), a nije bilo dokaza za prisustvo oligomera u snimljenom NOESY spektru.

Šema 64. Dimerna forma oksima 31a i uočena NOESY interakcija koja ide u prilog građenju

ovog dimera

Primenom GSD funkcije programa MestReNova, određen je odnos sin- i anti-

stereoizomera oksima kuminaldehida, tj. konstanta ravnoteže izomerizacije. Konstanta

ravnoteže između sin- i anti- oksima kuminaldehida iznosi 18,1, što pokazuje da su u rastvoru

termodinamički stabilniji (1E)-stereoizomeri, kao i kod prethodna dva oksima.

74

Tabela 17. 1H- i 13C-NMR spektralni podaci za jedinjenja 31a i 31b snimljena u CDCl3. Uočene NOESY i gHMBC interakcije

Šema 65. Strukture jedinjenja 31a i b i numeracija korišćena * bold oznake predstavljaju interakcije vodonika dimera pri asignaciji NMR spektara ** interakcija vodonika iz kolone „Pozicija” sa ugljenicima iz kolone gHMBC *** preklopljeni signali

Pozicija 1H 13C NOESY* gHMBC**

(E)-4-(1-metiletil)benzaldehid oksim (31a)

1 / 129,5 (ps q) J1C,7H = 7,5 J1C,2H = 7,5 J1C,2H'' = 7,5 / /

2 7,53 - 7,48 (m, AA'BB') 127,1*** (ddd) J2C,2H = 158,6 J2C,3H = 6,4 J2C,2H'' = 4,0 3, 7, OH 2, 4, 7

3 7,27 - 7,22 (m, AA'BB') 126,9*** (ddd) J3C,3H = 156,8 J3C,2H = 6,6 J3C,3H'' = 4,9 2, 5, 6 1, 3, 5

4 / 151,2*** (m) / /

5 2,92 (sep) J5,6 = 6,9 34,1 (dsep) J5C,5H = 127,5 J5C,6H = 3,9 3, 6 3, 4, 6

6 1,25 (d) J6,5 = 6,9 23,8 (qdq) J6C,6H = 126,1 J6C,5H = 9,9 J6C,6H'' = 5,0 3, 5 4, 5, 6

7 8,15 (s) 150,3*** (d) J7C,7H = 166,3 2, OH 1, 2

OH 8,92 (s) / 2, 7 7

(Z)-4-(1-metiletil)benzaldehid oksim (31b)

1 / 128,1*** (m) / /

2 7,92 - 7,88 (m, AA'BB') 131,1 (ddd) J2C,2H = 161,2 J2C,3H = 6,4 J2C,2H'' = 4,8 3, 7, OH 2, 4, 7

3 7,32 - 7,27 (m, AA'BB') 126,6 (ddd) J3C,3H = 157,1 J3C,2H = 6,6 J3C,3H'' = 5,2 2, 5, 6 1, 3, 5

4 / 151,4*** (m) / /

5 2,92 (sep) J5,6 = 6,9 34,1 (dsep) J5C,5H = 127,5 J5C,6H = 3,9 3, 6 3, 4, 6

6 1,26 (d) J6,5 = 6,9 23,8 (qdq) J6C,6H = 126,1 J6C,5H = 9,9 J6C,6H'' = 5,0 3, 5 4, 5, 6

7 7,38 (s) 146,7 (dt) J7C,7H = 172,6 J7C,2H = 4,8 2 1, 2

OH 8,92 (s) / 2 7

75

Tabela 18. 1H- i 13C-NMR spektralni podaci za jedinjenja 32 i 33 snimljena u CDCl3. Uočene NOESY i gHMBC interakcije


Pozicija

1H 13C NOESY gHMBC*

(4-(1-metiletil)fenil)metanamin (32)

1 / 140,6 / /

2 7,25 - 7,18 (m, AA'BB')

127,1 5, 6, 7, NH2 1, 2, 3, 4, 5, 7

3 126,6

4 / 147,5 / /

5 2,89 (sep) J5,6 = 6,9 33,8 3, 6 3, 4, 6

6 1,24 (br d) J6,5 = 6,9 24,0 3, 5 4, 5, 6

7 3,82 (s) 46,2 2, NH2 1, 2

NH2 2,00 (br s) / 2, 7 /

1-(1-metiletil)-4-(izotiocijanatometil)benzen (33)

1 / 131,5 (m) / /

2 7,29 - 7,21 (m, AA'BB')

126,9 (ddd) J2C,2H = 157,5 J2C,3H = 9,9 J2C,2H'' = 5,0 5, 6, 7 1, 2, 3, 4, 5, 7

3 127,0 (ddd) J3C,3H = 157,8 J3C,2H = 13,5 J3C,3H'' = 3,8

4 / 149,2 (m) / / 5 2,92 (sep) J5,6 = 6,9 33,8 (br d) J5C,5H = 127,9 3, 6 3, 4, 6

6 1,25 (d) J6,5 = 6,9 23,9 (qdq) J6C,6H = 126,0 J6C,5H = 9,9 J6C,6H'' = 5,0 3, 5 4, 5, 6

7 4,68 (s) 48,4 (t) J7C,7H = 144,6 2 1, 2, NCS

NCS / 125,5 (br s) / /

Šema 66. Strukture jedinjenja 32 i 33 i

numeracija korišćena pri asignaciji NMR spektara


76

4.5. Ispitivanje citotoksičnosti izotiocijanata

In vitro citotoksičnost sintetisanih monoterpenskih izotiocijanata je ispitivana za

ćelijsku liniju kancera debelog creva HCT-116, kolorimetrijskim MTT testom. MTT test se

zasniva na redukciji bledo žute tetrazolijum soli MTT (3-(4,5-dimetiltijazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazolijum-bromid) do ljubičasth kristala formazana (šema 68). MTT lako prolazi

kroz ćelijsku membranu i redukciju katalizuje mitohondrijalni enzim sukcinat dehidrogenaza,

koja je aktivna jedino u živim ćelijama. Koncentracija formazana, određena apsorpcionim

spektrofotometrom, direktno je srazmerna broju živih (vijabilnih) ćelija u uzorku. Sa

smanjenjem apsorbance raste citoksičnost ispitivanih jedinjenja. Apsorbanca je odredjena na

mikročitaču, na talasnoj dužini od 550 nm. U ovim eksperimentima ispitivana je vremenski i

dozno zavisna citotoksičnost sintetisanih monoterpenskih izotiocijanata.

Šema 67. Reakcija redukcije soli MTT

Ćelije kancera debelog creva, HCT-116, su izložene dejstvu rastućih koncentracija

(0,01, 0,04, 0,1, 0,4, 1, 4, 10, 40, 100 μM) ispitivanih jedinjenja u toku 24 i 72 h. Rezultat

ispititivanja citotoksičnosti je prikazan kao procenat živih ćelija, dobijen tako što se

apsorbanca uzorka tretiranog rastvorom izotiocijanata određene koncentracije podeli

apsorbancom uzorka kontrolne grupe i pomnoži sa 100. Dobijeni podaci (tri ponavljanja za

svaku koncentraciju) su prikazani kao njihova srednja vrednost ± standardna devijacija

(tabele 19 i 20). Upareni Studentov je t-test korišćen za statističku obradu dobijenih podataka

i utvrđivanja postojanja značajnosti razlike između srednjih vrednosti tretiranih i kontrolnih

uzoraka. U svim statističkim analizama, interval poverenja je bio 95%. U tabeli 21 su

prikazane koncentracije cisplatine i monoterpenskih izotiocijanata za koje se postiže 50%

inhibicije vijabilnosti (IC50) ćelija kancera debelog creva, tj. za koje se broj tretiranih ćelija

smanjuje za 50% u odnosu na kontrolni uzorak.

77

Tabela 19. Citotoksičnost (%) cisplatine i sintetisanih izotiocijanata na ćelijsku liniju kancera debelog creva HCT-116, nakon 24 h

ispitivana supstanca koncentracija (µg/mL)

0,01 0,04 0,1 0,4 1 4 10 40 100

cisplatina n.t. n.t. 93 ± 7 83 ± 7 * 81 ± 7 * 66 ± 6 * 43 ± 4 * n.t. n.t.

smeša geranil- i neril-izotiocijanata 98 ± 8 95 ± 9 93 ± 9 86 ± 9 * 86 ± 9 * 76 ± 8 * 75 ± 7 * 56 ± 5 * 31 ± 3 *

mirtenil-izotiocijanat 94 ± 9 91 ± 8 88 ± 7 83 ± 7 * 82 ± 6 * 72 ± 7 * 70 ± 6 * 67 ± 6 * 37 ± 3 *

kuminil-izotiocijanat 99 ± 8 92 ± 8 91 ± 8 89 ± 7 88 ± 7 76 ± 6 * 74 ± 6 * 73 ± 6 * 59 ± 4 *

* statistički značajne vrednosti (p < 0,05), u odnosu na negativnu kontrolu ** n.t. - koncentracija nije testirana

Tabela 20. Citotoksičnost (%) cisplatine i sintetisanih izotiocijanata na ćelijsku liniju kancera debelog creva HCT-116, nakon 72 h

* statistički značajne vrednosti (p < 0,05), u odnosu na negativnu kontrolu ** n.t. - koncentracija nije testirana

ispitivana supstanca koncentracija (µg/mL)

0,01 0,04 0,1 0,4 1 4 10 40 100

cisplatina n.t. n.t. 93 ± 7 78 ± 7 * 53 ± 7 * 15 ± 6 * 14 ± 4 * n.t. n.t.

smeša geranil- i neril-izotiocijanata 119 ± 8 118 ± 9 117 ± 9 114 ± 9 * 102 ± 9 * 95 ± 8 * 78 ± 7 * 20 ± 5 * 19 ± 3 *

mirtenil-izotiocijanat 104 ± 8 102 ± 7 98 ± 7 92 ± 6 * 80 ± 6 * 65 ± 5 * 37 ± 5 * 17 ± 5 * 14 ± 3 *

kuminil-izotiocijanat 97 ± 8 94 ± 8 88 ± 7 79 ± 7 76 ± 6* 74 ± 6 * 67 ± 6 * 63 ± 5 * 50 ± 4 *

78

Slika 12. Zavisnost vijabilnosti ćelija kancera debelog creva od koncentracija ispitivanih rastvora: 1) smeše geranil- i neril-izotiocijanata, 2) mirtenil- i 3) kuminil-izotiocijanata, u periodu od 24 h

Slika 13. Zaviisnost vijabilnostti ćelija kancera mir

debelog creva ortenil- i 3) kumi

od koncentracija inil-izotiocijanat

ispitivanih rastvta, u periodu od 7

vora: 1) smeše g72 h

geranil- i neril-iz

7

otiocijanata, 2)

79


80

Tabela 22. IC50 cisplatine i sintetisanih izotiocijanata prema ćelijama kancera debelog creva u toku 24 i 72 h

ispitivano jedinjenje

IC50 (µg/ml) 24 h

IC50 (µM) 24 h

IC50 (µg/ml) 72 h

IC50 (µM) 72 h

cisplatina 8,27 27,57 1,14 3,80

smeša geranil- i neril-izotiocijanata 79,45 407,21 69,58 356,62

mirtenil-izotiocijanat 254,85 1319,85 12,14 62,87

kuminil-izotiocijanat > 500 > 2600 191,25 1000,89

MTT test je pokazao doznu zavisnost efekata ispitivanih supstanci, jer citotoksičnost raste sa porastom koncentracije i nakon 24 h (slika 12) i nakon 72 h (slika 13), a na osnovu IC50 vrednosti, primetna je i vremenska zavisnost efekta citotoksičnosti. Sve ispitivane supstance pokazuju citotoksičnost i pri najmanjim koncentracija posle 24 h. Posle 72 h, jedino kuminil-izotiocijanat pokazuje citotoksičnost pri svim koncentracijama, a smeša geranil-/neril-izotiocijanata i mirtenil-izotiocijanat tek pri 4, odnosno 0,1 μg/mL. Mirtenil-izotiocijanat posle 24 h i kuminil-izotiocijanat posle 72 h pokazuju veću ili jednaku aktivnost kao i cisplatina, do koncentracije od 0,4 μg/mL. Prema opšte prihvaćenim kriterijumima, značajnu citotoksičnost pokazuju one supstance čija je IC50 vrednost niža od 20 μM. Ako je IC50 u intervalu 20–100 μM supstanca pokazuje umerenu ili slabu citotoksičnost, dok se aktivnost jedinjenja čija vrednost IC50 prelazi 100 μM smatra jako slabom (Geran et al., 1972). Na osnovu toga, može se zaključiti da ni jedan testirani monoterpeneski izotiocijanat ne pokazuje značajnu citotoksičnost. Mirtenil-izotiocijanat ima umerenu citotoksičnost posle 72 h, dok su ostali jako slabo aktivni. IC50 vrednosti opadaju u nizu: kuminil- > mirtenil- > smeša geranil- i neril-izotiocijanata (posle 24 h), odnosno kuminil- > smeša geranil- i neril- > mirtenil-izotiocijanat (posle 72 h). Veća voluminoznost bočnog lanca mirtenil-izotiocijanata je verovatno uticala na manju aktivnost u odnosu na smešu neril-/geranil-izotiocijanata posle 24 h, jer, kako je već rečeno u teorijskom delu, voluminoznost bočnog lanca utiče na brzinu vezivanja izotiocijanata za glutation u ćeliji. Međutim, posle 72 h (dovoljno vremena da se i mirtenil-izotiocijanat veze za glutation i ispolji svoju aktivnost), IC50 vrednost mirtenil-izotiocijanata je skoro 6 puta manja od vrednosti za smešu geranil-/neril-izotiocijanat, što je prava mera citotoksičnosti za mirtenil-izotiocijanat.

Poređenjem podataka za IC50 sa literaturnim vrednostima za IC50 sulforafanina (IC50 15 μM za HT29 ćelijsku liniju kancera debelog creva (Gamet-Payrastre et al., 1998), dok je za HTC-116 ćelijsku liniju, koja je i pri ovom ispitivanju korišćena, 6,67 μM (Pocasap & Weerapreeyakul, 2016)) i određenih seskviterpenskih izotiocijanata (IC50 u opsegu 11 - 33 μM za ćelijsku liniju HT29 (Zubía et al., 2008a, 2008b)), može se zaključiti da jedino mirtenil-izotiocijanat može da im parira po aktivnosti, dok su ostali od 10 do 400 puta manje aktivni.

5. Zaključak

82

P a g e 8 2 U ovom master radu opisane su sinteze mirtenil- i kuminil-izotiocijanata i smeše

geranil- i neril-izotiocijanata, polazeći od monoterpenskih aldehida (mirtenala,

kuminaldehida i citrala - smeše geranijala i nerala,), sa ukupnim prinosima od 8,6, 14,5 i

20,3%. Sinteze su ostvarene u tri koraka: 1) prevođenjem aldehida u oksime reakcijom bez

rastvarača, 2) redukcijom oksima do amina litijumaluminijum-hidridom i 3) konverzijom

amina u izotiocijanate, reakcijom sa ugljen-disulfidom i oksidacijom nastalih ditiokarbamata

vodonik-peroksidom. Svi stereoizomerni oksimi 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ su razdvojeni

preparativnom hromatografijom na koloni silika-gela. Ispitana je termalna stabilnosti oksima

3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ pri različitim uslovima analize gasnom hromatografije.

Svi sintetski intermedijeri su spektralno okarakterisani 1D- i 2D-NMR, MS, IR i UV

spektroskopijom, uz detaljno tumačenje dobijenih spektralnih podataka. Izvršena je potpuna

asignacija 1H i

13C NMR signala oksima, amina i izotiocijanata. Analizom NOESY spektara

oksima snimljenih u deuterohloroformu utvrđeno je da u rastvorima, pored monomernih

vrsta, postoje i vodonično vezani dimerni i/ili oligomerni adukti. Ovi adukti se ne javljaju u

rastvorima oksima u deuterodimetilsulfoksidu. Korišćenjem GSD funkcije programa

MestReNova određene su konstante ravnoteže izomerizacije sin- i anti-oksima.

U cilju potvrđivanja asignacije stereoizomernih oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ,

izračunata su 1H i

13C hemijska pomeranja pomoću programa Gaussian 09 (na DFT nivou

teorije). Za odabrane signale, izvršena je HiFSA analiza, kako bi se odredile vrednosti

pojedinih konstanti kuplovanja. Na osnovu vrednosti vicinalnih konstanti kuplovanja,

dobijenih spin simulacijom, vodonika iz -CH2CH2- fragmenta stereoizomernih oksima 3,7-

dimetil-2,6-oktadienalâ određen je odnos anti- i gauche-konformera duž te σ veze.

Ispitana je in vitro citotoksičnost sintetisanih izotiocijanata prema ćelijama kancera

debelog creva, HCT-116, MTT testom. Rezultati su interpretirani vodeći računa o strukturi

ispitivanih jedinjenja, a upoređeni su i sa literaturnim podacima za citotoksičnost sulforafana

i seskviterpenskih izotiocijanata morskih organizama. Mirtenil-izotiocijanat pokazuje

umerenu citotoksičnost posle 72 h (IC50 = 62,87 μM), a kuminil-izotiocijanat i smeša geranil-

i neril-izotiocijanata su bili slabo aktivni (IC50 > 100 μM).

6. Literatura

Literatura Sinteza i spektralna karakterizacija monoterpenskih izotiocijanata

84

Adams, R. P. Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography/Mass

Spectrometry (4th ed.), Allured Publishing Corporation, Carol Stream, 2007.

Adesida, A.; Edwards, L.G.; Thornalley, P.J. Food Chem. Toxicol. 1996, 34, 385.

Agerbirk, N.; Olsen, C. E.; Sørensen, H. J. Agric. Food. Chem. 1998, 46, 1563.

Aitken, R. A. Carbon with Two Attached Heteroatoms with at Least One Carbon-to-

Heteroatom Multiple Link, Jones, R. (vol. ed.), Comprehensive Organic Functional

Group Transformations II, Katritzky, R. A., Taylor, R. J. K. (ed.), Elsevier Science

Ltd., Oxford, 2005, 5, 976.

Albanese, D.; Penso, M. Synthesis 1991, 1001.

Andersson, A. A. M.; Merker, A.; Nilsson, P.; Sørensen, H.; Åman, P. J. Sci. Food Agric.

1999, 79, 179.

Anjaneyulu, B.; Maller, R. K.; Nagarajan, K.; Kueng, W.; Wirz, B. J. Labelled Compd.

Radiopharm. 1985, 22, 313.

Bellostas, N.; Sørensen, A. D.; Sørensen, J. C.; Sørensen, H. Adv. Bot. Res. 2007, 45, 369.

Bennett, R. N.; Hick, A. J.; Dawson, G. W.; Wallsgrove, R. M. Plant Physiol. 1995, 109,

299.

Bernat, J.; Kniezo, L.; Petercakova, D.; Imrich, J.; Kutschy, P. Z. Chem. 1988, 28, 141.

Besson, T.; Guillard, J.; Rees, C. W.; Thiery, V. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1998, 889.

Bhalla, K. N. Oncogene 2003, 22, 9075.

Block, G.; Patterson, B.; Subar, A. Nutr. Cancer 1992, 18, 1.

Blotny, G. Liebigs Ann. Chem. 1982, 1927.

Bodeker, J.; Cammerer, B.; Kockritz, P. Z. Chem. 1985, 25, 173.

Bones, A.M.; Rossiter, J. T. Physiol. Plant. 1996, 97, 194.

Boyer, J. H.; Ramakrishnan, V. T. J. Org. Chem. 1972, 37, 1360.

Braun, J.; Deutsch, H. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1912, 45, 2188.

Braverman, S.; Cherkinsky, M.; Birsa, M. L. Four Carbon—Heteroatom Bonds: X—CX,

X=C=X, XC=X, CX, Knight, J. G. (ed.), Science of Synthesis, Georg Thieme Verlag

KG, New York, 2005, 18, 188.

Brüsewitz, G., Cameron, B. D., Chasseaud, L. F., Görler, K., Hawkins, D. R., H. Koch, H.,

Mennicke, W. H. Biochem. J. 1977, 162, 99.


85

Burmeister, W. P.; Cottaz, S.; Rollin, P.; Vasella, A.; Henrissat, B. J. Biol. Chem. 2000, 10,

1074.

Burow, M.; Bergner, A.; Gershenzon, J.; Wittstock, U. Plant Mol. Biol. 2007, 63, 49.

Buskov, S.; Olsen, C. E.; Sørensen, H.; Sørensen, S. J Biochem. Biophys. Methods 2000, 43,

175.

Cambie, R. C.; Lee, H. H.; Rutledge, P. S.;Woodgate, P. D. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1

1979, 757.

Capon, R. J.; MacLeod, J. K. Aust. J. Chem. 1988, 41, 979.

Chen, M.-J.; Tang, W.-Y.; Hsu, C.-W.; Tsai, Y.-T.; Wu, J.-F.; Lin, C.-W.; Cheng, Y.-M.;

Hsu, Y.-C. Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2012, 2012, 415231.

Cho, C.- G.; Posner, G. H. Tetrahedron Lett. 1992, 33, 3599.

Chung, F. L.; Jiao, D.; Getahun, S. M.; Yu, M. C. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1998,

7, 103.

Clarke, D. B. Anal. Methods 2010, 2, 310.

Cotton, S. C.; Sharp, L.; Little, J.; Brockton, N. Am. J. Epidemiol. 2000, 151, 7.

Dains, F. B.; Brewster, R. Q.; Olander, C. P. Org. Synth. 1941, Coll. Vol. 1, 447.

Damljanović, I.; Vukićević, M.; Vukićević, R. D. Monatsh. Chem. 2006, 137, 301.

Dinkova-Kostova, A. T.; Kostov, R. V. Trends Mol. Med. 2012, 18, 337.

Diveley, W. R.; Buntin, G. A.; Lohr, A. D. J. Org. Chem. 1969, 34, 616.

Drobnica, L.; Kristian, P.; Augustin, J. The Chemistry of Cyanates and Their Thio

Deriuatiues, Patai, S. (Ed.), John Wiley and Sons, New York, 1977, 1003.

Du, L. C.; Halkier, B. A. Phytochemistry 1998, 48, 1145.

Dyson, G. M.; George, H. J. J. Chem. Soc. 1924, 125, 1702.

Elbert, T.; Cerny, M. Collect. Czech. Chem. Commun. 1985, 50, 2000.

Ettlinger, M.G.; Kjær, A. Recent Adv. Phytochem. 1968, 1, 59.

Fahey, J. W.; Talalay, P. Food Chem. Toxicol. 1999, 37, 973.

Fahey, J. W., Wehage, S. L., Holtzclaw, W. D., Kensler, T. W., Egner, P. A., Shapiro, T. A.,

Talalay, P. Cancer Prev. Res. 2012, 4, 603.

Fahey, J. W.; Zalcmann, A. T.; Talalay, P. Phytochemistry 2001, 56, 5.

Fahey, J. W.; Zhang, Y.; Talalay, P. Proc. Nat. Acad. Sci U. S. A. 1997, 94, 10367.


86

Fava, A.; Iliceto, A.; Ceccon, A.; Koch, P. J. Am. Chem. Soc. 1965, 87, 1045.

Fedoseev, V. M.; Litvinov, L. N. Zh. Obshch. Khim. 1964, 34, 557

Fokin, A. V.; Kolomiets, A. F.; Studnev, Yu. N.; Rapkin, A. I.; Yakutin, V. I. Izv. Akad. Nauk

SSSR, Ser. Khim. 1972, 1210.

Fujiwara, S.; Shin-Ike, T.; Sonoda, N.; Aoki, M.; Okada, K.; Miyoshi, N.; Kambe, N.

Tetrahedron Lett. 1991, 32, 3503.

Furukawa, I.; Abe, N.; Hashimoto, S. Chem. Express 1988, 3, 215.

Galletti, S.; Bernardi, R.; Leoni, O.; Rollin, P.; Palmieri, S. J. Agric. Food Chem. 2001, 49,

471.

Gamet-Payrastre, L.; Li, P.; Lumeau, S.; Cassar, G.; Dupont, M. -A.; Chevolleau, S.; Gasc,

N.; Tulliez, J.; Terce, F. Cancer Res. 2000, 60, 1426.

Gamet-Payrastre, L.; Lumeau, S.; Gasc, N.; Cassar, G.; Rollin, P.; Tulliez, J. Anticancer

Drugs 1998, 9, 141.

Gasper, A. V., Al-Janobi, A., Smith, J. A. Bacon, J. R., Fortun, P., Atherton, C., Taylor, M.

A., Hawkey, C. J., Barrett, D. A., Mithen, R. F. Am. J. Clin. Nutr. 2005, 82, 1283.

Geran, R.I.; Greenberg, N. H.; Macdonald, M. M.; Shumacher, A. M.; Abbott, B. J.

Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors

and other biological systems, Cancer Chemotherapy Reports, Part III, 1972, 3, 1.

Getahun, S.M.; Chung, F.-L. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1999, 8, 447.

Giamoustaris, A.; Mithen, R. Theor. Appl. Gen. 1996, 93, 1006.

Gil, V. M. S.; Teixeira-Dias, J. J. C. Mol. Phys. 1968, 15, 47.

Gilmore, J.; Gallagher. P. T. Carbon with Two Attached Heteroatoms with at Least One

Carbon-to-Heteroatom Multiple Link, Moody, C. J. (vol. ed.), Comprehensive

Organic Functional Group Transformations, Katritzky, R. A., Meth-Cohn, O., Rees

C. W. (ed.), Elsevier Science Ltd., Oxford, 1995, 5, 1021.

Gonda, J.; Kristian, P.; Mikler, L. Collect. Czech. Chem. Commun. 1986, 51, 112.

Graser, G.; Schneider, B.; Oldham, N. J.; Gershenzon J. Arch. Biochem. Biophys. 2000, 378,

411.

Grubb, C. D.; Zipp, B. J.; Ludwig-Muller, J.; Masuno, M. N.; Molinski, T. F.; Abel S. Plant

J. 2004, 40, 893.

Habib, N. S.; Rieker, A. Synthesis 1984, 825.

Halkier, B. A.; Du, L. C. Trends Plant Sci. 1997, 2, 425.


87

Halkier, B. A.; Gershenzon, J. Annu. Rev. Plant Biol. 2006, 57, 303.

Hansen, P. E. Progress in NMR Spectroscopy, Pergamon Press, Oxford, 1981, 14, 175.

Hasapis, X.; MacLeod, A. Phytochemistry 1982, 21, 1009.

He, H.-Y.; Salvi, J.; Catalos, R. F.; Faulkner, D. J. J. Org. Chem. 1992, 57, 3191.

Hecht, S. S.; Carmella, S.G.; Murphy, S. E. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1999, 8,

907.

Hodgkins, J. E.; Ettlinger, M. G. J. Org. Chem. 1956, 21, 404.

Hodgkins, J. E.; Reeves, W. P.; Liu, Y. T. J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, 2532.

Hull, R. J. Chem. Soc. C 1968, 1777.

Hussein, A. Q.; Abu-Taha, A.; Jochims, J. C. Chem. Ber. 1978, 111, 3750.

Hussein, A. Q.; Jochims, J. C. Chem. Ber. 1979, 112, 1956.

Jackson, S. J.; Singletary, K. W. J. Nutr. 2004a, 134, 2229.

Jackson, S. J.; Singletary, K. W. Carcinogenesis 2004b, 25, 219.

Jain, R.; Bally, T.; Rablen, P. R. J. Org. Chem. 2009, 74, 4017.

Jochims, J. C.; Seeliger, A. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1967, 6, 174.

Juge, N.; Mithen, R. F.; Traka, M. Cell. Mol. Life Sci. 2007, 64, 1105.

Iwasawa, N.; Funahashi, M.; Hayakawa, S.; Ikeno, T.; Narasaka, K. Bull. Chem. Soc. Jpn.

1999, 72, 85.

Kanematsu, S.; Yoshizawa, K.; Uehara, N.; Miki, H.; Sasaki, T.; Kuro, M.; Lai Y. C.;

Kimura, A.; Yuri, T.; Tsubura, A. Oncol. Rep. 2011, 26, 603.

Keck, A. S.; Staack, R.; Jeffery, E. H. Nutr. Cancer 2002, 42, 233.

Keum, Y.-S.; Jeonga, W.-S.; Konga, A. N. T. Mutat Res. 2004, 555, 191.

Kim, B.R.; Hu, R.; Keum, Y.S.; Hebbar, V.; Shen, G.; Nair, S.S.; Kong, A.N. Cancer Res.

2003a, 63, 7520.

Kim, J. N.; Jung, K. S.; Lee, H. J.; Son, J. S. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 1597.

Kim, D. H.; Kim, M.; Kwon, H. J. J. Biochem. Mol. Biol. 2003b, 36, 110.

Kim, J. N.; Ryu, E. K. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 8283.

Kim, J. N.; Song, J. H.; Ryu, E. K. Synth. Commun. 1994, 24, 1101.


88

Kliebenstein, D. J.; Kroymann, J.; Brown, P.; Figuth, A.; Pedersen, D.; Gershenzon, J.;

Mitchell-Olds, T. Plant Physiol. 2001a, 126, 811.

Kliebenstein, D. J.; Lambrix, V. M.; Reichelt, M.; Gershenzon, J.; Mitchell-Olds, T. Plant

Cell 2001b, 13, 681.

Kniezo, L.; Bernat, J. Synth. Commun. 1990, 20, 509.

König, G. M.; Wright, A. D.; Sticher O. J. Nat. Prod. 1992, 55, 633.

Kricheldorf, H. R. Synthesis 1970, 539.

Kristian, P.; Gonda, J. Chem. Pap. 1986, 40, 773.

Lambrix, V.; Reichelt, M.; Mitchell-Olds, T.; Kliebenstein, D. J.; Gerschenzon, J. Plant Cell

2001, 13, 2793.

LeCount, D. J.; Dewsbury, D. J.; Grundy, W. Synthesis 1977, 582.

Li, G.; Tajima, H.; Ohtani, T. J. Org. Chem. 1997, 62, 4539.

London, S.J.; Yuan, J.M.; Chung, F.L.; Gao, Y.T.; Coetzee, G.A.; Ross, R.K.; Yu, M.C.

Lancet 2000, 356, 724.

Loose, G.; Weddige, H. Justus Liebigs Ann. Chem. 1960, 636, 144.

Losanitsch, S. M. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1891, 24, 3021.

Magrath, R.; Bano, F.; Morgner, M.; Parkin, I.; Sharpe, A.; Lister, C.; Dean, C.; Turner, J.;

Lydiate, D.; Mithen, R. Heredity 1994, 72, 290.

Marsh, R. E.; Waser, J. Acta Crystallogr. B 1970, 26, 1030.

Martin, D.; Beyer, H.; Gross, H. Chem. Ber. 1965, 98, 2425.

Matusheski, N. V.; Jeffery, E. H. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 5743.

McElhinney, R. S. J. Chem. Soc. C. 1966, 950.

Meyer, D. J., Crease, D. J., Ketterer, B. Biochem. J. 1995, 306, 565.

Mikkelsen, M. D.; Naur, P.; Halkier, B. A. Plant J. 2004, 37, 770.

Mithen, R. Adv. Bot. Res. 2001, 35, 213.

Mithen, R.; Armah, C.; Traka, M. Vegetables, Whole Grains, and Their Derivatives in

Cancer Prevention, Mutanen, M., Pajari, A.-M. (vol. ed.), Diet and Cancer, Albini, A.

(ed.), Springer, New York, 2011, 2, 1.

Mithen, R. F.; Dekker, M.; Verkerk, R.; Rabot, S.; Johnson, I. T. J. Sci. Food Agric. 2000,

80, 967.


89

Mithen, R.; Clarke, J.; Lister, C.; Dean, C. Heredity 1995, 74, 210.

Molina, P.; Alajarin, M.; Arques, A. Synthesis 1982, 596.

Morel, F.; Langouet, S.; Maheo, K.; Guillouzo, A. Cell. Biol. Toxicol. 1997, 13, 323.

Mori, I.; Oshima, K.; Nozaki, H. Tetrahedron Lett. 1984, 25, 4683.

Mosmann, T. J. Immunol. Methods 1983, 65, 55.

Mumm, O.; Richter, H. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1940, 73, 843.

Myzak, M. C.; Karplus, P. A.; Chung, F. L.; Dashwood, R. H. Cancer Res. 2004, 64, 5767.

Myzak, M. C.; Tong, P.; Dashwood, W.-M.; Dashwood, R. H; Ho, E. Exp.Biol. Med.

(Maywood) 2007, 232, 227.

Nath, J.; Jamir L.; Patel, B. K. Green Chem. Lett. and Rev. 2011, 4, 1.

Naur, P.; Petersen, B. L.; Mikkelsen, M. D.; Bak, S.; Rasmussen, H.; Olsen, C. E.; Halkier,

B. A. Plant Physiol. 2003, 133, 67.

Nishiyama, K.; Oba, M. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1987, 60, 2289.

Olsen, 0.; Sørensen, H. J. Am. Oil Chem. Soc. 1981, 58, 857.

Øverby, A.; Zhao, C. M.; Bones, A. M.; Chen, D. J. Gastroenterol. Hepatol. 2014, 4, 99.

Ottenbrite, R. M. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1972, 88.

Ouédraogo, I. W.; Boulvin, M.; Flammang, R.; Gerbaux, P.; Bonzi-Coulibaly, Y. L.

Molecules 2009, 14, 3275.

Pocasap, P.; Weerapreeyakul, N. Asian Pac. J. Trop. Biomed. 2016, 6, 121.

Rabot, S.; Nugon-Baudon, L.; Raibaud, P.; Szylit, O. Br. J. Nutr. 1993, 70, 323.

Rathke, A. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1872, 5, 799.

Reeves, W. P.; Simmons, A.; Rudis, J. A.; Bothwell, T. C. Synth. Commun. 1981, 11, 781.

Robiquet, P.J.; Boutron, F. J. Pharm. Chim. 1831, 17, 279.

Rosa, E. A. S.; Heaney, R. K.; Fenwick, G. R.; Portas, C. A. M. Hort. Rev. 1997, 19, 99.

Ruske, W.; Keilert, M. Chem. Ber. 1961, 94, 2695.

Ryter, S. W.; Alam, J.; Choi, A. M. Physiol. Rev. 2006, 86, 583.

Saegusa, T.; Kobayashi, S.; Ito, Y. J. Org. Chem. 1970, 35, 2118.

Sakai, S.; Fujinami, T.; Aizawa, T. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1977, 50, 425.


90

Scharf, G.; Prustomersky, S.; Knasmuller, S.; Schulte-Hermann, R.; Huber, W. W. Nutr.

Cancer 2003, 45, 74.

Schmidt, E.; Kammerl, E.; Ross, D.; Zaller, F. Justus Liebigs Ann. Chem. 1955, 594, 233.

Schmidt, E.; Striewsky, W.; Seefelder, M.; Hitzler, F. Justus Liebigs Ann. Chem. 1950, 568,

192.

Schmidt, E.; Zaller, F.; Moosmuller, F.; Kammerl, E. Justus Liebigs Ann. Chem. 1954, 585,

230.

Seidl, P. R.; Dias, J. F. NMR spectra of hydroxylamines, oximes and hydroxamic acids,

PATAI's Chemistry of Functional Groups, John Wiley & Sons, Ltd., New York, 2010.

Shahak, I.; Sasson, Y. J. Am. Chem. Soc. 1973, 95, 3440.

Shapiro, T. A.; Fahey, J. W.; Wade, K. L.; Stephenson, K.K.; Talalay, P. Cancer Epidemiol.

Biomarkers Prevent. 1998, 7, 1091.

Shikita, M.; Fahey, J. W.; Golden, T. R.; Holtzclaw, W. D.; Talalay, P. Biochem. J. 1999,

341, 725.

Smith, P. A. S.; Emerson, D. W. J. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 3076.

Sørensen, H. Canola and Rapessed: Production, Chemistry, Nutrition and Processing

Technology 1990, 9, 149.

Sorek, H.; Zelikoff, A. L.; Benayahu, Y.; Kashman, Y. Tetrahedron Lett. 2008, 49, 2200.

Struhl, K. Genes Dev. 1998, 12, 599.

Tajima, H.; Li, G. Synlett 1997, 773.

Talalay, P. Proc. Am. Philos. Soc. 1999, 143, 52.

Talalay, P.; Fahey, J. W.; Holtzclaw, W. D.; Prestera, T.; Zhang, Y. Toxicol. Lett. 1995, 82,

173.

Talalay, P.; Zhang, Y. Biochem. Soc. Trans. 1996, 24, 806.

Tanaka, S.; Uemura, S.; Okano, M. Bull. Chem. Soc. Jpn 1977, 50, 2785.

Textor, S., Bartram, S., Kromann, J., Falk, K. L., Hick, A., Pickett, J. A., Gerschenzon, J.

Planta 2004, 218, 1026.

Textor, S., De Kraker, W.E, Hause, B., Gerschenzon, J.,Tokuhisa, J. G. Plant Physiol. 2007,

144, 60.

Thejass, P.; Kuttan, G. Life Sci. 2006, 78, 3043.

Thieme, P. C.; Hadicke, E. Justus Liebigs Ann. Chem. 1978, 227.


91

Thornalley, P. J. Anticancer Drugs 2002, 13, 331.

Toshimitsu, A.; Uemura, S.; Okano, M.; Watanabe, N. J. Org. Chem. 1983, 48, 5246.

Trofimov, B. A.; Nedolya, N.; Gerasimova, V.; Voronkov, M. G. Zh. Org. Khim. 1988, 24,

2003.

Qazi, A.; Pal, J.; Maitah, M.; Fulciniti, M.; Pelluru, D.; Nanjappa, P.; Lee, S.; Batchu, R. B.;

Prasad, M.; Bryant, C. S.; Rajput, S.; Gryaznov, S.; Beer, D. G.; Weaver, D. W.;

Munshi, N. C.; Goyal, R. K.; Shammas, M. A. Transl. Oncol. 2010, 3, 389.

Uda, Y.; Kurata, T.; Arakawa, N. Agric. Biol. Chem. 1986, 50, 2735.

Van den Dool, H.; Kratz, P. D. J. Chromatogr. A 1963, 11, 463.

Vovk, M. V.; Bratenko, M. K.; Samarai, L. I. Ukr. Khim. Zh. (Russ. Ed.) 1991, 57, 431.

Walter, C. R. Jr. J. Am. Chem. Soc. 1952, 74, 5185.

Wetter, L. R.; Chisholm, M. D. Can. J. Biochem. 1968, 46, 931.

Wittstock, U., Halkier, B. A. Trends Plant Sci. 2002, 7, 263.

Xu, K.; Thornalley, P. J. Biochem. Pharmacol. 2000, 60, 221.

Yanaka, A.; Zhang, S.; Tauchi, M.; Suzuki, H.; Shibahara, T.; Matsui, H.; Nakahara, A.;

Tanaka, N.; Yamamoto, M. Inflammopharmacology 2005, 13, 83.

Yonezawa, T.; Morishima, I.; Fukuta, K.; Ohmori, Y. J. Mol. Spectrosc. 1969, 31, 341.

Zhang, Y.; Kensler, T. W.; Cho, C. G.; Posner, G. H.; Talalay, P. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A.

1994, 91, 3147.

Zhang, Y.; Kolm, R. H.; Mannervik, B.; Talalay, P. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995,

206, 748.

Zhang, Y.; Li, J.; Tang, L. Free Radic. Biol. Med. 2005, 38, 70.

Zhang, Y.; Talalay, P. Cancer Res. 1994, 54, 1976s.

Zhang, Y.; Talalay, P. Cancer Res. 1998, 58, 4632.

Zhang, Y.; Talalay, P.; Cho, C.G.; Posner, G.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89, 2399.

Zubía, E.; Ortega, M. J.; Carballo, J. L. J. Nat. Prod. 2008a, 71, 2004.

Zubía, E.; Ortega, M. J.; Hernández-Guerrero, C. J.; Carballo, J. L. J. Nat. Prod. 2008b, 71,

608.

7. Prilozi

Prilozi

Sinteza i spektralna karakterizacija monoterpenskih izotiocijanata 93

Spisak priloga:

Prilog 1 TIC Hromatogram reakcione smeše i (EI)MS spektar smeše oksima (1E,2E)-,

(1Z,2E)-, (1E,2Z)- i (1Z,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienala (11a - d)

Prilog 2 IR spektar smeše oksima (1E,2E)-, (1Z,2E)-, (1E,2Z)- i (1Z,2Z)-3,7-dimetil-

2,6-oktadienala (11a - d)

Prilog 3 UV spektar smeše oksima (1E,2E)-, (1Z,2E)-, (1E,2Z)- i (1Z,2Z)-3,7-dimetil-

2,6-oktadienala (11a - d)

Prilog 4 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar oksima (1E,2E)-3,7-dimetil-2,6-

oktadienala (11a)

Prilog 5 1H-kuplovani

13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar oksima (1E,2E)-3,7-

dimetil-2,6-oktadienala (11a)

Prilog 6 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar oksima (1Z,2E)-3,7-dimetil-2,6-

oktadienala (11b)


13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar oksima (1Z,2E)-3,7-

dimetil-2,6-oktadienala (11b)

Prilog 8 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar oksima (1E,2Z)-3,7-dimetil-2,6-

oktadienala (11c)


13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar oksima (1E,2Z)-3,7-

dimetil-2,6-oktadienala (11c)

Prilog 10 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar oksima (1Z,2Z)-3,7-dimetil-2,6-

oktadienala (11d)


13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar oksima (1Z,2Z)-3,7-

dimetil-2,6-oktadienala (11d)

Prilog 12 (EI)MS spektar (E)-3,7-dimetil-2,6-oktadien-1-amina (12a)

Prilog 13 (EI)MS spektar (Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadien-1-amina (12b)

Prilog 14 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar smeše (E)- i (Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadien-

1-amina (12a i 12b)

Prilog 15 13

C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar smeše (E)-i (Z)-3,7-dimetil-2,6-

oktadien-1-amina (12a i 12b)

Prilozi


Prilog 16 TIC Hromatogram reakcione smeše (E)- i (Z)-1-izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-

oktadiena (13a i 13b)

Prilog 17 (EI)MS spektar (E)-1-izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-oktadiena (13a)

Prilog 18 (EI)MS spektar (Z)-1-izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-oktadiena (13b)

Prilog 19 IR spektar smeše (E)- i (Z)-1-izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-oktadiena (13a i

13b)

Prilog 20 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar smeše (E)- i (Z)-1-izotiocijanato-3,7-

dimetil-2,6-oktadiena (13a i 13b)


13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar smeše (E)- i (Z)-1-

izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-oktadiena (13a i 13b)

Prilog 22 TIC Hromatogram reakcione smeše i (EI)MS spektar smeše oksima (E)- i (Z)-

(1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten-2-karbaldehida (21a i 21b)

Prilog 23 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar smeše oksima (E)- i (Z)-(1R,5S)-6,6-

dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten-2-karbaldehida (21a i 21b)


13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar smeše oksima (E)- i (Z)-

(1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten-2-karbaldehida (21a i 21b)

Prilog 25 (EI)MS spektar ((1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten-2-il)metanamina

(22)

Prilog 26 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar ((1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-

hepten-2-il)metanamina (22)

Prilog 27 13

C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar ((1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-

hepten-2-il)metanamina (22)

Prilog 28 TIC Hromatogram reakcione smeše i (EI)MS spektar (1R,5S)-2-

(izotiocijanatometil)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-heptena (23)

Prilog 29 IR spektar (1R,5S)-2-(izotiocijanatometil)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-heptena

(23)

Prilog 30 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (1R,5S)-2-(izotiocijanatometil)-6,6-

dimetilbiciklo[3.1.1]-2-heptena (23)


13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (1R,5S)-2-

(izotiocijanatometil)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-heptena (23)

Prilog 32 TIC Hromatogram reakcione smeše i (EI)MS spektar smeše oksima (E)- i (Z)

4-(1-metiletil)benzaldehida (31a i 31b)

Prilog 33 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar smeše oksima (E)- i (Z)-4-(1-

metiletil)benzaldehida (31a i 31b)

Prilozi



13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar smeše oksima (E)- i (Z)-4-

(1-metiletil)benzaldehida (31a i 31b)

Prilog 35 (EI)MS spektar (4-(1-metiletil)fenil)metanamina (32)

Prilog 36 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (4-(1-metiletil)fenil)metanamina (32)

Prilog 37 13

C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (4-(1-metiletil)fenil)metanamina (32)

Prilog 38 TIC Hromatogram reakcione smeše i (EI)MS spektar 1-(1-metiletil)-4-

(izotiocijanatometil)benzena (33)

Prilog 39 IR spektar 1-(1-metiletil)-4-(izotiocijanatometil)benzena (33)

Prilog 40 UV spektar 1-(1-metiletil)-4-(izotiocijanatometil)benzena (33)

Prilog 41 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar 1-(1-metiletil)-4-



13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar 1-(1-metiletil)-4-


96

Prilog 1. TIC Hromatogram reakcione smeše i (EI)MS spektar smeše oksima (1E,2E)-, (1Z,2E)-, (1E,2Z)- i (1Z,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienala

(11a - d)

97

Prilog 2. IR spektar smeše oksima (1E,2E)-, (1Z,2E)-, (1E,2Z)- i (1Z,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienala (11a - d)

98

Prilog 3. UV spektar smeše oksima (1E,2E)-, (1Z,2E)-, (1E,2Z)- i (1Z,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienala (11a - d):

1,03 · 10-4

mol dm-3

(levo) i 2,06 · 10-5

mol dm-3

(desno)

99

Prilog 4. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar oksima (1E,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienala (11a)

100

Prilog 5. 1H-kuplovani

13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar oksima (1E,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienala (11a)

101

Prilog 6. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar oksima (1Z,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienala (11b)

102


13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar oksima (1Z,2E)-3,7-dimetil-2,6-oktadienala (11b)

103

Prilog 8. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar oksima (1E,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienala (11c)

104


13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar oksima (1E,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienala (11c)

105

Prilog 10. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar oksima (1Z,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienala (11d)

106


13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar oksima (1Z,2Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadienala (11d)

107

Prilog 12. (EI)MS spektar (E)-3,7-dimetil-2,6-oktadien-1-amina (12a)

Prilog 13. (EI)MS spektar (Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadien-1-amina (12b)

108

Prilog 14. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar smeše (E)- i (Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadien-1-amina (12a i 12b)

109

Prilog 15. 13

C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar smeše (E)-i (Z)-3,7-dimetil-2,6-oktadien-1-amina (12a i 12b)

110

Prilog 16. TIC Hromatogram reakcione smeše (E)- i (Z)-1-izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-oktadiena (13a i 13b)

Prilog 17. (EI)MS spektar (E)-1-izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-oktadiena (13a)

111

Prilog 18. (EI)MS spektar (Z)-1-izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-oktadiena (13b)

112

Prilog 19. IR spektar smeše (E)- i (Z)-1-izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-oktadiena (13a i 13b)

113

Prilog 20. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar smeše (E)- i (Z)-1-izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-oktadiena (13a i 13b)

114


13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar smeše (E)- i (Z)-1-izotiocijanato-3,7-dimetil-2,6-oktadiena (13a i 13b)

115

Prilog 22. TIC Hromatogram reakcione smeše i (EI)MS spektar smeše oksima (E)- i (Z)-(1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten-2-

karbaldehida (21a i 21b)

116

Prilog 23. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar smeše oksima (E)- i (Z)-(1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten-2-karbaldehida (21a i 21b)

117


13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar smeše oksima (E)- i (Z)-(1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten-2-karbaldehida

(21a i 21b)

118

Prilog 25. (EI)MS spektar ((1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten-2-il)metanamina (22)

119

Prilog 26. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar ((1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten-2-il)metanamina (22)

120

Prilog 27. 13

C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar ((1R,5S)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-hepten-2-il)metanamina (22)

121

Prilog 28. TIC Hromatogram reakcione smeše i (EI)MS spektar (1R,5S)-2-(izotiocijanatometil)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-heptena (23)

122

Prilog 29. IR spektar (1R,5S)-2-(izotiocijanatometil)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-heptena (23)

123

Prilog 30. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (1R,5S)-2-(izotiocijanatometil)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-heptena (23)

124


13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (1R,5S)-2-(izotiocijanatometil)-6,6-dimetilbiciklo[3.1.1]-2-heptena (23)

125

Prilog 32. TIC Hromatogram reakcione smeše i (EI)MS spektar smeše oksima (E)- i (Z)-4-(1-metiletil)benzaldehida (31a i 31b)

126

Prilog 33. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar smeše oksima (E)- i (Z)-4-(1-metiletil)benzaldehida (31a i 31b)

127


13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar smeše oksima (E)- i (Z)-4-(1-metiletil)benzaldehida (31a i 31b)

128

Prilog 35. (EI)MS spektar (4-(1-metiletil)fenil)metanamina (32)

129

Prilog 36. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (4-(1-metiletil)fenil)metanamina (32)

130

Prilog 37. 13

C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (4-(1-metiletil)fenil)metanamina (32)

131

Prilog 38. TIC Hromatogram reakcione smeše i (EI)MS spektar 1-(1-metiletil)-4-(izotiocijanatometil)benzena (33)

132

Prilog 39. IR spektar 1-(1-metiletil)-4-(izotiocijanatometil)benzena (33)

133

Prilog 40. UV spektar 1-(1-metiletil)-4-

(izotiocijanatometil)benzena (33): 1,04 · 10-4

mol dm-3

(gore) i 3,47 · 10-5

mol dm-3

(dole)

134

Prilog 41. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar 1-(1-metiletil)-4-(izotiocijanatometil)benzena (33)

135


13C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar 1-(1-metiletil)-4-(izotiocijanatometil)benzena (33)

8. Biografija i bibliografija

Biografija i bibliografija Sinteza i spektralna karakterizacija monoterpenskih izotiocijanata

137

Magdalena Tasić je rođena 31. oktobra 1992. godine u Nišu. Osnovnu školu

„Desanka Maksimović” i prirodno-matematički smer Gimnazije „Bora Stanković” završila je

kao nosilac diplome „Vuk Karadžić”. Tokom srednje škole redovno je učestvovala na

Međuokružnim i Republičkim takmičenjima iz hemije i bila uspešna, sa nagradom za drugo

mesto na Republičkom takmičenju u kategoriji test i eksperimentalne vežbe, školske 2007/08.

Osnovne akademske studije hemije na Departmanu za hemiju Prirodno-matematičkog

fakulteta u Nišu upisala je školske 2011/12. Studije je završila u roku, 04.10.2014. godine, sa

ostvarenih 206 bodova ESPB (od potrebnih 180) i prosečnom ocenom 10,00. Master

akademske studije, smer Hemija, modul Istraživanje i razvoj, upisala je školske 2014/15. na

Departmanu za hemiju Prirodno-matematičkog fakulteta, Univerziteta u Nišu. Dobitnik je

godišnje nagrade Srpskog hemijskog društva za 2015. godinu za izuzetan uspeh u toku

studija, a bila je stipendista „Fonda za mlade talente” Ministarstva omladine i sporta, za

studente završnih godina osnovnih i master akademskih studija sa visokoškolskih ustanova

čiji je osnivač Republika Srbija, školske 2013/14. i 2015/16. i stipendista Ministarstva

prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije školske 2012/2013. i 2014/15.

Od juna do septembra 2012. godine učestvovala je u projektu „Otvorene laboratorije”

u Laboratoriji za analitičku i fizičku hemiju, Prirodno-matematičkog fakulteta, Univerziteta u

Nišu, pod rukovodstvom dr Milana Stojkovića. Bila je polaznik 9. škole masene

spektrometrije, održane od 23. od 27. oktobra 2014. godine, u organizaciji Prirodno-

matematičkog fakulteta u Nišu i Univerziteta Pierre et Marie Curie, Pariz, Francuska.

Objavila je rad u „Hemijskom pregledu” u saradnji sa profesorkom dr Ružicom

Nikolić. Prezentovala je radove na 2. i 3. konferenciji Mladih hemičara Srbije (u saradnji sa

profesorima dr Gordanom Stojanović i dr Nikom Radulović), a rezultati prezentovani na 3.

konferenciji Mladih hemičara Srbije su deo ovog master rada.

Rad objavljen u nacionalnom naučnom časopisu (M53):

1. Tasić, M.; Nikolić, R. Biološki značaj nikla, Hemijski pregled 2016, 57, 3.

Radovi saopšteni na nacionalnim naučnim skupovima objavljenim u izvodu (M64):

2. Tasić, M.; Radulović, N. „Zelena” sinteza i potpuna asignacija 1H- i

13C-NMR spektara

svih stereoizomernih oksima 3,7-dimetil-2,6-oktadienalâ, Kratki izvodi radova Treće

konferencije mladih hemičara Srbije, Belgrade, Serbia, October 24, 2015, 59.

3. Tasić, M.; Stojanović, G. Izolovanje i identifikacije alkaloida iz biljke Sedum acre L.,

Programme and Book of Abstracts of the 51st Meeting of the Serbian Chemical Society and

2nd

Conference of the Young Chemists of Serbia, Niš, Serbia, June 5 – 7, 2014, 139.

Documents

cija · Прилог 5/1 ПРИРОДНo - mАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА