1. Principi LDg PGI: dlake nokta kože sluzokože oka uva

1. Principi LDg PGI: dlake nokta kože sluzokože oka uva

Cilj nastave:

2. Principi LDg IGI:

aglutinacija, precipitacija, ELISA, PCR, PH

invazivna aspergiloza (IA) invazivna kandidijaza (IC) zigomikoze Pneumocystis pneumonija

2. Principi LDg IGI:

aglutinacija, precipitacija, ELISA, PCR, PH

invazivna aspergiloza (IA) invazivna kandidijaza (IC) zigomikoze Pneumocystis pneumonija

3. Metode identifikacije gljiva

Metode ispitivanja

osetljivosti gljiva na AM Difuzija Dilucija Etest

3. Metode identifikacije gljiva

Metode ispitivanja

osetljivosti gljiva na AM Difuzija Dilucija Etest

4. Epidemiologija GI

Rizične grupe pacijenata Endemske GI

(bifazne i subkutane mikoze)

Mikoalergeni i mikoalergoze Mikotoksini i mikotoksikoze

4. Epidemiologija GI

Rizične grupe pacijenata Endemske GI

(bifazne i subkutane mikoze)

Mikoalergeni i mikoalergoze Mikotoksini i mikotoksikoze

STANDARDNE MIKOLOŠKE METODE (KONVENCIONALNE METODE)

1. MIKROSKOPSKI PREGLED BOLESNICKOG MATERIJALA

direkni mikroskopski preparat(DMP) patohistologija (PH)

2. IZOLACIJA GLJIVA IZ BOLESNICKOG MATERIJALA

m i k o l o š k a k u l t u r a (MK)

STANDARDNE MIKOLOŠKE METODE (KONVENCIONALNE METODE)

1. MIKROSKOPSKI PREGLED BOLESNICKOG MATERIJALA

direkni mikroskopski preparat(DMP) patohistologija (PH)

2. IZOLACIJA GLJIVA IZ BOLESNICKOG MATERIJALA

m i k o l o š k a k u l t u r a (MK)

OSNOVNI PRINCIPI LABORATORIJSKE DIJAGNOZE GI

IMUNOLOŠKE METODEDOKAZIVANJE ANTITELA (At)

DOKAZIVANJE ANTIGENA (Ag)

DOKAZIVANJE BIOMARKERA

IMUNOLOŠKE METODEDOKAZIVANJE ANTITELA (At)

DOKAZIVANJE ANTIGENA (Ag)

DOKAZIVANJE BIOMARKERA

MOLEKULARNE METODEDOKAZIVANJE DNK (PCR)

MOLEKULARNE METODEDOKAZIVANJE DNK (PCR)

DOKAZANA GIDOKAZANA GI VEROVATNA/MOGUĆA GIVEROVATNA/MOGUĆA GI

“z l a t n i s t a n d a r d”“z l a t n i s t a n d a r d”

STANDARDNE MIKOLOŠKE METODE

(KONVENCIONALNE METODE)

• HEMOKULTURA NA GLJIVE

• BIOPSIJA

STANDARDNE MIKOLOŠKE METODE

(KONVENCIONALNE METODE)

• HEMOKULTURA NA GLJIVE

• BIOPSIJA

OSNOVNI PRINCIPI LABORATORIJSKE DIJAGNOZE IGI

“non culture” metode – izbor za LDg IGI

IMUNOLOŠKE METODE

DOKAZIVANJE At

DOKAZIVANJE Ag gljiva

DOKAZIVANJE BIOMARKERA

IMUNOLOŠKE METODE

DOKAZIVANJE At

DOKAZIVANJE Ag gljiva

DOKAZIVANJE BIOMARKERA

MOLEKULARNE METODE

DOKAZIVANJE DNK (PCR)

MOLEKULARNE METODE

DOKAZIVANJE DNK (PCR)

Problem: retko pozitivne, invazivna metoda uzorkovanja, spore

Problem: retko pozitivne, invazivna metoda uzorkovanja, spore

Prednost: Rana Dg IGI

Senzitivne

Brze

Prednost: Rana Dg IGI

Senzitivne

Brze

Prednost:Rana Dg IGI

Visoko senzitivne

Brze

Prednost:Rana Dg IGI

Visoko senzitivne

Brze

Prednost: DOKAZANA IGIPrednost: DOKAZANA IGI

Problem: interpretacija nalaza At kod imunodeficijentnih osoba

Problem: interpretacija nalaza At kod imunodeficijentnih osoba

Problem: lako moguća kontaminacija uzoraka

Nisu standardizovane

Problem: lako moguća kontaminacija uzoraka

Nisu standardizovane

MikologijaKlinička

slikaFaktori

domaćina + + Verovatna IGI=

= Dokazana IGI MikologijaKlinička

slikaFaktori

domaćina + +

tkivo

Mikologija+Faktori domaćina

Negativna

Klinička slika+Faktori

domaćina

NegativnaNije

radjena=

=

Moguća IGI

Nova strategija dijagnoze IGI*

*EORTC/MSG kriterijumi*EORTC/MSG kriterijumi

Idealan dijagnostički test

• Senzitivan i specifičan• Visoka pozitivna prediktivna vrednost (PPV)• Visoka negativna prediktivna vrednost (NPV)• Jednostavan• Jeftin• Brz

• Senzitivan i specifičan• Visoka pozitivna prediktivna vrednost (PPV)• Visoka negativna prediktivna vrednost (NPV)• Jednostavan• Jeftin• Brz

Zašto “non cultural” metode (detekcija biomarkera)???

Principi testova

• Antigeni and antitela se lakše otkrivaju nego same gljive

Zašto biomarkeri?

Antitela se produkuju u velikoj količini i cirkulišuAntitela se produkuju u velikoj količini i cirkulišu

Solublni Ag gljiva često prolaze iz tkiva u cirkulaciju

Solublni Ag gljiva se nalaze i u urinu

Solublni Ag gljiva se mogu detektovati i kada su male količine

Solublni Ag gljiva često prolaze iz tkiva u cirkulaciju

Solublni Ag gljiva se nalaze i u urinu

Solublni Ag gljiva se mogu detektovati i kada su male količine

Kultura na gljive ima nisku senzitivnos:zbog malog broja gljiva u tkivu ili krvi – neophodan veći broj uzoraka

Kultura na gljive ima nisku senzitivnos:zbog malog broja gljiva u tkivu ili krvi – neophodan veći broj uzoraka

Ćelijski zid

Citoplazmatska membrana

Metaboliti

DNK/RNK

Candida Aspergillus Metode

Mannans1,3--D-glucanschitin

EnolaseHSP-90

arabinitol

C-14 lanosterol demethylaseChitin synthaseActinAspartate proteinaseRibosomal RNA

Galactomannan1,3--D-glucanschitin

D-mannitol

C-14-lanosterol demethylaseAlkaline proteaseMitochondrial DNAHSP-90Ribosomal RNA genes

LAELISARIAAmebocid lizatSpectrofotometrija

PCR

GLCMas. spektroskop.

ELISAImmunoblot

Biomarkeri gljiva i “non culture” metode

Strukture gljiva

“Non cultural” metode (aglutinacija, imunodifuzija, ELISA)

Principi Ag-At testova

Antigen Test

+

Latex obložen At Uzorak

(+) Ag gljiva

Antibody Test

Latex obložen Ag Uzorak (+) At na gljiva

+

Lateks aglutinacija (LA) – princip testa

Aglutinat

Aglutinat

Lateks aglutinacija (LA) – primena

Primena testa – detekcija Ag: Galaktomanan – Aspergillus Ag (IA*)

Manan – Candida Ag (IK**)

Glukuroksilomanan – Cryptococcus Ag

Primena testa – detekcija Ag: Galaktomanan – Aspergillus Ag (IA*)

Manan – Candida Ag (IK**)

Glukuroksilomanan – Cryptococcus Ag

Primena testa – detekcija At: Anti-galaktomanan-At

Anti-manan-At

Anti-glukuroksilomanan-At

Primena testa – detekcija At: Anti-galaktomanan-At

Anti-manan-At

Anti-glukuroksilomanan-At

LA – interpretacija nalaza LA – interpretacija nalaza *Invazivna aspergiloza

** Invazivna kandidijaza

*Invazivna aspergiloza

** Invazivna kandidijaza

Immunobiology, 4th Edition

Imunodifuzija (ID) – princip testa

Con

cent

rati

on

Imunodifuzija (ID) - princip testa

Con

cent

rati

on

Imunodifuzija (ID) - princip testa

Kub

y Im

mun

olog

y, 4

th E

diti

on

Imunodifuzija (ID) - princip testa

Kub

y Im

mun

olog

y, 4

th E

diti

on

Imunodifuzija (ID) - princip testa

Kub

y Im

mun

olog

y, 4

th E

diti

on

Imunodifuzija (ID) - princip testa

Imunodifuzija (ID) – primena

Primena:

aspergiloza (Ag, IgG)

subkutane mikoze (Ag, IgG)

endemske mikoze (Ag, IgG)

Primena:

aspergiloza (Ag, IgG)

subkutane mikoze (Ag, IgG)

endemske mikoze (Ag, IgG)

Pozitivan nalaz - precipitacijaPozitivan nalaz - precipitacija

Sandwich ELISA

Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija Ag gljiva

Sandwich ELISA

Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

Add Specimen

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija Ag gljiva

Sandwich ELISA

Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

Add Specimen

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija Ag gljiva

Sandwich ELISA

Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

Add SpecimenContaining Ag

Primena testa: • Galaktomanan – Aspergillus Ag (IA)• Manan – Candida Ag (IK)

• Glukuroksilomanan – Cryptococcus Ag

Primena testa: • Galaktomanan – Aspergillus Ag (IA)• Manan – Candida Ag (IK)

• Glukuroksilomanan – Cryptococcus Ag

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)princip testa - detekcija Ag

Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija At

Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

(Specimen)

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija At

Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

(Specimen)

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija Ag

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija At

Primena testa: • anti-Aspergillus IgA, IgM, IgG, IgE (IA, aspergilom, ABPA, astma)

• anti-Candida (IK) IgA, IgM, IgG

• anti-Cryptococcus IgM, IgG

• Specifična At pri sumnji na endemske mikoze

Primena testa: • anti-Aspergillus IgA, IgM, IgG, IgE (IA, aspergilom, ABPA, astma)

• anti-Candida (IK) IgA, IgM, IgG

• anti-Cryptococcus IgM, IgG

• Specifična At pri sumnji na endemske mikoze

“Non cultural” metode (PCR)

Principi PCR testa

Primena: Aspergiloza Kandidijaza Pneumocistis pneumonija

PCR ZA DIJAGNOZU IGI NIJE STANDARDIZOVAN!!!

Uzorci:

• krv

• serum

• tkivo

• BAL

• CSF

Uzorci:

• krv

• serum

• tkivo

• BAL

• CSF

Protokoli

• DNK ekstrakcije

• PCR dizajn

• Amplifikacije

Protokoli

• DNK ekstrakcije

• PCR dizajn

• Amplifikacije

Species/genus

specifične sekvence• HSP 90 • Lanosterol• demethylase • chitin synthase • aspartic proteinase• actin

Species/genus

specifične sekvence• HSP 90 • Lanosterol• demethylase • chitin synthase • aspartic proteinase• actin

Automatizovan metod izdvajanja DNK gljiva iz krvi

Ekstrakcija DNK

• Automatizovana

• Trajanje testa 16 h - 4 h

• In vitro osetljivost (1cfu/ml)

Ekstrakcija DNK

• Automatizovana

• Trajanje testa 16 h - 4 h

• In vitro osetljivost (1cfu/ml)

Kontaminacija (problem)

• tokom ekstrakcija

• tokom izvođenje testa

• tokom priprema proba

• tokom priprema reagenasa

Okolina!!!

Kontaminacija (problem)

• tokom ekstrakcija

• tokom izvođenje testa

• tokom priprema proba

• tokom priprema reagenasa

Okolina!!!

Metode patohistologije u dijagnozi IGI

Specijalna bojenja na gljive

GLJIVE - specijalna bojenja (HP)

Gomori methenamin silver (GMS):

Prednost: dobra vizuelizacija gljiva

Gljive: tamno braon – osnova zelena

Gomori methenamin silver (GMS):

Prednost: dobra vizuelizacija gljiva

Gljive: tamno braon – osnova zelena

H&E:

Prednost: dobro detektuje zapaljenski odgovor

Nedostatak: loša vizuelizacija gljiva

H&E:

Prednost: dobro detektuje zapaljenski odgovor

Nedostatak: loša vizuelizacija gljiva

Periodic acid-Shiff (PAS):

Prednost: dobra vizuelizacija gljiva

Gljive: crvene ili ružičaste – osnova zelena

Periodic acid-Shiff (PAS):

Prednost: dobra vizuelizacija gljiva

Gljive: crvene ili ružičaste – osnova zelena

Mucin (mucicarmin):

Prednost: dobra vizuelizacija kapsule gljiva

Kapsula: ružičasta – osnova sivo-roze

Mucin (mucicarmin):

Prednost: dobra vizuelizacija kapsule gljiva

Kapsula: ružičasta – osnova sivo-roze

Fontana-Masson:

Prednost: dobra vizuelizacija ĆZ gljiva i melanina

Gljive/melanin: tamnobraon – osnova svetla

Fontana-Masson:

Prednost: dobra vizuelizacija ĆZ gljiva i melanina

Gljive/melanin: tamnobraon – osnova svetla

Gljive – histopatologija (HP)

Hope et al., Lancet Infectious Diseases 5: 609, 2005

H&EH&EGMSGMS

Pluća (mucikarmin) Pluća (mucikarmin)

Gljive – histopatologija (HP)

Pluća (PAS)Pluća (PAS)

Imunohistohemija (mAt)

WF-AF-1 (Dako)

EB-A1 (Dako)

Imunohistohemija (mAt)

WF-AF-1 (Dako)

EB-A1 (Dako)

Gljive – imunohistopatologija (IHP)

Choi JK, Am J Clin Pathol 121: 18, 2004

Pneumocystis jirovecii - Gimza

Mikroskopski nalaz oktetnih cisti (400X)

BAL, biopsija plućnog tkiva

Mikroskopski nalaz oktetnih cisti (400X)

BAL, biopsija plućnog tkiva