Cinetica enzimatica

Cenni alla cinetica delle reazioniCenni alla cinetica delle reazioni

• Velocita’ di reazione• Reazioni di I° e II° ordine• Molecolarita’ di una reazione• Molecolarita di una reazione• t1/2• Velocita’ e costanti di equilibrio

CINETICA ENZIMATICACINETICA ENZIMATICAOVVERO:

LO STUDIO DELLA VELOCITA’ DI REAZIONE

FATTORI CHE INFLUENZANO LA VELOCITA’ DI REAZIONE:

-Concentrazione del substrato

-Concentrazione dell’enzima

-pH

-Temperatura

-Inibitori, Attivatori

-Concentrazione dei Sali (forza ionica)Co ce t a o e de Sa ( o a o ca)

La velocità di una reazione i ti i f i d llenzimatica in funzione della

concentrazione del substratoconcentrazione del substrato

(D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3° ed., John Wiley & Sons, 2004)

Teoria di Michaelis e Menten

Teoria di Briggs e Haldane

(Teoria dello “stato stazionario”)(Teoria dello stato stazionario )

E + S ES E + P

(D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3° ed., John Wiley & Sons, 2004)

E + S ES E + P k1 k2

kDove: k2 = kcat

k-1 e se: k2 ≥ k-1

[ ] [ ][ ] [ ] [ ]ESd[ ] [ ][ ] [ ] [ ]ESkESkSEkdtESd

1210 −−−==

[ ] [ ] [ ]ESEE =:conosostituend [ ] [ ] [ ]ESEE −= 0:con osostituend

[ ] [ ][ ]kk

SEES+

= 0 ma poiché: [ ]ESkv cat=[ ][ ]S

kkk

++ −

1

12p [ ]cat

[ ][ ]SEk 0[ ][ ][ ]S

kkk

SEkv cat

++

=−

1

12

0

k1

Questa è l’equazione di Michaelis-Menten, dove:12 kkK −+

1

12

kKM =

Equazione di Michaelis e Menten

[ ][ ]SEkv cat= 0

[ ]SKv

M +=

dove: [ ] max0 VEkcat =

La concentrazione del substrato alla quale max21 Vv =2

è denominata MK , la costante di Michaelis.

Notare che a basse [S] , dove [S] << KM :

[ ][ ]SEk cat [ ][ ]SEK

vM

cat0=

Poiché KS per la dissociazione di [ES] è uguale a si ha: 1

1

kk−

2k

E’ chiaro che quando k 1>> k2 l’equazione si semplifica a:

1

1

2

kkKK SM +=

E chiaro che quando k-1>> k2, l equazione si semplifica a:

SM KK =

[ ][ ]

:che ha si :Se max0 VEkcat =[ ][ ] :cui da max

SKSVv

M +=

[ ]

[ ] [ ]

,S

max

max

SVKS

VvKM =>>

[ ] [ ]

[ ]

, max

V

SK

vKSM

M ×=<<

[ ]2

, maxVvKS M ==

k1 k2

E + S ES E + Pk-1

Dove: k2 = kcat

e: 1

kk− = KS

<< k-1

1k[ ][ ][ ] SKES

SE= [ ]ESkv cat=[ ]ES

[ ] [ ] [ ] :cui da 0 ESEE −=

[ ] [ ][ ][ ]SKSEES

S += 0 e

[ ][ ][ ]SK

SEkvS

cat

+= 0

[ ]SK S + [ ]SKS +

Quest’ultima equazione è uguale a quella iniziale doveQuest ultima equazione è uguale a quella iniziale, dove KM è uguale alla costante di dissociazione del complesso enzima-substrato, KS .p , S

(D.L. Nelson, M.M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th ed., W.H. Freeman & Co., 2005)

Dato: [ ]max SVv = [ ][ ]

:reciprociiprendendoSK

vM +

=

[ ]111

:reciprociiprendendo

VSVKM +⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

fi di i k ( d i i i)

[ ] maxmax VSVv ⎟⎠

⎜⎝

Grafico di Lineweaver e Burk (o dei reciproci)

[ ] maxVSvKv M +−=

G fi di E di H f

[ ]S

Grafico di Eadie e Hofstee

(D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3° ed., John Wiley & Sons, 2004)

(A. Fersht, Structure and mechanism in protein science, W.H. Freeman & Co., 1999)

Il significato dei parametri di Michaelis e Menten:g pkcat :

l li i di Mi h li M i i i è l- nel semplice meccanismo di Michaelis e Menten in cui vi è un solo complesso enzima-substrato e tutte gli steps di “binding” sono veloci, kcat è semplicemente la costante di I° ordine per la conversione chimica del complesso ES nel complesso EP;

- (per reazioni più complesse, kcat è una funzione di tutte le costanti di I° ordine e non può essere assegnata a un particolare processo eccetto quando intervengano delle g p p q gsemplificazioni;)

V- , questa quantità è detta anche numero di turnover

perché rappresenta il numero massimo di molecole di substrato [ ]0

max

EVkcat =

p ppconvertite in prodotto per sito attivo nell’unità di tempo (o il numero di volte che l’enzima ‘turns over’ per unità di tempo.

KKM :

sebbene alida per il semplice meccanismo di Michaelis e Menten o in casi in-sebbene valida per il semplice meccanismo di Michaelis e Menten o in casi in cui comunque KM = KS, la vera costante di dissociazione del complesso enzima-substrato, KM può essere considerata in qualche caso come una costante di di i idissociazione apparente.-KM è unica per ogni coppia enzima-substrato. Substrati differenti che reagiscono con uno stesso enzima hanno KM differenti; così come enzimi differenti che agiscono su uno stesso substrato hanno KM differenti.-In reazioni enzimatiche dove esistono più complessi ES, KM rappresenta comunque la quantità di enzima legato sotto qualsiasi forma al substrato.I i i i K è l i d l b ll l-In tutti i casi KM è la concentrazione del substrato alla quale:

maxVv =KM è una costante di dissociazione apparente che può essere considerata come la costante di dissociazione complessiva di tutte le specie di enzima legato.

2v =

kcat/KM:

quando << KM , ES si forma in quantità minima. Di conseguenza,[ ]S[ ] [ ]EE[ ] [ ]

[ ][ ] [ ][ ]SEKk

KSEkv

EE

catcat ×≈=

≈

0

0

In questo caso, kcat/KM è la costante apparente di secondo ordine della reazione enzimatica; la velocità della reazione varia direttamente in

[ ][ ]KK MM

della reazione enzimatica; la velocità della reazione varia direttamente in proporzione a quante volte enzima e substrato si incontrano in soluzione. Questa quantità è quindi una misura dell’efficienza catalitica dell’enzima.Vi è un limite superiore al valore di kcat/KM : esso non può essere più grande di k1, cioè la decomposizione di ES a dare E +P non può avvenire con maggior frequenza di quanto E ed S si uniscono a formare EScon maggior frequenza di quanto E ed S si uniscono a formare ES.Gli enzimi più efficienti hanno valori di kcat/KM prossimi al limite di diffusione di 108 -109 M-1 x sec-1.Praticamente l’enzima catalizza una reazione ogni volta che esso incontra una molecola di substrato.

kcat : numero di micromoli di S convertite in P per secondo da una micromole di enzima operante in condizioni saturanti di Suna micromole di enzima operante in condizioni saturanti di S.

k k k k k k

KS K K’

E + S ES ES’ ES” EP’ EP” E + Pk1 k2 k3 k4 k5 k6

k 1 k 2 k 3 k 4 k 5 k 6k-1 k-2 k-3 k-4 k-5 k-6

(D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3° ed., John Wiley & Sons, 2004)

(D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3° ed., John Wiley & Sons, 2004)

(D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3° ed., John Wiley & Sons, 2004)