Diagrama mostrando a Anidrase carbónica II. A esfera cinza é um ion de zinco que funciona como cofator no sítio ativo.

CINÉTICA ENZIMÁTICACINÉTICA ENZIMÁTICA

CINÉTICA ENZIMÁTICACINÉTICA ENZIMÁTICA

CINÉTICA ENZIMÁTICACINÉTICA ENZIMÁTICAENZIMASENZIMAS APLICAÇÃO:EFEITOSAPLICAÇÃO:EFEITOS FONTEFONTEAmilasesAmilases(hidrolase) (hidrolase)

Panificação, massas e biscoitos:Modificação da Panificação, massas e biscoitos:Modificação da massas;massas;Cerveja:preparação do mosto;Cerveja:preparação do mosto;Álcool e Bebidas destiladas:sacarificação;Álcool e Bebidas destiladas:sacarificação;Auxiliar Digestivo;Auxiliar Digestivo;Amido Modificado para Alimentos.Amido Modificado para Alimentos.

FungosFungos

MalteMalteMalteMalteMalte, PâncreasMalte, PâncreasMalte, FungosMalte, Fungos

ProteasesProteases(hidrolase)(hidrolase)

Panificação, massas e biscoito:modificação da Panificação, massas e biscoito:modificação da viscosidade e textura da massa;viscosidade e textura da massa;Cerveja:estabilidade ao frio;Cerveja:estabilidade ao frio;Lavagens e Limpeza: remoção de manchas;Lavagens e Limpeza: remoção de manchas;

Peles e Couros: remoção da elastinaPeles e Couros: remoção da elastina

Carnes: amaciamentoCarnes: amaciamentoQueijos: formação da coalhada, flavorizanteQueijos: formação da coalhada, flavorizanteAlimentos Proteicos: obtenção de hidrólisadosAlimentos Proteicos: obtenção de hidrólisados

Papaína, BromelinaPapaína, BromelinaPapaína, PepsinaPapaína, PepsinaBactérias, Fungos, Bactérias, Fungos, PâncreasPâncreas

Bactérias, Fungos, Bactérias, Fungos, PâncreasPâncreasPapaína, BromelinaPapaína, BromelinaRenina, FungosRenina, FungosBactérias, PâncreasBactérias, Pâncreas

CINÉTICA ENZIMÁTICACINÉTICA ENZIMÁTICAENZIMASENZIMAS APLICAÇÃO:EFEITOSAPLICAÇÃO:EFEITOS FONTEFONTEPectinasesPectinases(hidrolase)(hidrolase)

Frutas: clarificação dos sucosFrutas: clarificação dos sucosVinhos: Clarificação, FiltraçãoVinhos: Clarificação, Filtração

FungosFungosFungosFungos

LipasesLipases(hidrolase)(hidrolase)

Lavagens, limpezas: remoção de manchas;Lavagens, limpezas: remoção de manchas;Queijos: flavorizantesQueijos: flavorizantes

Pâncreas, FungosPâncreas, FungosFungosFungos

Glicose OxidaseGlicose Oxidase(oxido-redutase)(oxido-redutase)

Alimentos: remoção de oxigênioAlimentos: remoção de oxigênio FungosFungos

CatalaseCatalase(oxido-redutase)(oxido-redutase)

Remoção de HRemoção de H22OO22: alvejante, bactericida: alvejante, bactericida Fungos, FígadoFungos, Fígado

LipoxidadeLipoxidade(oxido-redutase)(oxido-redutase)

Panificação: alvejantePanificação: alvejante Farinha de SojaFarinha de Soja

Glicose-isomeraseGlicose-isomerase(isomerase)(isomerase)

Xarope de alto teor de frutoseXarope de alto teor de frutose Bactérias, FungosBactérias, Fungos

Enzimas são proteínas (seqüência de aminoácidos) com peso molecular muito grande, e com propriedades catalíticas.

Na maioria das vezes são proteínas globulares. É mostrado na tabela 2 uma comparação entre as características das enzimas e dos catalisadores inorgânicos.

Comparação entre as enzimas e os catalisadores inorgânicos.

CARACTERÍSTICACARACTERÍSTICAENZIMASENZIMAS CATALISADORES CATALISADORES

QUÍMICOSQUÍMICOS

1 – Especificidade ao substrato1 – Especificidade ao substrato AltaAlta BaixaBaixa

2 – Natureza da estrutura2 – Natureza da estrutura ComplexaComplexa SimplesSimples

3 – Sensibilidade à temperatura3 – Sensibilidade à temperatura AltaAlta BaixaBaixa

4 – Condições de reação (T, P e pH)4 – Condições de reação (T, P e pH) SuavesSuaves Drásticas Drásticas (geralmente)(geralmente)

5 – Custo de obtenção (isolamento e purificação)5 – Custo de obtenção (isolamento e purificação) AltoAlto ModeradoModerado

6 – Natureza do processo6 – Natureza do processo Batelada/contíBatelada/contínuonuo

Batelada/contínuoBatelada/contínuo

7 – Consumo de energia7 – Consumo de energia BaixoBaixo AltoAlto

8 – Formação de subprodutos8 – Formação de subprodutos BaixaBaixa AltaAlta

9 – Reutilização do catalisador9 – Reutilização do catalisador Simples/caraSimples/cara SimplesSimples

10 – Atividade catalítica (temperatura ambiente)10 – Atividade catalítica (temperatura ambiente) AltaAlta BaixaBaixa

11- Presença de cofatores11- Presença de cofatores SimSim NãoNão

12 – Energia de ativação12 – Energia de ativação BaixaBaixa AltaAlta

13 – Velocidade de reação13 – Velocidade de reação AltaAlta BaixaBaixa

A característica mais importante das enzimas é A característica mais importante das enzimas é a elevada especificidade;a elevada especificidade;

Muitas enzimas possuem um grupo limitado de Muitas enzimas possuem um grupo limitado de substratos;substratos;

mas outras possuem uma especificidade mas outras possuem uma especificidade absoluta para um único substrato como absoluta para um único substrato como mostrado na Figura 1:mostrado na Figura 1:

Sítio ativo

Substrato Produtos

Enzima Enzima

E + S ES E + P

NOMENCLATURANOMENCLATURA nome do substrato nome do substrato ou + sufixo ou + sufixo asease reação que catalisa reação que catalisa protease (hidrolisa proteínas)protease (hidrolisa proteínas) álcool desidrogenase (catalisa a álcool desidrogenase (catalisa a

desidrogenação de um álcool)desidrogenação de um álcool) outras apresentam terminações outras apresentam terminações inaina

(tripsina, renina, bromelina etc)(tripsina, renina, bromelina etc)

CINÉTICA ENZIMÁTICACINÉTICA ENZIMÁTICA

A linha em vermelho representa a reação na ausência de catalisador;A linha em vermelho representa a reação na ausência de catalisador;A linha em azul na presença de enzima. A linha em azul na presença de enzima. S: nível de energia do(s) substrato(s); S: nível de energia do(s) substrato(s); P: nível de energia do(s) produto(s); P: nível de energia do(s) produto(s); G: energia de Gibbs; G: energia de Gibbs; R: coordenada de reação (sentidos de progressão de reação);R: coordenada de reação (sentidos de progressão de reação);ΔG'º: energia livre padrão bioquímica;ΔG'º: energia livre padrão bioquímica; ΔG‡: energia de ativação ΔG‡: energia de ativação S-P: do(s) substrato(s); S-P: do(s) substrato(s); P-S: do(s) produto(s)). P-S: do(s) produto(s)).

CINÉTICA ENZIMÁTICACINÉTICA ENZIMÁTICA

A cinética enzimática é o estudo do mecanismo pelo qual as enzimas se ligam aos substratos, transformando-os em produtos.São utilizados dados sobre a velocidade de reação de enzimas através de ensaios enzimáticos.

Mecanismo de reação de uma enzima com substrato único. A enzima (E) liga o substrato (S) e liberta o produto (P).

Cinética de Michaelis–Menten

Curva de saturação para uma enzima mostrando a relação entre a concentração do substrato e a velocidade de reação;As reações catalisadas por enzimas são saturáveis, e a sua velocidade de catálise não indica uma resposta linear face ao aumento de substrato. Se a velocidade inicial da reação é medida sobre uma escala de concentrações de substrato [S]);a velocidade de reação (v), aumenta com o acréscimo de [S]. A medida que [S] aumenta, a enzima satura-se e a velocidade atinge o valor máximo Vmax.

A saturação acontece porque, à medida que aumenta a concentração de substrato, aumenta também a quantidade de enzima na forma do complexo enzima-substrato (ES). À velocidade máxima (Vmax), todos os centros ativos estão ocupados (saturados) com substrato, ou seja, não existe enzima livre para ligar mais substrato;A concentração do complexo (ES) é igual à concentração de enzima.

CINÉTICA ENZIMÁTICACINÉTICA ENZIMÁTICA

CINÉTICA ENZIMÁTICACINÉTICA ENZIMÁTICAA atividade de uma enzima é geralmente descrita através de (Vmax ) e também da constante de Michaelis-Menten (KM), que representa a concentração do substrato detectado a uma velocidade de reação igual a metade de (1/2*Vmax)

Cada enzima possui um KM característico (kcat) para um dado substrato; este parâmetro é muitas vezes usado para demonstrar a força de ligação de um substrato à enzima.

É também usada outra constante cinética, kcat, para descrever o comportamento de uma enzima, representando o número de moléculas de substrato que podem ser catalisadas por centro ativo por segundo.

CINÉTICA ENZIMÁTICACINÉTICA ENZIMÁTICA

.

EnzimaEnzima SubstratoSubstrato KKmm (mM) (mM)

CatalaseCatalase HH22OO22 2525

HexoquinaseHexoquinase GlicoseGlicoseFrutoseFrutose

0,150,151,51,5

Glutamato Glutamato DesidrogenaseDesidrogenase

GlutamatoGlutamatoAlfa-cetoglutaratoAlfa-cetoglutaratoAmônicaAmônica

0,120,122,02,05757

Aspartato Aspartato aminotransferaseaminotransferase

AspartatoAspartatoAlfa-cetoglutaratoAlfa-cetoglutaratoOxalacetatoOxalacetatoGlutamatoGlutamato

0,90,90,10,10,040,044,04,0

No modelo da cinética de Michaelis-Menten de uma reação com um substrato existe uma reação bimolecular inicial entre a enzima E e o substrato S para formar o complexo ES. Embora o mecanismo enzimático para a reação unimolecular                              possa ser bastante complexo, há tipicamente um passo na determinação da velocidade que permite que se modele o mecanismo como um passo catalítico simples de velocidade constante k2.

            (Eq. 1).

k2 também é o valor máximo de reações enzimáticas catalisadas por segundo.

Com baixas concentrações de substrato [S], a enzima permanece em equilíbrio entre a forma livre E e o complexo enzima-substrato ES;

Aumentando [S] aumenta [ES] à custa de [E], mudando o equilíbrio para o lado direito.

Uma vez que a velocidade de reação depende da concentração [ES], a velocidade é sensível a pequenas alterações de [S];Altos valores de [S], a enzima fica totalmente saturada com substrato, e existe apenas na forma ES. Nestas condições, a velocidade (v≈k2[E]tot=Vmax) é insensível a pequenas alterações de [S]; assim, [E]tot é a concentração total enzimática

que é aproximadamente igual à concentração [ES] em condições de saturação.

A equação de Michaelis–Menten[7] descreve como a velocidade de reação v depende da posição do equilíbrio ligado ao substrato e da constante de velocidade k2. Michaelis e Menten mostraram que se k2 for bem menor que k-1 (chamada a aproximação de equilíbrio), pode obter-se a seguinte equação:

A constante de Michaelis Km é definida como a concentração para a qual a velocidade da reação enzimática é a metade de Vmax.Isto pode verificar-se ao substituir Km = [S] na equação de Michaelis-Menten. Se o passo para determinação da velocidade for lento, quando comparado com a dissociação do substrato (k2 << k-1), então a constante de Michaelis Km é aproximadamente à constante de dissociação do complexo ES, embora tal situação seja relativamente rara.

A situação mais normal dá-se quandok2 > k-1 as vezes chamada como cinética de Briggs-Haldane; A equação ainda se verifica em condições mais gerais, como provém da aproximação ao estado estacionário;Durante o período inicial, a velocidade de reação v é relativamente constante, indicando que [ES] é também aproximadamente constante (cf. equação 1):

A concentração de [ES] é dada por:

em que a constante de Michaelis Km é definida por:

[E] é a concentração de enzima livre);.

Em conjunto, a fórmula geral para a

velocidade de reação v vem pela equação de Michaelis-Menten:

A constante de especificidade kcat / Km é uma medida da eficiência de conversão pela enzima do substrato em produto.Usando a definição da constante de Michaelis Km, a equação pode ser escrita na forma:

O gráfico de velocidade face a [S] não é linear. Embora a baixas concentrações de substrato se mantenha linear, vai curvando à medida que aumenta a concentração de substrato. Antes da chegada dos computadores, que permitem ajustar regressões não lineares de forma simples, podia chegar a ser realmente difícil estimar os valores de Km e Vmax nos gráficos não lineares. Então vários pesquisadores concentrassem os seus esforços em desenvolver métodos de linearização da equação de Michaelis-Menten, dando como resultado o gráfico de Lineweaver-Burke

O gráfico de Lineweaver-Burk ou representação de duplo recíproco é a forma mais comum, e simples,de mostrar os dados da cinética enzimática.Para tal, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da equação de Michaelis-Menten. Como se pode ver na figura, o resultado deste tipo de representação é uma linha reta cuja equação é a da reta, sendo o ponto de interceção entre a reta e o eixo das ordenadas equivalente a 1/Vmax, e o ponto de intercepção entre a reta e o eixo de abcissas equivalente a -1/Km.

O gráfico de Lineweaver-Burke mostra o significado dos pontos de interceção entre a reta e os eixos de ordenadas, e do gradiente da velocidade.

INIBIÇÃO ENZIMÁTICAINIBIÇÃO ENZIMÁTICA

Esquema cinético para inibidores enzimáticos reversíveis.E=Enzima;S=Substrato;ES=Complexo;P=Produto; I=Inibidor

[P]

e

[S]

Tempo

Produto

Substrato

FATORES DE INIBIÇÃO ENZIMÁTICAFATORES DE INIBIÇÃO ENZIMÁTICA

[P] [E]1

[E]2

[E]1>[E]2>[E]3>[E]4

[E]3

[E]4

Tempo

FATORES DE INIBIÇÃO ENZIMÁTICAFATORES DE INIBIÇÃO ENZIMÁTICAInfluência da Concentração da EnzimaInfluência da Concentração da Enzima

O modelo cinético de Michaelis e Menten é utilizado para explicar O modelo cinético de Michaelis e Menten é utilizado para explicar matematicamente a influência da concentração do substrato na matematicamente a influência da concentração do substrato na cinética da reação enzimática. cinética da reação enzimática.

Essa teoria admite que inicialmente, a enzima e o substrato reagem Essa teoria admite que inicialmente, a enzima e o substrato reagem reversívelmente, formando um composto intermediário denominado reversívelmente, formando um composto intermediário denominado “complexo enzima-substrato” que por sua vez decompõe ou “complexo enzima-substrato” que por sua vez decompõe ou regenera a enzima e forma os produto da reação.regenera a enzima e forma os produto da reação.

k1k1 E + S ESE + S ES k2k2

k3k3 ES E + P ES E + P VV onde k1 = constante de velocidade de formação do complexoonde k1 = constante de velocidade de formação do complexo k2 = constante de velocidade de dissociação do complexok2 = constante de velocidade de dissociação do complexo k3 = constante de velocidade de decomposição do complexo k3 = constante de velocidade de decomposição do complexo

formando os produtos da reaçãoformando os produtos da reação V = velocidade de formação dos produtosV = velocidade de formação dos produtos

FATORES DE INIBIÇÃO ENZIMÁTICAFATORES DE INIBIÇÃO ENZIMÁTICAInfluência da Concentração de SubstratoInfluência da Concentração de Substrato

Consideremos um caso simples, caracterizado pelas Consideremos um caso simples, caracterizado pelas seguintes hipóteses:seguintes hipóteses:

a)a) Complexo ES (1mol de enzima para 1 mol de Complexo ES (1mol de enzima para 1 mol de substrato)substrato)

b)b) O complexo formado se decompõe, sem reagir com O complexo formado se decompõe, sem reagir com outras substâncias existentes no sistemaoutras substâncias existentes no sistema

c)c) Fazendo X = ES logo a variação da concentração de Fazendo X = ES logo a variação da concentração de X com o tempo (dX/dt) será:X com o tempo (dX/dt) será:

dX/dt = kdX/dt = k11.E.S – k.E.S – k22X – kX – k33X X eq. 01 eq. 01 fazendo Et = E + X logo E = Et – Xfazendo Et = E + X logo E = Et – X fazendo St = S + X logo S = St – Xfazendo St = S + X logo S = St – X onde St = quantidade de substrato total adicionada ao onde St = quantidade de substrato total adicionada ao

sistemasistema S = quantidade de substrato não associada ao S = quantidade de substrato não associada ao

complexo EScomplexo ES Et = quantidade de enzima total adicionada ao Et = quantidade de enzima total adicionada ao

sistemasistema E = quantidade de enzima não associada ao E = quantidade de enzima não associada ao

complexo EScomplexo ES

Substituindo os valores de E e de S na eq. 01 Substituindo os valores de E e de S na eq. 01 vem:vem:

eq. 02eq. 02 supondo que as concentrações de substrato são supondo que as concentrações de substrato são

muito maiores que as de enzima e portanto muito maiores que as de enzima e portanto muito maiores que as do complexo, o que é muito maiores que as do complexo, o que é comum na práticacomum na prática

ES<<S>>EES<<S>>E Então pela eq. 02 vem:Então pela eq. 02 vem: eq. 03eq. 03

XkXkXtSXtEkdtdX

32))((1 −−−−=

XkktSXtEkdtdX )32()(1 +−−=

Supondo, ainda que boa parte da reação Supondo, ainda que boa parte da reação se desenvolve mantendo-se constante a se desenvolve mantendo-se constante a concentração do complexo no tempo concentração do complexo no tempo (estado estacionário) ou seja (estado estacionário) ou seja dX/dt = 0dX/dt = 0

XkkXESk tt )()( 321 +=−

32

)(1kk

XtEtSkX+

−=

mkXtStEtS

kkkXtEtSX −=

+−=

1/)32()(

1k÷

onde = constante de Michaelis e onde = constante de Michaelis e Menten que pode indicar o grau de Menten que pode indicar o grau de

afinidade da enzima pelo substrato, ou afinidade da enzima pelo substrato, ou seja, quanto maior a afinidade da enzima seja, quanto maior a afinidade da enzima pelo substrato menor é o valor de kmpelo substrato menor é o valor de km

isolando isolando XX

132

kkk

mk +=

mktEtS

mkXtSX =+

mktEtS

mktSX =

+1

+

=

mktSmk

tEtSX1

1.

+=

mktSmkmk

tEtSX 1.

( )tSmkmk

mktEtSX

+= .

tSmktEtSX

+=

fazendo fazendo St = SSt = S e e Et = EEt = E vem, vem,

SmkSEX

+= eq. 04

Sabendo que a velocidade da reação enzimática é

V = K3X eq. 05Substituindo a eq. 04 na eq. 05 vem,

SmkESkV

+= 3

Fazendo K3E = Vmax = Velocidade máxima de formação de produtos correspondente a situação em que toda enzima se encontra na forma ES vem:

SmkSVV

+= max eq. 06

Esta equação é chamada equação de Michaelis e Menten.

SmkSVV

+= max

Vmax

Vmax/2 (1)

(2) (3)

Na região (1) do gráfico a velocidade da reação é uma função crescente da concentração do substrato, até um determinado valor desta concentração (ponto 2) que a partir do qual a velocidade se mantém constante (região 3).O tipo desta curva é análogo aos fenômenos de saturação que pode ser melhor compreendido analisando o próximo gráfico.

km S

Situação antes do EquilíbrioSituação antes do Equilíbrio Situação no EquilíbrioSituação no Equilíbrio % da V% da Vmaxmax

EE SS E + S E + S ⇔⇔ ES ES

25%25%

50%50%

75%75%

100%100%

100%100%

Quando a concentração do substrato é tal Quando a concentração do substrato é tal que a velocidade de reação é metade da que a velocidade de reação é metade da velocidade máxima teremos:velocidade máxima teremos:

[S]K[S]

21

m +=

Km + [S] = 2[S]Km = [S]

Como se sabe o valor de Km é inversamente proporcional a afinidade da enzima pelo substrato. Desta forma podemos comparar a afinidade da Enzima1 com a da Enzima2 no gráfico:

Vmax

Vmax/2

S Km1 Km2

Km2 > Km1

portanto, a afinidade da enzima1 pelo

substrato S é maior que a da enzima2

Enzima1

Enzima2

A forma precisa de determinar A forma precisa de determinar VVmaxmax e e kkmm

a partir de dados experimentais é pela a partir de dados experimentais é pela equação de Lineweaver-Burk;equação de Lineweaver-Burk;

Resultado da inversão da equação 4 de Resultado da inversão da equação 4 de Michaelis e Menten, como já visto Michaelis e Menten, como já visto anteriormente:anteriormente:

eq. 07eq. 07

SVmk

VV1.

maxmax

11 +=

que trata-se da equação de uma reta que trata-se da equação de uma reta representada pela figura a seguir.representada pela figura a seguir.

1/v

1/vMAX

km/Vmáx

1/S1v

1vMAX

+= kmVmáx*

1S

ATIVIDADE ENZIMÁTICAATIVIDADE ENZIMÁTICA A velocidade da reação pode também ser A velocidade da reação pode também ser

expressa em termos de sua atividade expressa em termos de sua atividade enzimática, que é a quantidade de produto enzimática, que é a quantidade de produto formado em um certo tempo pela quantidade de formado em um certo tempo pela quantidade de enzima utilizada. enzima utilizada.

A atividade de uma enzima é definida A atividade de uma enzima é definida especificamente para cada caso estudado.especificamente para cada caso estudado.

A CONSTANTE CATALÍTICA é definida para se A CONSTANTE CATALÍTICA é definida para se estudar a eficiência da catálise enzimática. estudar a eficiência da catálise enzimática.

[E]Vk max

cat =

kkcatcat equivale ao número máximo de equivale ao número máximo de moléculas de substrato que um moléculas de substrato que um centro ativo converte em produto por centro ativo converte em produto por segundo; segundo;

Como exemplo, podemos tomar a Como exemplo, podemos tomar a enzima catalase com enzima catalase com

kkcatcat = 10 = 1077 s s-1-1; ; portanto esta enzima é capaz de portanto esta enzima é capaz de

originar 10 000 000 moléculas originar 10 000 000 moléculas de produto por segundo. de produto por segundo.

A inibição enzimática pode ser reversível ou A inibição enzimática pode ser reversível ou irreversívelirreversível

O O inibidor irreversívelinibidor irreversível forma um complexo estável com forma um complexo estável com a enzima não podendo ser removido para recuperar a a enzima não podendo ser removido para recuperar a enzima ativa.enzima ativa.

ExemploExemplo: metais pesado (Hg), agentes complexantes : metais pesado (Hg), agentes complexantes de metais (CN)de metais (CN)

A A inibição reversívelinibição reversível é caracterizada por uma é caracterizada por uma constante de equilíbrio kconstante de equilíbrio k ii, que é medida pela afinidade , que é medida pela afinidade do inibidor com a enzima.do inibidor com a enzima.

Três formas simples de inibição podem ser descritas:Três formas simples de inibição podem ser descritas: Pelo substrato (reversível)Pelo substrato (reversível) Competitiva (reversível)Competitiva (reversível) Não competitiva (irreversível)Não competitiva (irreversível)

FATORES DE INIBIÇÃO ENZIMÁTICAFATORES DE INIBIÇÃO ENZIMÁTICAInfluência da Concentração de SubstratoInfluência da Concentração de Substrato

FATORES DE INIBIÇÃO ENZIMÁTICAFATORES DE INIBIÇÃO ENZIMÁTICAInfluência da Concentração de SubstratoInfluência da Concentração de Substrato

Inibidores enzimáticos são moléculas que reduzem ou eliminam a atividade das enzimas.Podem ser de dois tipos:Reversíveis: quando a remoção do inibidor restaura a atividade enzimática;classificados como competitivos, acompetitivos, não-competitivos e mistos, segundo o efeito que produzam nas constantes cinéticas Km e Vmax.Este efeito dependerá da união do inibidor à enzima E, ao complexo

enzima-substrato ES ou a ambos.

Irreversíveis: quando o inibidor inativa de modo permanente a enzima.Geralmente produzem modificações covalentes de resíduos do centro catalítico da enzima. Estas reações decaem de forma exponencial e são habitualmente saturáveis. Abaixo dos níveis de saturação, mantêm uma cinética de primeira ordem em relação ao inibidor.

INIBIÇÃO ENZIMÁTICAINIBIÇÃO ENZIMÁTICA

Esquema cinético para inibidores enzimáticos reversíveis.

kk11

E + S ESE + S ES kk22

kk33

ES + S ES2 (Complexo não reativo)ES + S ES2 (Complexo não reativo) kk44

kk55

ES E + PES E + P VV

S

Vmax

V

ikSSmk

SVV 2max

++

=

eq. 08

onde ki é a constante de inibição; Para encontrar as constantes faz-se a inversão segundo Lineweaver-Burk

Influência do Excesso de SubstratoInfluência do Excesso de Substrato

SiKVSV

mkVV max

11.maxmax

11 ++=

Km/vmax

1/S-1/km

1/V

Eq. 9

1ª Hipótese:para valores de S<<ki a eq. 09 se

reduz em,

SVmk

VV1.

maxmax

11 +=

X

SiKVSV

mkVV max

11.maxmax

11 ++=

1/vmaxKi

S

1/Vmax

1/V

Eq. 9

2ª Hipótese:para valores de S>>km a eq. 09 se

reduz em,

SiKVVV max

1

max

11 +=

Os valores de Vmax determinados em ambos os gráficos devem ser próximos.

X

Diz-se que um inibidor competitivo reage com a Diz-se que um inibidor competitivo reage com a enzima como se fosse um outro substrato. enzima como se fosse um outro substrato.

Indicando-se com Indicando-se com ΙΙ a fórmula molecular de um a fórmula molecular de um inibidor competitivo, a teoria de Michaelis e inibidor competitivo, a teoria de Michaelis e Menten fornece:Menten fornece:

kk11 k k33

E + S ES ES E + PE + S ES ES E + P kk2 2 V V kk44

E + E + ΙΙ E EΙΙ E EΙΙ E + P’ E + P’ kk5 5 k k66

INIBIÇÃO ENZIMÁTICAINIBIÇÃO ENZIMÁTICA

Esquema cinético para inibidores enzimáticos reversíveis.

O complexo EO complexo EΙΙ (Enzima-Inibidor) pode ou (Enzima-Inibidor) pode ou não formar produto, porém quando o não formar produto, porém quando o inibidor forma o complexo Einibidor forma o complexo EΙΙ fica fica impedindo que o substrato S entre em impedindo que o substrato S entre em contato com a enzima E.contato com a enzima E.

A velocidade de formação do produto A velocidade de formação do produto desejado será, então:desejado será, então:

eq. 10 eq. 10 Sikmk

SVVi+Ι+

=)/1(max

onde km = (k2+k3)/k1 = cte de Michaelis e Menten

Ι = concentração do Inibidor ki = (k5+k6)/k4

Invertendo a equação segundo Lineweaver-Burk

SVikmk

ViV1.

max

)/1(

max

11 Ι++= Eq.11

)/1(1

ikmk Ι+−

-1/km 1/S

1/V

1/Vmax

I2>I1 I1

I=0

=

Fazendo a relação entre Velocidade Fazendo a relação entre Velocidade segundo Michaelis e Menten e a segundo Michaelis e Menten e a Velocidade de inibição competitiva vem;Velocidade de inibição competitiva vem;

iKSmkmk

iVV

)(1

+Ι+= Eq.12

Esta relação trata-se de uma Esta relação trata-se de uma representação matemática da influência representação matemática da influência das concentrações de substrato e de das concentrações de substrato e de inibidor na inibição competitiva, da inibidor na inibição competitiva, da seguinte forma:seguinte forma:

S>>i

S1

S2<S1

I

V/VI

1

Ou seja, com o aumento da concentração de substrato em relação a concentração do inibidor diminui a influência do inibidor na cinética enzimática.

INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA (irreversível)INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA (irreversível) Consideremos o caso em que o inibidor, Consideremos o caso em que o inibidor,

presente no sistema na concentração presente no sistema na concentração ΙΙ, bloqueia , bloqueia irreversivelmente uma concentração irreversivelmente uma concentração αΙαΙ de de enzima. Teremos então:enzima. Teremos então: kk11 k3k3

E + S ES E + PE + S ES E + P kk22 V Vii

kk44

E+E+ΙΙ E EΙΙ

SmKSkViV

+Ια−= )3max(

A velocidade de formação do produto desejado será:

onde Ι = Concentração do inibidor αΙ = porção de enzima bloqueada irreversivelmente

eq. 13

Invertendo a equação segundo Lineweaver-Burk Invertendo a equação segundo Lineweaver-Burk vem:vem:

SkVmk

kViV1.

3max3max

11Ια−

+Ια−

= eq. 14

Ια− 3max

1kV

1/S-1/km

I=0

I1

I2>I11/Vi

=