Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos

8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos

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CINÉTICA

ENZIMÁTICA

Dra. Maria Mercedes Soberón Lozano


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Concepto - Cinética

Estudia:

• Las velocidades dereacciónenzimática.

• Mecanismos de

reacción deenzimas.


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Concentración de sustrato quedesaparece por unidad de tiempo.

¿Cómo se “ visualiza” la acción

catalítica de una enzima ?

Concentración de producto que se formapor unidad de tiempo.


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Unidad de actividad enzimática (U)

Cantidad de enzima que cataliza la

conversión de 1 µmol de sustrato en un

minuto.

¿Cómo se expresa la veloc idadenzimática?


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katal (kat): Cantidad de enzima quetransforma 1 mol de sustrato por segundo.

1 katal = 60 x 106 U.Esta unidad es muy grande, por lo que seutilizan submúltiplos como

el microkatal (µkat, 10-6 kat), o

el nanokatal (nkat, 10-9 kat).

Sistema Internacional de Unidades (SI)


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Hipótesis que intentaron explicar elmecanismo de acción de las enzimas

Leonor Michaelis y Maud Menten (1913)

(1) Condición equilibrio rápido


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George E. Briggs y

John B. S Haldane(1925)

Hipótesis que intentaron explicar elmecanismo de acción de las enzimas

John B. S Haldane

(2) Condición estado estacionario


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k 1 , k -1 y k cat constantes cinéticasindividuales de cada proceso.

También denominadas constantesmicroscópicas de velocidad.

E + S E-S E + P k 1

k -1

k cat

Mecanismo cinético


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Hipótesis Michaelis-Menten(Condición equilibrio rápido)

E + S E-S P + Ek1

k-1

kcat (1)

Deducción Ec. (1):

- Complejo E-S piedra angular de la cinéticaenzimática.- Complejo E-S en equilibrio rápido conrespecto a E y S (kcat < k -1)


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Hipótesis Michaelis-Menten(Condición equilibrio rápido)

E + S E-S P + Ek1

k-1

kcat

Velocidad de reacción (v)

v = k cat E-S

k cat = constante catalítica de velocidad


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E + S E-S P + E

k1

k-1

kcat

Pasos para resolver esquema (1):

(1)

[E][S] k-1Ks = ---------- = -------

[ES] k1

- Constante de disociación aparente (Ks):


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Dividiendo ec (2) entre ec (3) (Et) : v kcat [E-S]

---- = -------------- (4)

Et [E] + [E-S]

Et = E + [E-S], Conc. de S >> Et (3)

Velocidad de reacción (2)v = kcat [E-S]


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Hipótesis Michaelis-Menten

Pero, k cat [Et] = V max

Reordenando la ec. 4, se llega a la ec.Michaelis- Menten:

K s = K m

v

V max

S

K s + S ----------- = ----------- v

V maxS

K s + S = --------------ó


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L im itac iones de la Ec.Michael is-Menten

Válida mayormente para sistemas

enzimáticos uni-reactivos sencillos.


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Para reacciones enzimáticas con más de un

complejo E-S, el significado REAL y EXACTO

de Km y Vmax cambia.

E + S (E-S E-S1 E-P) P + E

k2

k-1

kcatk1

k-2

k3

k-3


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Hipótesis de Briggs-Haldane(Condición estado estacionario)

Como siempre,

v = kcat [E-S]

E + S (E-S1 E-S

2 E-P) P + E

k1

k-1

kcat

E-S

k2

k-2

k3

k-3


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E + S E-S P + E

k1

k-1

kcat

E-S permanece constante:

Vel. de formación E-S = Vel. de desaparición E-S

k1[E][S] = k-1[E-S] + kcat[E-S]

k1[E][S] = (k-1 + kcat) [E-S] Reordenando:

(5)


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Despejando E-S de ec (5):

E-S = ------------------E S

k-1 + k cat /k1

------------

k-1

k1

+ ------------kcat

k1

------------

kcat

k1

Ks +

Km = Ks + kcat /k1 Km > Ks


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Hipótesis de Briggs-Haldane(Condición estado estacionario)

v

V max

S

K m + S

-----------

=----------- v

V maxS

K m + S

=--------------

ó


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Cuando k cat K m v = k cat Et

k 1 k catE + S E-S P + E

k -1


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En la práctica...... Gráfica

Michaelis-Menten

v

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------


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Gráfica de Lineweaver-Burk 1/v = Km/Vm x 1/[S] + 1/Vm

Pendiente de línea


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¿Por qué determinar Km?

Establece el valor aprox. deconcentración de sustrato en la célula.

Identificación de isoenzimas

Regulación a nivel de enzimas porcambios en Km, inducidos por ligandos.


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Conociendo Km podemos “in vitro”trabajar la enzima en condiciones de

[S] > Km

Cuando [S] >100 Km Vmax, valor

que permite conocer la [E]total presenteen el sistema de reacción.



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Si kcat


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Glucosa

Glucosa-6-P

ATP

ADP

Hexoquinasa

Glucoquinasa

Km hexoquinasa = 0.2 mM

Km glucoquinasa = 10 mM

[glucosa] sangre = 4 - 5 mM

[glucosa]intracelular = 0.2 – 2 mM

Después de ingerir dieta rica en carbohidrato, [glucosa]sangre, es alta.

Glucosa es transportada al hígado para ser convertida en

Glu-6-P.


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Etanol y metanol compiten por la

enzima alcohol deshidrogenasa.

Km Et < Km Met

Esta enzima prefiere metabolizar el

etanol (afinidad 20 veces mayor que

metanol)

¿Puede el s ign if icado de Km exp licar el

t ratam iento con etano l para casos de

intox icación con metano l?


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Administrar etanol para saturar la alcohol

deshidrogenasa y evitar que ésta degrade al

metanol

¿Puede el s ign if icado de Km exp licar el

t ratam iento con etano l para casos deintox icación con metano l?

Tratamiento:


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¿Por qué determinar Vm?

Centros activos de enzima, saturados consustrato ( [S]>>Km).

Varía de una enzima a otra.

Si mecanismo de reacción es de dos omás pasos, Vm será SIEMPRE equivalente a

kcat[Et].

Permite calcular la [E]total presente en lareacción.


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Significado de kcat

Constante de velocidad de primerorden.

Denominada también “número derecambios” (turnover number) ,cantidad máxima de moléculas (S, P)transformadas / tiempo, por moléculade enzima o por número de sitiosactivos.


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Enzima Sustrato Kcat (s-1)

Catalasa H2O2 40 000 000

Anhidrasa carbónica HCO3 - 400 000

Acetilcolinoesterasa Acetilcolina 14 000

Β-Lactamasa Benzilpenicilina 2 000

Fumarasa Fumarato 800

Valor kcat de Algunas Enzimas


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Enzima Sustrato Kcat/Km

(M-1 S-1)

Acetilcolinoesterasa Acetilcolina 1.6 x 108

Anhidrasa carbónica

CO2 8.3 x 107

HCO3- 1.5 x 107

Catalasa H2O2 4 x 107

Crotonasa Crotonil-CoA 2.8 x 108

Fumarasa

Fumarato 1.6 x 108

Malato 3.6 x 107

Eficiencia catalítica de algunas enzimas


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Características

Disminuir o bloquear la velocidad de

reacción, uniéndose a la enzima.

Son específicos.

Alteran grupos importantes para lafunción catalítica, o

Alteran ligeramente conformación dela enzima sin llegar a desnaturalizarla.


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Aplicaciones

Identifica aminoácidos presentes en elsitio catalítico de la enzima y su

probable rol en catálisis.

Fundamento de fármacos antivíricos,antibacterianos y antitumorales


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Tipos Inhibición

Unión irreversible por enlaces covalentes,

provocando modificación química de

grupos en centros de fijación y sitio

activo de la enzima.

1. Inhibición Permanente

I hibi ió t d l í


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Compuesto organofosforadoque inhibe la actividad de

ACETILCOLINESTERASA

Gas sarín

Inhibición permanente del gas sarín

Los organofosforados forman un éster estable con el OH

de la SER del centro activo de la enzima y la reacción no

prospera; la enzima queda bloqueada e inactiva.


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2. Inhibición reversible

Competitiva

Acompetitiva

No competitiva

Tipos:


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Inhibición Competitiva

I y S compiten por sitiocatalítico.

Análogo o derivadono metabolizable del

verdadero sustrato.Actúa sólo

aumentando

el Km

(Km app

) para S.

Vm permaneceinalterable

Ks k3

E + S E-S E + P

+

I

kI

EI


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Acción Bioquímica de Agentes Quimioterapéuticos

Tetrahidrofolato

5, 10-metilentetrahidrofolato

UMP dTMP

7, 8dihidrofolato

NADPH + H+

NADP+Serina

Glicina

Dihidrofolatoreductasa

Timidilatosintasa

Fluorouracil

Metotrexato

Inhibición

FdUMP

DNA

Serina hidroximetiltransferasa

Ácido fólico


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Las posiciones 7 y 8 llevanhidrógeno formando el

DIHIDROFOLATO

8

7


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Trimetoprim (TMP) y

sulfametoxazol (SMX) actúan de

forma sinérgica.

Trimetoprim inhibe de formacompetitiva la dihidrofolato

reductasa.

TMP-SMX inhibe 50,000 veces

más la dihidrofolato reductasa

bacteriana que la de los

mamíferos

1968 Introducción en mercado de BACTRIM (combinaciónde trimetoprim-sulfametoxasol).


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Inhibición No Competitiva

I se une tanto a la enzimacomo al complejo E-S.

Km no se altera (KI = Km ).

Vm varía. Disminuye amedida que aumenta [I].

I, podría impedir la

conformación de centro

catalítico.

No puede ser superada

aumentando [S].

Ks k3

E + S E-S E + P

+ +I I

EI + S ESI

Ks


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Inhibición Acompetitiva

I sólo se une alcomplejo E-S.

I no se une al centro

activo sino a cualquierotro sitio.

No se puede superarla inhibición

aumentando la [S].Km es más pequeño

(aparente afinidad)

Ks k3

E + S

E-S

E + P

+

I

kI

ESI


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¿Entendieron

la cinética delas enzimas?

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