2015

Lara Mayoral Manzanares

01/05/2015

CITOMETRO DE FLUJO

Concepto de citometra de flujo.

Objetivos principales de la citometra de flujo.

Componentes del clitmetro de flujo.

Fluorescencia y fluorocromos.

Parmetros analizables por citometra de flujo.

Aplicaciones de la citometria de flujo.

Ventajas y Desventajas.

1. CONCEPTO DE CITOMETRA DE FLUJO.

Mtodo analtico por el que se mide la emisin de mltiples fluorescencias y la dispersin de

luz de clulas o partculas microscpicas, alineadas mediante una corriente lquida laminar,

cuando son presentadas de una en una y a gran velocidad frente a una o mltiples fuentes de

iluminacin.

Nivel Molecular

Protenas extracelulares.

Secuencias de ADN o ARN

libres.

Complejos inmunes circulantes.

Nivel Subcelular

Viriones individuales.

Liposomas.

Cromosomas aislados.

Orgnulos aislados.

Ncleos aislados.

Nivel Celular

Bacterias.

Hongos unicelulares.

Clulas humanas y

animales.

Protoplastos vegetales.

Nivel Supracelular

Hibridomas y fusiones celulares.

Esferoides.

Cuerpos embrioides.

Larvas y embriones.

Organismos pluricelulares.

2. OBJETIVOS PRINCIPALES DE LA CITOMETRA DE

FLUJO.

Identificar y enumerar subpoblaciones celulares nicas y definidas.

Seleccionar y separar fsicamente subpoblaciones de clulas deseadas (por defleccin

electrosttica; esta tecnologa de separacin se llama "electronic cell sorting")

Medir capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas.

3. COMPONENETES DEL CITMETRO DE FLUJO.

Consta de cuatro componentes: sistema de fluidos, sistemas ptico, electrnico e informtico.

El sistema de fluidos permite que las clulas sean analizadas de una en una.

El sistema ptico analiza las clulas mediante su interaccin con el haz luminoso

(laser).

El sistema electrnico filtra y procesa las seales generadas por el sistema ptico.

El sistema informtico almacena la informacin y permite el anlisis de los datos de

manera interactiva con el operador.

El sistema de fluidos transporta las clulas hacia el centro del lser de una en una. En la cmara

de flujo de un citmetro se produce un flujo laminar al interaccionar dos fluidos, el de la

muestra y el de la vaina o envolvente (PBS), que rodea el fluido que contienen la muestra.

Cuando se produce esta interaccin, las clulas penetran en el centro de fluido de la vaina por

medio de diferentes presiones velocidades de fluidos (constante pero mayor que la de la

muestra). El PBS y la muestra no se mezclan. Por aumento de la presin en el depsito del PBS

se establece un flujo hacia abajo y las clulas salen por el tubo que conecta con la muestra, al

principio apelotonado y desordenado, pero despus se alinean hasta quedar en fila de modo

que pasen de una en una ante el rayo lser. El que las clulas pasen alineadas por el lser es

esencial para que nos definan bien las poblaciones situndolas en su sitio. En el caso contrario

en la pantalla veremos que las clulas se colocan como si se tratase de un televisor sin antena.

Esto puede ocurrir por que el tubo este rajado o roto impidiendo el mantenimiento de la

presin, por falta de PBS o debido a la existencia de burbujas en la cmara.

La luz, al incidir sobre las clulas se dispersa en

dos direcciones: horizontal y verticalmente. Esta

dispersin proporciona informacin relativa

sobre el tamao de las clulas y la granulosidad.

La luz incidente puede, adems, excitar una

serie de fluorocromos presentes en las clulas.

La presencia de fluorocromos proporciona

informacin adicional sobre las clulas. En

principio, el citmetro puede detectar cualquier

propiedad celular o bioqumica que se acople a

un fluorocromo.

El sistema electrnico convierte todo en seales digitales para almacenar en el ordenador.

La informacin sobre cada clula se recoge y se almacena en un ordenador. Los resultados de

todas las medidas obtenidas se conservan en forma de listado numrico. El uso de un software

adecuado permite el anlisis de las propiedades de las clulas de modo interactivo, mediante

la combinacin de varios parmetros.

4. FLUORESCENCIA Y FLUOROCROMOS.

Los fluorocromos son sustancias que absorben energa luminosa de una determinada longitud

de onda. Esta absorcin de luz provoca el ascenso de electrones a niveles energticos

superiores. Los electrones excitados regresan rpidamente a su estado normal emitiendo un

fotn y desprendiendo energa radiante. La energa consumida en la absorcin de luz es mayor

que la liberada y, por lo tanto, la longitud de onda que se desprende es mayor que la que se

absorbe (salto de Stokes). E=ch/

Los ms usados deben absorber a una misma longitud de onda de 488 nm (luz azul). Para que

dos o ms fluorocromos se puedan usar simultneamente, sus longitudes de onda de emisin

deben ser diferentes. La intensidad de fluorescencia que se recoge en los detectores es

proporcional al nmero de molculas de fluorocromo presentes en las clulas.

5. PARMETROS ANALIZABLES POR CITROMETRA DE

FLUJO.

Parmetros nucleares

Contenido de ADN y ARN.

Estructura de la Cromatina.

Parmetros Citoplasmticos

Protenas funcionales.

Protenas estructurales.

Parmetros de Superficie

Ag.

Pared Celular.

Parmetros Extracelulares

Captura de protenas excretadas.

6. APLICACIONES DE LA CITOMETRA DE FLUJO.

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE

Objetivo Determinar la presencia y cuantificar la expresin de protenas (antgenos) o de

regiones de las mismas (epitopos) en la superficie de las clulas de la sangre, tejidos linfoides,

lquidos biolgicos o cultivos celulares, usando combinaciones adecuadas de anticuerpos

fluorescentes.

Metodologa Se realiza mediante el marcaje de antgenos de la membrana plasmtica con

anticuerpos mono- o policlonales conjugados con fluorocromos. El proceso de preparacin de

la muestra es mnimo en la mayora de las determinaciones (sangre entera) o puede requerir

etapas de:

Concentracin celular: lquidos biolgicos (LCR, orina, etc.).

Dispersin celular: lavado broncoalveolar, esputo inducido.

Disgregacin mecnica: tejidos linfoides, tejidos mucosos.

Disgregacin enzimtica: tejidos slidos, cultivos en monocapa.

Estimulacin celular controlada: estudios de activacin.

Informacin Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y tcnicas de anlisis permiten

identificar subpoblaciones especficas de clulas y determinar:

Linaje celular.

Grado de maduracin.

Grado de activacin.

Clonalidad de cadenas ligeras de inmunoglobulinas y del receptor TCR.

Expresin de protenas de fusin en translocaciones cromosmicas

Hematologa

Diagnstico y pronstico de leucemias, linfomas, sndromes linfoproliferativos y

sndromes mielodisplsicos. Deteccin de Enfermedad Mnima Residual. Recuento absoluto de clulas CD34+ viables circulantes o en preparaciones celulares

para el auto- o alotransplante de precursores hematopoyticos. Diagnstico de Hemoglobinuria Paroxstica Nocturna. Deteccin de fenotipo MDR (resistencia a frmacos) mediado por la glicoprotena-P.

Inmunologa

Determinacin de porcentaje y recuento absoluto de subpoblaciones linfocitarias T, B

y NK en el seguimiento de inmunodeficiencias y otras alteraciones de la respuesta

inmunitaria. Recuento absoluto de CD4+ y cociente CD4/CD8 en pacientes con VIH. Deteccin de leucocitos activados en sangre perifrica o en preparaciones celulares

estimuladas. Deteccin de aloanticuerpos y autoanticuerpos circulantes o unidos a clulas. Diagnstico de deficiencias en molculas de adhesin. Identificacin de basfilos circulantes y deteccin de la desgranulacin provocada por

alergenos.

Hemostasia

Diagnstico de deficiencias congnitas de glicoprotenas plaquetarias.

Deteccin ex vivo de plaquetas activadas circulantes in vivo.

Determinacin de la reactividad plaquetaria ex vivo.

Cuantificacin de receptores gpIIb/IIIa ocupados en la terapia antiagregante

plaquetaria con antagonistas de gpIIb/IIIa.

Objetivo Determinar la presencia y cuantificar la expresin de protenas (antgenos) o de

regiones de las mismas (epitopos) en la cara interna de la membrana plasmtica, citoplasma,

vesculas o ncleo de las clulas de sangre, tejidos linfoides, lquidos biolgicos o cultivos

celulares, utilizando combinaciones de anticuerpos fluorescentes.

Mtodos El proceso de preparacin de la muestra requiere etapas de fijacin y

permeabilizacin para hacer accesibles los epitopos intracelulares.

El proceso de preparacin de la muestra es menor en la mayora de las determinaciones

(sangre entera) o puede requerir etapas de:

Concentracin celular: lquidos biolgicos (LCR, orina, etc.)

Dispersin celular: lavado broncoalveolar, esputo inducido.

Disgregacin mecnica: tejidos linfoides, tejidos mucosos.

Disgregacin enzimtica: tejidos slidos, cultivos en monocapa.

Estimulacin celular controlada: estudios de activacin.

Bloqueo de la exportacin de protenas: protenas de secrecin (citoquinas).

Informacin Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y tcnicas de anlisis permiten

identificar:

Linaje celular.

Grado de maduracin.

Grado de activacin.

Expresin de enzimas intracelulares.

Activacin de enzimas intracelulares.

Expresin de protenas reguladoras del ciclo celular.

Expresin de antgenos relacionados con la apoptosis.

Expresin de protenas de fusin en translocaciones cromosmicas.

Aplicaciones

Diagnstico y pronstico de leucemias, linfomas y sndromes linfoproliferativos.

Deteccin de Enfermedad Mnima Residual.

Deteccin de leucocitos activados en sangre o preparaciones celulares estimuladas.

Identificacin de clulas productoras de citocinas.

Estudio de la polarizacin TH1/TH2/TH17 en linfocitos TH activados.

Identificacin de clulas Tregs.

Identificacin de clulas en fase de proliferacin.

Identificacin de clulas tumorales en muestras complejas.

Identificacin y cuantificacin de clulas tumorales circulantes en sangre y lquidos

biolgicos.

Estudio de la regulacin del ciclo celular.

Identificacin de clulas en apoptosis temprana o tarda.

Anlisis de los mecanismos reguladores y ejecutores de la apoptosis.

Diagnstico de deficiencias en molculas de adhesin leucocitarias.

Diagnstico de anomalas congnitas en el citoesqueleto.

Diagnstico de deficiencias congnitas de almacenamiento en plaquetas.

Identificacin y cuantificacin de eritrocitos con hemoglobina fetal en el adulto.

Objetivo Determinar la presencia y cuantificar los niveles de cidos nucleicos (ADN y ARN) en

clulas enteras, clulas permeabilizadas o suspensiones de ncleos aislados a partir de sangre

perifrica, tejidos linfoides, lquidos biolgicos, biopsias y otras muestras de tejidos slidos y

cultivos celulares, utilizando fluorocromos que se unen a los cidos nucleicos.

Metodologa La determinacin de la ploida o el ciclo celular, requieren el acceso

estequiomtrico del fluorocromo al ncleo celular, por lo que utilizan clulas fijadas y/o

permeabilizadas, o suspensiones de ncleos aislados.

Segn la aplicacin, el proceso de preparacin de la muestra puede ser mnimo o requerir

etapas de fijacin y permeabilizacin. Los fluorocromos permeables de cidos nucleicos

penetran en clulas en fresco y permiten distinguir las clulas nucleadas en sangre entera u

otras muestras hematolgicas o detectar los cidos nucleicos residuales en eritrocitos y

plaquetas inmaduras.

Los fluorocromos impermeables de cidos nucleicos se usan para detectar cambios en la

permeabilidad de membrana asociados con apoptosis y necrosis.

Informacin Las tcnicas de anlisis basadas en el uso de fluorocromos especficos de cidos

nucleicos en clulas permeabilizadas permiten:

Determinar la ploida celular.

Detectar la presencia de clulas en proliferacin.

Calcular la distribucin en las fases del ciclo celular.

Identificar clulas nucleadas en sangre (leucocitos, eritroblastos).

Estimar el grado de maduracin de precursores de eritrocitos y plaquetas.

Identificar y cuantificar clulas vivas, apoptticas y necrticas.

Aplicaciones

Pronstico de leucemias, linfomas y sndromes linfoproliferativos.

Clculo de la ploida en tumores slidos y neoplasias hematolgicas.

Identificacin de clulas en fases de proliferacin en tumores slidos y hematolgicos.

Determinacin del ciclo celular en cultivos celulares in vitro.

Determinacin de la activacin de linfocitos por mitgenos in vitro.

Anlisis de la proliferacin de clulas tumorales en muestras complejas.

Identificacin y cuantificacin de clulas tumorales circulantes.

Estudio de la regulacin del ciclo celular.

Identificacin de clulas en apoptosis temprana o tarda.

Anlisis de los mecanismos reguladores y ejecutores de la apoptosis.

Determinacin de la viabilidad celular.

Cuantificacin de la actividad citotxica de clulas NK y linfocitos CD8 activados.

Identificacin de reticulocitos y clculo del Indice de Madurez Reticulocitaria (RMI).

Identificacin de plaquetas reticuladas y clculo del Indice de Madurez Plaquetaria

(PMI).

Objetivo Analizar, de forma cualitativa o cuantitativa, fenmenos dinmicos o transitorios de

la Bioqumica intracelular, cuya alteracin sea causa, consecuencia o est relacionado con

situaciones fisiopatolgicas de relevancia clnica.

Mtodos Se realiza usando fluorocromos, sustratos fluorognicos especficos o partculas

fluorescentes cuyas propiedades varan en funcin de:

Entorno celular: pH, iones, molculas oxidantes, reductoras.

Actividad de enzimas intracelulares especficos: oxidasas, peptidasas.

Transporte a travs de membrana plasmtica o de orgnulos.

Acumulacin selectiva en compartimentos intracelulares.

El proceso de preparacin de la muestra debe respetar la viabilidad y competencia funcional.

En muchas aplicaciones en Inmuno-Hematologa, el anlisis funcional se puede realizar en

muestras de sangre entera, con un grado de manipulacin mnima.

En estudios de activacin, se puede requerir una etapa de estimulacin celular controlada.

Informacin

Fluidez y permeabilidad de membrana.

Fagocitosis de microorganismos.

Transporte de partculas y molculas solubles al interior de la clula.

Retencin intracelular de molculas.

Extrusin de sustratos a travs de bombas de eflujo.

Potenciales de membrana plasmtica y mitocondrial.

pH intracelular y su regulacin dinmica.

Movimientos de iones a travs de membrana o desde depsitos intracelulares.

Generacin de especies reactivas de oxgeno y xido ntricoNiveles de gluttion

Citoenzimologa de flujo.

Sntesis de ADN.

Niveles de depsitos de lpidos metablicos y estructurales

Aplicaciones

Identificacin de blastos en el diagnstico de leucemias.

Seguimiento de la activacin de leucocitos o plaquetas.

Anlisis del contenido en iones y la regulacin del equilibrio inico celular.

Deteccin de la expresin de superficie procoagulante en plaquetas.

Seguimiento y cuantificacin de fagocitosis de microbios o partculas sintticas.

Anlisis de la respuesta oxidativa en fagocitos ("Burst oxidativo").

Anlisis de la actividad de proteasas intralisosomales en fagocitos.

Anlisis de la actividad proteoltica intracelular en clulas tumorales invasivas.

Determinacin del pH intracelular y su regulacin.

Anlisis del estrs oxidativo inducido y de las defensas antioxidantes celulares.

Identificacin y cuantificacin de clulas en apoptosis.

7. VENTAJAS Y DESVENTAJAS

VENTAJAS DE LA CITOMETRA DE FLUJO

Anlisis de un nmero estadsticamente significativo de clulas (1000 a ms de

100.000 clulas).

Mltiples marcajes de una sola clula.

Anlisis de alto nmero de partculas en corto tiempo (5.000 eventos /seg. ).

Alta sensibilidad y objetividad.

Medidas separadas de cada clula (no slo el promedio).

Medidas cuantitativas: discriminacin de las clulas segn la cantidad de marcador.

Mltiples parmetros: define subpoblaciones complejas.

Miles de clulas por segundo.

DESVENTAJAS DE LA CITOMETRA DE FLUJO

Poca informacin morfolgica de la clula

No proporciona informacin de la localizacin celular en un tejido

Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (10 millones de clulas /

hora)

Necesita suspensin de clulas individuales (1).

Costos de la tecnologa.

Mtodo destructivo.

Incapacidad de visualizar las clulas que se analizan.

BIBLIOGRAFA

http://www.uv.es/oconnor/CITOMICA%20FP%202013/Citometria%20de%20Flujo%20FP.pdf

http://perso.wanadoo.es/sergioram1/citometro.htm

https://www.uclm.es/irec/divulgacion/seminarios/JoseManuelPerezLastra.pdf

http://www.cnb.csic.es/~fotonica/Photonic_en/Review/citometria_de_flujo.htm