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CITOQUIMICA APLICADA A LA HEMATOLOGIA

Bqca. Ivan Mara VictoriaHematologa Clnica2011

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Son un complemento de las tinciones hematolgicas.Por medio de ellas se localizan enzimas y sustancias inorgnicas.As se mejora la diferenciacin celular.Tambin sirven para el diagnstico de ciertas leucemias.

La citoqumica estudia la composicin qumica de la clula y permite detectar la localizacin topogrfica de algunos principios inmediatos, enzimas, metales pesados y otras sustancias.

MORFOLOGA BIOQUMICA

CITOMORFOLOGIA.70-80%

CITOQUIMICA.90-95%

INMUNOFENOTIPOMICROSC. ELECTRN.MAS99-100%CITOGENETICA Y BIOL. MOLECULARCONFIABILIDAD DE LOS METODOS PARA EL Dx DE LAS LEUCEMIAS AGUDAS

Tres pasos fundamentales:

Fijacin: preservar las estructuras y reactividad funcional de las clulas.

Incubacin en el medio de reaccin: como consecuencia se generan productos que ponen en evidencia el componente a ser estudiado.

Contraste: permite detectar con mayor facilidad el producto de reaccin .Las reacciones deben tener 3 caractersticas: sensibilidad, especificidad y reproductibilidad.

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MUESTRAS UTILIZADAS

EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFRICA

PUNCION DE MDULA SEA

PUNCION DE GANGLIOS

LCR

TIPOS DE TINCIONESSe pueden clasificar en:

Atendiendo al nivel de vitalidad de las clulas que se pretende colorear, se pueden dividir en vitales y no vitales.

Atendiendo al momento en el que empezaron a ser utilizadas para el Dx hematolgico, se dividen en tradicionales y especiales.

TINCIONES VITALES Y NO VITALES

Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre clulas que estn vivas.

Las tinciones vitales son aquellas que se efectan sobre clulas que estn vivas, mediante la introduccin de un colorante en la circulacin de un organismo vivo. Son colorantes vitales: el verde Jano y el azul de metileno.

Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos vivos, pero que estn aislados del organismo del que proceden.

Las tinciones no vitales se realizan sobre clulas muertas. La coloracin de clulas muertas requiere un proceso previo de fijacin, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos.

TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALESColorantes cidos: tienen una especial afinidad por las estructuras alcalinas de las clulas, como por ejemplo la hemoglobina (eosina).

Colorantes bsicos: tienen una especial afinidad por las estructuras cidas de las clulas, como por ejemplo los cidos nucleicos (azul de metileno).

Colorantes neutros: son sales de un cido y de una base coloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro (eosinato de azul de metileno).

Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por estructuras cidas o bsicas. Son insolubles en el agua y tien a aquellas sustancias que tienen un poder de disolucin superior al del lquido empleado para preparar la solucin colorante (Sudn III)

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Tambin hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polcromas.

Una coloracin es panptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras.

Y es pancrmica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas.

Elempleocombinadode los colorantes May Grunwald y Giemsa se conoce con el nombre de tincin panpticade MayGrunwald Giemsa.

Se basa en el uso de soluciones preparadas a base de colorantes de acentuado poder policromatfilo y metacromtico

Fundamento:Se basa en elagregadode la solucinde MayGrunwald formada por eosinato de azul de metileno en alcohol metlico , la que fija el extendido y tiene afinidad por los citoplasmas.Luego se agrega elcoloranteGiemsa diluido (en el momento de realizarse la coloracin), Esta constituido por Azures que son derivados por oxidacin del azul de metileno. Tiene afinidad por los ncleos y ciertas granulaciones.

La eosina es uncolorantecido por lo tanto tie los componentes acidfilos de las clulas.El azul de metileno es uncolorantebsico por lo tanto se une a las fracciones basfilas

Es importante respetar las condiciones de la coloracin ya que variaciones de pH pueden alterarla. En esta coloracin se trabaja a pH neutro o ligeramente alcalino.Si se trabaja a pH cido, habr mayor cantidad de sustancias cargadas positivamente y se absorber mayor cantidad de eosina. Los extendidos adquieren una tonalidad rojisa.Si el pH es muy bsico, habr mayor fijacin de azul de metileno y se exagerarn los colores azules.9

Las reacciones citoqumicas pueden tambin clasificarse segn el mecanismo qumico involucrado

1-Progresivas estables: Son reacciones que exigen un tiempo mnimo pero no un mximo.

2-Progresivas indefinidas: En estas la reaccin contina y puede hacer ilegible el preparado o conducir a valores errneos.

3-Fugaces: Son las que pierden color rpidamente y no pueden conservarse mucho tiempo.

CLASIFICACION DE LAS TCNICAS CITOQUMICASCITOQUMICA CLSICAINMUNOCITOQUMICA NO FLUORESCENTECITOQUMICA FLUORESCENTECITOQUMICA ELCTRNICA

CITOQUMICA AUTOMATIZADA

Citoqumica Clsica: Se fundamenta en reacciones coloreadas que pueden observarse e interpretarse con el microscopio ptico comn.

Citoqumica electrnica: Se caracteriza por ser una metodologa de elevada sensibilidad

Citoqumica Fluorescente: puede o no ser inmunocitoqumica, se fijan sobre distintas estructuras de las clulas y al ser excitadas por luz UV producen fluorescencias de distintos colores.

Inmunocitoqumica no fluorescente:Se basa en la marcacin de anticuerpos con sustancias que son capaces de dar reacciones citoqumicas intensamente coloreadas que permiten su revelacin.

Fisicocitoqumca electrofortica Permite reconocer determinados componentes de las organelas celulares obtenidas en solucin mediante la lisis de la misma. Mediante electroforesis en un campo elctrico y la identificacin por reacciones citoqumicas, permite identificar complejos isoenzimticos, mientras que los mtodos citoqumicos simples revelan una enzima en bloque.

Citoqumica automatizada: Es el fundamento de la CMF que utiliza la citoqumica fluorescente

CITOQUIMICA ELECTRONICA:

Figura 1. Imagen ultraestructural (Microscopio Electrnico de Transmisin) de un folculo linfoide en las Placas de Peyer del ileon de animales que sufren una infeccin experimental aguda con el vDVB. Obsrvese la presencia de abundantes imgenes de apoptosis de los linfocitos, caracterizada por la condensacin y marginacin de la cromatina (flecha) y la fragmentacin del ncleo y del citoplasma (cuerpos apoptticos) (cabeza de flecha).13

CITOQUIMICA FLUORESCENTE:

INMUNES

NO INMUNES

S

P

INMUNOCITOQUMICA NO FLUORESCENTE

CITOQUIMICA AUTOMATIZADA:

CONSIDERACIONES PRACTICASConservacin de la muestra (FAL)

Condiciones de la reaccin

Observacin la microscopio (ausencia/presencia/,morfologa/distribucion)

Interpretacin (score o ausencia/presencia)

Estandarizacin

Reactivos utilizados

Pueden ser reconocibles.SUSTANCIAS RECONOCIBLES:1-DNA Y RNA.2-PROTEINAS.3-HEMOGLOBINA.4-HIDRATOS DE CARBONO.5-LIPIDOS.6-FOSFOLIPIDOS.7-METALESENZIMAS RECONOCIBLES

1-MIELOPEROXIDASAS (MPO)2-FOSFATASA ALCALINA (FAL)3-FOSFATASA ACIDA (FAC)4-ESTERASAS (EST)5-FOSFATASA ACIDA TARTRATO RESISTENTE (FAC-TR)6-DEHIDROGENASAS (DH)

CITOQUIMICA CLASICAReconocimiento de principios no enzimticos:

Hidratos de carbonos: PAS

Fe hemosidernico: PERLS

Lpidos: Red Ol/Sudan Black

Hemoglobina fetal: elucin acida

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Reconocimientos por principios enzimticos:

MPO

FAL

FAC

ESTERASAS

CATALASAS

ENZIMAS HIDROLITICAS

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TINCIONES CLASICAS:

1) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO ENZIMATICOS

TINCIN DE PAS (Peryodic Schiff Acid) Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los carbohidratos por la accin del cido perydico, potente agente oxidante, liberndose grupos aldehdo que al combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de color rojo prpura intenso.

-C-C- ALDEHIDOS PURPURA

ACIDO PERYODICO SCHIFF

Los precursores linfoides normales son negativos, sin embargo en procesos leucmicos los linfoblastos son positivos

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Progenie linfoide normales (-)Hasta llegar al linfocito donde un 30% es (+) en corona de grnulosLinfoblastos leucmicos (+)Positividad en mazacotesSerie roja normal (-)Serie roja anormal (+) [LMA6]Serie granulocitica (+) difusa

PAS en neutrofilos con un patrn difuso

LMA6 (eritroide) MO PAS: todos los precursores eritroide contienen glucgeno, nunca los normales.

Reaccin dePAS, mdula sea. Grnulos gruesos en el citoplasma de los linfoblastos.

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TINCION DE PERLSLos grnulos de hemosiderina detectables citoqumicamente mediante la reaccin de Perls.

Se basa en la liberacin de los iones frricos de su unin con las protenas por la accin del cido clorhdrico; dichos iones frricos al reaccionar con el ferrocianuro potsico dan un precipitado azul verdoso de ferrocianuro frrico.

Por esta reaccin se detecta el Fe hemosidernico, que es insoluble, pero no el Fe contenido en la ferritina que es hidrosoluble.

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Sideroblastos en anilloReflejando una anormalidad en la acumulacion de Fe en las mitocondrias (azul de prusia)

HEMOSIDENURIA: hierro liberado en orina en una HPN

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En el estudio del Fe medular hay que valorar conjuntamente 3 parmetros: n de sideroblastos, tipo de los mismos y Fe macrofgico.

Bsicamente se presentas 3 patrones: 1) n sideroblastos alto y Fe de depsito aumentado: es frecuente hallarlo en estados anmicos que cursan con sobrecarga frrica.

2) n sideroblastos bajo y Fe de depsito disminuido o ausente: es el patrn caracterstico de la anemia ferropnica pura; de aparicin muy precoz en un balance frrico negativo.

3) n sideroblastos bajo con acmulo de Fe en los macrfagos medulares. Este patrn disociado es propio de entidades que condicionan un bloqueo del Fe a nivel de los macrfagos, por lo que el Fe no puede ser cedido a los eritroblastos, suele observarse en anemias secundarias.

Hemocromatosis(cortes histolgicos de hgado)

HEMOGLOBINA FETALTest de Kleihauer-Betke

La hemoglobina fetal (HbF o 22) es cido y lcali resistente. Por consiguiente, sometiendo un preparado fresco de sangre a una elucin cida ser arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloracin de estos ltimos.

Los hemates con hemoglobina fetal se colorean con eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacas y aparecen como sombras.

Esta prueba se usa para determinar si hay GR del feto en una mujer embarazada con un grupo sanguneo Rh(-).

SUDAN BLACK / RED OIL Ambas se utilizan para la deteccin de lpidos, en el caso del Sudan Black este tie los fosfolpidos y esteroles de membrana de los grnulos.

Tie tanto los grnulos azurfilos inespecficos como los especficos de los neutrofilos

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LMA2 (con eosinofilia t(8;21): intensa tincin de las clulas en maduracin y de los grnulos de los eosinofilos anormales.

2) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS ENZIMATICOS

MIELOPEROXIDASA La demostracin citoqumica de esta enzima se basa en la accin oxidante de la peroxidasa sobre un sustrato (bencidina) en presencia de perxido de hidrgeno, apareciendo un precipitado azul en el lugar del citoplasma en donde se ha producido la reaccin.

BENCIDINA

H2O2MPO

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Resultados.ERITROCITOS Y SU PROGENIE : NEGATIVOS

GRANULOCITOS Y SU PROGENIE : MIELOBLASTOS AGRANULARES 30% POSITIVOS.

NEUTRFILO ES SIEMPRE POSITIVO 100% ??

EOSINFILO TAMBIN , PERO COLOR PARDO AMARILLO

BASFILO EN 50%

LINFOCITOS Y SU PROGENIE: NEGATIVOS

MONOCITOS: POSITIVOS EN GRNULOS DISPERSOS.

ESTRES OXIDATIVOScorificacin de MPO en granulocitos:Se categorizaron los neutrfilos de acuerdo al contenido de grnulos presente en el citoplasma, en scores que van de 0 a 4, en orden creciente.Grado 0: Sin granulaciones teidas. (fig. 1 y 2)

Grado 1: Escasas granulaciones teidas dispersas (fig.3 y 4)

Scorificacin de MPO en granulocitos:Grado 2: Regulares granulaciones sin cubrir el ncleo (fig. 5)

Grado 3: abundantes granulaciones teidas en todo su citoplasma sin llegar a cubrir completamente el ncleo. (fig.6 )

Scorificacin de MPO en granulocitos:Grado 4: granulaciones que cubren la clula completamente dndoles un aspecto de casquete. (fig.8 y 9)

FOSFATASA ALCALINALa fosfatasa alcalina es una hidrolasa perteneciente al grupo de las fosfomonoesterasas.

Ligeros cambios de pH determinan una rpida inactivacin de la enzima.

Es un marcador de granulaciones secundarias o especificas.

La demostracin citoqumica se basa en la hidrlisis de ciertos substratos, de los cuales se liberan unos productos intermedios que combinados con una sal diazoica dan un precipitado coloreado.

La actividad granulocitica de la FA se manifiesta en forma de un precipitado de color pardo negruzco localizado en el citoplasma.Se encuentran actividad FA en algunas clulas maduras y semimaduras de la granulopoyesis neutrofilica (segmentados y bandas)

ndice de actividad de FALGrado 0: sin reaccin

Grado I: coloracin difusa o con pequeos puntos coloreados

Grado II: mayor densidad cromtica, por lo general en la zona del hilio nuclear.

Grado III: mayor granulacin oscura, tie todo el citoplasma.

Grado IV: completamente oscuro

No todos los granulocitos presentan el mismo grado de positividad; en funcin de este dato se establece un ndice de actividad de FA. Se pueden distinguir tres tipos de reaccin: - grado 0: sin actividad enzimtica. - grado I: con cierta actividad enzimtica en forma granular nica o actividad dbil difusa en una parte del citoplasma, especialmente en la zona perinuclear. - grado II: intensa actividad granular o actividad difusa distribuida por todo el citoplasma granuloctico. Se realiza un recuento sobre 100 granulocitos asignando a cada uno un grado; y a cada grado se la asocia un valor: grado 0=0, grado I=1, grado II=2. Se suman los valores y el nmero obtenido es el ndice de FAG, que tiene un valor mnimo de 0 y mximo de 200. El ndice normal oscila entre 20 y 40. Su mximo inters se centra en el estudio de los sndromes mieloproliferativos, sobre todo para corroborar el diagnstico de LMC para la que se designan valores muy bajos o nulos. Su determinacin es muy til para establecer el diagnstico diferencial entre LMC y reacciones neutroflicas secundarias que cursan con valores elevadsimos.

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En el citoplasma de los No contienen gruesos granulos que forman un denso precipitado de color pardo oscuro esto demuiestra una intensa actividad de FAL esto es una PV58

FOSFATASA ACIDA

Se basa en la hidrlisis del substrato naftol-AS-Bi-fosfato.

La aplicacin prctica del estudio de la FA se refiere sobre todo al estudio de los sndromes linfoproliferativos crnicos (LPC) y leucemia aguda linfoblstica (LAL), dnde existe una buena correlacin entre el tipo de positividad y el fenotipo de membrana.

FAC LT(+) Y LB (-)

El 90% de las LAL de origen T dan una reaccin + intensa de localizacin centrosmica. La LLC-T y otros SLPC T suelen cursar con valores elevados de FAC que es tartrato sensible. La LLC-B presenta muy escasa actividad al igual que ocurre con otras proliferaciones de linfocitos B.

LLA-T: INTENSA ACTIVIDAD CENTROSOMICA DE FOSFATASA ACIDA EN MAS DEL 70 % DE LOS BLASTOS.

Tricoleucemia: Tincin fosfatasa cida (+) tartrato resistente

La tricoleucemia es un proceso linfoproliferativo en que el estudio de la FA ofrece un particular inters por cuanto la actividad enzimtica a pesar de ser una clula linfoide es difusa, intensa y tartrato resistente.61

4 sustratos:Naftol-AS-C-cloroacetato (CAE)Naftol-AS-D-acetato-naftil-acetato-naftil-butirato

hidrolizados precipitado insoluble sal diazoicaESTERASAS

ESTERASAS

GR y su progenieGranulocitos y su progenieLinfocitos y su progenieMonocitos y su progenieNaftil butirato/acetatoNormales (-)(+) M6(-) o con algunas granulaciones F Resit(-) o + dbil(+++++)Fluoruro sensibleNaftil cloro acetatoIdem(+++++)(-)(+)

Son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar steres en sus componentes cidos y alcoholes. Existen diferentes variedades segn el substrato empleado.

LMA3 hipergranular (MO) CLOROACETO ESTERASA: notese la intensa coloracin confirma la maduracin despus del estadio de blasto

LMA5 (monocitica) MO TINCION DE ESTERASAS COMBINADAS: monoblastos teidos de marrones (esterasas no especificas) y un neutrfilo teido de azul (cloroacetoesterasa)

GranulocitosLinfocitosMonocitosPlaquetasEritrocitosMb SegLbl LinMbl MonMg PqPEbl GRPASFeMPOFALFACANAENCAESudan Black

EN RESUMEN..

MUCHAS GRACIAS!