Citogenetica convencional

CITOGENÉTICA CONVENCIONAL

Béjar Vilela, Rosario

Estudio de cromosomas, estructura y herencia.

Los transtornos cromosómicos constituyen una entidad dentro de las enfermedades genéticas.

CITOGENÉTICA CONVENCIONAL

Estudio Citogenético/ Cromosómico

Células estén división celular (Mitosis)

Análisis cromosómico (morfología y patrón de bandas) en Metafase.

Algunas células normalmente en proceso de proliferación y diferenciación por lo que no necesitan de un estimulante mitogénico para que entren división.

Otras células ya diferenciadas requieren de un estimulante mitógeno para que entren en mitosis.

Cultivos Indirectos y Cultivos Directos

Cultivos a corto plazo y cultivos a largo plazo

Cultivo Celular DirectoLa célula no requiere de un estimulante mitogénico para entrar

en división celular. Cultivo de Células Fetales

Cultivo a largo plazo (10-14 d)

Muestra: Liquido Amniótico obtenido por Amniocentesis alrededor de la 16ª semana de gestación.

Dx prenatal de una alteración cromosómica. Cultivo de Vellosidades Coriales

Cultivo corto plazo (24 –48 horas) y Cultivo largo plazo (10-14 d)

Muestra: Biopsia aspiración de Vellosidades Coriónicas alrededor de la 10ª sem. de gestación.

Dx prenatal de una alteración cromosómica. Cultivo de Restos Endouterinos

Cultivo largo plazo (10-14 días)

Muestra: Legrado uterino y/o producto abortado

Detectar una anomalía cromosómica del producto.

Procedimiento (“Cultivo Directo” de Líquidos Orgánicos )

Centrifugar a 1000 RPM por 10min.

Eliminar sobrenadante y colectar los sedimentos

Adicionar 6 ml. De Solución Hipotónica ( ClK 0.075 M ) agitar con Pipeta Pasteur

Incubar a 37°C por 30 min.

Centrifugar a 1000 RPM por 10 min. Eliminar el sobrenandante.

Procedimiento (“Cultivo Directo” de Líquidos Orgánicos )

Añadir 5 ml de Fijador. Agitar con Pipeta Pasteur y dejar a TA por 30 min.

Centrifugar a 1000 RPM por 10 min, eliminar sobrenandante y añadir 5 ml de Fijador. Repetir este paso 2 o 3 veces.

Colocar 3 a 4 gotas sobre una lámina portaobjeto y fijarlo al calor.

Coloración convencional (Giemsa).

Bandeo Cromosómico (Banda GTG).

Observación Microscópica.

Cultivo Celular Indirecto

La célula requiere de un estimulante mitogénico para que entre en división celular.

Cultivo de Linfocitos

Cultivo a corto plazo (72 horas)

Muestra: Sangre Periférica

Se realiza para detectar cualquier alteración cromosómica constitucional (que el defecto cromosómico este presente en todas las células de nuestro organismo).

Se utiliza para detectar las autosomopatías (Síndromes Down, Patau, Edwards, etc.) y las Gonosomopatías (Síndromes de Turner,

Triple X, Klinefelter, etc.)

Cultivo Celular: MEDIOS DE CULTIVO CELULAR

Contienen todos los aminoácidos, vitaminas, cofactores, coenzimas, enzimas, sales, iones, indicadores de pH. Todo lo necesario para que la célula pueda dividirse in vitro.

Existen distintos medios de cultivo los cuales se seleccionan dependiendo del tipo de muestra o tipo de célula a cultivar y lograr que estos respondan adecuadamente con un crecimiento celular.

Cultivo Celular

Medios de Cultivo más Utilizados

1. Medio McCoy’s 5A Modified

Cultivo Sangre Periférica (Linfocitos)

2. Medio RPMI 1640:


3. Medio Tc199:


4. Medio Ham F10 ó Ham F12

Cultivo de células fetales

Cultivo Celular

SUPLEMENTOS

Las células requieren para su crecimiento y división celular de suplementos, los cuales serán utilizados dependiendo del tipo de células que se desea cultivar y del tipo de estudio citogenético requerido.

1.- SUERO BOVINO FETAL (SBF) : Se utiliza a diferentes concentraciones:

20% para el cultivo de SP

30% para el cultivo de células fetales

Cultivo Celular

2.- PENICILINA + ESTREPTOMICINA: Utilizado como antibióticos para evitar la contaminación bacteriana.

3.- ANTIMICOTICOS: Fungizona para evitar el crecimiento de hongos, si es que fuera necesario.

4.- L- GLUTAMINA: Aa que en su forma levógira mejora el crecimiento celular.

5.- ESTIMULANTE MITOGENICO: Utilizado para estimular el proceso de mitosis en el cultivo de linfocitos.

Fitohemaglutinina (PHA)

Cultivo Celular

Medios de Cultivo y Suplementos

Formas de presentación :Medio Líquido y en polvo

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)

Toma de Muestra

. Condiciones de asepsia

. Anticoagulante heparina

. Volumen de muestra


Selección de los medios de cultivo y suplementos


Sedimentar la mx 2h aprox.


Eliminar el

P.G (dejar un

pequeño remanente)

dejando la interfase

(Globulos blancos)

y el plasma.


Se utilizará para la siembra( 20 gotas).


. Incubar a 37ºc por

72 horas


. El índice máximo de

mitosis se obtiene a las

70-72horas. Por lo tanto

habrán más células en

metafase


. Diariamente se

debe mezclar el

frasco de cultivo.

. Controlar cambios

de color que indica

cambios del ph o

turbidez que indica

contaminación.


. COSECHA

1. Colchicinización

. Agregar Colchicina

100 uL. Mezclar suavemente


. Incubar a 37ºC por

15 minutos


Eliminar el sobrenadante. Trabajar siempre con el sedimento


2. Hipotonización

. Adicionar solución

hipotónica: Cloruro

de Potasio 0.075 M

7mL y homogenizar.


. Incubar a 37ºC por 12 minutos.


3. FIJACIÓN:

. Adicionar Fijador

(Metanol +Acido Acético Glacial ) V/V

. Sacar el tubo de la estufa y adicionar 5 mL de fijador Carnoy para detener la acción de la solución hipotónica.Observar color marrón oscuro.. Homogenizar. Centrifugar 2500 RPM por 12 minutos.


. Eliminar el sobrenadante y

repetir el paso anterior 3 veces hasta que ya no haya turbidez.

El último sedimento resuspender con 1mL de fijador.


4. Preparado Cromosómico

. Adicionar 3 a 4 gotas sobre

una lámina portaobjetos

helada.

. Secar al calor de un

mechero.

. Guardar en una gradilla


Coloración Convencional: Bandeo GTG

- Tripsina 1% (buffer)

- Solución Salina Fisiológica

- Giemsa 4%


Cromosomas con Bandas G



Elaboración del Cariograma

GRACIAS

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