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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA
Programa de Pós Graduação em Genética, Conservação e Biologia
Evolutiva
NATÁLIA DAYANE MOURA CARVALHO
Manaus - Amazonas
Setembro - 2015
Citogenômica comparativa de lagartos da família Teiidae da
Amazônia
ii
NATÁLIA DAYANE MOURA CARVALHO
Orientadora: Dra. Maria Claudia Gross – UFAM
Coorientador: Dr. Carlos Henrique Schneider - UFAM
Manaus – Amazonas
Setembro - 2015
Citogenômica comparativa de lagartos da família Teiidae
da Amazônia
Tese apresentada ao Programa de Pós-
graduação do Instituto Nacional de Pesquisas
da Amazônia, como parte dos requisitos para
obtenção do título de doutor em Genética,
Conservação e Biologia Evolutiva.
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
C331c Carvalho, Natalia Dayane Moura
Citogenômica comparativa de lagartos da família Teiidae da Amazônia /
Natalia Dayane Moura Carvalho. --- Manaus: [s.n.], 2015.
xix, 146 f.. : il. color.
Tese (Doutorado) --- INPA, Manaus, 2015.
Orientador : Maria Claudia Gross.
Coorientador: Carlos Henrique Scheneider.
Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva
1. DNAs repetitivos. 2. I Heterocromatina. 3. Macroteiidae.
I.Título
CDD 597.09
Sinopse:
Cinco espécies de macroteídeos foram estudadas mediante análises de citogenética
clássica (coloração convencional, detecção da heterocromatina e regiões organizadoras
de nucléolo) e moleculares (hibridização fluorescente in situ de DNA repetitivo em
tandem e disperso, Cot1-DNA, clonagem e sequenciamento). Os resultados obtidos
demonstraram que DNAs repetitivos estão normalmente associados à heterocromatina e
diferenças na composição desta fração repetitiva entre os teídeos são evidentes. Esta
possui papel importante na organização funcional e estrutural do centrômero e telômero
destas espécies.
Palavras-chave: Macroteiidae, Heterocromatina, DNAs repetitivos, Centrômero,
Telômero.
v
ESTRESSEEE nãããooo!!! EINSTRESEEE!!
Quando alguém o crítica ou algo não dá certo, você fica irritadíssimo? Se você tem esse
sintoma, você está estressado. E se está estressado, bom, você é NORMAL.
Augusto Cury
vi
A realização deste estudo foi possível devido:
Ao Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva
(GCBEV).
Ao Laboratório de Citogenômica Animal (LACA) onde todas as análises foram
realizadas.
Aos financiamentos fornecidos pelo projeto Rede BioPHAM (CNPq/FAPEAM
Processo: 563348/2010-0), Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento
Tecnológico (Processo: 474617/2013-0), CAPES (Processo: 23038.009447/2013-45),
Programa Pro-Amazonia Biodiversidade e Sustentabilidade (Processo: 047/2012) e
FAPEAM (PN. 020/2013).
À Fundação de Amparo a Pesquisas do Estado do Amazonas (FAPEAM) pela
concessão da bolsa de estudo durante a realização deste trabalho.
vii
Agradecimentos
Desde já agradeço a todos, que de forma direta ou indiretamente, contribuíram
para a realização deste trabalho.
À minha orientadora Dra. Profa. Maria Claudia Gross por ter me aceitado como
orientada, pelos conhecimentos, conselhos, puxões de orelha, sugestões, apoio,
confiança e pelo exemplo de profissional. À Maria Claudia Gross por tantas coisas que
nem sei por onde começar..... mas quero agradecer principalmente pela sua amizade, por
estar sempre disponível as minhas aflições e angústias pessoais, por tantos momentos de
“desentedimentos, desavenças” (olha que não foram poucos) mas você tão preocupada
em me proteger de tantas coisas que eu nem imaginava que estivesse acontecendo.
Muito abrigada por tudo de coração. Serei eternamente grata por todos os momentos
que me incentivou a crescer tanto o pessoal quanto o profissional. Agradeço por tudo e
muito mais!!
Ao meu coorientador Dr. Carlos Henrique Schneider pela sua coorientação,
ensinamentos, discussões, críticas e sugestões. Ao “Carlão” pela amizade, pelos bons
momentos no laboratório, nas coletas (lembra “Eu não quero comer”, hahaha) e
principalmente por ter me aguentado desde o mestrado até o doutorado. Afinal, sempre
serei “Papagaio de pirata”.
Aos professores Dr. Roberto Artoni, Dra. Mara Almeida, Dr. Marcelo Vicari, Dra.
Viviane Nogaroto, Miguel e aos colegas do Laboratório de Citogenética Animal da
Universidade Estadual de Ponta Grossa, pela ajuda durante o período que fiquei no
laboratório da UEPG.
Aos meus professores da graduação e pós-graduação pelos inúmeros ensinamentos
durante toda a minha vida acadêmica.
Aos amigos do Laboratório de Citogenômica Animal (LACA) pelo companheirismo,
amizade e principalmente por todos os momentos que passamos juntos: Francijara
Araújo, Erika Milena, Sabrina Mitozo (Sassá), Sabrina Araújo, Vanessa Pinheiro,
Leonardo Goll e tantos os outros que passaram pelo LACA (Camila, Rafael, Marília,
viii
Karol, Mariah, Renan, Jéssica, Thaís, Ana Carolina, Vanessa Salles e Dayane).
Obrigada pela agradável convivência diária, é claro sem ABRAÇOS!!! Essa é a
Família LACA...amável!!
À minha família, meu motivo de orgulho, exemplo de vida. Obrigada por tudo e por
acreditarem em mim durante toda a minha vida. Aos meus pequenos sobrinhos por me
mostrar que vale a pena viver. Amo vocês mais que tudo nessa vida.
Ao meu marido (namorido) Rogério de Oliveira Neves por mostrar-me que é
maravilhoso estar ao seu lado... Neguinho, te amo!!!
Aos amigos Edson, João, Julia, Thatianna, Camila, Leila e Maria Leandra por estarem
sempre presentes na minha vida, alguns quilômetros de distância porém tão próximos de
coração!!
Obrigada a todos!
ix
Resumo
Macroteídeos são lagartos Neotropicais da família Teiidae, a qual apresenta variação
cariotípica quanto ao número diploide e diferenças nos padrões de distribuição da
heterocromatina. Contudo, o mapeamento físico cromossômico de DNAs repetitivos
bem como análises comparativas destes elementos são incipientes no grupo, sendo
fundamentais para o entendimento da dinâmica, organização e a carioevolução destes
lagartos. Diante disto, o presente estudo isolou e mapeou diferentes classes de
sequências de DNAs repetitivos, tais como fração repetitiva Cot1-DNA, DNAr 5S,
sequências teloméricas, genes da tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1 e SINE em
cromossomos mitóticos de cinco espécies de teídeos amazônicos: Ameiva ameiva,
Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin.
O mapeamento das sequências repetitivas revelou um padrão diferenciado em
Cnemidophorus sp.1, enquanto que as demais espécies apresentaram todas as
sequências associadas entre si na região heterocromática. O mapeamento físico
cromossômico do gene da tropomiosina 1 foi realizado pela primeira vez em lagartos e
revelou que, além de ser funcional, este possui função estrutural semelhante aos demais
elementos repetitivos mapeados, estando localizados preferencialmente nas regiões
centroméricas e terminais dos cromossomos. A FISH com Cot1-DNA isoladas tanto de
Ameiva ameiva quanto de Cnemidophorus sp.1 evidenciou que estas sequências estão
localizadas principalmente nas regiões heterocromáticas centroméricas e teloméricas
dos cromossomos de Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e
Tupinambis teguixin. Em Cnemidophorus sp.1 a sonda de Cot1-DNA isolada de Ameiva
ameiva apresentou múltiplas marcações intersticiais nos cromossomos, enquanto que o
mapeamento do Cot1-DNA isolado da própria espécie marcou regiões centroméricas de
alguns cromossomos, ressaltando a composição centromérica diferencial nesta espécie.
A clonagem e o sequenciamento do Cot1-DNA evidenciou que diferentes
microssatélites, transposons, retrotransposons e algumas famílias gênicas também
compõe a fração de DNA moderada e altamente repetitiva nas espécies de teídeos.
Assim, os resultados obtidos neste estudo demonstraram que diversas classes de DNAs
repetitivos fazem parte do genoma das espécies analisadas, estando estes intercalados e
alocados na heterocromatina, especialmente em regiões centroméricas e teloméricas,
xi
Abstract
Macroteiids Neotropical lizards Teiidae family. Classical cytogenetic approaches in this
group revealed karyotype variation with diploid numbers ranging 34-52 chromosomes,
as well as differences in the distribution patterns of heterochromatin and composition
thereof. However, the physical chromosomal mapping of repetitive DNA and
comparative analysis of these elements is incipient fundamental to the understanding of
the dynamics, organization and carioevolution this group of lizards. In that sense, this
study mapped different classes of sequences of repetitive DNA, such as 5S rDNA,
telomeric sequences, genes of tropomyosin 1 and retrotransposons Rex 1 and SINE and
repetitive fraction Cot1-DNA in chromosomes of five species of Ameiva ameiva,
Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps and Tupinambis
teguixin. The mapping of repetitive sequences revealed a distinct pattern in
Cnemidophorus sp.1, while the remaining species showed all sequences associated with
each other in the heterochromatic region. The chromosomal physical mapping of
tropomyosin 1 gene was first performed in lizards and revealed that in addition to being
functional, has a structural function similar to the other mapped repetitive elements
(rDNA 5S, telomeric sequences, retrotransposons Rex 1 and SINE) being located
preferably in the centromeric regions of chromosomes and terminals. The FISH Cot1-
DNA isolated from both Ameiva ameiva much Cnemidophorus sp.1 showed that these
sequences are mainly located in the regions heterochromatic centromeric and telomeric
chromosome of Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps and
Tupinambis teguixin. In Cnemidophorus sp.1 the Cot1-DNA probe isolated from
Ameiva ameiva had multiple interstitial markings on chromosomes, while the mapping
Cot1-DNA isolated from the species itself marked centromeric regions of some
chromosomes, highlighting the centromeric differential composition in this species. The
cloning and sequencing oh the repetitive fraction showed that different microsatellites,
transposons, retrotransposons and some gene families also make up the fraction of
moderately and highly repetitive DNA in the species teídeos. The results of this study
demonstrated that different classes of repetitive DNA are part of the genome of Ameiva
ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps and
Tupinambis teguixin, being interspersed heterochromatin and differences in the
composition of this repetitive fraction between teideos are evident. These sequences
xii
plays an important role in the functional and structural organization of the centromere
and telomere these species.
xiii
Sumário
1 Introdução .................................................................................................................... 20
1.1 Considerações sobre os teídeos ................................................................................ 20
1.2 Citogenética de teídeos ............................................................................................. 22
1.3 DNAs repetitivos ...................................................................................................... 24
3 Objetivos ...................................................................................................................... 28
3.1 Geral ......................................................................................................................... 28
3.2 Específicos ................................................................................................................ 28
4 Material e Métodos ...................................................................................................... 29
4.1 Material ..................................................................................................................... 29
4.2 Métodos .................................................................................................................... 31
4.2.1 Indução de mitoses ................................................................................................ 31
4.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos a partir de colchicina in vitro (Ford e
Hamerton, 1956) ............................................................................................................. 31
4.2.3 Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C) ........................................... 32
4.2.4 Detecção das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) ..................................... 32
4.2.5 Extração de DNA................................................................................................... 33
4.2.6 Isolamento de sequências repetitivas através da técnica de Cot- DNA (DNA
enriquecido com sequências alta e moderadamente repetitivas) .................................... 34
4.2.7 Isolamento de sequências repetitivas via PCR (Polymerase Chain Reaction) e
marcação da sonda por nick translation ......................................................................... 34
4.2.8 Marcação das sondas ............................................................................................. 36
4.2.9 Hibridização in situ por fluorescência – FISH ...................................................... 36
4.2.10 Análise cariotípica ............................................................................................... 38
4.2.11 Clonagem ............................................................................................................. 38
4.2.12 Sequenciamento dos fragmentos de DNA repetitivo .......................................... 39
4.2.13 Análise das Sequências ........................................................................................ 39
5. Resultados e discussão ............................................................................................... 41
5.1 Artigo 1 - Análises citogenéticas de cinco espécies de lagartos amazônicos das
subfamílias Teiinae e Tupinambinae e revisão da diversidade cariotípica a família
Teiidae. ........................................................................................................................... 42
5.1.2 Introdução .............................................................................................................. 44
5.1.3 Material e Métodos ................................................................................................ 45
xiv
5.1.4 Resultados .............................................................................................................. 48
5.1.5 Discussão ............................................................................................................... 50
5.2 Artigo 2 - DNAs repetitivos na organizacao do genoma de especies de lagartos
amazonicos da família Teiidae ....................................................................................... 66
5.2.2 Introdução .............................................................................................................. 68
5.2.3 Material e Métodos ................................................................................................ 70
5.2.4 Resultados .............................................................................................................. 73
5.2.5 Discussão ............................................................................................................... 94
5.3 Artigo 3 – Composição diferencial de DNAs repetitivos na região centromérica em
espécies de lagartos amazônicos..................................................................................... 99
5.3.2 Introdução ............................................................................................................ 101
5.3.3 Material e Métodos .............................................................................................. 102
5.3.4 Resultados ............................................................................................................ 105
5.3.5 Discussão ............................................................................................................. 111
6 Conclusão .................................................................................................................. 122
7 Referências Bibliográficas ......................................................................................... 123
xv
Lista de figuras
Introdução
Figura 1. Filogenia entre os gêneros das subfamílias Tupinambini (a, b, c) e Teiinae (d,
e, f). (a) Hipótese de Vanzolini e Valencia, 1965; Gorman, 1970; (b, e) Hipótese de
Presch, 1974; (c, f) Hipótese de Teixeira, 2003; (d) Hipótese de Gorman, 1970.
Figura 2. Mapa mostrado a área geográfica, onde os pontos amarelos representam os
locais de coleta.
Capítulo 1
Figura 1. Cariótipos de espécies pertencentes subfamília Teiinae: (a), (e), (i) e (m)
Coloração convencional; (b), (f), (j) e (n) Regiões de heterocromatina evidenciada pela
técnica de banda C; (c), (g), (k) e (o) em destaque o par nucleolar impregnado com
AgNO3; (d), (h), (l) e (p) em destaque o par portador do sítio de DNAr 18S (vermelho)
e cromossomos contracorados com DAPI. Barra de escala representam 10 µm.
Figura 2. Cariótipos de Tupinambis teguixin: (a) Coloração convencional; (b) Regiões
de heterocromatina evidenciada pela técnica de banda C; (c) em destaque o par
nucleolar impregnado com AgNO3; (d) em destaque o par portador do sítio de DNAr
18S (vermelho) e cromossomos contracorados com DAPI. m=Macrocromossomo,
mi=microcromossomo. Barra de escala representa 10 µm.
Capítulo 2
Figura 1. Cariótipos evidenciando o DNAr 5S (sítios vermelhos) das espécies
pertencentes a subfamília Teiinae: (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus sp.1, (c)
Kentropyx calcarata, (d) Kentropyx pelviceps e da subfamília Tupinambinae: (e)
Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contra corados com DAPI. a=série
gradual de cromossomos acrocêntricos. m=Macrocromossomo, mi=microcromossomo.
Barra de escala representam 10 µm.
Figura 2. Cariótipos evidenciando as sequências teloméricas (sítios vermelhos) das
espécies pertencentes a subfamília Teiinae: (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus
sp.1, (c) Kentropyx calcarata, (d) Kentropyx pelviceps e da subfamília Tupinambinae:
(e) Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contra corados com DAPI. a=série
xvi
gradual de cromossomos acrocêntricos. m=Macrocromossomo, mi=microcromossomo.
Barra de escala representam 10 µm.
Figura 3. Cariótipos evidenciando o gene da tropomiosina 1 (sítios vermelhos) das
espécies pertencentes a subfamília Teiinae: (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus
sp.1, (c) Kentropyx calcarata, (d) Kentropyx pelviceps e da subfamília Tupinambinae:
(e) Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contracorados com DAPI. a=série
gradual de cromossomos acrocêntricos. m=Macrocromossomo, mi=microcromossomo.
Barra de escala representam 10 µm.
Figura 4. Cariótipos evidenciando o retroelemento Rex 1 (sítios vermelhos) das
espécies pertencentes a subfamília Teiinae: (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus
sp.1, (c) Kentropyx calcarata, (d) Kentropyx pelviceps e da subfamília Tupinambinae:
(e) Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contra corados com DAPI. a=série
gradual de cromossomos acrocêntricos. m=Macrocromossomo, mi=microcromossomo.
Barra de escala representam 10 µm.
Figura 5. Cariótipos evidenciando o retroelemento SINE (sítios vermelhos) das espécies
pertencentes a subfamília Teiinae: (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus sp.1, (c)
Kentropyx calcarata, (d) Kentropyx pelviceps e da subfamília Tupinambinae: (e)
Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contra corados com DAPI. a=série
gradual de cromossomos acrocêntricos. m=Macrocromossomo, mi=microcromossomo.
Barra de escala representam 10 µm.
Figura 6. Double fiber-FISH em fibras cromatínicas estendidas de Kentropyx calcarata
utilizando sondas de DNAr 5s (sítios verdes), sequências teloméricas (sítios verdes),
genes da tropomiosina 1 (sítios vermelhos) e o retroelemento Rex 1 (sítios vermelhos).
(a) DNAr 5s (b) genes da tropomiosina 1 (c) DNAr 5s + genes da tropomiosina 1 (d)
DNAr 5s + genes da tropomiosina 1 + DAPI (e) sequência telomérica (f) Rex 1 (g)
sequência telomérica + Rex 1 (h) sequência telomérica + Rex 1 + DAPI. O mesmo
padrão foi observado para as demais espécies analisadas no presente estudo. Barra de
escala representam 10 µm.
Capítulo 3
xvii
Figura 1. FISH com a sonda homóloga de Cot1-DNA de Ameiva ameiva (a), e de
Cnemidophorus sp.1 (b). Os cromossomos foram contracorados com DAPI. Barra de
escala: 10 µm.
Figura 2. Cariótipos com a sonda de Cot1-DNA5 de Ameiva ameiva hibridizada
(vermelho). (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus sp.1, (c) Kentropyx calcarata, (d)
Kentropyx pelviceps e (e) Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contracorados
com DAPI. a=série gradual de cromossomos acrocêntricos. m=Macrocromossomo,
mi=microcromossomo. Barra de escalas: 10 µm.
Figura 3. Idiograma de Ameiva ameiva. Em preto, heterocromatina; em verde claro,
genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s; em amarelo, sequências
teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em
verde escuro, Cot1-DNA da própria espécie. a=série gradual de cromossomos
acrocêntricos.
Figura 4. Idiograma de Cnemidophorus sp.1. Em preto, heterocromatina; em verde
claro, genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s; em amarelo, sequências
teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em
verde escuro, Cot1-DNA de Ameiva ameiva.
Figura 5. Idiograma de Kentropyx calcarata. Em preto, heterocromatina; em verde
claro, genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s; em amarelo, sequências
teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em
verde escuro, Cot1-DNA de Ameiva ameiva. a=série gradual de cromossomos
acrocêntricos.
Figura 6. Idiograma de Kentropyx pelviceps. Em preto, heterocromatina; em verde
claro, genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s; em amarelo, sequências
teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em
xviii
verde escuro, Cot1-DNA de Ameiva ameiva. a=série gradual de cromossomos
acrocêntricos.
Figura 7. Idiograma de Tupinambis teguixin. Em preto, heterocromatina; em verde
claro, genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s; em amarelo, sequências
teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em
verde escuro, Cot1-DNA de Ameiva ameiva. m=Macrocromossomo,
mi=microcromossomo.
xix
Lista de tabelas
Capítulo 1
Tabela 1. Espécies das subfamílias Teinae e Tupinambinae: Local de coleta, número e
sexo dos animais analisados e espécimes voucher (lotes) são listados. AM: Amazonas.
Tabela 2. Compilação da literatura dos dados citogenéticos básicos para a família
Teiidae. Na tabela apresenta o número diploide (2n), fórmula cariotípica (FC), número
fundamental (NF). Três descrições de formulas cariotípicas: (a) número de
cromossomos de dois braços, número de cromossomos de braço único e número de
microcromossomos; (b) série gradual de cromossomos do tipo acrocêntricos; (c)
cromossomos macrocromossomos (M) e microcromossomos (mi). Para dados não
indicados nas publicações foi utilizada a simbologia “--”.
Tabela 3. Dados citogenéticos de bandamentos diferenciais compilados da literatura
para a família Teiidae. Na tabela apresenta o local da coleta, regoes organizadoras de
nucléolos (RONs), heterocromatina constitutiva (HC), hibridização in situ fluorescente
(FISH). Localidade: Amazonas (AM), Bahia (BA), Estados Unidos (USA), Espírito
Santo (ES), Goiás (GO), Mato Grosso (MT), Minas Gerais (MG), Pará (PA), Rio de
Janeiro (RJ), Rio Grande do Sul (RS), Rondônia (RO), São Paulo (SP), Sergipe (SE),
Tocantins (TO). Para dados não indicados nas publicações foi utilizada a simbologia “--
”.
Capítulo 3
Tabela 1. Espécies das subfamílias Teinae e Tupinambinae: Local de coleta, número e
sexo dos animais analisados e espécimes voucher (lotes) são listados. AM: Amazonas.
Tabela 2. Sequências repetitivas obtidas pela fração Cot1-DNA de Ameiva ameiva e
similaridade das sequências conhecidas em banco de dados públicos.
Tabela 3. Sequências repetitivas obtidas pela fração Cot1-DNA de Cnemidophorus sp.1
e similaridade das sequências conhecidas em banco de dados públicos.
20
1 Introdução
1.1 Considerações sobre os teídeos
A biodiversidade é a medida da diversidade de organismos numa região,
incluindo a variação genética, a unidade taxonômica, o endemismo e os complexos
ecológicos nos quais inclui a diversidade dentro de espécies, entre espécies e em nível
de ecossistemas (Ricklefs, 2003). Baseado neste contexto, estima-se que existem
atualmente 15 milhões de espécies no mundo e 1,8 milhões destas seriam encontradas
no Brasil, país considerado o principal dentre os portadores de megadiversidade (Aguiar
et al., 2004; Lewinsohn e Prado, 2005). Destas espécies brasileiras, 760 espécies, mais
48 subespécies, totalizando 808 táxons, pertencentes às ordens Crocodylia (6 espécies),
Testudines (36 espécies) e Squamata (72 espécies de anfisbênias, 386 espécies + 40
subespecies de serpentes e 260 espécies + 8 subespecies de lagartos) (SBH, 2014),
destacando-se que 281 espécies deste último grupo são encontrados na Amazônia
brasileira e, destes, 85 são espécies de lagartos alocados nas famílias Anguidae,
Gekkonidae, Gymnophthalmidae, Iguanidae, Scincidae e Teiidae (Ávila - Pires, 1995;
Ávila - Pires et al., 2007).
A família Teiidae pertence à infraordem Scincomorpha e são conhecidos
popularmente como macroteídeos devido à contraposição ao seu grupo irmão, a família
Gymnophthalmidae, conhecidos como microteídeos. Teiidae compreende 151 espécies
válidas restritas ao Novo Mundo, ocorrendo desde o nordeste dos Estados Unidos até a
Argentina, as quais estão distribuídas em três subfamílias: Teiinae composto pelos
gêneros Ameiva, Ameivula, Aurivela, Aspidoscelis, Contomastix, Cnemidophorus,
Dicrodon, Holcosus, Kentropyx, Medopheos e Teius; Tupinambinae composto pelos
gêneros Crocodilurus, Dracaena, Salvator e Tupinambis; e Callopistinae composto pelo
gênero Callopistes (Harvey et al., 2012). Os gêneros Aspidoscelis, Ameiva, Holcosus,
Kentropyx e Cnemidophorus apresentam um complexo de espécies e são considerados
os mais diversos dentre os teídeos. Aspidoscelis é composto por cinco grupos: grupo
cozumela, deppei, sexlineatus, tigris e tesselatus; Ameiva é composto por cinco grupos:
ameiva, bifrontata, dorsalis, erythrocephala e incertae; Holcosus é composto por três
grupos: grupo orcesi, septemlineatus e undulatus; Kentropyx é composto por 3 grupos:
grupo calcarata, striata e paulensis; Cnemidophorus possui quatro grupos: grupo
lemniscatus, nigricolor, murinus e vanzoi (Harvey et al., 2012). Na Amazônia são
21
encontradas 13 espécies de lagartos distribuídas nos gêneros Ameiva, Cnemidophorus,
Crocodilurus, Dracaena, Kentropyx e Tupinambis (Ávila - Pires et al., 2007).
As espécies de Teiidae morfologicamente apresentam corpo relativamente
esquios, com caudas longas em formato de chicote, a cabeça terminando em focinhos
estreitos. A língua é bífida e são lagartos de grande porte, alguns atingindo mais de um
metro de comprimento (Vitt et al., 2008). A maioria das espécies são forrageadoras
ativas, heliotérmicas mantendo a temperatura corpórea relativamente alta durante o
período de atividade e estão presentes em uma variedade de ambientes, incluindo semi-
arborícolas, semi-aquáticas e terrestres (Silva e Araújo, 2008). A reprodução é sempre
ovípara e as ninhadas podem ser grandes, frequentemente proporcionais ao tamanho das
fêmeas (Silva e Araújo, 2008). Várias espécies são partenogenéticas, como algumas do
gênero Aspidoscelis (Lowe e Wright, 1966; Wright, 1967; Fritts, 1969; Neaves, 1969;
Lowe et al., 1970; Mckimey et al., 1973; Scudday, 1973; Maringuez-Moran et al.,
2000), Cnemidophorus (Peccinini, 1971; Cole e Dessauer, 1993; Rocha et al., 1997) e
Kentropyx (Cole et al., 1995).
A determinação do sexo em lagartos pode ter influência ambiental ou ser
genotípica (Deeming et al., 1988; Crews, 2003; Janzen e Phillips, 2006; Gamble, 2010).
A determinação genotípica está relacionada a fatores genéticos durante a fertilização
dos ovócitos, com a presença de genes específicos envolvidos na determinação sexual
(Kasahara et al., 1996; Janzen e Phillips, 2006). Já a determinação ambiental ocorre em
principalmente em função de diferentes temperaturas de incubação de ovos, que
influenciam a diferenciação gonadal, sendo observado em algumas espécies da família
Anguidae e Gekkonidae (Wagner, 1980; Langerwerf, 1984; Tokunaga, 1985). Com
relação à teídeos, não há estudos sobre a influência da temperatura na determinação
sexual, porém nas espécies Aspidocelis tigres tigres e Ameivula littoralis foi observado
um sistema cromossômico sexual do tipo XX:XY, sendo o macho heterogamético (Bull,
1978; Peccinini-Seale et al., 2004).
Com relação à importância ecológica dos teídeos, estes constituem elementos
essenciais para a dinâmica ecológica dos sistemas naturais, uma vez que ocupam
posições específicas dentro da organização trófica dos ecossistemas, sejam eles como
predadores ou presas, o que pode influenciar outras populações de seres vivos. Ainda,
os lagartos têm sido amplamente utilizados como organismos modelo de estudos
ecológicos, morfológicos, sistemáticos, genéticos e citogenéticos visando conhecer os
22
padrões de distribuição das espécies, as relações entre a variabilidade ambiental,
identificação taxonômica, conhecimento da filogenia e da diversidade genética e
composição cariotípica, fornecendo informações relevantes sobre a biologia destas
espécies (Pinka e Vitt, 2003; Camargo et al., 2010).
1.2 Citogenética de teídeos
Dentre os teídeos, cerca de 70% das espécies já possuem seu cariótipo descrito,
revelando uma alta taxa de evolução cromossômica e genomas maiores devido ao
acúmulo de sequências repetitivas de DNA, sendo que a maioria das espécies apresenta
ausência de cromossomos sexuais diferenciados, onde machos e fêmeas possuem
constituição cromossômica idêntica (Kasahara et al., 1996, Reeder et al., 2002; Olmo et
al., 2005). Ainda, análises cromossômicas permitiram o reconhecimento de dois grupos
citogenéticos na família Teiidae: a) grupo Dracaena (atual subfamília Tupinambinae),
composto por cariótipo apresentando de 34 a 38 cromossomos e clara distinção entre
macrocromossomos e microcromossomos; b) grupo Ameiva (atual subfamília Teiinae)
com o número diploide de 46 a 56 cromossomos e sem uma clara distinção entre os
macros e microcromossomos (Gorman, 1970). Caracteres osteológicos corroboraram os
dados cromossômicos e foi proposta a existência de duas tribos para os teídeos: Teiini
(grupo Dracaena) e Tupinambini (grupo Ameiva) (Presch, 1974; 1983). Mais tarde, ao
serem analisados numerosos caracteres osteológicos e de tecidos moles estas tribos
foram elevadas a categoria de subfamília: Teiinae e Tupinambinae. Ainda, análises com
caracteres morfológicos na família Teiidae propuseram a presença de três subfamílias:
Teiinae, Tupinambinae e Callopistinae (Harvey et al., 2012). Recentemente, analises
baseadas em caracteres moleculares indicaram que Teiidae é composto por duas
subfamílias, Teiinae e Tupinanambinae (Pyron et al., 2013). Estas duas subfamílias
formam o grupo monofilético Teiioidea, restrito ao Novo Mundo, e grupo-irmão dos
Lacertidae do Velho Mundo (Estes et al., 1988). Apesar do monofiletismo das
subfamílias Teiinae e Tupinambinae, as relações filogenéticas entre os gêneros de
teídeos são controversas, não havendo consenso entre as árvores filogenéticas propostas
(Gorman, 1970; Vanzolini e Valencia, 1965; Presch, 1974; Teixeira, 2003; Giugliano et
al. 2007). Na subfamília Tupinambinae, dados cromossômicos (Gorman, 1970) e
morfológicos (Vanzolini e Valencia, 1965) indicam que Tupinambis e Dracaena são
23
grupos-irmãos (Figura 1a), enquanto que dados osteológicos suportam Tupinambis e
Crocodilurus como gêneros irmãos (Figura 1b- Presch, 1974). Porém, a combinação de
análises morfológicas com a ultra-estrutura de espermatozóide favoreceu o agrupamento
irmão de Crocodilurus e Dracaena (Figura 1c - Teixeira, 2003). Na subfamília Teiinae,
análises filogenéticas indica um grupo monofilético englobando Ameiva, Kentropyx,
Aspidoscelis e Cnemidophorus e a posição dos gêneros Dicrodon e Teius é incerta na
árvore filogenética (Gorman, 1970; Presch, 1974; Teixeira, 2003- Figura 1d, e, f).
Figura 1. Filogenia entre os gêneros das subfamílias Tupinambini (a, b, c) e Teiinae (d,
e, f). (a) Hipótese de Vanzolini e Valencia, 1965; Gorman, 1970; (b, e) Hipótese de
Presch, 1974; (c, f) Hipótese de Teixeira, 2003; (d) Hipótese de Gorman, 1970.
Número diploide igual a 36 cromossomos, composto por 12 macrocromossomos
(M) e 24 microcromossomos (m) é considerado o cariótipo ancestral para a subfamília
Tupinambinae (Gorman, 1973) e também para a ordem Squamata (Gorman e Atkins,
1967; Paull et al., 1976; Bickham, 1984). Para a subfamília Teiinae, o cariótipo com 50
cromossomos seria o ancestral e teria se originado por rearranjos cromossômicos do
tipo fissão envolvendo os macrocromossomos de um cariótipo ancestral da subfamília
Tupinambinae (Gorman, 1973). Porém, estas proposições estão baseadas em
informações citogenéticas referentes à coloração convencional, com a determinação do
24
número diploide e número fundamental de braços, que são as mais abundantes para os
teideos. Ainda, poliploidia foi observada em algumas espécies de teídeos, onde ocorre
sempre em forma triploide (Lowe e Wright, 1966; Wright, 1967; Fritts, 1969; Neaves,
1969; Lowe et al., 1970; Mckimey et al., 1973; Scudday, 1973; Maringuez-Moran et
al., 2000).
Algumas espécies da família Teiidae possuem análises pormenorizadas da
estrutura e organização dos cromossomos revelada através de técnicas de coloração
diferencial, como a detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) por
impregnação de nitrato de prata e a caracterização dos padrões de heterocromatina
constitutiva pela banda C. Estas técnicas diferenciais têm se revelado um caráter útil e
informativo para a taxonomia e a sistemática, muitas vezes apresentando padrões
espécie-específicos (Porter et al., 1991; Rocha et al., 1997; Peccinini-Seale et al., 2004;
Santos et al., 2007; 2008). Com relação às regiões organizadoras de nucléolos foi
evidenciado RON simples com uma variação na localização das RONs em algumas
espécies dos gêneros Ameiva, Ameivula, Cnemidophorus, Crocodilurus, Kentropryx,
Salvator e Tupinambis. Enquanto que Ameivula nativo e Teius oculatus apresentam
RONs múltiplas (Rocha et al., 1997; Veronese et al., 2003).
Grande quantidade de heterocromatina, localizadas nas regiões centromérica,
pericentromérica e telomérica da maioria dos cromossomos foram observadas em
algumas espécies dos gêneros Ameiva, Ameivula, Aspidoscelis, Cnemidophorus,
Crocodilurus, Kentropryx e Tupinambis. Estes blocos de heterocromatina constitutiva
podem abrigar sequências repetitivas de DNA, que compreendem uma grande parte do
genoma dos eucariotos.
1.3 DNAs repetitivos
Os DNAs repetitivos fazem parte do genoma dos eucariotos e podem estar
organizados in tandem ou podem ser encontrados dispersos no genoma (Charlesworth et
al., 1994). As sequências repetitivas in tandem como as sequências satélites,
minissatélites, microssatélites e famílias multigênicas, enquanto que as sequências
repetitivas dispersas englobam os elementos transponíveis (Nei e Rooney, 2005).
Os elementos transponíveis são encontrados geralmente dispersos no genoma e
podem ser de dois tipos: retrotransposons e os transposons, que são classificados de
acordo com sua organização estrutural e mecanismo de transposição destas sequências
25
(Charlesworth et al., 1994; Kidwell, 2002; Martins, 2007; Böhne et al., 2008). Os que
são do primeiro tipo também são chamados de elementos de classe I e transpõem via
transcrição reversa do seu RNA, sendo três tipos: elementos longos intercalados (long
interspersed elements-LINEs), elementos curtos intercalados (short intersperser
elements-SINEs) e os que possuem longas repetições terminais (long terminal repeats-
LTRs). O segundo tipo são os transposons ou elementos de classe II que se
movimentam-se pelo genoma através de cópias de DNA (Kidwell, 2002; Martins,
2007). Diversas famílias de elementos transponíveis estão presentes no genoma de
lagartos, como LINE (L1, RTE, jockey e R2), LTR retrotransposons (Metaviridae,
Pseudoviridae, Retroviridae - class I e BEL retroelements) e transposons (cut and paste,
hAT, PIF/Harbinger, Tc1/mariner, rolling circle - Helitrons e self-syntheizing -
Polintons/Mavericks) (Kordis, 2009). Porém, a organização genômica destes elementos
transponíveis nos cromossomos ainda não está elucidada.
Os genes da tropomiosina constituem uma família gênica, altamente conservadas
no genoma, que codificam quatro genes distintos, sendo eles TPM 1 (TPMα), TPM 2
(TPMβ), TPM 3 (TPMγ) e TPM 4 (TPMδ) e essas apresentam várias isoformas que são
produzidas através do processo de splicing alternativo ou promotores alternativos
(Vrhoviski et al., 2008; Barua, 2013; Janco et al., 2013). Esta família gênica parece
exercer diversas funções celulares, tais como a migração celular, citocinese, transporte
intracelular e contração muscular (Vrhoviski et al., 2008; Barua, 2013). Contudo, até o
momento não é conhecido o padrão de distribuição destas sequências em cromossomos
de lagartos e este marcador é interessante para estudos evolutivos. Para este grupo, as
informações relativas à organização do genoma restrigem-se a mapeamento físico
cromossômicos de genes ribossomais, DNA telomérico e DNA satélite.
Os DNAs ribossomais estão organizados em duas famílias multigênicas
distintas, o DNAr 45S e DNAr 5S, composta por um número variável de repetições em
diferentes genomas. O DNA ribossomal 45S consiste de uma unidade transcricional que
codifica os RNAs ribossomais 28S, 18S e 5,8S e um espaçador intergênico não
transcrito (IGS) (Martins, 2007). Estas sequências correspondem às regiões
organizadoras de nucléolo, que podem ser detectadas indiretamente pela impregnação
de proteínas ribossomais com nitrato de prata quanto diretamente por hibridização in
situ fluorescente (FISH) utilizando sondas de genes da família RNAr 45S (Martins et
al., 2011). Já o DNAr 5S consiste em sequências codificantes de 120 pb que são
26
separadas uma das outras por um DNA espaçador não transcrito (NTS) de tamanho
variável, cuja variação relaciona-se com a ocorrência de deleções ou inserções, presença
de pseudogenes ou pequenas repetições (Martins et al., 2000; 2002; Wasko et al., 2001;
Galetti Jr e Martins, 2004; Martins, 2007). Os sítios de DNAr 5S apresentam uma só
sequência repetida in tanden, geralmente em um único par cromossômico, mas podem
ocorrer em dois ou mais pares e só podem ser observados com a FISH (Guerra, 2004).
Para espécies da família Teiidae, a localização física cromossômica com sonda
de DNAr 28S evidenciou marcação em um par de microcromossomos em Ameiva
auberi, enquanto que Aspidoscelis marmorata foi localizado em um par de
macrocromossomos (Porter et al., 1991). Para outra família de lagartos (Agamidae)
sondas de DNAr 45S (18 e 28S) estavam localizadas no primeiro par cromossômico
para Leiolepis belliana belliana (2n=36), Leiolepis reevesii rubritaeniata (2n=36) e
Leiolepis boehmei (2n=34). Com relação ao sítio de DNAr 5S este foi mapeado no sexto
par nas três espécies de Leiolepis, sugerindo uma conservação na localização física
cromossômica deste gene. Contudo, autores que sugerem fusões reposionando o DNAr
45 provavelmente ocorreram em algumas espécies de Leiolepinae (Srikulnath et al.,
2009a, b; 2011).
Rearranjos cromossômicos têm sido evidenciados, na maioria das vezes, com a
localização física cromossômica de sequências teloméricas, que consistem de repetições
curtas ricas em guanina (TTAGGG)n, normalmente presentes nos extremidades dos
cromossomos. Estas sequências são amplamente conservadas nos genomas de
vertebrados, sendo regiões de extrema importância na estabilidade aos cromossomos,
uma vez que estão associadas à multiproteínas que formam o complexo Shelterin,
protegendo-os da degradação, além de permitirem a replicação completa do DNA e
integridade dos cromossomos (Nanda et al., 2002; Guerra, 2004; Multani et al., 2006;
Monagham, 2010). Assim, o aparecimento de sítios teloméricos intersticiais tem sido
relacionado com o processo evolutivo envolvendo telômeros, tais como fusões,
inversões e translocações a partir de uma condição ancestral, durante a evolução
cariotípica em várias espécies. Para espécies de teídeos do gênero Aspidoscelis, a
hibridização com sondas teloméricas evidenciou ITSs em seus cromossomos, indicando
ter surgido a partir de eventos de amplificações dos ITS por meio dos DNAs satélites
(Meyne et al., 1990; Rovatsos et al., 2015). Já em espécies de outras famílias, gêneros
Lepossoma e Polychrus, a hibridização com sondas teloméricas evidenciou sítios
27
teloméricos intersticiais, o que sugere resquícios de eventos de fusão/fissão ocorridos
durante a evolução cariotípica (Pellegrino et al., 1999; Bertolotto et al., 2001). No
entanto, muitos cromossomos rearranjados podem não mostrar estes sítios teloméricos
insterticiais devido à processos moleculares de erosão de sequências de DNA repetitivos
e a proteção desses ITS (sequências similares àquelas presentes nos telômeros) pelo
complexo Shelterin durante o reparo do DNA (Mandrioli et al., 1999; Wood et al.,
2015). Estudos recentes têm mostrado que sítios teloméricos intersticiais (ITSs) são
bastante comuns em espécies de Squamata (anfisbênias, serpentes e lagartos), onde
estão localizados em regiões pericentroméricas, regiões centroméricas e/ou intersticial
(Rovatsos et al., 2015).
Tanto os elementos transponíveis como os DNAs satélites/microssatélites podem
estar relacionadas com o surgimento de cromossomos sexuais heteromórficos
(Giovannotti et al., 2009; Martins et al., 2011). Por exemplo, em Eremias velox
(Lacertidae) certas sequências de microssatélites foram extensivamente acumuladas no
genoma e encontram-se alocadas em parte do cromossomo W, favorecendo a
heterocromatinização ou adição de heterocromatina promovendo um heteromorfismo
dos cromossomos sexuais (Porkoná et al., 2011).
Assim, o mapeamento físico cromossômico de diferentes classes de DNAs
repetitivos nas espécies de teídeos amazônicas Ameiva ameiva, Cnemidophorus sp.1,
Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin são imprescindíveis
para a compreensão da organização do genoma deste grupo de lagartos. A comparação
da localização física cromossômica destas sequências de DNA entre as diferentes
espécies pode proporcionar melhor visão do genoma das espécies e de como ocorreu à
evolução deste grupo. Ainda, a análise cariotípica de indivíduos provenientes de regiões
de possível endemismo e que até o momento foram pouco amostradas pode favorecer a
elucidação da diversidade oculta, permitindo o reconhecimento citogenético dos táxons.
28
2 Objetivos
2.1 Geral
Caracterizar citogenomicamente as espécies de teídeos Ameiva ameiva,
Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin
provenientes da Amazônia, visando contribuir na diferenciação dos táxons, melhor
entendimento da organização genômica e sua carioevolução dos mesmos.
2.2 Específicos
Comparar o cariótipo das espécies de teídeos coletados em diferentes localidades
da Amazônia com os descritos na literatura para cada táxon.
Estabelecer os padrões de distribuição da heterocromatina constitutiva (Banda
C) e da região organizadora de nucléolo (RONs) em cromossomos mitóticos.
Mapear sequências de DNA repetitivo, visando compreender como estes
elementos se comportam entre as espécies de teídeos.
Comparar a organização do genoma destas espécies, utilizando as sequências de
DNA repetitivas isoladas para o mapeamento cromossômico.
29
3 Material e Métodos
3.1 Material
Foram analisadas citogenomicamente as espécies de lagartos Ameiva ameiva,
Cnemidophorus sp.1 (em processo de descrição pelo Dr Federico Arias – Universidade
de São Paulo), Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin
coletadas no estado do Amazonas, Brasil, nas seguintes localidades:
1) Florestas nas margens do rio Jatapu, município de São Sebastião do Uatumã.
2) Florestas nas margens dos Rios Darahá e Ayuanã, ambos no município de
Santa Isabel do Rio Negro.
3) Floresta na margem do Rio Purus, município de Tapauá.
4) Floresta na margem do rio Cuieiras, no município de Manaus.
5) Floresta da Reserva Florestal Adolpho Ducke, no município de Manaus.
6) Área urbana do município Manaus – Bairro Parque 10 de Novembro.
Figura 2. Mapa mostrado a área geográfica, onde os pontos amarelos representam os
locais de coleta.
30
Excetuando os pontos de coleta 5 e 6, em todas as áreas foram estabelecidas
grades de amostragem padronizadas. Para cada ponto de amostragem foi formado por
um conjunto de seis trilhas de 2 km cada, sendo três de cada margem do rio. Cada trilha
foi distanciada 1 km uma da outra. Em cada trilha foram abertas 6 picadas em curva de
nível, distribuídas nas seguintes posições: ponto zero (início da trilha), 500 m, 1000 m,
2000 m. As trilhas partiram da margem do rio de referência para o interior da floresta.
Para a amostragem das espécies de lagartos foram utilizados três métodos mais
eficientes para inventários de herpetofauna em floresta de terra firme na Amazônia
(Pinto, 2006; Moraes, 2008).
No primeiro método foi efetuado o transecto de amostragem visual, que é uma
combinação do método de levantamento por encontros visuais (visual encounter
surveys, Crump e Scott, 1994) e do método de contagem pontual (usado principalmente
por ornitólogos). Três pessoas percorreram a linha central da parcela (250 m),
registrando todos os indivíduos avistados durante o percurso, que deve durar, no
mínimo, 1 hora. A cada 25 ou 50 m ocorre uma parada de 5 minutos, durante os quais
serão registrados todos os animais avistados.
No segundo método foi efetuada busca ativa, onde os animais foram amostrados
por busca ativa visual, a qualquer hora do dia, sem limitação de tempo para a atividade
(este foi o único método utilizado para os pontos de coleta 5 e 6).
E no último método foi utilizado armadilhas do tipo pitfall que consistiram em
uma série de baldes de 62L enterrados no solo ao nível do chão e com 8 m equidistantes
entre si. Os baldes foram ligados por uma cerca-guia com aproximadamente 1 m de
altura, de forma que o animal seja guiado para cair no balde. Cada unidade amostral de
pitfalls consistiu em uma linha de 11 baldes enterrados no chão e conectados pela cerca-
guia. Essa disposição resulta em uma amostragem de um trecho de 80 m na floresta. Em
cada expedição, foram instaladas um total de 18 unidades amostrais, três em cada trilha
de 2 km, e os baldes serão vistoriados uma vez ao dia.
Ressalta-se que estes três métodos de amostragem foram utilizados em função do
desenho amostral adotado no projeto Sistema Nacional de Pesquisa em Biodiversidade-
Diversidade filogenética da Amazônia (SISBIOTA-BioPham/CNPq-FAPEAM). Os
animais foram levados vivos para o laboratório, de campo ou laboratório de
Citogenômica Animal da UFAM, onde foram eutanaziados com dose letal de anestésico
para a retirada da medula óssea para a preparação das suspensões celulares e amostras
31
de tecido muscular ou cauda foram armazenadas em tubo de eppendorf com álcool
absoluto para análise molecular. Os exemplares testemunhos foram fixados em
formaldeído 10% (injetados na cavidade celomática e trato digestório), armazenados em
álcool 70%. Os espécimes testemunhos foram depositados na Coleção Herpetológica do
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Lotes: INPA H31712, 33213, 34791,
34841, 35018). A identificação das espécies foi efetuada pelo pesquisar Federico Arias,
da Universidade de São Paulo.
3.2 Métodos
3.2.1 Indução de mitoses
Para estimular a divisão celular e a resposta imunológica, foi utilizada a técnica
descrita por Oliveira et al. (1988), que consistiu em preparar uma solução de fermento
biológico na seguinte proporção: 0,5 g de fermento, 0,5 g de açúcar e 20 mL de água
destilada. Esta solução foi incubada em estufa a 37°C por cerca de 20 minutos, e
posteriormente foi injetada no animal intraperitonealmente na proporção de 1 mL para
cada 100 g do peso do animal vivo. Os lagartos foram mantidos à temperatura
aproximada a 30 °C por um período de 24 a 48 horas antes da coleta das amostras para
análise citogenética.
3.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos a partir de colchicina in vitro (Ford e
Hamerton, 1956)
Após o tempo da aplicação da solução de fermento biológico, o animal foi
eutanaziado com dose letal de anestésico Tiopental sódico. Em seguida foram retirados
os fêmures e cortada as epífises. O canal ósseo foi lavado sucessivas vezes em solução
hipotônica de KCl a 0,075M e transferido para outro recipiente de vidro contendo cerca
de 10 mL da solução hipotônica de KCl, onde foi dissociado com seringas. Foi
acrescentado 0,5 mL de solução de colchicina 0,025% e a suspensão celular obtida foi
colocada em estufa a 37 °C por 30 minutos. Em seguida o material foi ressuspendido
cuidadosamente com o auxílio de uma seringa desprovida de agulha e transferido para
um tubo de centrífuga, utilizando-se uma pipeta Pasteur. Foram adicionadas 1 mL de
fixador Carnoy 3:1 (metanol: ácido acético), recém preparado e gelado e a amostra foi
centrifugada por 10 minutos a 900 rpm, descartando-se o sobrenadante. Posteriormente,
32
foi adicionado com cuidado 8 mL de fixador Carnoy 3:1, ressuspendendo o material
cuidadosamente com o auxílio de uma pipeta Pasteur e esta lavagem foi repetida por
mais duas vezes. Após a última centrifugação e eliminação do sobrenadante foram
adicionados 1,5 mL de fixador e o material foi ressuspendido com cuidado. Esta
suspensão celular foi guardada em tubos eppendorf e mantida em freezer para posterior
utilização.
Para a preparação das lâminas, as mesmas foram colocadas em solução
sulfocrômica por 24 horas. Após este período, foram retiradas, lavadas em água corrente
e destilada e armazenadas em álcool 100%. As lâminas foram imersas em água destilada
a 45 °C, em banho-maria. Após 5 minutos, foram retiradas da água e a suspensão
celular foi gotejada sobre três pontos diferentes da lâmina, que foi seca diretamente ao
ar. Em seguida, as amostras foram coradas com Giemsa 5% diluído em tampão fosfato
0,06M e pH 6,8, por 10 minutos, lavadas em água destilada e secas ao ar.
3.2.3 Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C)
Para a detecção da heterocromatina constitutiva foi utilizada a técnica descrita
por Sumner (1972), com algumas modificações. As lâminas com a suspensão celular
foram tratadas em solução de HCl 0,2N a 45 °C, por 2 minutos, lavadas rapidamente em
água destilada à temperatura ambiente e secas ao ar. Após isso as lâminas foram
incubadas por cerca de 30 segundos em solução de hidróxido de bário a 5%, recém
preparada e filtrada a 42 °C. Posteriormente, a ação do hidróxido de bário foi
interrompida imergindo-se rapidamente a lâmina em solução de HCl 0,2N (temperatura
ambiente), lavada em água destilada e deixada secar ao ar. Após secas, as lâminas foram
incubadas em solução 2xSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trisódico 0,03M, pH 6,8)
em banho-maria a 60 °C, por 15 minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadas várias
vezes em água destilada e secas ao ar. As lâminas foram coradas com solução de
Giemsa (diluída a 5% em tampão fosfato 0,06M e pH 6,8) durante 10 minutos, lavadas
em água destilada e secas.
3.2.4 Detecção das regiões organizadoras de nucléolo (RONs)
Para a detecção das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foi utilizada a
técnica descrita por Howell e Black (1980), com modificações. Sobre as lâminas com a
suspensão foram adicionadas 2 gotas de uma solução coloidal de gelatina (2 g de
33
gelatina comercial sem sabor, dissolvida em 100 mL de água destilada, acrescida de
1mL de acido fórmico) e, sobre cada gota de gelatina, duas gotas de solução aquosa de
nitrato de Prata (AgNO3) a 50%, agitando-se levemente a lâmina, que foi coberta com
lamínula. A lâmina foi colocada em câmara úmida, em banho-maria a 60 °C, durante 3
a 8 minutos. Após esse tempo, quando a lâmina adquiriu uma coloração marrom
dourada, a mesma foi lavada em água destilada, permitindo que a lamínula seja retirada
naturalmente pela própria água e seca ao ar.
3.2.5 Extração de DNA
A extração de DNA foi realizada a partir do tecido muscular da coxa ou cauda,
utilizando o protocolo básico de Sambrook e Russel (2001) com algumas modificações.
Foram macerados aproximadamente 20 mg de tecido muscular e transferidos para um
tubo de volume de 1,5 mL. Em seguida foram adicionados 500 µL de tampão de lise
(Tris-HCl 10 mM em pH 8,0, NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, SDS 1%) conforme Estoup
et al. (1993). Posteriormente foram acrescentados: 15 L de proteinase K (10 mg/mL) e
6 L de RNAse (10 mg/mL). As amostras foram incubadas a 60 ºC por
aproximadamente 2 horas para que o tecido seja totalmente digerido. Foram adicionados
100 µL de acetato de amônio 3M, 1 volume (600 µL) de fenol-clorofórmio (1:1) e
agitado por inversão, por alguns minutos. Após isso as amostras foram centrifugadas
por 30 minutos a 14.000 rpm em temperatura ambiente. O sobrenadante foi transferido
para um novo tubo, adicionados 600 µL de clorofórmio e misturado, cuidadosamente,
por alguns minutos, por inversão. Em seguida, a mistura foi centrifugada por 20
minutos a 14.000 rpm. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e foram
acrescentados 100 µL de acetato de amônio 3M, 1 volume (600 µL) de isopropanol
gelado e misturado gentilmente por inversão. O precipitado foi deixado a -20 °C por
cerca de 14 horas. O material foi retirado do freezer e centrifugado por 30 minutos a
14.000 rpm, descartando-se o sobrenadante. O pellet foi lavado com 1 mL de etanol
70% e centrifugado por 20 minutos a 14.000 rpm. Novamente, o sobrenadante foi
descartado, o pellet foi seco em estufa a 55 °C, ressuspendido em 100 μl de TE 0,2X ou
água milli-Q e deixado eluindo por 14 horas. Para possibilitar a análise da quantidade e
integridade do material, o DNA extraído foi quantificado em espectrofotômetro
NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).
34
3.2.6 Isolamento de sequências repetitivas através da técnica de Cot1- DNA (DNA
enriquecido com sequências alta e moderadamente repetitivas)
O isolamento de sequências repetitivas foi baseado na cinética de reassociação
do DNA (Zwick et al., 1997; Ferreira e Martins, 2008). O DNA genômico foi diluído a
100-500 ng/µl em 0,3 M NaCl. Em tubos de 1,5 ml foi colocado 50 µl de amostras de
DNA de Ameiva ameiva e Cnemidophorus sp.1 (50 μl de 100-500 ng/μl de DNA em
0,3 M NaCl) Em seguida, em tubos com os DNAs foram autoclavados por 5 minutos
a 1,4 atm/120 oC. Foi aplicado 3 µl do DNA autoclavado em gel de agarose 1% para
checar o tamanho dos fragmentos obtidos (ideal obter fragmentos entre 100 e 1.000 pb).
Após, o material foi desnaturado 3 alíquotas (tubos 0, 1 e 5) com 50 µl do DNA
autoclavado em banho a 95 oC por 10 minutos. Os tubos foram colocados em gelo por
10 segundos: tratar imediatamente o tubo 0 com enzima S1 nuclease e colocar os tubos
1 e 5 em banho a 65 oC para renaturação. Após 1 minuto, foi retirado o tubo 1 e tratado
com S1 nuclease e após 5 minutos, foi retirado o tubo 5 e tratado com S1 nuclease. Para
o tratamento com S1 nuclease, foi utilizado 1U da enzima para cada 1 µg de DNA (5,5
µl tampão 10× para o volume final de 50 µl). Foi incubado a 37 oC por 8 minutos.
Posteriormente as amostras foram congeladas imediatamente em nitrogênio líquido. Foi
adicionado volume igual de fenol/clorofórmio (1:1) e centrífugado por 5 minutos a
13.000 rpm. Foi transferida para um novo tubo a fase aquosa e foi precipitado o DNA
com 2,5 volumes de etanol absoluto gelado. O material foi deixado no freezer a 75 oC
negativos por 30 minutos. Após o tempo, foi centrifugado por 15 minutos a 15.000 rpm
a 4 oC e deixado secar. Em seguida, o material foi ressuspendido em 50 µl de água ultra-
pura estéril autoclavada. Posteriormente o tamanho do fragmento foi checado por
comparação com marcador de Low Mass DNA 1 Kb, em eletroforese padrão (com
tampão Tris-Borato-EDTA 0,5X e corrida a 70 V por 40 minutos) em gel de agarose
0,8%, corado com GelRed Acid Gel Stain (Biotium 1:500). A visualização e análise do
DNA no gel foram feitas no fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency), o qual
possui acoplado um transluminador de luz ultravioleta (260 nM).
3.2.7 Isolamento de sequências repetitivas via PCR (Polymerase Chain Reaction) e
marcação da sonda por nick translation
Sequências repetitivas em tandem já identificadas e caracterizadas como
conservadas em outros vertebrados foram estudadas, tais como DNAr 18S, DNAr 5S,
35
genes da tropomiosina 1 e sequências teloméricas. Para a obtenção das sondas de DNAr
18S, DNAr 5S e genes da tropomiosina 1 foram utilizados o DNA genômico extraído do
músculo ou cauda de um exemplar de teídeos. As sondas foram obtidas por amplificação
por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), conforme Saiki et al. (1988) utilizando os
primers: DNAr 5S F (5’- CGA GGTCGGGCCTGGTTAGTA-3’) e 5S R (5’-
CTTCYGAGATCAGACGAGATC-3’) desenhados a partir de uma sequência consenso
entre diversas classes de vertebrados (mamíferos, reptéis, anfíbios e peixes); DNAr 18S
(IpF 5’CCGCTTTGGTGACTCTTGAT e IpR 5’CCGAGGACCTCACTAAACCA)
(Gross et al., 2010); Tropomiosina 1 F (5’- GAGTTGGATCGGGCTCAGGAGCG-3’) e
TROP 1 R (5’-CGGTCAGCCTCTTCAGCA ATGTGCTT-3’) (Friesen et al., 1999).
Para sequências teloméricas as amplificações foram feitas sem DNA com os seguintes
primers: (TTAGGG)5 e (CCCTAA)5 (Ijdo et al., 1991).
Os ciclos de amplificação seguiram as seguintes etapas:
a) 5S: 1 minutos a 94 ºC (desnaturação inicial); 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C
(desnaturação), 1 minuto a 59 °C (ligação dos primers), 1 minuto e 30 segundos a 72 °C
(extensão), e 5 minutos a 72 °C (extensão final).
b) 18S: 2 minutos a 94 ºC (desnaturação inicial); 35 ciclos de 1 minuto a 95 ºC
(desnaturação), 1 minuto a 55 ºC (ligação dos primers), 1 minuto e 40 segundos a 72 ºC
(extensão); 7 minutos a 72 ºC (extensão final).
c) TROP 1: 3 minutos a 95 °C (desnaturação inicial); 35 ciclos de 30 segundos a
95 °C, 30 segundos a 58 °C (ligação dos primers), e 1 minuto e 20 segundos a 72 °C
(extensão); de 5 minutos a 72 °C (extensão final).
d) Telomérica: a primeira parte da amplificação é feita em baixa estringência: 4
minutos a 94 °C (desnaturação inicial), 12 ciclos de 1 min at 94 °C (desnaturação), 45
segundos a 52 °C (ligação dos primers) e 1 minutos e 30 segundos a 72 °C (extensão);
seguida por 35 ciclos de alta estringência: 1 minuto a 94 °C (desnaturação), 1 minuto e 30
segundos a 60 °C (ligação dos primers) e 1 minuto e 30 segundos a 72 °C(extensão); 7
minutos a 72 ºC (extensão final).
Elementos transponíveis já identificadas e caracterizadas como conservadas em
outros vertebrados, tais como Rex 1 e SINE também foram testado utilizando os
seguintes primes: a) Rex1 (RTX1-F1 5’TTCTCCAGTGCCTTCAACACC e RTX1-R3
5’TCCCTCAGCAGAAAGAGTCTGCTC) (Volff et al., 1999, 2000, 2001a); b) SINE
36
SAURIA (SQ1F 5’CCCWGCTCCTGCCAACCTAGC e SQ1R 5’TAG
TCATGCTGGCCACATGACC) (Piskurek et al., 2006).
As reações de PCR foram feitas em um termociclador Eppendorf - Mastercycler
Gradient, para volume final de 15 μL (1 μL de DNA genômico (100 ng); 1,5 μL de
Tampão 10X com cloreto de magnésio (1,5 mM); 0,15 μL de Taq DNA polimerase
(5U/µl); 3,0 μL de dNTP (1 mM); 0,6 μL de cada primer (5 mM); água milli-Q para
completar o volume).
3.2.8 Marcação das sondas
As sondas isoladas (Cot1-DNA e PCR) foram marcadas pelo método de nick
translation utilizando biotina 14-dATP (Bionick labeling system-Invitrogen) e/ou
digoxigenina-11-dUTP (Dig-Nick Translation mix Roche). Para tanto, em um tubo de
eppendorf de 1,5 mL, mantido no gelo, foi preparada uma solução contendo 1 μL de
Mix dNTP 10x; 1 μL de sonda de DNA (200 ng/ μL); 1 μL de Mix de enzima 10x; 6 μL
de água milli-Q, totalizando 9 μL, para cada lâmina que foi hibridizada. Esta solução foi
homogeneizada, centrifugada brevemente e incubada a 16 ºC por 90 minutos no
termociclador. Em seguida, para interromper a reação, foi adicionado 1 μL de stop
buffer (EDTA 0,5 M) e após isso foi mantida em freezer para posterior utilização.
3.2.9 Hibridização in situ fluorescente – FISH
Foi utilizada a técnica de hibridização in situ por fluorescência (FISH) descrita
por Pinkel et al. (1986). Foram utilizadas como sondas sequências teloméricas, genes da
tropomiosina 1, DNAs ribossomais e elementos transponíveis obtidos por PCR e as
sequências repetitivas obtidas pelo Cot1-DNA.
Tratamento das lâminas
As lâminas foram lavadas em tampão PBS 1x por 5 minutos em temperatura
ambiente. As lâminas foram desidratadas em série alcoólica gelada (70%, 85% e 100%)
durante 5 minutos cada. Em seguida foram tratadas com 90 µl de RNase 10 µg/mL (5
µL de RNase 10 mg/mL e 975 µL de 2XSSC) por 1 hora em câmara úmida a 37 ºC. As
lâminas foram lavadas três vezes em 2xSSC durante 5 minutos cada. Após isso, as
lâminas foram lavadas em PBS 1x durante 5 minutos.
Fixação
37
As lâminas foram fixadas em formaldeído 1% em PBS 1X/50mM MgCl2 durante
10 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente lavadas em PBS 1x por 5 minutos.
Após, as lâminas foram desidratadas em série alcoólica gelada (70%, 85% e 100%)
durante 5 minutos cada.
Pré-hibridização
As lâminas foram desnaturadas em formamida 70% em 2xSSC a 70 ºC por 5
minutos e novamente desidratadas em etanol gelado 70%, 85% e 100% por 5 minutos
cada.
Solução de hibridização
Em um tubo eppendorf, foram adicionados 2,5 µl de sonda (produto de PCR), 25
µl de formamida, 10 µl de sulfato de dextrano 50%, 5 µl de 20Xssc e 7,5 µl de água
milliQ . A sonda foi desnaturada a 99 °C por 10 minutos e passada imediatamente ao
gelo.
Hibridização
Foram colocados 40 µl de solução de hibridização sobre uma lamínula e a
lâmina foi invertida sobre a lamínula. As lâminas foram mantidas com o material
voltado para baixo em câmara úmida (H20 destilada) a 37 °C por cerca de 14 horas.
Lavagens
As lamínulas foram removidas das lâminas. Em seguida foram lavadas duas
vezes em formamida 15% a 42°C durante 10 minutos cada. Em seguida, foi lavada em
solução Tween 0,5% durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Detecção
As lâminas foram incubadas em tampão NFDM por 15 minutos. Após foram
lavadas duas vezes com solução Tween 5% por 5 minutos a temperatura ambiente.
Foram colocadas sobre cada lâmina 20 µL de anti digoxigenina-rodamina e/ou 100 µL
de streptavidina Alexa Fluor 488/NFDM. Em seguida foram cobertas com lamínula e
deixadas por 60 minutos em câmara úmida com água destilada. Posteriormente as
lamínulas foram removidas e as lâminas foram lavadas três vezes em solução Tween
38
5% por 2 minutos a temperatura ambiente cada. As lâminas foram desidratadas em série
alcoólica 70, 85 e 100% durante 5 min cada. Ao final, esperar secar.
Montagem das lâminas
Foi adicionado a cada lâmina solução de DAPI diluído em antifade VectaShield
Vector (20 µL de antifade e 1 µL de DAPI).
3.2.10 Análise cariotípica
Após a análise e contagem dos cromossomos ao microscópio óptico foi
estabelecido o número diploide modal e suas frequências relativas para cada indivíduo.
As melhores metáfases obtidas com as técnicas clássicas (convencional, RON e banda
C) foram analisadas e capturadas em um microscópio óptico Zeiss AX10. As metáfases
submetidas a técnicas moleculares (FISH) foram analisadas e capturadas em
fotomicroscópio de epifluorescência LEICA ou em fotomicroscópio de epifluorescência
Olympus BX51, em objetiva de imersão. Para a montagem dos cariótipos foi utilizado o
programa Adobe Photoshop 7.0, versão CS5, a partir de cromossomos metafásicos
mitóticos, os quais foram recortados e tentativamente emparelhados. Os cromossomos
foram medidos, utilizando o programa livre ImageJ e organizados em ordem
decrescente de tamanho. A morfologia cromossômica foi determinada de acordo com os
critérios de relação de braços (RB=BM/Bm, onde BM = braço maior e Bm = braço
menor) segundo Levan et al. (1964). Os cromossomos foram organizados em ordem
decrescente de tamanho e a morfologia foi determinada baseada na razão entre os
braços como cromossomos metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocentricos
(st) e acrocêntricos (a). Dependendo da espécie, a fórmula cariotípica foi determinada
de acordo com a série gradual de cromossomos acrocêntricos ou número de
cromossomos portadores de dois braços, braço único e microcromossomos ou número
de macrocromossomos (M) e micromossomos (mi), para ser possível a comparação com
os dados descritos na literatura (Lowe e Wright 1966, Peccinini-Seale, 1981). Ressalta-
se que foram considerados microcromossomos aqueles com tamanho de até 2.5 μm,
puntiformes e não tem qualquer morfologia específica.
3.2.11 Clonagem
Os fragmentos de DNA isolados por Cot-1 e os produtos de PCR foram inseridos
independentemente nos vetores plasmidiais pMOSBlue blunt ended e pGEM-T
39
(Promega), respectivamente e foram utilizados para transformar bactérias competentes
Escherichia coli, linhagem DH5 preparadas no próprio laboratório.
Transformação de bactérias competentes Escherichia coli DH5 com os vetores
plasmidiais recombinantes:
Foi pipetado 50 µL de células de células competentes em um tubo eppendorf,
adicionado 10 µL do produto obtido na ligação às células competentes e foi misturado
suavemente. Em seguida, as células foram incubadas em gelo por 30 minutos e após, foi
dado um choque térmico nas células por exatos 5 minutos no banho-maria a 37 ºC.
Posteriormente, foi colocado em gelo por 10 minutos e adicionado 500 µL de meio LB
liquido em cada tubo. Foi colocado para agitar a 150 rpm por uma hora a 37 ºC.
Enquanto isso foi preparado o meio solido onde foi espalhado 30 µL de X-gal 2% e 20
µL IPTG 0,1 M em cada placa de meio de cultura sólido contendo ampicilina (50
µL/mL), para a seleção dos clones recombinantes, passado a uma hora as bactérias foi
plaqueadas e incubadas a 37 ºC durante uma noite (aproximadamente 16 horas).
3.2.12 Sequenciamento dos fragmentos de DNA repetitivo
Os fragmentos foram sequenciados pelo método de Sanger et al. (1977), com
terminadores marcados com fluorescência. Para a realização do sequenciamento, foi
feito um mix contendo 150 e 300 ng de DNA, 5 pmol de cada primer em reações
separadas; 4 L do premix (kit) e água mili-Q para completar o volume de 10 L. Essas
reações foram processadas em um termociclador em 30 ciclos sendo: desnaturação a 95
°C por 20 segundos, anelamento a 50 °C por 15 segundos e extensão a 72 °C por 1
minuto e 30 segundos. Os primers utilizados no sequenciamento foram primers
universais que se anelam nos plasmídios pMOS e pGEM-T utilizados como vetores de
clonagem. Depois de sequenciado, os fragmentos foram submetidos a um tratamento de
precipitação para a eliminação do produto não incorporado durante a reação de
sequenciamento e logo após foi realizada a leitura automática do fragmento no
sequenciador automático de ABI 3130 XL (Applied Biosystem) nas condições de
injeção e corrida recomendadas pelo fabricante.
3.2.13 Análise das Sequências
As amostras sequenciadas foram salvas (formato abd) e transferidas do
sequenciador para outro computador. Todas as sequências foram alinhadas utilizando-se
40
o programa de alinhamento múltiplo Clustal W (Thompson et al., 1994), que está
incluso no BioEdit v. 7.05.3 (Hall, 1999). O alinhamento gerado foi manualmente
conferido no mesmo programa.
Para identificação de possíveis homologias, as sequências nucleotídicas obtidas
foram submetidas a buscas online BLAST (“Basic Local Alignment Search Tool”)
(Altschul et al., 1990) através do National Center for Biotechnology Information
(NCBI) (USA), “website” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Para sequências de
elementos transponíveis foram submetidas buscas na base de dados Repbase do Genetic
Information Research Institute (http://www.girinst.org/censor/) utilizando o programa
on-line Censor (Kohany et al., 2006). As sequências geradas foram depositadas nestes
mesmos bancos de dados.
41
4 Resultados e discussão
Os resultados e discussão dos dados são apresentados na forma de três artigos
científicos:
4.1 Artigo 1- Análises citogenéticas de cinco espécies de lagartos amazônicos das
subfamílias Teiinae e Tupinambinae e revisão da diversidade cariotípica da família
Teiidae. Artigo aceito no periódico Comparative Cytogenetics. doi:
10.3897/CompCytogen.v9i4.5371.
4.2 Artigo 2 – DNAs repetitivos na organização do genoma de espécies de lagartos
amazônicos da família Teiidae. Submetido para publicação no periódico Cytogenetics
and Genome Research.
4.3 Artigo 3 – Composição diferencial de DNAs repetitivos na região centromérica em
espécies de lagartos amazônicos. Submetido para publicação no periódico Molecular
Cytogenetics.
42
5.1 Artigo 1 - Análises citogenéticas de cinco espécies de lagartos amazônicos das
subfamílias Teiinae e Tupinambinae e revisão da diversidade cariotípica da família
Teiidae
43
5.1.1 Resumo
Lagartos da família Teiidae (infraordem Scincomorpha) são conhecidos popularmente
como macroteídeos. Na região Amazônica, são encontradas 13 espécies destes lagartos
distribuídas nos gêneros Ameiva, Cnemidophorus, Crocodilurus, Dracaena, Kentropyx
e Tupinambis. Os estudos citogenéticos neste grupo restringem-se apenas a
macroestrutura cariotípica. Deste modo, foram realizadas uma compilação de dados
citogenéticos para a família Teiidae, além da inclusão de análises citogenéticas clássicas
(coloração convencional, Banda C e RON) e moleculares (FISH com sondas de DNAr
18S) de Ameiva ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx
pelviceps e Tupinambis teguixin, coletados no estado do Amazonas, Brasil. Para Ameiva
ameiva, K. calcarata e K. pelviceps foi encontrado 2n=50 cromossomos, sendo
classificados por uma série gradual de cromossomos acrocêntricos. Cnemidophorus sp.1
apresenta 2n=48 cromossomos, sendo 2 cromossomos portadores de dois braços, 24
cromossomos de braço único e 22 microcromossomos. Tupinambis teguixin apresenta
2n=36 cromossomos, sendo 12 macrocromossomos (M) e 24 microcromossomos (m). A
heterocromatina constitutiva apresentou-se distribuída nas regiões centroméricas e
terminais da maioria dos cromossomos. A região organizadora de nucléolo (RON),
apresentou-se simples, com uma variação na localização das mesmas entre as espécies,
evidenciada tanto por impregnação com AgNO3 como pela hibridização de sondas
DNAr 18S. Os dados obtidos revelaram uma variação cariotípica em relação ao número
diploide, número fundamental e fórmula cariotípica, o que reforça a importância no
aumento de análises cromossômicas na família Teiidae.
Palavras-chave: Macroteiids, Cromossomo, Heterocromatina, Coloração diferencial,
DNAr-FISH
44
5.1.2 Introdução
A família Teiidae é composta por lagartos conhecidos popularmente como
macroteídeos e são restritos ao Novo Mundo (Giugliano et al., 2007; Harley et al.,
2012). Harvey et al. (2012) recentemente dividiu Teiidae em três subfamílias: Teiinae
incluindo os gêneros Ameiva (Meyer, 1795), Ameivula (Spix, 1825), Aurivela (Bell,
1843), Aspidoscelis (Fitzinger, 1843), Contomastix (Dumésil e Bibron, 1839),
Cnemidophorus (Wagler 1830), Dicrodon (Dumésil e Bibron, 1839), Holcosus (Cope,
1862), Kentropyx (Spix, 1825), Medopheos (Bocourt, 1874) e Teius (Merrem, 1820);
(2) Tupinambinae, incluindo os gêneros Crocodilurus (Spix, 1825), Dracaena (Daudin,
1801), Salvator (Dumésil e Bibron, 1839) e Tupinambis (Daudin, 1802); e (3)
Callopistinae, composto por um único gênero Callopistes (Gravenhorst, 1837).
Contudo, a hipótese filogenética de Teiidae baseada em caracteres morfológicos
(Reeder et al., 2002; Giugliano et al., 2007) difere substancialmente de hipóteses
baseadas em DNA mitocondrial. A filogenia com base na morfologia é consistente com
padrões biogeográficos bem estabelecidos entre os vertebrados neotropicais (Harvey et
al., 2012).
A maioria dos dados cromossômicos para as espécies de teídeos referem-se à
determinação do número diploide e fórmula cariotípica (Fritts, 1969; Gorman, 1970;
Lowe et al., 1970; Robinson, 1973; Cole et al., 1979; de Smet et al., 1981; Navarro et
al., 1981; Ward and Cole, 1986; Cole et al., 1995; Markezich et al., 1997; Rocha et
al., 1997; Walker et al., 1997; Manriquen-Moran et al., 2000; Veronese et al., 2003).
Porém, apesar de incipientes, algumas espécies desta família possuem análises
pormenorizadas da estrutura e organização dos cromossomos revelada através de
técnicas de coloração diferencial, como as detecções de heterocromatina e as regiões
organizadoras de nucléolo (RONs), bem como mapeamento físico cromossômico de
sequências de DNA de interesse (Bickhan et al., 1976; Bull, 1978; Peccinini-Seale e
Almeida, 1986; Porter et al., 1991; Rocha et al., 1997; Veronese et al., 2003;
Peccinini-Seale et al., 2004; Santos et al., 2007; Santos et al., 2008).
De acordo com as análises citogenéticas, desde 1970 esta família encontra-se
dividida em dois grupos: o grupo Dracaena (atual subfamília Tupinambinae) com
cariótipo apresentando 34 a 38 cromossomos com distinção entre os
macrocromossomos (M) e microcromossomos (m); e o grupo Ameiva (atual subfamília
45
Teiinae) com número diploide de 46 a 56 cromossomos, sem distinção entre os macros
e microcromossomos (Gorman, 1970).
Deste modo, o objetivo do presente estudo foi caracterizar citogeneticamente
cinco espécies da família Teiidae: Ameiva ameiva (Linnaeus, 1758), Cnemidophorus
sp.1, Kentropyx calcarata (Spix, 1825), Kentropyx pelviceps (Cope, 1868) e
Tupinambis teguixin (Linnaeus, 1758) utilizando marcadores citogenéticos clássicos e
moleculares (coloração convencional, padrão de heterocromatina, localização das
regiões organizadoras de nucléolo e mapeamento físico cromossômico de sequências de
DNAr 18S). Ainda, a organização cariotípica desta família foi discutida.
5.1.3 Material e Métodos
Trinta e três espécimes pertencentes às subfamílias Teiinae e Tupinambinae
foram coletados no estado do Amazonas, Brasil, nas seguintes localidades: florestas nas
margens do rio Jatapu, município de São Sebastião do Uatumã (0º50' e 01º55'S; 58º50' e
60º10'W); rio Darahá e Ayuanã, ambos no município de Santa Isabel do Rio Negro
(0°24′24″N; 65°1′1″W); rio Purus, no município de Tapauá (5º42'115'' S; 63º13'684''
W); perímetro urbano de Manaus (3º07'13.03'' S; 60º01'440'' W). Todas as coletas foram
conduzidas com a licença do ICMBio/SISBIO 41825-1. Os locais de coleta estão
localizados em terras públicas (Tabela 1). Os animais foram eutanaziados logo após a
captura com uma dose letal de anestésico Tiopental sódico do anestésico onde foram
desprovidos de alimentos ou água. Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal da Fundação Universidade do Amazonas / Universidade
Federal do Amazonas (UFAM) (número 041/2013). Nenhuma espécie ameaçada de
extinção ou protegida foi utilizada neste estudo. Os animais foram submetidos aos
procedimentos citogenéticos, sendo posteriormente fixados com formaldeído 10%
(injetados na cavidade celomática e trato digestório) (Franco e Salomão, 2002) e
conservados em álcool 70%. Os espécimes testemunhos foram depositados na Coleção
Herpetológica do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA H31712, 33213,
34791, 34841, 35018).
46
Tabela 1. Espécies das subfamílias Teiinae e Tupinambinae: Local de coleta, numero e sexo dos animais analisados e espécimes voucher (lotes)
são listados. AM: Amazonas
Subfamília Espécies Local de coleta Número e sexo dos animais
analisados
Voucher (lotes)
Ameiva ameiva São Sebastião do Uatumã, AM
Santa Isabel do Rio Negro, AM
Tapauá, AM
11 (quatro machos;
três fêmeas;
quatro sem identificação do sexo)
INPA H33213
Cnemidophorus sp.1 Manaus, AM 13 (cinco machos; oito fêmeas) INPA H 35018
Teiinae Kentropyx calcarata São Sebastião do Uatumã, AM
4 (três machos;
uma fêmea)
INPA H31712
Kentropyx pelviceps Tapauá, AM
3 (três fêmeas)
INPA H34841
Tupinambinae Tupinambis teguixin São Sebastião do Uatumã, AM
Tapauá, AM
3 (duas fêmeas;
um sem identificação do sexo)
INPA H34791
47
As suspensões celulares foram obtidas a partir de medula óssea utilizando
colchicina in vitro segundo a técnica descrita por Ford e Hamerton (1956). A
heterocromatina constitutiva (HC) foi detectada utilizando o protocolo descrito por
Sumner (1972) e a região organizadora de nucléolo (RONs) foi detectada utilizando a
técnica de impregnação por nitrato de prata descrita por Howell e Black (1980).
O DNA genômico foi extraído a partir de tecido muscular utilizando o protocolo
de fenol-clorofórmio descrito por Sambrook e Russel (2001) e quantificado em
espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). O DNAr 18S foi amplificado
por reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os primers 18Sf (5’-CCG CTT
TGG TGA CTC TTG AT-3’) e 18Sr (5’-CCG AGGACC TCA CTA AAC CA-3’)
(Gross et al., 2010a). As reações de PCR foram realizadas em um volume final de 15
µL contendo DNA genômico (200 ng), tampão 10x com 1,5 mM de MgCl2, Taq DNA
polimerase (5 U/µL), dNTPs (1 mM), par de primers (5 mM), e água Milli-Q. O ciclo
de amplificação seguiram as seguintes etapas: 1 min 95 °C; 35 ciclos de 1 min a 94 °C,
1 min a 56 °C e 1 min 30 s a 72 °C; seguidos por 5 min a 72 °C. O produto de PCR de
DNAr 18S foi marcado por nick translation com digoxigenina-11-dUTP (Dig- Nick
Translation mix; Roche) segundo o protocolo do fabricante. A detecção da sonda foi
realizada utilizando anti-digoxigenina rodamina (Roche) foi usado para detectar o sinal
da sonda. Hibridizações homólogas e heterólogas foram realizadas de acordo com o
protocolo descrito por Pinkel et al. (1986) em condições de estringência de 77% (2,5
ng/µL de DNAr 18S, 50% formamida, 10% sulfato de dextrano, e 2x SSC a 37 °C por
18 h). Os cromossomos foram contra corados com DAPI (2 mg/ml) em meio de
montagem VectaShield (Vector).
Os cromossomos foram analisados usando o microscópio de epifluorescência da
Olympus BX51 e as imagens foram capturadas com a câmera digital (Olympus DP71)
usando o programa Image-Pro MC 6.3 software. As metáfases mitóticas foram
processadas no programa Adobe Photoshop CS5 e os cromossomos foram medidos
usando o Image J. Os cromossomos foram organizados em ordem decrescente de
tamanho e a morfologia foi determinada baseada na razão entre os braços como
cromossomos metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocentricos (st) e
acrocêntricos (a) (Levan et al., 1964). Para permitir comparação com o descrito na
literatura, a fórmula cariotípica foi determinada de acordo com a série gradual de
cromossomos acrocêntricos ou número de cromossomos portadores de dois braços,
48
braço único e microcromossomos ou número de macrocromossomos (M) e
micromossomos (mi) (Lowe e Wright, 1966, Peccinini-Seale, 1981). Ressalta-se que
foram considerados microcromossomos aqueles com tamanho de até 2.5 μm,
puntiformes e não tem qualquer morfologia específica.
5.1.4 Resultados
O número diploide para todos os indivíduos de Ameiva ameiva, Kentropyx
calcarata e Kentropyx pelviceps foi igual a 50 cromossomos, com uma série gradual de
cromossomos acrocêntricos (Figuras 1a, 1i e 1m). Cnemidophorus sp.1 apresenta 48
cromossomos com 2 cromossomos de dois braços, 24 cromossomos de braço único e 22
microcromossomos (Figura 1e). Tupinambis teguixin apresenta 36 cromossomos, sendo
12 macrocromossomos (M) e 24 microcromossomos (mi), sendo os pares de
macrocromossomos 1, 3, 4 e 5 metacêntricos e os pares 2 e 6 cromossomos
submetacêntricos (Figura 2a). Foi observado uma constrição secundária localizada na
região distal dos braços longos do par 1 em Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata e
Kentropyx pelviceps e do par 2 em Tupinambis teguixin (Figuras 1e, 1i, 1m e 2a).
Nenhum cromossomo sexual diferenciado foi observado nas espécies analisadas.
A heterocromatina constitutiva foi observada nas regiões centromérica e
terminal da maioria dos cromossomos de Ameiva ameiva, Cnemidophorus sp.1,
Kentropyx calcarata e Kentropyx pelviceps (Figura 1b; 1f; 1j e 1n). Em Tupinambis
teguixin, blocos heterocromáticos localizaram-se na região centromérica de todos os
macrocromossomos, além de blocos terminais tênues que foram visualizados nos macro
e microcromossomos (Figura 2b).
A RON apresentou-se como simples em todas as espécies analisadas. Em
Ameiva ameiva a RON foi localizada na região terminal dos braços longos do par 7
(Figura 1c). Em Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata e Kentropyx pelviceps a
RON foi evidenciado na região distal dos braços longos do par 1 e em Tupinambis
teguixin no par 2, coincidente com a constrição secundária presente nos cariótipos
destas espécies (Figuras 1g, 1k, 1o e 2c, respectivamente). A hibridização in situ
fluorescente (FISH) com sonda de DNAr 18S, evidenciou um par cromossômico
portador deste sítio, coincidente com a marcação por nitrato de Prata nas cinco espécies
analisadas (Figuras 1d, 1h, 1l, 1p e 2d).
49
Figura 1. Cariótipos de espécies pertencentes subfamília Teiinae: (a), (e), (i) e (m)
Coloração convencional; (b), (f), (j) e (N) Regiões de heterocromatina evidenciada pela
técnica de banda C; (c), (g), (k) e (o) em destaque o par nucleolar impregnado com
AgNO3; (d), (h), (l) e (p) em destaque o par portador do sítio de DNAr 18S (vermelho)
e cromossomos contracorados com DAPI. Barra de escala representam 10 µm.
50
Figura 2. Cariótipos de Tupinambis teguixin: (a) Coloração convencional; (b) Regiões
de heterocromatina evidenciada pela técnica de banda C; (c) em destaque o par
nucleolar impregnado com AgNO3; (d) em destaque o par portador do sítio de DNAr
18S (vermelho) e cromossomos contracorados com DAPI. m=Macrocromossomo,
mi=microcromossomo. Barra de escala representa 10 µm.
5.1.5 Discussão
Análises citogenéticas conduzidas para família Teiidae na década de 1970
indicavam que as espécies poderiam ser alocados em dois grupos: Ameiva, com número
diploide variando de 46 a 56 cromossomos, sem distinção entre os macros e
microcromossomos; grupo Dracaena, com cariótipo apresentando 34 a 38
cromossomos, com distinção entre os macrocromossomos e microcromossomos
(Gorman, 1970). Até o final da década de 1980, numerosos caracteres osteológicos,
morfológicos e de tecidos moles corroboraram os dados cromossômicos, sendo
considerada a existência destas duas subfamílias para os teídeos, que formavam o grupo
monofilético Teiioidea, restrito ao Novo Mundo, sendo este grupo-irmão dos
Lacertidae, do Velho Mundo (Presch, 1974; 1983; Estes et al., 1988).
O maior número de dados cariotípicos disponíveis refere-se a espécies da
subfamília Teiinae, com descrição do número diploide de 63 espécies (Tabela 2). Os
representantes de Teiinae cariotipados apresentam número diploide variando entre
2n=30 (Ameiva auberi) a 2n=54 (Teius oculatus e Teius teyou), além da presença de
51
cromossomos sexuais do tipo XX/XY em Aspidocelis tigris e Ameivula littoralis e da
presença de triploidia em algumas espécies de Aspidocelis, que apresentam 2n=3x=69
cromossomos. Hibridização interespecífica foi observada em algumas espécies do
gênero Aspidocelis, as quais estavam anteriormente alocadas no gênero Cnemidophorus
(Lowe et al., 1970; Walker et al., 1997; Lutes et al., 2000; Manríquez-Morán et al.,
2000). Se considerado os grupos propostos por Gorman (1970), os representantes da
subfamília Teiinae estariam alocados no grupo Ameiva. Contudo, algumas espécies
apresentam distinção entre macro e microcromossomos, apesar da maioria dos
cromossomos ser acrocêntrico, o que contraria o que foi proposto por Gorman (1970)
como característica citogenética do grupo.
52
Tabela 2. Compilação da literatura dos dados citogenéticos básicos para a família Teiidae. Na tabela apresenta o número diploide (2n), fórmula
cariotípica (FC), número fundamental (NF). Três descrições de formulas cariotípicas: (a) número de cromossomos de dois braços, número de
cromossomos de braço único e número de microcromossomos; (b) série gradual de cromossomos do tipo acrocêntricos; (c) cromossomos
macrocromossomos (M) e microcromossomos (mi). Para dados não indicados nas publicações foi utilizada a simbologia “--”.
Subfamília Gênero Espécie
(Harvey et al., 2012)
Espécie
(Descrição inicial)
2n Tipo de FC e descrição NF Referência
Callopistinae Callopistes Callopistes flavipunctatus Callopistes flavipunctatus 2n=38 c (12M+26m) 50 2
Callopistes maculatus Callopistes maculatus 2n=38 c (12M+26m) 26, 50 2, 8
Teiinae
Ameiva Ameiva ameiva Ameiva ameiva 2n=50 a (0: 26: 24)
b (série gradual de cromossomos acrocêntricos)
50 2, 18
Ameiva auberi Ameiva auberi 2n=30 a (8: 10:12) 38 11
Ameiva chrysolaema Ameiva chrysolaema 2n=50 a (0: 22: 28), (6: 20: 24) 50, 56 2
Ameiva dorsalis Ameiva dorsalis 2n=50 a (4: 22: 24) 54 2
Ameiva exsul Ameiva exsul 2n=50 a (0: 26: 24) 50 2
Ameiva maynardi Ameiva maynardi 2n=50 a (4: 22: 24) 54 2
Ameivula Ameivula nativo
Ameivula litorralis
Ameivula ocellifera
Cnemidophorus nativo
Cnemidophorus littoralis
Cnemidophorus ocellifera
2n=50
2n=46( XX/XY)
2n=50
a (5: 19: 24)
a (5: 19: 22)
b(série gradual de cromossomos acrocêntricos)
53
51
-
14
9
18
Aspidoscelis Aspidoscelis angusticeps Cnemidophorus angusticeps 2n=44, 46 a (6: 20: 18), a (2: 24: 20) 50, 48 3, 16
53
Aspidoscelis burti Cnemidophorus burti 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3
Aspidoscelis calidipes Cnemidophorus calidipes 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3
Aspidoscelis ceralbensis Cnemidophorus ceralbensis 2n=52 - - 4
Aspidoscelis communis Cnemidophorus communis 2n=46 a (2: 24:20) 48 3
Aspidoscelis costatus Cnemidophorus costatus 2n=46 a (2: 24:20) 48 3
Aspidoscelis cozumelae Cnemidophorus cozumelae 2n=49, 50 a (0: 28: 21), a (11: 19: 20) 49, 61 3, 16
Aspidoscelis deppei Cnemidophorus deppei 2n=50, 52 a (0: 26: 24), a (0: 28: 24) 50, 52 3, 16
Aspidoscelis exsanguis Cnemidophorus exsanguis 3n=69* - - 3, 10
Aspidoscelis flagellicaudas Cnemidophorus flagellicaudas 3n=69* - - 3
Aspidoscelis gularis Cnemidophorus gularis 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3
Aspidoscelis guttatus Cnemidophorus guttatus 2n=52 a (0: 28: 24) 52 3
Aspidoscelis hyperythrus Cnemidophorus hyperythrus 2n=52 a (0: 28: 24) 52 3
Aspidoscelis inoratus Cnemidophorus inoratus 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3, 10
Aspidoscelis laredoensis Cnemidophorus laredoensis 2n=46 a (2: 24: 20) 48 4
Aspidoscelis lineatissima Cnemidophorus lineatissima 2n=52 a (0: 28: 24) 52 3
Aspidoscelis marmoratus Cnemidophorus marmoratus 2n=46 a (0: 22: 24) 46 11
Aspidoscelis maslini Cnemidophorus maslini 2n=47 a (14: 13: 20) 49 3
Aspidoscelis mexicana Cnemidophorus mexicana 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3
Aspidoscelis motaguae Cnemidophorus motaguae 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3
54
Aspidoscelis neomexicanus Cnemidophorus neomexicanus 2n=46 a (4: 20: 22) 50 3,10
Aspidoscelis opatae Cnemidophorus opatae 3n=69* - - 3
Aspidoscelis parvisocius Cnemidophorus parvisocius 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3
Aspidoscelis rodecki Cnemidophorus rodecki 2n=50 - - 1
Aspidoscelis sacki Cnemidophorus sacki 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3
Aspidoscelis sptemvittatus Cnemidophorus sptemvittatus 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3
Aspidoscelis sexlineatus Cnemidophorus sexlineatus 2n=46 a (2: 24: 20), a (8: 18: 20) 48, 54 3, 5
Aspidoscelis sonorae Cnemidophorus sonorae 2n=46, 3n=69* a (4: 20: 22) 48 2, 3, 10
Aspidoscelis tesselatus Cnemidophorus tesselatus 2n=46, 3n=69* a (4: 20: 22) 50 3, 10, 15
Aspidoscelis tigris tigres Cnemidophorus tigris tigris 2n=46(XX/XY) a (6: 16: 24) 52 2, 10
Aspidoscelis tigris aethiops Cnemidophorus tigris aethiops 2n=46 a (6: 16: 24) 52 3
Aspidoscelis t. estebanensis Cnemidophorus t. estebanensis 2n=46 a (6: 16: 24) 52 3
Aspidoscelis t. gracilis Cnemidophorus t. gracilis 2n=46 a (6: 16: 24) 52 3
Aspidoscelis t. marmoratus Cnemidophorus t. marmoratus 2n=46 a (6: 16: 24) 52 3
Aspidoscelis t. maximus Cnemidophorus t. maximus 2n=46 a (6: 16: 24) 52 3
Aspidoscelis t. septentrionalis Cnemidophorus t. septentrionalis 2n=46 a (6: 16: 24) 52 3
Aspidoscelis ubiparens Cnemidophorus uniparens 3n=69* - - 3, 10
Aspidoscelis velox Cnemidophorus velox 3n=69* - - 3
Cnemidophorus Cnemidophorus arenivagus Cnemidophorus arenivagus 2n=50 a (2: 24: 24) 52 9, 13
55
Cnemidophorus arubensis Cnemidophorus arubensis 2n=50 a (2: 24: 24) 52 9, 13
Cnemidophorus cryptus Cnemidophorus cryptus 2n=50 - 52 9
Cnemidophorus gramivagus Cnemidophorus gramivagus 2n=50 - 52 9
Cnemidophorus lemniscatus Cnemidophorus lemniscatus 2n=50 a (2: 24: 24) 52 2, 3
Cnemidophorus murinus Cnemidophorus murinus 2n=50 a (2: 24:24) 52 4, 3
Cnemidophorus sp.1 - 2n=48 a (2: 24:22) 50 Presente
trabalho
Contomastix Contomastix lacertoides Cnemidophorus lacertoides 2n=50 a (0: 26: 24) 52 6, 17
Kentropyx Kentropyx borckiana Kentropyx borckiana 2n=50 a (0: 26: 24) 50 12
Kentropyx calcarata Kentropyx calcarata 2n=50 b(série gradual de cromossomos acrocêntricos) 50 12, 19
Kentropyx striata Kentropyx striata 2n=50 a (0: 26: 24) 50 12
Kentropyx paulensis Kentropyx paulensis 2n=50 b(série gradual de cromossomos acrocêntricos) 50 18
Kentropyx pelviceps Kentropyx pelviceps 2n=50 b(série gradual de cromossomos acrocêntricos) 50 Presente
trabalho
Kentropyx vanzoi Kentropyx vanzoi 2n=50 b(série gradual de cromossomos acrocêntricos) 50 18
Teius Teius oculatus Teius oculatus 2n=54 a (8: 28: 18) 62 17
Teius teyou Teius teyou 2n=54 a (8: 22: 24) 62 2
Tupinambinae
Crocodilurus - Crocodilurus lacertinus 2n=34 c (12M+22m) 46 2
Crocodilurus amazonicus Crocodilurus amazonicus 2n=34 c (12M+22m) 46 19
Dracaena Dracaena guianensis Dracaena guianensis 2n=38 a (10:2:26) 48 2
56
Tupinambis - Tupinambis nigropunctatus 2n=36, 38 a (10: 2: 24), c (16M+22m) 46, 54 2, 7
Tupinambis quadrilineatus Tupinambis quadrilineatus 2n=38 c (12M+26m) - 19
Tupinambis teguixin Tupinambis teguixin 2n=38, 36 a (10: 0: 28), (12M+24m) 48 7, 19
Salvator Salvator merianae Tupinambis merianae 2n=36, 38 a (10: 0: 26), c (12M+26m) 48, 50 7, 17, 19
* Poliploidia em forma triploide (3n). 1 – Fritts, 1969; 2 – Gorman, 1970; 3 - Lowe et al., 1970; 4 – Robinson, 1973; 5 - Bickham et al., 1976; 6 -
Cole et al., 1979; 7 - de Smet et al., 1981; 8 - Navarro et al., 1981; 9 - Peccinini-Seale e Almeida, 1986; 10 - Ward e Cole, 1986; 11 - Porter et
al., 1991; 12 - Cole et al., 1995; 13 - Markezich et al., 1997; 14 - Rocha et al., 1997; 15 - Walker et al., 1997; 16 - Manriquen-Moran et al.,
2000; 17 - Veronese et al., 2003; 18 - Santos et al., 2007; 19 - Santos et al., 2008.
57
Ameiva ameiva e Kentropyx calcarata apresentaram 2n=50 cromossomos
(presente estudo), o que corrobora os dados disponíveis na literatura para estas espécies,
provenientes de diferentes localidades (Peccinini-Seale e Almeida 1986; Gorman 1970;
Beçak et al., 1972; Schimid e Guttenbach 1988; Sites et al., 1990; Veronese et al.,
2003; Santos et al., 2007). Contudo, no presente trabalho A. ameiva e K. calcarata
apresentaram série gradual de cromossomos acrocêntricos devido à ausência de uma
separação de tamanhos entre esses cromossomos, similarmente ao descrito por Cole et
al. (1995) e Santos et al. (2007). O mesmo aconteceu em Kentropyx pelviceps, cujas
características citogenéticas foram reveladas pela primeira vez no presente trabalho.
Ainda, fórmulas cariotípicas compostas por cromossomos portadores de dois
braços, cromossomos portadores de braço único e os cromossomos microcromossomos
já foram descritas para Ameiva ameiva e Kentropyx calcarata e nos demais gêneros da
subfamília Teiinae (Lowe e Wright, 1966; Peccinini-Seale e Almeida, 1986; Gorman,
1970; Beçak et al. 1972; Schimid e Guttenbach, 1988; Sites et al., 1990; Veronese et
al., 2003), o que revela que algumas divergências ocorrem devido aos distintos
parâmetros de classificação adotados por vários autores em suas análises
cromossômicas.
Já o gênero Cnemidophorus é reconhecido como complexo, dividido em quatro
grupos:
(1) Cnemidophorus lemniscatus incluindo as espécies Cnemidophorus
arenivagus (Markezich, Cole e Dessauer, 1997), Cnemidophorus arubensis (Lidth de
Jeude, 1887), Cnemidophorus cryptus (Cole e Dessauer, 1993), Cnemidophorus
flavissimus (Ugueto, Harvey e Rivas, 2010), Cnemidophorus gramivagus (Mccrystal e
Dixon, 1987), Cnemidophorus lemniscatus espeuti (Boulenger, 1885), Cnemidophorus
lemniscatus gaigei (Ruthven, 1924), Cnemidophorus lemniscatus lemniscatus
(Linnaeus, 1758), Cnemidophorus lemniscatus splendidus (Markezich, Cole e Dessauer,
1997), Cnemidophorus pseudolemniscatus (Cole e Dessauer, 1993), Cnemidophorus
senectus (Ugueto, Harvey e Rivas, 2010) e Cnemidophorus sp. B.;
(2) Cnemidophorus nigricolor incluindo as espécies Cnemidophorus
leucopsammus (Ugueto e Harvey, 2010), Cnemidophorus nigricolor (Peters, 1873),
Cnemidophorus rostralis (Ugueto e Harvey, 2010) e Cnemidophorus sp. A;
58
(3) Cnemidophorus murinus includindo as espécies Cnemidophorus murinus
(Laurenti, 1768) e Cnemidophorus ruthveni (Burt, 1935).;
(4) Cnemidophorus vanzoi incluindo as espécies Cnemidophorus vanzoi (Baskin
e Williams, 1966) (Harvey et al., 2012).
Vale ressaltar que diversas novas espécies deste gênero têm sido descritas,
revelando que a taxonomia deste gênero ainda não esta elucidada, o que enfatiza a
necessidade de estudos morfológicos neste gênero.
Citogeneticamente, poucas espécies de Cnemidophorus apresentam descrição
cariotípica e as espécies que já possuem seu cariótipo descrito indica o número diploide
igual a 50 cromossomos composto por cromossomos portadores de dois braços,
cromossomos portadores de braço único e os cromossomos microcromossomos (Tabela
2; Peccinini-Seale e Almeida, 1986). No entanto, o cariótipo de Cnemidophorus sp. 1
(considerada como pertencente ao grupo Cnemidophorus gramivagus por Federico
Arias, que está descrevendo a espécie) (Amazonas), difere dos descritos para outras
espécies do gênero. Esta espécie apresenta 2n=48 cromossomos com a ausência de um
par de cromossomos microcromossomos. Isto demonstra a presença de rearranjos
cromossômicos robertsonianos, que podem estar associados à evolução cromossômica
deste gênero, os quais favoreceram mudanças no número diploide (redução do número
diploide). Outra população do estado do Amazonas (cidade de Manacapuru),
identificada como pertencente ao grupo Cnemidophorus lemniscatus possui o número
diploide de 50 cromossomos, com a presença de cromossomos portadores de dois
braços, braços únicos e microcromossomos (0:26:24) (Sites et al., 1990). Nossos
resultados demonstram que os espécimes amostrados de Manaus são cariotipicamente
distintos dos espécimes de Manacapuru, uma vez que Cnemidophorus sp.1 confirmando
que trata-se de nova espécie.
Já na subfamília Tupinambinae, as sete espécies cariotipadas apresentam com
número diploide variando de 2n=34 a 2n=38 cromossomos, com distinção de macro e
microcromossomos (Santos et al., 2008, presente trabalho). Nenhum tipo de sistema de
cromossomo sexual foi evidenciado na subfamília (Gorman, 1970). Tupinambis teguixin
apresentou 2n=36 cromossomos (12M+24m), número e fórmula cariotípica também
encontrado por Gorman (1970), De Smet (1981) e Santos et al. (2008). Por outro lado,
Beçak et al. (1972) descreveram outro número diploide igual a 38 cromossomos
59
(12M+26m) para T. teguixin, com um par adicional de cromossomos
microcromossomos.
No que diz respeito ao padrão de distribuição da heterocromatina em espécies da
família Teiidae, blocos heterocromáticos foram localizados nas regiões centromérica e
terminal de quase todos os cromossomos, sendo que em alguns pares foram também
evidenciados em regiões pericentromérica, intersticial e proximal (Tabela 3). O padrão
heterocromático das espécies Cnemidophorus sp. 1, Kentropyx calcarata, Kentropyx
pelviceps e Tupinambis teguixin são descritos pela primeira vez no presente estudo. As
cinco espécies de teídeos analisadas no presente trabalho apresentaram grande
quantidade de blocos heterocromáticos nas regiões centromérica e terminal da maioria
dos cromossomos, coincidindo com o padrão descrito na literatura. Esse padrão de
distribuição de heterocromatina é similar entre as espécies analisadas, sugerindo um
padrão conservado observado para espécies de teídeos. Porém, três espécies da
subfamília Tupinambinae Crocodilurus amazonicus (Spix, 1825), Salvator merianae
(Duméril e Bibron, 1839) e Tupinambis quadrilineatus (Manzani e Abe, 1997),
apresentam padrões de heterocromatina espécie-específicos, com blocos
heterocromáticos nas regiões centromérica, pericentromérica, intersticial e proximal da
maioria dos cromossomos (Santos et al., 2008). A existência desse padrão distinto de
heterocromatina provavelmente pode ser atribuída a um processo de adição de
heterocromatina ou heterocromatinização durante a evolução dessas espécies.
60
Tabela 3. Dados citogenéticos de bandamentos diferenciais compilados da literatura para a família Teiidae. Na tabela apresenta o local da coleta,
regoes organizadoras de nucléolos (RONs), heterocromatina constitutiva (HC), hibridização in situ fluorescente (FISH). Localidade: Amazonas
(AM), Bahia (BA), Estados Unidos (USA), Espírito Santo (ES), Goiás (GO), Mato Grosso (MT), Minas Gerais (MG), Pará (PA), Rio de Janeiro
(RJ), Rio Grande do Sul (RS), Rondônia (RO), São Paulo (SP), Sergipe (SE), Tocantins (TO). Para dados não indicados nas publicações foi
utilizada a simbologia “--”.
Subfamília Espécie
(Harvey et al., 2012)
Espécie
(Descrição inicial)
Localidade RON HC FISH Referência
Teiinae Ameiva ameiva Ameiva ameiva GO, RO, MT, TO Região terminal do
braço longo do par 7
Regiões centromérica e
terminal
- 8
Ameiva ameiva Ameiva ameiva AM Região terminal do
braço longo do par 7
Regiões centromérica e
terminal
DNAr 18S (par 7) Presente
trabalho
Ameiva auberi Ameiva auberi - - - DNAr 45S (par de
microcromosomos)
4
Aspidoscelis gularis Cnemidophorus gularis USA Região centromérica - 1
Aspidoscelis laredoensis Cnemidophorus laredoensis USA - Região centromérica - 1
Aspidoscelis marmoratus Cnemidophorus marmoratus - - - DNAr 45S (par 2) 4
Aspidoscelis sexlineatus Cnemidophorus sexlineatus USA - Região centromérica - 1
Aspidoscelis tigris Cnemidophorus tigriss USA - Região centromérica - 2
61
Ameivula littoralis
Ameivula nativo
Ameivula ocellifera
Cnemidophorus littoralis
Cnemidophorus nativo
Cnemidophorus ocellifera
RJ
ES
BA, SE, MG
Regiao terminal do
braco longo do par 8
RONs múltiplas
(pares não indicados)
Regiao terminal do
braco longo do par 5
-
-
Regiões centromérica e
terminal
-
-
-
7
5
8
Cnemidophorus arenivagus Cnemidophorus arenivagus - Região terminal do
braço longo do par 1
- - 3
Cnemidophorus cryptus Cnemidophorus cryptus - Região terminal do
braço longo do par 1
- - 3
Cnemidophorus gramivagus Cnemidophorus gramivagus - Região terminal do
braço longo do par 1
- - 3
Cnemidophorus lemniscatus Cnemidophorus lemniscatus - Região terminal do
braço longo do par 1 - - 3
Cnemidophorus sp.1 - AM Região distal do braço
longo do par 1 Regiões centromérica e
terminal
DNAr 18S (par 1) Presente
trabalho
Contomastix larcetoides Cnemidophorus larcetoides RS - Região centromérica - 6
Kentropryx calcarata Kentropryx calcarata BA, TO, MT Região distal do braço
longo do par 1 - - 8
Kentropryx calcarata Kentropryx calcarata AM Região distal do braço
longo do par 1 Regiões centromérica e
terminal
DNAr 18S (par 1) Presente
trabalho
Kentropryx paulensis Kentropryx paulensis SP Região distal do braço Regiões centromérica e - 8
62
longo do par 1 terminal
Kentropyx pelviceps Kentropyx pelviceps AM Região distal do braço
longo do par 1 Regiões centromérica e
terminal
DNAr 18S (par 1) Presente
trabalho
Kentropryx vanzoi Kentropryx vanzoi RO Região distal do braço
longo do par 1 - - 8
Teius oculatus Teius oculatus RS RONs múltiplas (pares
não indicados)
- - 6
Tupinambinae Crocodilurus amazonicus Crocodilurus amazonicus PA Região distal do braço
longo do par 2 Região pericentromérica - 9
Salvator meriane Tupinambis merianae TO, SP, ES Região distal do braço
longo do par 2
Região pericentromérica - 9
Tupinambis quadrilineatus Tupinambis quadrilineatus GO, TO Região distal do braço
longo do par 2
Regiões centromérica,
pericentromérica,
interstitial, proximal e
terminal
- 9
Tupinambis teguixin Tupinambis teguixin GO, TO Região distal do braço
longo do par 2
- - 9
Tupinambis teguixin Tupinambis teguixin AM Região distal do braço
longo do par 2
Regiões centromérica e
terminal
DNAr 18S (par 2) Presente
trabalho
1 - Bickhan et al., 1976; 2 – Bull, 1978; 3 - Peccinini-Seale e Almeida, 1986; 4 - Porter et al., 1991; 5 - Rocha et al., 1997; 6 - Veronese et al.,
2003; 7 - Peccinini-Seale et al., 2004; 8 - Santos et al., 2007; 9 - Santos et al., 2008.
63
Regiões heterocromáticas são ricas em sequências de DNA repetitivas
geralmente localizadas nas regiões centroméricas ou terminais de cromossomos.
Embora a heterocromatina possa estar localizada na mesma região cromossômica de
espécies diferentes, isto não significa que têm a mesma composição genética, que pode
mudar a quantidade de sequências de DNAs repetitivos nos cromossomos. Portanto, o
mapeamento de sequências repetitivas tem sido considerado importante marcador
espécies específicos ou populacionais (Carvalho et al., 2012, Schneider et al., 2013).
Embora as cinco espécies de teídeos analisadas no presente estudo apresentem
macroestrutura cariotípica conservada, algumas características cromossômicas
distinguem os cariótipos destas espécies. Em Cnemidophorus sp. 1, Kentropyx
calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin foi observado a presença de uma
constrição secundária localizada na região distal do par 1 e par 2, a qual é ausente em
Ameiva ameiva. Essas constrições secundárias geralmente estão presentes em um par
cromossômico e são bastante comuns em diversas espécies de lagartos (Bertolotto et al.,
1996; Kasahara et al., 1996; Bertolotto et al., 2002; Srikulnath et al., 2009a). Nessas
constrições secundárias geralmente estão situadas às regiões organizadoras de nucléolo
(RONs) que são identificadas, de forma indireta, por impregnação dos cromossomos
com nitrato de prata, pois marcam somente proteínas nucleolares envolvidas com a
atividade transcricional dos genes ribossomais da família 45S. Ainda, as RONs podem
estar localizadas em um único par cromossômico, considerada esta uma característica
basal e já relatados em diferentes espécies de lagartos (Porter et al., 1991).
A localização das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) revelou ser um
excelente marcador para a caracterização das espécies e estudos evolutivos entre os
lagartos teídeos, sendo que essa informação já foi mencionada para alguns gêneros da
família Teiidae (Santos et al. 2007, 2008), como Kentropyx (Kentropyx calcarata,
Kentropyx paulensis (Boettger, 1893) e Kentropyx vanzoi (Gallagher e Dixon, 1980),
Crocodilurus (Crocodilurus amazonicus), Cnemidophorus (Cnemidophorus arenivagus,
Cnemidophorus cryptus, Cnemidophorus gramivagus e Cnemidophorus lemniscatus
lemniscatus), Salvator (Salvator merianae) e Tupinambis (Tupinambis quadrilineatus e
Tupinambis teguixin).
Tupinambis teguixin apresentou RONs simples evidenciada na constrição
secundária no braço longo do par 2. Uma característica comum entre as espécies da
subfamília Tupinambinae é a presença desta constrição secundária localizada no par 2
64
(Gorman, 1970). Já, as quatro espécies da subfamília Teiinae também apresentar RON
simples, porém localizadas em par cromossômico distinto, ou seja, Cnemidophorus
sp.1, Kentropyx calcarata e Kentropyx pelviceps foi evidenciado na constrição
secundária do par 1 e em Ameiva ameiva no par 7. Para as espécies Cnemidophorus sp.1
e Kentropyx pelviceps os dados são inéditos. Os dados de RONs para Ameiva ameiva e
Kentropyx calcarata analisadas no presente trabalho corroboram os dados prévios
(Schmid e Gutternbach, 1988; Cole et al., 1995; Verosene et al., 2003; Santos et al.,
2007). Entretanto, duas populações da Amazônia oriental de Ameiva ameiva
apresentaram RONs múltiplas envolvendo os pares 1, 2, 6, 16, 18, 19 e alguns
cromossomos pequenos (Peccinini-Seale e Almeida, 1986). Esses autores sugerem que
a variação inter-individual encontrada em Ameiva ameiva pode estar relacionada na
identificação dos sítios ativos de RONs (Miller et al., 1976; Howell e Black 1980;
Boisvert et al., 2007). Além disso, essa variabilidade pode ser devido à impregnação de
regiões de heterocromatina constitutiva ricas em resíduos ácidos, no qual o nitrato
impregna tanto as RONs como regiões heterocromáticas não portadoras de sítios
ribossomais, não revelando o número exato de RONs (Sumner, 2003).
A técnica da hibridização in situ fluorescente (FISH) utilizando sondas de DNA
ribossomal 45S pode elucidar questões relacionadas à organização cromossômica e
carioevolução, sendo uma técnica mais refinada que a impregnação por nitrato de prata,
uma vez que localiza as sequências de DNAr 45S em cromossomos mitóticos (Carvalho
et al., 2012; Terencio et al., 2012; Schneider et al., 2013). Para as espécies analisadas
no presente estudo a hibridização in situ fluorescente do gene ribossomal 18S
corroborou os resultados obtidos com impregnação pelo nitrato de prata, confirmando a
existência deste sítio ribossomal em apenas um par de cromossomos. Este mesmo
padrão foi identificado em outras espécies da família Teiidae, evidenciando marcação
em um par de microcromossomos em Ameiva auberi, enquanto que Cnemidophorus
marmoratus foi localizado em um par de macrocromossomos (Porter et al., 1991). Além
disso, foi possível observar um heteromorfismo de tamanho dos sítios entre os
cromossomos homólogos nas quatro espécies analisadas, fato descrito para outras
espécies de lagartos (O’Meally et al., 2009; Srikulnath et al., 2009; Srikulnath et al.,
2011). Este heteromorfismo de tamanho provavelmente pode estar associado aos
mecanismos de crossing-over desigual, rearranjos como transposições, deleções e/ou
duplicações ou variações no número de cópias do DNAr presentes nestas regiões, o que
65
ocasionariam em alterações nos sítios ribossomais (Ribeiro et al., 2008; Gross et al.,
2010a).
Sendo assim, os dados do presente trabalho aliados aos disponíveis na literatura
indicam que os lagartos da família Teiidae possuem uma variação cariotípica com
relação ao número diploide, número fundamental e formula cariotípica, reforçando a
importância no aumento de análises cromossômicas na família Teidae. Estudos com o
mapeamento físico cromossômico de sequências de DNA repetitivas nas cinco espécies
de teídeos amazônicas são essenciais para a compreensão da organização do genoma,
bem como elucidar a evolução cariotípica deste grupo de lagartos.
66
6.2 Artigo 2 - DNAs repetitivos na organização do genoma de espécies de lagartos
amazônicos da família Teiidae
67
6.2.1 Resumo
Os DNAs repetitivos perfazem a maior fração do genoma eucarioto, que é composta por
sequências in tandem e dispersas. Tais DNAs repetitivos apresentam variações em
relação a sua composição, número de cópias, forma de distribuição, dinâmica e
organização no genoma, podendo contribuir para a diversificação evolutiva de
diferentes espécies de vertebrados. Estas sequências estão normalmente alocadas em
regiões de heterocromatina das regiões centroméricas e teloméricas dos cromossomos,
contribuindo na sua estruturação. Diante disto, o objetivo do presente estudo foi mapear
sequências de DNAs repetitivos DNAr 5S, sequências teloméricas, genes da
tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1 e SINE em cromossomos mitóticos das
espécies amazônicas de teídeos Ameiva ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx
calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin visando o entendimento da
organização e a sua carioevolução. O mapeamento das sequências repetitivas revelou
um padrão diferenciado em Cnemidophorus sp.1, enquanto que as demais espécies
apresentaram todas as sequências intercaladas entre si na região heterocromática. O
mapeamento físico cromossômico do gene da tropomiosina foi realizado pela primeira
vez em lagartos e revelou que, além de ser funcional, possui função estrutural
semelhante aos demais elementos repetitivos mapeados (DNAr 5S, sequências
teloméricas, retroelementos Rex 1 e SINE), estando localizados preferencialmente nas
regiões centroméricas e terminais dos cromossomos.
Palavras-chave: FISH, Heterocromatina, sequências teloméricas, DNAr 5S, SINE,
Tropomiosina, Rex 1, centrômero, telômero
68
6.2.2 Introdução
Macroteiideos são lagartos exclusivamente Neotropicais, pertencente à família
Teiidae, abrangendo atualmente cerca de 135 espécies agrupadas em três subfamílias:
Callopistinae (gênero Callopistes), Teiinae (gêneros Ameiva, Ameivula, Aurivela,
Aspidoscelis, Contomastix, Cnemidophorus, Dicrodon, Holcosus, Kentropyx,
Medopheos e Teius) e Tupinambinae (gêneros Crocodilurus, Dracaena, Salvator e
Tupinambis) (Harvey et al., 2012). Citogeneticamente esta família apresenta uma
diversidade cariotípica considerável, com a ocorrência de diferentes números diploides,
fórmulas cariotípicas, padrões de heterocromatina constitutiva, localização das regiões
organizadoras de nucléolo e a localização física cromossômica de sequências de DNAr
18S (Para revisão ver Carvalho et al., 2015a).
Embora as frações genômicas eucromáticas estejam notadamente anotadas em
vários vertebrados, as sequências repetitivas/heterocromáticas são pobremente
conhecidas (Padeken et al., 2015). Contudo, os DNAs repetitivos perfazem a maior
porção do genoma eucarioto e podem estar organizados in tandem como as sequências
satélites, minissatélites, microssatélites e as famílias multigênicas, ou dispersas como os
transposons e retrotransposons (Charlesworth et al., 1994; Nei e Rooney, 2005; Kordis,
2009). Na maioria dos organismos estas estão alocados nas regiões centroméricas e
teloméricas, quando contribuem na estruturação cromossômica (Padeken et al., 2015) e
podem desempenhar papéis importantes na organização estrutural e funcional (Kordis,
2009).
Centrômero é uma região do cromossomo que promove a formação de um
complexo protéico chamado cinetócoro, onde os microtúbulos do fuso responsáveis
pelo movimento dos cromossomos durante a divisão celular se fixam (Westhorpe e
Straight, 2013; Plohl et al., 2014; Padeganeh et al., 2013; He et al., 2015; Steiner e
Henikoff, 2015). Além destas funções, os centrômeros atuam como pontos de checagem
da divisão celular, coesão das cromátides irmãs e citocinese (Tanaka et al., 2013;
Fukagawa e Earnshawm, 2015; He et al., 2015; Steiner e Henikoff, 2015). A região
centromérica é constituída principalmente de DNAs satélites e por outras sequências
repetitivas de DNA, porém as sequências de DNA e a organização das mesmas
normalmente são espécie-específicas e provavelmente estas sequências podem estar
envolvidas na organização estrutural e funcional do centrômero (Padeganeh et al., 2013;
He et al., 2015; Steiner e Henikof, 2015; Padeken et al., 2015).
69
Os DNA repetitivos telométicos, DNAs ribossomais 5S e 18S, bem como
retroelementos têm sido amplamente mapeados por hibridização in situ fluorescente
(FISH) em várias espécies de vertebrados (Schneider et al., 2012; Terencio et al., 2012;
Chaiprasertsri et al., 2013; Rojo et al., 2014; Pokorná et al., 2015). Dentre estes DNAs
repetitivos funcionais destacam-se os DNAs ribossomais da família multigênicas 5S,
que consiste em sequências codificantes de 120 pb, que são separadas por um DNA
espaçador não transcrito (NTS) de tamanho variável. Alguns grupos de vertebrados
possuem ampla variação no mapeamento físico cromossômico e sequências dos NTS e
esta variação é devido à ocorrência de deleções ou inserções, presença de pseudogenes
ou pequenas repetições (Martins et al., 2000; Wasko et al., 2001; Martins, 2007).
Rearranjos cromossômicos têm sido evidenciados a partir do mapeamento de
sequências teloméricas, que consistem de repetições de (TTAGGG)n. Estas sequências
teloméricas associadas à multiproteínas que formam o complexo Shelterin, protegem as
extremidades dos cromossomos contra degradação ou danos do DNA, além de permitir
a replicação completa do DNA e integridade dos cromossomos (Simonet et al., 2011;
Wood et al., 2015). Quando sequências teloméricas aparecem em regiões diferentes nos
cromossomos, tais como em regiões intersticiais (sítios teloméricos intersticiais - ITSs),
têm sido relacionadas com os processos evolutivos envolvendo telômeros, como fusões,
inversões e translocações a partir de uma condição ancestral (Mandrioli et al., 1999;
Wood et al., 2015). Apesar da organização genômica do gene da tropomiosina nos
cromossomos dos vertebrados ainda serem escassos, este marcador também é
interessante em estudos evolutivos, uma vez que o gene da tropomiosina é uma família
de proteínas altamente conservada no genoma dos vertebrados e são responsáveis por
diversas funções celulares, tais como a migração celular, citocinese, transporte
intracelular e contração muscular (Vrhoviski et al., 2008; Barua, 2013). Esta família
gênica codifica quatro genes distintos, sendo eles TPM 1 (TPMα), TPM 2 (TPMβ),
TPM 3 (TPMγ) e TPM 4 (TPMδ) e essas apresentam várias isoformas que são
produzidas através do processo de splicing alternativo ou promotores alternativos
(Vrhoviski et al., 2008; Barua, 2013; Janco et al., 2013).
Com relação aos elementos retrotransponíveis, estes são capazes de se mover
no genoma utilizando molécula de RNA como intermediário de sua transposição. Esse
mecanismo, consequentemente, causa uma duplicação, aumentando do número de
cópias no genoma (Böhne et al., 2008). Dentre eles, o retroelemento SINE pode ser
70
derivado de diferentes classes de RNAs, tais como 7SL RNA (Nishihara et al., 2002),
tRNA (Nishihara et al., 2006), rRNA 5S (Ohshima e Okada, 2005) e rRNA 28S (Longo
et al., 2015) e encontram-se amplamente distribuídos nos genomas da maioria dos
vertebrados (Piskurek et al., 2009). Já o retroelemento Rex está presente nos diversos
organismos com diferentes padrões de organização onde esteve ativo durante a evolução
(Volff et al., 2000).
Diante disto, o objetivo do presente estudo foi mapear as sequências de DNAr 5S,
sequências teloméricas, genes da tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1 e SINE em
cromossomos mitóticos das espécies de teídeos amazônicos Ameiva ameiva,
Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin,
com o intuito de investigar os padrões de distribuição de cada elemento no genoma,
visando o entendimento da organização e carioevolução deste grupo de lagartos.
6.2.3 Material e Métodos
Amostras de Ameiva ameiva (Linnaeus, 1758), Cnemidophorus sp.1, Kentropyx
calcarata (Spix, 1825), Kentropyx pelviceps (Cope, 1868) e Tupinambis teguixin
(Linnaeus, 1758) foram obtidas em diferentes localidades do estado do Amazonas,
Brasil: florestas nas margens do rio Jatapu, município de São Sebastião do Uatumã
(0º50' E 01º55' S; 58º50' E 60º10' W), florestas nas margens dos rios Darahá e Ayuanã,
ambos no município de Santa Isabel do Rio Negro (0°24′24″ N; 65°1′1″ W), florestas
nas margens do rio Purus, no município de Tapauá (5º42'115'' S; 63º13'684'' W),
florestas nas margens do rio Cuieiras, no município de Manaus, floresta da Reserva
Florestal Adolpho Ducke, no município de Manaus (2º56‟0” S; 59º58‟0” W) e
perímetro urbano de Manaus (3º07'13.03'' S; 60º01'440'' W) com a autorização de coleta
(ICMBio/SISBIO 41825-1). Os animais foram eutanaziados logo após a captura com
uma dose letal de anestésico Tiopental sódico do anestésico. Esta pesquisa foi aprovada
pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Fundação Universidade do
Amazonas / Universidade Federal do Amazonas (UFAM) (número 041/2013).
Nenhuma espécie ameaçada de extinção ou protegida foi utilizada neste estudo. Os
animais foram submetidos aos procedimentos citogenéticos, sendo posteriormente
fixados com formaldeído 10% (injetados na cavidade celomática e trato digestório)
(Franco e Salomão 2002) e conservados em álcool 70%. Os espécimes testemunhos
foram depositados na Coleção Herpetológica do Instituto Nacional de Pesquisas da
71
Amazônia (INPA H31712, 33213, 34791, 34841, 35018). Todos os exemplares foram
identificados pelo pesquisador Dr. Federico Arias.
Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de suspensões celulares de
medula óssea utilizando colchicina in vitro (Ford e Hamerton, 1956). O DNA genômico
foi extraído a partir de tecido muscular utilizando o protocolo de fenol-clorofórmio
descrito por Sambrook et al. (1989) e quantificado em espectrofotômetro NanoDrop
2000 (Thermo Scientific). O DNAr 5S, genes da tropomiosina 1 e os retroelementos
Rex 1 e SINE foram amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando
os seguintes primers: DNAr 5S F (5’- CGA GGTCGGGCCTGGTTAGTA-3’) e 5S R
(5’- CTTCYGAGATCAGACGAGATC-3’) desenhados a partir de uma sequência
consenso entre diversas classes de vertebrados disponíveis no GeneBank (mamíferos,
repteis, anfíbios e peixes); Tropomiosina 1F (5’-
GAGTTGGATCGGGCTCAGGAGCG-3’) e TROP 1R (5’-
CGGTCAGCCTCTTCAGCA ATGTGCTT-3’) (Friesen et al., 1999); RTX1- F1 (5’-
TTCTCCAGTGCCTTCAACACC-3’) e RTX1-R1 (5’-
TCCCTCAGCAGAAAGAGTCTGCTC-3’) (Volff et al., 2000); SINE Sauria (SQ1F
5’CCCWGCTCCTGCCAACCTAGC e SQ1R 5’TAG TCATGCTGGCCACATGACC)
(Piskurek et al., 2006). Para sequências teloméricas as amplificações foram feitas sem
DNA com os seguintes primers: (TTAGGG)5 e (CCCTAA)5 (Ijdo et al., 1991).
As reações foram realizadas em um volume final de 15 µL contendo 1 µL de
DNA genômico (100 ng), 1,5 µL de tampão 10x com 1,5 mM de MgCl2, 0,15 µL de
Taq DNA polimerase (5 U/µL), 3,0µL de dNTPs (1 mM), 0,6 µL de cada primer (5
mM) e água Milli-Q. As condições de amplificação foram: (a) DNAr 5s: 2 min 94 °C;
seguidos por 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min 30seg a 57 °C, e 1 min 30 s a 72 °C; e
uma extensão final de 5 min a 72 °C; (b) TROP 1: 3 min 95 °C; seguidos por 35 ciclos
de 30 seg a 95 °C, 30 seg a 58 °C, e 1 min 20 s a 72 °C; e uma extensão final de 5 min a
72 °C; (c) Rex 1: 2 min a 95°C; seguidos por 35 ciclos de 1 min a 95°C, 40 seg a 55°C,
2 min a 72°C e uma extensão final de 5 minutos a 72°C; (d) SINE: 3 min a 94°C;
seguidos por 35 ciclos de 30 seg a 94°C, 50 seg a 50°C, 30seg a 72°C e uma extensão
final de 5 minutos a 72°C; (e) (TTAGGG)n: 1 min a 95°C, 30 seg a 50°C, 1 min a 72°C,
seguidos de 35 ciclos de 1 min a 94°C, 30 seg a 60°C, 2 min a 72°C, e 5 minutos a
72°C.
72
Para confirmar a amplificação das sequências específicas, os elementos
repetitivos foram clonados e sequenciados. Para tanto, os produtos de PCR de DNAr 5s,
genes da tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1 e SINE foram inseridos no vetor
plasmidial pGEM-T Easy (Promega), foram transformadas em células competentes
DH5α de Escherichia coli (Promega). Os clones foram sequenciados em sequenciador
automático de DNA ABI 3130 XL (Applied Biosystem). O alinhamento das sequências
foi feito através da ferramenta Clustal W (Thompson et al., 1994), incluída no
programa BioEdit 7.0 (Hall, 1999). Cada clone foi identificado por buscas na base de
dados do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) com a ferramenta BLASTn e na base do
Repbase (Jurka et al., 2005) no Genetic Information Research Institute (Giri)
(http://www.girinst.org/repbase) utilizando o software CENSOR (Kohany et al., 2006).
As sequências obtidas foram depositadas no GenBank (NCBI).
As sondas de DNAr 5s, sequências teloméricas, genes da tropomiosina 1 e os
retroelementos Rex 1 e SINE foram marcadas com digoxigenina-11-dUTP (Dig-Nick
Translation mix; Roche), enquanto que para a fiber-FISH o DNAr 5s e sequências
teloméricas foram marcadas com Biotina-16-dUTP (Bio-Nick Translation mix; Roche),
por reação de nick translation de acordo com instruções do fabricante. A FISH
(Hibridização in situ fluorescente) foi realizada segundo a técnica descrita por Pinkel et
al., (1986), com modificações, enquanto que a fiber-FISH (Hibridização in situ
fluorescente em fibras estendidas) foi realizada de acordo com o protocolo descrito por
Barros et al. (2011) em condições de altas estringência (2,5 ng/µL de produto de PCR,
50% formamida, 10% sulfato de dextrano, e 2x SSC a 37 °C por 18 h). Anti-
digoxigenina rodamina (Roche) e streptavidina Alexa fluor 488 (Life Technologies)
foram usados para detectar o sinal. Os cromossomos foram contra corados com DAPI (2
mg/ml) em meio de montagem VectaShield (Vector).
Os cromossomos mitóticos obtidos foram analisados em microscópio de
epifluorescência (Leica DFC 3000G). As metáfases foram fotografadas, os cariótipos
foram montados no programa Adobe Photoshop CS4 e medidos usando o Image J. Os
cariótipos foram organizados de forma decrescente seguindo a fórmula cariotípica
proposta por Carvalho et al. (2015a), sendo as espécies Ameiva ameiva, K. calcarata e
K. pelviceps portadoras de 2n=50 cromossomos, classificados por uma série gradual de
cromossomos acrocêntricos; Cnemidophorus sp.1 com 2n=48 cromossomos de dois
73
braços, braço único e microcromossomos e Tupinambis teguixin com 2n=36
cromossomos, sendo 12 macrocromossomos (M) e 24 microcromossomos (m).
Os sinais de hibridização das sondas visualmente considerados fracos foram
chamados de tênues e os de sinalização forte de conspícuos. Ainda, em cromossomos
acrocêntricos portadores de DNAs repetitivos, sempre que a localização física
cromossômica do mesmo foi centromérica, o mesmo foi considerado também como
parte do braço curto (p) devido impossibilidade de delimitação das duas porções
cromossômicas.
6.2.4 Resultados
As sequências amplificadas por PCR e sequenciadas estão em processo de
submissão no GenBank (NCBI). A sequência de DNAr 5s apresentou 120 pb referente à
região do transcrito funcional, a de TPM 1 apresentou 310 pb, a de Rex 1 apresentou
433 pb e a sequência de SINE apresentou 293 pb (Anexo I). Estas sequências foram
comparadas com outras disponíveis no banco de dados do NCBI, apresentando
similaridade de 100% com DNAr 5S de Iguana iguana (GenBank: M10817.1|),
similaridade de 75% com genes da tropomiosina 1 de Microlophus quadrivittatus
(GenBank: EF666450.1), similaridade de 100% com Rex 1 de Pterophyllum scalare
(GenBank: JX576340.1) e similaridade 100% com SINE de Darevskia caucasica
caucasica (GenBank: KJ680121.1|).
74
Subfamília Teiinae
a) Ameiva ameiva
Em Ameiva ameiva os sítios de DNAr 5S foram localizados na região
centromérica/ braço curto dos pares 1 a 18, excetuando o par 9 que não possui nenhum
sinal de hibridização destas sequências ribossomais e os pares 16 e 17 que possuem
marcação intersticial (Figura 1a). As localizações físico-cromossômicas do gene da
tropomiosina e dos retroelementos Rex 1 e SINE apresentaram-se semelhante ao do
DNAr 5S, excetuando o par 18 que não apresentou sinais de hibridização (Figura 3a, 4a,
5a, respectivamente). Marcações teloméricas conspícuas foram observadas na
extremidade do braço curto da maioria dos cromossomos e fracos sinais de hibridização,
perceptíveis apenas na ausência de sobreposição com o DAPI, nos braços longos dos
mesmos. Ainda, marcações teloméricas não foram visualizadas nos cromossomos dos
pares 19 a 25. Nos pares 16 e 17 grandes blocos teloméricos intersticiais estavam
presentes (Figuras 2a) (Quadro 1).
75
Quadro 1 – Quadro comparativo do local de distribuição das sequências de DNAs
repetitivos nos pares cromossômicos de Ameiva ameiva: Heterocromatina constitutiva -
HC, DNAr 18S, DNAr 5S, sequência telomérica, gene da tropomiosina, Rex 1 e SINE.
O sinal – indica ausência de marcação, p braço curto e q braço longo. Todas as
marcações foram conspícuas, excetuando as sinalizadas como tênues no quadro abaixo.
Pares HC
(Carvalho et
al., 2015a)
DNAr 18S
(Carvalho et
al., 2015a)
DNAr 5S
(presente
estudo)
Sequência
telomérica
(presente
estudo)
Tropomiosina
(presente
estudo)
Rex 1
(presente
estudo)
SINE
(presente
estudo)
1 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p
2 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p
3 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p
4 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Tênue
centromérica p Tênue
centromérica p
5 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Tênue
Centromérica p Tênue
Centromérica p
6 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p
7 Centromérica p/
terminal q Terminal q Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p
8 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p
9 Centromérica p - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p
10 Centromérica p - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p
11 Centromérica p - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p
12 Centromérica p/
terminal q
- Centromérica p Centromérica p Tênue
centromérica p
Centromérica p Centromérica p
13 Centromérica p - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p
14 Centromérica p - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p
15 Centromérica p - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p
16 Centromérica p - Intersticial q Intersticial q Tênue
intersticial q
Intersticial q Intersticial q
17 Centromérica p - Intersticial q Intersticial q Tênue
intersticial q
Tênue
intersticial q
Intersticial q
18 Centromérica p - Centromérica p Centromérica p - - -
19 Centromérica p - - - - - -
20 Centromérica p - - - - - -
76
21 Centromérica p - - - - - -
22 Centromérica p - - - - - -
23 Centromérica p - - - - - -
24 Centromérica p - - - - - -
25 Centromérica p - - - - - -
77
b) Cnemidophorus sp.1
Cnemidophorus sp.1 apresentou somente um sítio do gene ribossomal 5S
localizado na região intersticial dos braços longos do par 11 (Figura 1b). Marcações
conspícuas de DNA telomérico foram encontradas em diferentes porções
cromossômicas, excetuando os pares 13, 19, 20 a 22 que não apresentaram nenhum
sinal forte de hibridização destas sequências (Figura 2b). O gene da tropomiosina
apresentou múltiplas marcações ao longo de todos os cromossomos, com blocos
compartimentalizados principalmente em regiões intersticiais (Figura 3b). Nos pares
cromossômicos 11, 20, 22 e 23 nenhum sinal de hibridização do retroelemento Rex 1 foi
observado, enquanto nos demais pares blocos compartimentalizados foram evidenciados
em regiões terminais e intersticiais (Figura 4b). O retroelemento SINE foi mapeado em
blocos conspícuos intersticiais, excetuando os pares 8, 9, 10, 12, 13, 15 a 24 que não
apresenta nenhum sinal de hibridização (Figura 5b) (Quadro 2).
78
Quadro 2 – Quadro comparativo do local de distribuição das sequências de DNAs
repetitivos nos pares cromossômicos de Cnemidophorus sp.1: Heterocromatina
constitutiva - HC, DNAr 18S, DNAr 5S, sequência telomérica, gene da tropomiosina,
Rex 1 e SINE. O sinal – indica ausência de marcação, p braço curto e q braço longo.
Todas as marcações foram conspícuas.
Pares HC
(Carvalho et
al., 2015a)
DNAr 18S
(Carvalho
et al.,
2015a)
DNAr 5S
(presente
estudo)
Sequência
telomérica
(presente
estudo)
Tropomiosina
(presente estudo)
Rex 1
(presente
estudo)
SINE
(presente
estudo)
1 Centromérica p/
terminal q Distal q - Múltiplas
marcações
intersticiais
Múltiplas marcações
intersticiais
Múltiplas marcações
intersticiais
Múltiplas marcações
intersticiais
2 Centromérica p/
terminal q - - Múltiplas
marcações intersticiais
Múltiplas marcações
intersticiais Múltiplas
marcações
intersticiais,
terminal q
Múltiplas
marcações intersticiais
3 Centromérica p/
terminal q - - Múltiplas
marcações
intersticiais
Múltiplas marcações
intersticiais Múltiplas
marcações
intersticiais,
terminal q
Múltiplas
marcações
intersticiais
4 Centromérica p/
terminal q - - Múltiplas
marcações
intersticiais
Múltiplas marcações
intersticiais,
terminal q
Múltiplas
marcações
intersticiais,
terminal q
Múltiplas
marcações
intersticiais
5 Centromérica p/
terminal q - - Múltiplas
marcações
intersticiais
Múltiplas marcações
intersticiais,
terminal q
Múltiplas
marcações
intersticiais,
terminal p
Múltiplas
marcações
intersticiais
6 Centromérica p/
terminal q - - Múltiplas
marcações
intersticiais
Múltiplas marcações
intersticiais,
terminal q
Múltiplas
marcações
intersticiais,
terminal p
Múltiplas
marcações
intersticiais
7 Centromérica p/
terminal q - - Múltiplas
marcações
intersticiais
Múltiplas marcações
intersticiais,
terminal p
Múltiplas
marcações
intersticiais
Múltiplas
marcações
intersticiais
8 Centromérica p/
terminal q - - Múltiplas
marcações
intersticiais
Múltiplas marcações
intersticiais Múltiplas
marcações
intersticiais
Múltiplas
marcações
intersticiais
9 Centromérica p/
terminal q - - Múltiplas
marcações
intersticiais
Múltiplas marcações
intersticiais Múltiplas
marcações
intersticiais
-
10 Centromérica p/
terminal q - - Múltiplas
marcações
intersticiais
Múltiplas marcações
intersticiais Múltiplas
marcações
intersticiais
-
11 Centromérica p - Intersticial q Múltiplas
marcações
intersticiais
Múltiplas marcações
intersticiais - Marcação
intersticial q
79
12 Centromérica p - - Múltiplas
marcações
intersticiais
Múltiplas marcações
intersticiais,
terminal q
Intersticial,
terminal q -
13 Centromérica p - - - Múltiplas marcações
intersticiais,
terminal p
Centromérica p/
terminal q -
14 Centromérica p - - Terminal q Múltiplas marcações
intersticiais,
terminal pq
Centromérica p/
terminal q
15 Centromérica p - - Terminal q Disperso/ terminal p Intersticial q Terminal q
16 Centromérica p - - Centromérica p/
terminal q Disperso/ terminal p Centromérica p/
terminal q -
17 Centromérica p - - Centromérica p/
terminal q Disperso/ terminal p Intersticial q -
18 Centromérica p - - Centromérica p/
terminal q Disperso Centromérica p/
terminal q -
19 Centromérica p - - - Terminal q Centromérica p/
terminal q -
20 Centromérica p - - - Centromérica p/
terminal q - -
21 Centromérica p - - - Disperso Centromérica p/ terminal q
-
22 Centromérica p - - - Centromérica p/
terminal q - -
23 Centromérica p - - Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q - -
24 Centromérica p - - Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q
-
80
c) Kentropyx calcarata
Kentropyx calcarata os DNAr 5S foram localizados na região centromérica e
terminal na maioria dos cromossomos, com alguns pares apresentando marcações
terminais e intersticiais (Figura 1c). Marcações teloméricas conspícuas foram
observadas na extremidade do braço curto/centromérica da maioria dos cromossomos e
fracos sinais de hibridização nos braços longos dos mesmos. Nos pares cromossômicos
6, 7, 10 e 11 sítios teloméricos intersticiais estavam presentes, enquanto que nenhuma
marcação foi evidenciada nos pares 15 a 18 e 25 (Figura 2c). As sequências do gene da
tropomiosina foram mapeadas nas regiões centroméricas/ braços curtos dos pares 1 a 7,
12, 14 a 18, 20, 21 e 24 (Figura 3c). O retroelemento Rex 1 foi mapeado de forma
compartimentalizada preferencialmente nas regiões centroméricas/ braços curtos dos
pares 1, 2, 4, e 9 (Figura 4c). O retroelemento SINE foi evidenciado na região
centromérica/braço curto dos pares 1 a 5, 8, 9, 12 e 18 e intersticialmente no par 17
(Figura 5c) (Quadro 3).
81
Quadro 3 – Quadro comparativo do local de distribuição das sequências de DNAs
repetitivos nos pares cromossômicos de Kentropyx calcarata: Heterocromatina
constitutiva (HC), DNAr 18S, DNAr 5S, sequência telomérica, gene da tropomiosina,
Rex 1 e SINE. O sinal – indica ausência de marcação, p braço curto e q braço longo.
Todas as marcações foram conspícuas, excetuando as sinalizadas como tênues no
quadro abaixo.
Pares HC
(Carvalho et
al., 2015a)
DNAr 18S
(Carvalho et al.,
2015a)
DNAr 5S
(presente
estudo)
Sequência
telomérica
(presente
estudo)
Tropomiosina
(presente
estudo)
Rex 1
(presente
estudo)
SINE
(presente
estudo)
1 Centromérica p/
terminal q
Distal/q Centromérica p/
terminal q Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p
2 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p
3 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p Centromérica p - Centromérica p
4 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q
Centromérica p Centromérica p Centromérica p
5 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p Centromérica p - Centromérica p
6 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal,
intersticial q
Centromérica p - -
7 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal,
intersticial q
Centromérica p - -
8 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Tênue
centromérica p,/ terminal q
- - Tênue
centromérica p
9 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Tênue
centromérica p/
terminal q
- Centromérica p Tênue
centromérica p
10 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Intersticial - - -
11 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
intersticial q
- - -
12 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Tênue
centromérica p/ terminal q
Centromérica p - Tênue
centromérica p
13 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Tênue
centromérica p/
terminal q
- - -
14 Centromérica p - Centromérica p/
terminal,
intersticial q
Tênue
centromérica p/
terminal q
Centromérica p - -
82
15 Centromérica p - Centromérica p/
terminal,
intersticial q
- Centromérica p - -
16 Centromérica p - Centromérica p/
terminal q - Centromérica p - -
17 Centromérica p - Centromérica p/
terminal q - Centromérica p - Tênue
intersticial q
18 Centromérica p - Intersticial q - Centromérica p - Tënue
centromérica p
19 Centromérica p - Terminal p/ Intersticial q
Tênue centromérica p
- - -
20 Centromérica/p - Terminal p/
Intersticial q
Tênue
centromérica p
Centromérica p - -
21 Centromérica/p - Terminal p/
Intersticial q
Tênue
centromérica p
Centromérica p - -
22 Centromérica/p - Intersticial q Tênue centromérica p
- - -
23 Centroméricap - Intersticial q Tênue
centromérica p
- - -
24 Centromérica/p - Centromérica p/
terminal q
Tênue
centromérica p
Centromérica p - -
25 Centromérica/p - Centromérica p/ terminal q
- - - -
83
d) Kentropyx pelviceps
Kentropyx pelviceps os DNAr 5S foram localizados na região centromérica e
terminal na maioria dos cromossomos, com alguns pares apresentando marcações
intersticiais ou ao longo do cromossomo (Figura 1d). Sequências teloméricas
(TTAGGG)n foram evidenciadas nos telômeros na maioria dos cromossomos de
Kentropyx pelviceps, com marcações intersticiais nos pares 1, 2, 4 e 6 (Figura 2d). O
gene da tropomiosina apresentou-se distribuído preferencialmente em blocos nas
regiões centroméricas/braços curtos, bem como em regiões terminais, sendo os sinais
conspícuos evidenciados nos pares 1 a 5, 8 a 10, 12, 14 e 15 (Figura 3d). O
retroelemento Rex 1 foi mapeado de forma compartimentalizada preferencialmente nas
regiões terminais da maioria dos cromossomos, com alguns blocos intersticiais e
marcações dispersas em alguns pares (Figura 4d). Nem todos os cromossomos
apresentaram sinais de hibridização de SINE, que apresentou distribuição dispersa nos
cromossomos portadores (Figura 5d) (Quadro 4).
84
Quadro 4 – Quadro comparativo do local de distribuição das sequências de DNAs
repetitivos nos pares cromossômicos de Kentropyx pelviceps: Heterocromatina
constitutiva (HC), DNAr 18S, DNAr 5S, sequência telomérica, gene da tropomiosina,
Rex 1 e SINE. O sinal – indica ausência de marcação, p braço curto e q braço longo.
Todas as marcações foram conspícuas.
Pares HC
(Carvalho et
al., 2015a)
DNAr 18S
(Carvalho
et al.,
2015a)
DNAr 5S
(presente
estudo)
Sequência
telomérica
(presente estudo)
Tropomiosina
(presente estudo)
Rex 1
(presente
estudo)
SINE
(presente
estudo)
1 Centromérica p/
terminal q Distal q Centromérica p/
terminal q Centromérica p
terminal,
intersticial q
Centromérica p/ terminal q
Centromérica p/
terminal q -
2 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p
terminal,
intersticial q
Terminal q Centromérica p/
terminal q -
3 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q Terminal q Centromérica p/
terminal q Marcação dispersa
4 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p
terminal,
intersticial q
Centromérica p/
terminal q
Centromérica p/
terminal q Marcação
dispersa
5 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q
Centromérica p/
terminal q Marcação
dispersa
6 Centromérica p/
terminal q - Tênue
centromérica p,/
terminal q
Centromérica p
terminal,
intersticial q
- Centromérica
p/terminal
intersticial q
-
7 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q - Centromérica
p/terminal
intersticial q
-
8 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q Centromérica p Centromérica
p/terminal
intersticial q
Marcação
dispersa
9 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q
dispersa ao
longo do
cromossomo
Marcação
dispersa
10 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q
dispersa ao
longo do
cromossomo
Marcação
dispersa
11 Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q
dispersa ao
longo do
cromossomo
Marcação
dispersa
12 Centromérica p/ - Centromérica p/ Centromérica p/ Centromérica p Centromérica p/
terminal q
-
85
terminal q terminal q terminal q dispersa ao
longo do
cromossomo
13 Centromérica p/
terminal q - Centroméricap Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q -
14 Centromérica/p - Ao longo do
cromossomo
Centromérica p/
terminal q Centromérica p Centromérica p/
terminal q
-
15 Centromérica/p - Ao longo do cromossomo
Centromérica p/
terminal q Centromérica p Marcação
dispersa
-
16 Centromérica/p - Ao longo do
cromossomo
Centromérica p/
terminal q - Intersticial -
17 Centromérica/p - Ao longo do cromossomo
Centromérica p/
terminal q - Marcação
dispersa
-
18 Centromérica/p - Ao longo do
cromossomo
Centromérica p/
terminal q - Marcação
dispersa
-
19 Centromérica/p - Ao longo do
cromossomo
Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q -
20 Centromérica/p - Ao longo do cromossomo
Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q -
21 Centromérica/p - Ao longo do
cromossomo
Centromérica p/
terminal q - Marcação
dispersa -
22 Centromérica/p - Ao longo do
cromossomo
Centromérica p/
terminal q - Marcação
dispersa -
23 Centromérica/p - Ao longo do cromossomo
Centromérica p/
terminal q - Centromérica p/
terminal q
-
24 Centromérica/p - Ao longo do
cromossomo Centromérica p/
terminal q - Marcação
dispersa -
25 Centromérica/p - Ao longo do
cromossomo
Centromérica p/
terminal q - Marcação
dispersa -
86
Subfamília Tupinambinae
a) Tupinambis teguixin
Tupinambis teguixin foi evidenciado marcações de DNAr 5S, gene da tropomiosina,
Rex 1, SINE na região centromérica nos pares 1, 2, 3, 4 e 5 (Figura 1e, 3e, 4e, 5e).
Marcações teloméricas conspícuas foram observadas na extremidade do braço curto da
maioria dos cromossomos e fracos sinais de hibridização nos braços longos dos mesmos
(Figuras 2e) (Quadro 5).
Quadro 5 – Quadro comparativo do local de distribuição das sequências de DNAs
repetitivos nos pares cromossômicos de Tupinambis teguixin: Heterocromatina
constitutiva (HC), DNAr 18S, DNAr 5S, sequência telomérica, gene da tropomiosina,
Rex 1 e SINE. O sinal – indica ausência de marcação, p braço curto e q braço longo.
Todas as marcações foram conspícuas.
Pares HC
(Carvalho et
al., 2015)
DNAr 18s
(Carvalho et
al., 2015)
DNAr 5S
(presente
estudo)
Sequência
telomérica
(presente
estudo)
Tropomiosina
(presente
estudo)
Rex 1
(presente
estudo)
SINE
(presente
estudo)
1 Centromérica p/
terminal q - Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica
2 Centromérica p/
terminal q Distal q Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica
3 Centromérica p/
terminal q - Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica
4 Centromérica/p - Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica
5 Centromérica/p - Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica
6 Centromérica/p - - - - - -
7 Centromérica/p - - Centromérica p - - -
8 Centromérica/p - - Centromérica p - - -
9 Centromérica/p - - - - - -
10 Centromérica/p - - - - - -
11 Centromérica/p - - Centromérica p - - -
12 Centromérica/p - - Centromérica p - - -
13 Centromérica/p - - Centromérica p - - -
14 Centromérica/p - - - - - -
15 Centromérica/p - - - - - -
87
Fiber-Fish
As fibras cromatínicas estendidas submetidas à técnica da fiber-FISH utilizando sondas
do DNAr 5s e genes da tropomiosina 1 e/ou sequências teloméricas e retroelemento Rex
1 mostraram localização intercaladas entre os elementos repetitivos, sendo este padrão
observado para as cinco espécies de teídeos analisadas no presente trabalho (Figura 6).
16 Centromérica/p - - - - - -
17 Centromérica/p - - - - - -
18 Centromérica/p - - - - - -
88
Figura 1. Cariótipos evidenciando o DNAr 5S (sítios vermelhos) das espécies
pertencentes a subfamília Teiinae: (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus sp.1, (c)
Kentropyx calcarata, (d) Kentropyx pelviceps e da subfamília Tupinambinae: (e)
Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contra corados com DAPI. a=série
gradual de cromossomos acrocêntricos. m=Macrocromossomo, mi=microcromossomo.
Barra de escala representam 10 µm.
89
Figura 2. Cariótipos evidenciando as sequências teloméricas (sítios vermelhos) das
espécies pertencentes a subfamília Teiinae: (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus
sp.1, (c) Kentropyx calcarata, (d) Kentropyx pelviceps e da subfamília Tupinambinae:
(e) Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contra corados com DAPI. a=série
gradual de cromossomos acrocêntricos. m=Macrocromossomo, mi=microcromossomo.
Barra de escala representam 10 µm.
90
Figura 3. Cariótipos evidenciando o gene da tropomiosina 1 (sítios vermelhos) das
espécies pertencentes a subfamília Teiinae: (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus
sp.1, (c) Kentropyx calcarata, (d) Kentropyx pelviceps e da subfamília Tupinambinae:
(e) Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contracorados com DAPI. a=série
gradual de cromossomos acrocêntricos. m=Macrocromossomo, mi=microcromossomo.
Barra de escala representam 10 µm.
91
Figura 4. Cariótipos evidenciando o retroelemento Rex 1 (sítios vermelhos) das
espécies pertencentes a subfamília Teiinae: (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus
sp.1, (c) Kentropyx calcarata, (d) Kentropyx pelviceps e da subfamília Tupinambinae:
(e) Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contra corados com DAPI. a=série
gradual de cromossomos acrocêntricos. m=Macrocromossomo, mi=microcromossomo.
Barra de escala representam 10 µm.
92
Figura 5. Cariótipos evidenciando o retroelemento SINE (sítios vermelhos) das espécies
pertencentes a subfamília Teiinae: (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus sp.1, (c)
Kentropyx calcarata, (d) Kentropyx pelviceps e da subfamília Tupinambinae: (e)
Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contra corados com DAPI. a=série
gradual de cromossomos acrocêntricos. m=Macrocromossomo, mi=microcromossomo.
Barra de escala representam 10 µm.
93
Figura 6. Double fiber-FISH em fibras cromatínicas estendidas de Kentropyx calcarata utilizando sondas de DNAr 5s (sítios verdes), sequências
teloméricas (sítios verdes), genes da tropomiosina 1 (sítios vermelhos) e o retroelemento Rex 1 (sítios vermelhos). (a) DNAr 5s (b) genes da
tropomiosina 1 (c) DNAr 5s + genes da tropomiosina 1 (d) DNAr 5s + genes da tropomiosina 1 + DAPI (e) sequência telomérica (f) Rex 1 (g)
sequência telomérica + Rex 1 (h) sequência telomérica + Rex 1 + DAPI. O mesmo padrão foi observado para as demais espécies analisadas no
presente estudo. Barra de escala representam 10 µm.
94
6.2.5 Discussão
Mais de 70% das espécies de Teiidae já possui seu cariótipo descrito, com a maior
parte possuindo microcromossomos (para revisão ver Carvalho et al., 2015a). Os
microcromossomos são uma característica universal nos cariótipos de aves e répteis, tendo
um grande valor na evolução adaptativa (Burt, 2002). Estes microcromossomos possuem
genes funcionais, são ricos em GC, hiperacetilados, centrômeros e telômeros funcionais,
alta taxa de recombinação que assegura o emparelhamento correto bem como a segregação
cromossômica durante a divisão celular e se comportam como quaisquer outros
cromossomos (Burt, 2002; Janes et al., 2010). Apesar de muitos autores indicarem uma
conservação na macroestrutura cariotípica dos Squamata, rearranjos cromossômicos entre
os macrocromossomos e/ou entre microcromossomos provavelmente ocorreram em
algumas espécies neste grupo (Rovatsos et al., 2015; Srikulnath et al., 2015).
Rearranjos cromossômicos muitas vezes podem ser detectados pela hibridização de
sequências teloméricas. Estudos recentes têm mostrado que sítios teloméricos intersticiais
(ITSs) são bastante comuns em espécies de Squamata (anfisbênias, serpentes e lagartos),
onde estão localizados em regiões pericentroméricas, regiões centroméricas e/ou
intersticial (Rovatsos et al., 2015). O mapeamento das sequências repetitivas (TTAGGG)n
nas espécies de teídeos analisadas no presente trabalho revelou marcações conspícuas e
tênues em regiões teloméricas, centroméricas e intersticiais, além de ausência de sinais
teloméricos em alguns cromossomos. Essa falta de marcações teloméricas pode ser
explicada por diversos mecanismos que ocasionariam pequenos resíduos dos telômeros e
não poderiam ser detectados pela FISH convencional, tais como a redução do número de
repetições (TTAGGG)n no genoma, inativação dos telômeros e processo de erosão
molecular das sequências teloméricas (Mandrioli et al., 1999; Nanda et al., 2002; Revaud
et al., 2009; DeBaryshe e Pardue, 2011; Bolzán, 2012). Ainda, esses diferentes
mecanismos não implicariam necessariamente na perda total das sequências teloméricas,
ocorrendo somente o encurtamento do telômero (Bolzán, 2012). Este tipo de resultado já
foi descrito para uma espécie de morcego da família Molossidae, onde foi identificada a
ausência de marcações nas extremidades dos cromossomos de Eumops auripendulus (Faria
et al., 2009).
Sítios teloméricos intersticiais (ITS) foram evidenciados em regiões intersticiais e
centromérica dos cromossomos das espécies de teídeos analisadas. Com relação aos ITS,
os mesmos têm sido observados em muitas espécies de vertebrados, incluindo anfíbios,
95
peixes, aves, mamíferos e répteis (Meyne et al., 1990). Ainda, existem dois tipos diferentes
de ITS: os curtos-ITS (s-ITS) e a heterocromatina-ITS (het-ITS). Curtos-ITS são pequenas
repetições teloméricas localizados em posições intracromossômica enquanto que a
heterocromatina-ITS são repetições teloméricas localizadas em blocos heterocromáticos,
preferencialmente em regiões centroméricas e pericentroméricas (Ruiz-Herrera et al.,
2008; Rovatsos et al., 2015). Esses tipos de ITSs (s-ITS e het-ITS) têm sido considerados
indicativos de eventos de rearranjos cromossômicos durante a evolução. Porém, o s-ITS
pode não estar necessariamente associado a rearranjos cromossômicos, sítios frágeis e
hotspots de recombinação, uma vez que podem ter sido inseridos pela enzima telomerase
durante o reparo do DNA (Farré et al., 2009). Entretanto, estes s-ITS parecem estar
associados com a presença de elementos retrotransponíveis, como LTR retrotransposons e
non-LTR retrotransposons (SINE e LINE) (Azzalin et al., 2001). Além disso, os ITSs
podem não aparecer nos cromossomos rearranjados, o que tem sido atribuído a processos
de erosão molecular de DNAs repetitivos bem como a proteção desses ITS (sequências
similares àquelas presentes nos telômeros) pelo complexo Shelterin contra a maquinaria de
reparo do DNA, os quais não poderiam ser detectados pela FISH (Mandrioli et al., 1999;
Wood et al., 2015).
Para espécies de teídeos do gênero Aspidoscelis, a hibridização com sondas
teloméricas evidenciou heterocromatina-ITSs em seus cromossomos e também em outras
espécies de lagartos das famílias Agamidae, Gymnophthalmidae, Phrynosomatidae,
Phyllodactylidae, Polychrotidae e Sphaerodactylidae (Meyne et al., 1990; Schmid et al.,
2014; Rovatsos et al., 2015). Esses autores sugerem que heterocromatina-ITS em regiões
peri/centroméricas podem ter surgido a partir de eventos de amplificações dos het-ITS, os
quais estão colocalizados com outros DNAs repetitivos, os quais são os principais
componentes de heterocromatina (Rovatsos et al., 2015).
DNAs repetitivos acumulam-se preferencialmente em regiões heterocromáticas
devido à baixa densidade gênica e reduzida probabilidade de eliminação através de
recombinação (Szauter, 1984), representando um controle no mecanismo do número de
cópias (Charlesworth e Langley, 1989) e estratégia de adaptação para um grande número
de famílias de DNAs repetitivos (Langdon et al., 2000). Desta forma, a heterocromatina
tende a apresentar uma composição complexa de vários tipos de DNAs repetitivos,
localizadas principalmente em centrômeros, telômeros e posições intersticiais dos
cromossomos eucarióticos (Skipper, 2007; DeBaryshe e Pardue, 2011).
96
Dentre os elementos repetitivos, os retrotransposons vêm sendo mapeados em
vários organismos eucariotos e podem estar envolvidos em processos de inativação de
genes, recombinação e rearranjos cromossômicos (Terencio et al., 2012; Schneider et al.,
2012). Estes retrotransposons estão normalmente compartimentalizados nas regiões
heterocromáticas nos cromossomos de diversos grupos, mas em algumas espécies ocorrem
em regiões eucromáticas no genoma (Supiwong et al., 2013). Para as cinco espécies de
teídeos analisadas, o elemento retrotransponível Rex 1 e SINE apresentaram-se
preferencialmente acumulados em regiões de heterocromatina, preferencialmente nas
regiões centroméricas e terminais dos cromossomos, o que sugere que estas sequências
repetitivas estejam desempenhando um papel importante na estrutura organizacional e
funcional do centrômero e/ou telômero no genoma destas espécies. Ainda, como todos os
elementos retrotransponíveis, tanto o Rex 1 quanto o SINE podem contribuir para
diversidade e plasticidade do genoma através de vários mecanismos ao longo da evolução,
como ativação e inativação de genes, formação de pseudogenes, regulação da atividade
gênica, rearranjos, hotspots, recombinação, transferência de material genético (Longo et
al., 2015; Vigil-Stenman et al., 2015; Kojima et al., 2015).
Os SINE encontrados em genomas eucarióticos são tipicamente derivados de RNAs
celulares, tais como 7SL RNA, RNA de transferência (tRNA), RNA ribossomal 5S (5S
rRNA) e RNA ribossomal 28S (28S rRNA) (Piskurek et al., 2009; Longo et al., 2015).
Análises genéticas dos SINEs de espécies de Sauropsida, mostrou a presença de famílias
exclusivas neste grupo, conhecidos como Sauria SINEs, 5s-Sauria SINE, Anolis SINE 2 e
MIR (Piskurek et al., 2009). Nas espécies de teídeos analisadas, o retroelemento SINE
parece estar associado com o DNAr 5s, estando estas sequências repetitivas intercaladas
também com Rex1, sequências teloméricas e gene da tropomiosina 1, como observados nas
fibras cromatínicas distendidas.
Os genes de RNAs ribossomais estão entre as famílias multigênicas melhor
conhecida em vertebrados e a variabilidade molecular do DNAr 5S tem sido elucidada
frequentemente em função das regiões espaçadoras não transcritas (NTS), as quais
normalmente estão associadas a outros DNAs repetitivos (Campo e Garcia-Vazquez,
2012; Rebordinos et al., 2013; Artoni et al., 2015). Na espécie Cnemidophorus sp.1 os
sítios de DNAr 5s estão presentes em apenas um par cromossômico, o que parece
corresponder a uma condição ancestral para a maioria dos vertebrados (Martins e Wasko,
2004; Galetti Jr e Martins, 2004) e que serviria como estratégia de proteção contra de
97
eventos de transposição e permutação, os quais poderiam agir na dispersão dessas
sequências (Martins e Galetti Jr., 1999). Porém esta é uma espécie que está em processo de
descrição e cuja relação filogenética ainda não está esclarecida, merecendo atenção
especial em função de total discordância dos dados citogenéticos encontrados se
comparado com os demais já descritos para as espécies de teídeos (Carvalho et al., 2015a).
As espécies Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e
Tupinambis teguixin apresentaram múltiplos sítios associados com regiões
heterocromáticas nas regiões centroméricas e teloméricas. Além disso, sítios de DNAr 5s
também estão localizados em regiões intersticiais dos menores pares de cromossomos de
Ameiva ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata e Kentropyx pelviceps, as quais
são regiões eucromáticas dos cromossomos. Os múltiplos sítios de DNAr 5S não
correspondem a erros durante a hibridização, uma vez que sondas tanto homólogas quanto
heterólogas foram hibridizadas em condições de alta extringência (77%), sendo provável
que nem todos sejam sítios funcionais e correspondam a pseudogenes derivados da
associação destas sequências com os elementos retrotransponíveis. Vale ressaltar que o
sequenciamento do DNAr 5S a região gênica apresentou-se íntegra, sem stop codon ou
deleções que caracterizassem a presença de pseudogenes.
Comparando a localização física cromossômica dos DNAr 5s com as do DNAr 18s
(família DNAr 45S) descritos por Carvalho e colaboradores (2015a) para as mesmas
espécies (vale ressaltar que mesmos indivíduos foram analisados nestes dois estudos), fica
evidente que estes não apresentam posição sintênica em nenhuma das espécies (Quadros 1
a 5). Esta característica evitaria rearranjos cromossômicos entre os cromossomos
portadores dos sítios de DNAr 45s e 5s (Galetti Jr e Martins, 2004; Martins, 2007), bem
como facilitariam a ação das diferentes RNAs polimerases, uma vez que o DNAr 45s é
transcrito pela RNA polimerase I e o DNAr 5s pela RNA polimerase III (Martins, 2007).
Além do DNAr 5S, SINE, Rex 1 e sequências teloméricas serem encontradas
preferencialmente em regiões heterocromáticas de Ameiva ameiva (Linnaeus, 1758),
Kentropyx calcarata (Spix, 1825), Kentropyx pelviceps (Cope, 1868) e Tupinambis
teguixin a família multigênica da tropomiosina também é evidenciada nas região
centromérica, terminal e intersticial da maioria dos cromossomos das espécies de teídeos
analisadas. Porém, nem todos os cromossomos apresentaram as sequências de
tropomiosina, o que demonstra diferenças na composição de heterocromatina encontrada
nestas espécies estudadas, bem como na fração eucromática da própria espécie.
98
Mapeamentos físicos cromossômicos de sequências de tropomiosina até o momento
restringem-se a três espécies de peixes do gênero Potamorhina (Curimatidae), estando
localizadas nas regiões centroméricas, sugerindo que a TPM1 desempenham papéis
estruturais no genoma destas espécies (Pinheiro et al., no prelo). Ainda, estes genes são
evolutivamente conservados e atuam em atividades celulares, como migração celular, na
motilidade celular, na transformação celular, na citocinese e na contração muscular
(Vrhoviski et al., 2008; Chase et al., 2013; Janco et al., 2013).
Portanto, tal como sugerido por Eickbush e Eickbush (2007) para DNAr 45S, a
permanência de elementos repetitivos em associação nas espécies de lagartos pode estar
relacionada a eventos de regulação na transcrição dos DNAs ribossomais e do gene da
tropomiosina, além estarem atuando estruturalmente na organização centromérica e
telomérica, bem como na composição da fração heterocromática, especialmente em
Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin.
Entretanto estudos adicionais são necessários para elucidar a função e interação entre as
sequências gênicas e os demais elementos repetitivos. Ainda, é evidente que
Cnemidophorus sp.1 apresenta a região centromérica com composição genômica
diferencial, uma vez que nenhum dos elementos repetitivos mapeados apresentou-se
distribuído nesta região.
99
7.3 Artigo 3 – Composição diferencial de DNAs repetitivos na região centromérica em
espécies de lagartos amazônicos
100
7.3.1 Resumo
Diferenças nos padrões de distribuição da heterocromatina e na composição da mesma
foram observadas nas espécies de teídeos amazônicos. Estudos revelaram que estes blocos
heterocromáticos abrigam DNA repetitivos, tais como o DNA ribossomal 5S, sequências
teloméricas, genes da tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1 e SINE, uma vez que estes
elementos estão localizados nas regiões centroméricas e teloméricas nas espécies Ameiva
ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin. Já em
Cnemidophorus sp.1 estes elementos apresentam múltiplas marcações ao longo de todos os
cromossomos. Desta forma, o objetivo deste estudo foi caracterizar sequências de DNA
moderada e altamente repetitiva por Cot1-DNA dos genomas de Ameiva ameiva e
Cnemidophorus sp.1 por meio da clonagem e sequenciamento de DNA, bem como mapeá-
los cromossomicamente nos cariótipos das espécies de teídeos amazônicos Ameiva ameiva,
Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin,
visando o entendimento da organização e a dinâmica genômica. Os resultados do
sequenciamento das bibliotecas de DNA obtidas pelo Cot1-DNA evidenciou que diferentes
microssatélites, transposons, retrotransposons e algumas famílias gênicas também compõe
a fração de DNA moderada e altamente repetitiva nas espécies de teídeos. A FISH
utilizando sondas de Cot1-DNA isoladas tanto de Ameiva ameiva quanto de
Cnemidophorus sp.1 evidenciou que estas sequências estão localizadas principalmente nas
regiões heterocromáticas centroméricas e teloméricas dos cromossomos de Ameiva ameiva,
Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin, indicando que
desempenham papéis funcionais e estruturais no genoma destas espécies. Em
contrapartida, em Cnemidophorus sp.1 a sonda de Cot1-DNA isoladas de Ameiva ameiva
apresentou múltiplas marcações intersticiais nos cromossomos, enquanto que o
mapeamento do Cot1-DNA isolado da própria espécie marcou regiões centroméricas de
alguns cromossomos, ressaltando a composição centromérica diferencial nesta espécie.
Assim, os dados obtidos demonstraram que diversas classes de DNAs repetitivos fazem
parte do genoma de Ameiva ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx
pelviceps e Tupinambis teguixin, estando estas sequências compartilhadas entre as espécies
de teídeos analisadas, apesar de nem sempre estarem alocadas na mesma porção
cromossômica.
Palavras-chave: Cot1-DNA, FISH, heterocromatina, centrômero, telômero
101
7.3.2 Introdução
Teiidae constitui uma família de lagartos Neotropicais caracterizada por uma
diversidade cariotípica, com número diploide que varia de 34 a 52 cromossomos, bem
como diferenças nos padrões de distribuição da heterocromatina e composição da mesma
(Carvalho et al., 2015a; b). Nas espécies de teídeos amazônicos grande quantidade de
blocos heterocromáticos estão localizados nas regiões centromérica e terminal da maioria
dos cromossomos de Ameiva ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata e
Kentropyx pelviceps, enquanto que Tupinambis teguixin apresenta poucos blocos
heterocromáticos nas regiões centroméricas dos macrocromossomos, mostrando que a
distribuição da heterocromatina é diferencial entre as espécies de teídeos (Carvalho et al.,
2015a; b).
Estes blocos de heterocromatina normalmente abrigam DNA repetitivos, tais
como o DNA ribossomal 5S, sequências teloméricas, genes da tropomiosina 1 e os
retroelementos Rex 1 e SINE (Carvalho et al., 2015b). Estes elementos repetitivos foram
mapeados nos cromossomos de Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps
e Tupinambis teguixin e apresentaram-se localizados principalmente em regiões
heterocromáticas centroméricas e teloméricas, parecendo estar atuando estruturalmente na
organização do centrômero e/ou telômero (Carvalho et al., 2015b). Contudo, a composição
da fração heterocromática no genoma das espécies Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata,
Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin não está restrita a sequências de DNA
ribossomal 5S, sequências teloméricas, genes da tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1
e SINE, uma vez que alguns cromossomos possuem blocos heterocromáticos onde não se
observa sinais de hibridização destes elementos repetitivos (Carvalho et al., 2015a; b). Já
em Cnemidophorus sp.1 o padrão de organização cromossômica destas sequências é
diferente dos demais teídeos, apresentando múltiplas marcações ao longo de todos os
cromossomos, com blocos compartimentalizados principalmente em regiões intersticiais
dos cromossomos (Carvalho et al., 2015b), o que indica que a região centromérica desta
espécie apresenta uma composição diferenciada.
DNAs repetitivos podem ser isoladas por várias estratégias, dentre elas o Cot1-
DNA para isolamento da fração total de sequências moderada e altamente repetitiva nos
genomas (Vicari et al., 2010). O Cot1-DNA é baseado na cinética de reassociação do DNA,
cuja a fração repetitiva do genoma tende a se reanelar rapidamente após a desnaturação do
DNA genômico total. Assim, o tempo médio de renaturação de uma sequência em
102
particular dependerá do número de cópias que é encontrado no genoma e, se for dado
tempo suficiente, quase todo DNA de uma amostra desnaturado irá se reassociar
novamente (Zwick et al., 1997; Ferreira e Martins, 2008). Bibliotecas de DNAs repetitivos
de várias espécies têm identificado sequências de microssatélites, satélites, DNA
ribossomais e elementos transponíveis (transposons e retrotransposons) nesta fração
repetitiva do genoma (Hřibová et al., 2007; Zhang et al., 2012; Terencio et al., 2015). Esta
biblioteca de DNA enriquecida com sequências moderada e altamente repetitiva (Cot1-
DNA) pode ser mapeada em cromossomos e sequenciada, o que auxilia na análise da
fração repetitiva e tem auxiliado no entendimento da dinâmica, organização genômica bem
como em processos evolutivos (Ferreira e Martins, 2008; Szinay et al., 2010; Yu et al.,
2013).
Assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar sequências de DNA moderada e
altamente repetitivas que compõem os genomas de Ameiva ameiva e Cnemidophorus sp.1,
sendo estas espécies de teídeos com grande quantidade de heterocromatina organizada
diferencialmente. As bibliotecas enriquecidas com DNA repetitivo foram clonadas e
sequenciadas, bem utilizadas como sonda e mapeadas cromossomicamente em Ameiva
ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis
teguixin e revelaram uma composição centromérica diferencial em Cnemidophorus sp.1,
além de auxiliarem no entendimento da organização e dinâmica genômica destas
sequências nos cariótipos destas espécies de teídeos amazônicos.
7.3.3 Material e Métodos
Exemplares de Ameiva ameiva (Linnaeus, 1758), Cnemidophorus sp.1, Kentropyx
calcarata (Spix, 1825), Kentropyx pelviceps (Cope, 1868) e Tupinambis teguixin
(Linnaeus, 1758) foram coletadas no estado do Amazonas, Brasil, em diferentes
localidades: florestas nas margens do rio Jatapu, município de São Sebastião do Uatumã
(0º50' E 01º55' S; 58º50' e 60º10' W), florestas nas margens dos rios Darahá e Ayuanã,
ambos no município de Santa Isabel do Rio Negro (0°24′24″ N; 65°1′1″ W), florestas nas
margens do rio Purus, no município de Tapauá (5º42'115'' S; 63º13'684'' W), florestas nas
margens do rio Cuieiras, município de Manaus, floresta da Reserva Florestal Adolpho
Ducke, no município de Manaus (2º56‟0” S; 59º58‟0” W) e no perímentro urbano de
Manaus (3º07'13.03'' S; 60º01'440'' W) com a autorização de coleta (ICMBio/SISBIO
41825-1) (Tabela 1).
103
Tabela 1. Espécies das subfamílias Teiinae e Tupinambinae: Local de coleta, número e sexo dos animais analisados e espécimes voucher (lotes)
são listados. AM: Amazonas.
Subfamília Espécie Local de coleta Número e sexo dos animais Voucher
Ameiva ameiva São Sebastião do Uatumã, AM
Santa Isabel do Rio Negro, AM
Tapauá, AM
São Sebastião de Cuieiras, AM
Reserva Adolpho Ducke, AM
30 (treze machos;
treze fêmeas;
quatro sem identificação do sexo)
INPA H33213
Cnemidophorus sp.1 Manaus, AM 13 (cinco machos; oito fêmeas) INPA H35018
Teiinae Kentropyx calcarata São Sebastião do Uatumã, AM
São Sebastião de Cuieiras, AM
7 (três machos;
quatro fêmeas)
INPA H31712
Kentropyx pelviceps Tapauá, AM
3 (três fêmeas)
INPA H34841
Tupinambinae Tupinambis teguixin São Sebastião do Uatumã, AM
Tapauá, AM
Reserva Adolpho Ducke, AM
5 (quatro fêmeas;
um sem identificação do sexo )
INPA H34791
104
Os animais foram eutanaziados logo após a captura com uma dose letal de
anestésico Tiopental sódico do anestésico onde foram desprovidos de alimentos ou água.
Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Fundação
Universidade do Amazonas / Universidade Federal do Amazonas (UFAM) (número
041/2013). Nenhuma espécie ameaça de extinção ou protegidas foram utilizados neste
estudo. Os animais foram submetidos aos procedimentos citogenéticos, sendo
posteriormente fixados com formaldeído 10% (injetados na cavidade celomática e trato
digestório) (Franco e Salomão, 2002) e conservados em álcool 70%. Os espécimes
testemunhos foram depositados na Coleção Herpetológica do Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia (INPA H31712, 33213, 34791, 34841, 35018). Todos os
exemplares foram identificados pelo pesquisador Dr. Federico Arias.
As preparações cromossômicas foram obtidas a partir da medula óssea utilizando
colchicina in vitro (Ford e Hamerton, 1956). Em função da maior região heterocromática
ser encontrada em Ameiva ameiva e de Cnemidophorus sp.1 apresentar divergência no
mapeamento físico cromossomômico de diferentes classes de DNAs repetitivos quando
comparado com demais teídeos, estas duas espécies foram utilizadas para a obtenção da
biblioteca genômica enriquecida de DNA moderadamente e altamente repetitivos,
seguindo a técnica de cinética de renaturação Cot1-DNA (Zwick et al., 1997; Ferreira e
Martins, 2008). Amostras de DNA de Ameiva ameiva e Cnemidophorus sp.1 (50 μl de 100-
500 ng/μl de DNA em 0,3 M NaCl) foram autoclavadas (120 ◦C) por 5 minutos para obter
fragmentos entre 100 a 2000 pares de bases. Em seguida as amostras foram desnaturadas a
95 ◦C por 10 minutos, colocadas no gelo por 10 segundos e subsequentemente aquecidas
para reanelamento a 65◦C por 5 minutos. Após isso, as amostras foram incubadas a 37 ◦C
por 8 minutos com uma unidade da enzima S1 nuclease cuja função é digerir o DNA fita
simples. A fração repetitiva destas amostras foi recuperada por congelamento em
nitrogênio líquido e posterior extração de DNA, utilizando fenol-clorofórmio. Os
fragmentos de DNA resultantes foram clonados e sequenciados. Os fragmentos de Cot1-
DNA de Ameiva ameiva e de Cnemidophorus sp. foram ligados no vetor plasmidial
pMOSBlue blunt ended (GE Healthcare). Os clones foram sequenciados em sequenciador
automático de DNA ABI 3130 XL (Applied Biosystem). O alinhamento das sequências foi
feito através da ferramenta Clustal W (Thompson et al., 1994), incluída no programa
BioEdit 7.0 (Hall, 1999). Os clones gerados foram submetidos a um BLASTN para
detectar similaridade com sequências de domínio público contidas no banco de dados do
105
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), assim como com o banco de dados do Repbase
(Jurka et al., 2005) do Instituto de Pesquisa e Informação Genética (Giri)
(http://www.girinst.org/repbase/) por meio do software CENSOR (Kohany et al., 2006).
As bibliotecas de Cot1-DNA foram marcadas com digoxigenina-11-dUTP (Dig-
Nick Translation), pela reação de nick translation, seguindo as instruções do fabricante.
Anti-digoxigenina rodamina (Roche) foi usado para detectar o sinal. As bibliotecas de
Cot1-DNA de Ameiva ameiva marcadas com digoxigenina-11-dUTP foram hibridizadas
nos cromossomos da própria espécie, bem como hibridizações homólogas foram efetuadas
com as bibliotecas de Cot1-DNA em Cnemidophorus sp.1. As sondas obtidas a partir do
Cot1-DNA de Ameiva ameiva e Cot1-DNA de Cnemidophorus sp.1 também foram
hibridizadas nos cromossomos das demais espécies de teídeos analisadas.
A FISH foi realizada sob 77% de estringência (2,5 ng/µL sonda, 50% formamida,
10% sulfato de dextrano, e 2x SSC a 37 °C por 18h) (Pinkel et al., 1986). Os cromossomos
foram contra corados com DAPI (2 mg/ml) em meio de montagem VectaShield (Vector).
Os cromossomos foram analisados em microscópio de epifluorescência Leica DFC 3000G,
as metáfases foram fotografadas, montados os cariótipos no programa Adobe Photoshop
CS4 e medidos usando o Image J. Os cariótipos foram organizados seguindo a formula
cariotípica proposta por Carvalho et al. (2015a), sendo para Ameiva ameiva. Kentropyx
calcarata e Kentropyx pelviceps classificados como série gradual de cromossomos
acrocêntricos; Cnemidophorus sp.1 classificados como cromossomos portadores de dois
braços, cromossomos portadores de braço único e microcromossomos; e Tupinambis
teguixin classificados como macrocromossomos e microcromossomos.
7.3.4 Resultados
Um total de 40 clones de Cot1-DNA de Ameiva ameiva foram sequenciados sendo
que 20 sequências corresponderam a microssatélites; 8 a transposons; 6 a retrotransposons
e 6 a genes, todos apresentando alta similaridade com DNAs repetitivos depositadas nos
bancos públicos de DNA (Tabela 2). Para Cnemidophorus sp.1 30 clones de Cot1-DNA
sequenciados corresponderam a microssatélites; 5 a transposons e 5 a genes, todos também
apresentando alta similaridade com DNAs repetitivos depositadas nos bancos públicos de
DNA (Tabela 3).
106
Tabela 2. Sequências repetitivas obtidas pela fração Cot1-DNA de Ameiva ameiva e similaridade das sequências conhecidas em banco de dados
públicos.
Clone Homologia Similaridade Identidade
AA 1 DNA Transposons Tc1-like de Labeo rohita (GenBank AY083617.1) 100%
AA 2 Microsatellite Betula platyphylla var. japonica (GenBank AB084484.1) 100%
AA 3 Gene TAP2 mRNA de Oryzias latipes (GenBank AB033382.1) 100%
AA 4 Microsatellite Coffea canephora (GenBank EU526584.1) 100%
AA 5 Microsatellite Salmo salar (GenBank Y11457.1) 96%
AA 6 Microsatellite Serranus cabrilla (GenBank AM049431.1) 95%
AA 7 Microsatellite Hypericum perforatum (GenBank FR732510.1) 93%
AA 8 Microsatellite Apteronemobius asahinai (GenBank AB621739.1) 100%
AA 9 Non-LTR Retrotransposons CR 1 (RepBase/GIRI*) 88%
AA 10 Microsatellite Bos taurus (GenBank AF271953.1) 81%
AA 11 Microsatellite Colias behrii (GenBank FN552755.1) 100%
AA 12 DNA Transposons Tc1/mariner (RepBase/GIRI*) 80%
107
Tabela 3. Sequências repetitivas obtidas pela fração Cot1-DNA de Cnemidophorus sp.1 e similaridade das sequências conhecidas em banco de
dados públicos.
Clone Homologia Similaridade Identidade
Cn 1 Gene TAP2 mRNA de Oryzias latipes (GenBank AB033382.1) 100%
Cn 2 Microssatellites Betula platyphylla var. japonica (GenBank AB084484.1) 100%
Cn 3 DNA Transposons Tc1-like de Labeo rohita (GenBank AY083617.1) 100%
Cn 4 Microsatellite Colias behrii (GenBank FN552755.1) 93%
Cn 5 Microsatellite Glaucosoma hebraicum (GeneNank FJ409080.1) 97%
Cn 6 Microsatellite Colias behrii (GenBank FN552755.1) 99%
Cn 7 Microsatellite Apteronemobius asahinai (GenBank AB621739.1) 90%
Cn 8 Microsatellite Salmo salar (GenBank Y11457.1) 96%
108
Com a sonda homóloga de Cot1-DNA de Ameiva ameiva os sinais de hibridização
foram localizados na região centromérica/braço curto dos pares 1 a 18, excetuando o par 9
que não possui nenhum sinal destas sequências e os pares 16 e 17 que possuem marcação
intersticial (Figura 1a, 2a). Quando efetuada a hibridização homóloga de Cot1-DNA de
Cnemidophorus sp.1 nos cromossomos da própria espécie, marcações foram observados na
região centromérica/braço curto de alguns cromossomos, enquanto que a maioria dos
cromossomos apresentou ausência de marcação nesta região cromossômica (Figura 1b).
A hibridização utilizando sonda heteróloga de Cot1-DNA obtido a partir de Ameiva
ameiva em Cnemidophorus sp.1 apresentou múltiplas marcações ao longo de todos os
cromossomos, com blocos compartimentalizados principalmente em regiões intersticiais
(Figura 2b). Em Kentropyx calcarata e Kentropyx pelviceps foram localizados na região
centromérica na maioria dos cromossomos, com alguns pares apresentando marcações
terminais e intersticiais (Figura 2c; 2d, respectivamente) e Tupinambis teguixin
apresentaram marcações na região centromérica nos pares 1, 2, 3, 4 e 5 (Figura 2e).
Padrões similares de marcações foram observadas na hibridização heteróloga do Cot1-
DNA obtido a partir de Cnemidophorus sp.1 nos cromossomos de Ameiva ameiva,
Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin, porém as marcas foram
mais tênues.
109
Figura 1. FISH com a sonda homóloga de Cot1-DNA de Ameiva ameiva (a), e de Cnemidophorus sp.1 (b). Os cromossomos foram
contracorados com DAPI. Barra de escala: 10 µm.
110
Figura 2. Cariótipos com a sonda de Cot1-DNA5 de Ameiva ameiva hibridizada
(vermelho). (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus sp.1, (c) Kentropyx calcarata, (d)
Kentropyx pelviceps e (e) Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contracorados com
DAPI. a=série gradual de cromossomos acrocêntricos. m=Macrocromossomo,
mi=microcromossomo. Barra de escalas: 10 µm.
111
Figura 3. Idiograma de Ameiva ameiva. Em preto, heterocromatina; em verde claro, genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s; em
amarelo, sequências teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em verde escuro, Cot1-DNA da própria
espécie. a=série gradual de cromossomos acrocêntricos.
112
Figura 4. Idiograma de Cnemidophorus sp.1. Em preto, heterocromatina; em verde claro, genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s;
em amarelo, sequências teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em roxo, Cot1-DNA da própria
espécie; em verde escuro, Cot1-DNA de Ameiva ameiva.
113
Figura 5. Idiograma de Kentropyx calcarata. Em preto, heterocromatina; em verde claro, genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s;
em amarelo, sequências teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em verde escuro, Cot1-DNA de Ameiva
ameiva. a=série gradual de cromossomos acrocêntricos.
114
Figura 6. Idiograma de Kentropyx pelviceps. Em preto, heterocromatina; em verde claro, genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s;
em amarelo, sequências teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em verde escuro, Cot1-DNA de Ameiva
ameiva. a=série gradual de cromossomos acrocêntricos.
115
Figura 7. Idiograma de Tupinambis teguixin. Em preto, heterocromatina; em verde claro, genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s;
em amarelo, sequências teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em verde escuro, Cot1-DNA de
Ameiva ameiva. m=Macrocromossomo, mi=microcromossomo.
116
7.3.5 Discussão
Diversas classes de DNAs repetitivos compõem o genoma das espécies de
teídeos amazônicos, tais como DNA ribossomal 5S, sequências teloméricas, genes da
tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1 e SINE. A maior parte destes DNAs
repetitivos estão alocados em regiões de heterocromatina, além de estarem atuando
estruturalmente na organização centromérica e telomérica das espécies Ameiva ameiva,
Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin (Carvalho et al.,
2015b; Figuras 3, 4, 5, 6 e 7). Além destas funções, a heterocromatina pode ter outras
atividades no genoma, como atuar na segregação cromossômica, na organização
nuclear, na regulação da mitose, na progressão do ciclo celular, na proliferação das
células, na regulação da expressão gênica, bem como pode afetar o processo de
recombinação gênica (Grewal e Jia, 2007; Skipper, 2007; Bühler, 2009; Bloom, 2014).
Porém, a heterocromatina dos teídeos não se restringe aos DNAs ribossomais
5S, sequências teloméricas, genes da tropomiosina 1, retroelementos Rex 1 e SINE,
apresentando uma composição complexa de vários tipos de DNAs repetitivos (Skipper,
2007; DeBaryshe e Pardue, 2011). Pelo sequenciamento das bibliotecas obtidas pelo
Cot1-DNA foi evidenciado que diferentes microssatélites, transposons, retrotransposons
e algumas famílias gênicas também compõe essa fração de DNA moderadamente e
altamente repetitivo, que estes também estão alocados preferencialmente nas regiões
centroméricas e teloméricas de Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx
pelviceps e Tupinambis teguixin. Já para Cnemidophorus sp.1 estas sequências também
estão presentes no genoma, porém na região eucromática, similar ao padrão observado
para sequências teloméricas, genes da tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1 e SINE.
As sequências de DNAs repetitivos mais abundantes na fração moderada e
altamente repetitiva do genoma obtidas pelo Cot1-DNA de Ameiva ameiva e
Cnemidophorus sp.1 foram os microssatélites que apresentaram homologias com
sequências de outros organismos depositadas nos bancos de dados públicos, entre elas
Coffea canephora (Rubiaceae), Betula platyphylla var. japonica (Betulaceae),
Hypericum perforatum (Hypericaceae), Salmo salar (Salmonidae), Serranus cabrilla
(Serranidae), Glaucosoma hebraicum (Glaucosomatidae), Bos taurus (Bovidae),
Apteronemobius asahinai (Trigonidiidae) e Colias behrii (Pieridae). Ressalta-se que
existe diferenças nos microssatélites isolados das diferentes espécies. Acúmulos de
117
microssatélites podem estar associados com a diferenciação dos cromossomos sexuais
em algumas espécies de Sauropsida, os quais foram ocasionados por uma elevada
supressão de recombinação, degeneração e heterocromatinização (Porkoná et al., 2011;
Gamble et al., 2014; Matsubara et al., 2015), porém nenhuma das espécies analisadas
no presente estudo apresentaram cromossomos sexuais diferenciados, onde machos e
fêmeas possuem constituição cromossômica idêntica.
Os microssatélites ou repetições de sequências simples (SSRs) são sequências
curtas organizadas em longos segmentos constituídos de unidades de repetições em
tandem e são encontrados tanto em regiões codificantes ou não codificantes no genoma
de diversas espécies (de Oliveira et al., 2015). Em análises genéticas são considerados
bons marcadores moleculares devido a sua elevada abundância no genoma, herança co-
dominante, natureza multi-alélica, boa reprodutibilidade e tem sido empregados em
genética de populações, mapas de ligação e relações de parentesco (Qi et al., 2015;
Čížková et al., 2015).
SSRs auxiliam em papéis funcionais no genoma como na regulação gênica, na
replicação, na transcrição, na função de proteína e organização do genoma (Qi et al.,
2015). Esses SSRs são geralmente localizados nas regiões centroméricas e terminais dos
cromossomos de vários organismos, tais como observado no presente estudo em Ameiva
ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin, o que
corrobora estudos citogenômicos envolvendo os DNAs satélites/microssatélites de
algumas espécies de lagartos (Lacertidae, Scincidae e Varanidae) e cobras (Colubridae,
Pythonidae e Viperidae), que mostraram que estes estão localizados em região de
heterocromatina, especificamente em regiões centroméricas, pericentroméricas e/ou
teloméricas nos cromossomos, sugerindo que existem diferenças na composição dessas
regiões no genoma de Squamata (Singh et al., 1976; Grechko et al., 2005;
Chaiprasertsri et al., 2013; Giovannotti et al., 2013; 2014; Matsubara et al., 2015).
Além dos microssatélites, cerca de 50% das sequências obtidas pelo Cot1-DNA
das duas espécies exibiram similaridades com elementos transponíveis (transposons e
retrotransposons). Uma das características importantes destes elementos transponíveis é
o mecanismo de transposição, uma vez que os retrotransposons transpõem através de
um intermediário de RNA enquanto que os transposons movimentam-se pelo genoma
através de cópias de DNA e podem estar contribuindo para diversidade e plasticidade do
genoma durante a evolução (Kordis, 2009; Kojima et al., 2015). As sequências
118
apresentaram similaridade variando de 80% a 100% com os DNAs transposons Tc1-like
e Tc1/mariner. O transposon Tc1 é encontrado no genoma de diversos eucariotos e se
movimentam dentro e/ou entre genomas. É um elemento que possui cópias defeituosas
que foram acarretadas por diversas mutações causando a inativação do elemento no
genoma (Ivics e Izsvák, 2015; Tellier et al., 2015). Tc1 não são evidenciados, na forma
ativa, em genomas dos vertebrados (Dornan et al., 2015; Ivics e Izsvák, 2015; Tellier et
al., 2015).
Com relação aos retrotranposons, foi identificado o non-LTR retrotransposon
CR1 (Chicken Repeat 1) somente no genoma da espécie Ameiva ameiva, porém, isto
não indica que este não esteja presente no genoma de Cnemidophorus sp.1, uma vez que
o mesmo pode não ter sido identificado neste estudo. O retroelemento CR1 é uma
família de LINE amplamente distribuídos em uma variedade de organismos, incluindo
vertebrados (aves, peixes e repteis) e invertebrados (Thompson et al., 2009). CR1
contém uma região 5`UTR, duas janelas de leitura (ORFs 1 e 2) e uma região terminal
3`UTR. A região terminal 3`UTR possuem pequenas repetições (microssatélites)
relativamente conservadas dentro de cada um dos sete grupos de CR1 (A-G) (Suh,
2015). CR1 são os únicos elementos transponíveis que estavam ativos ao longo da
evolução das aves e repteis e, assim, tem sido amplamente utilizados como marcadores
filogenéticos e na identificação de espécies, visando compreender a evolução do
genoma dentro de Amniota (Suh, 2015; Suh et al., 2015).
Os DNAs repetitivos DNAr 5s, genes da tropomiosina1 e os retrolementos Rex 1
e SINE também já foram mapeados nos cromossomos das espécies de teídeos analisadas
no presente estudo, porém os mesmos não foram evidenciados no sequenciamento dos
DNAs moderada e altamente repetitivos obtidos pela técnica de Cot1-DNA. O Cot1-
DNA é o produto da concentração do DNA genômico (C0), o tempo em segundos de
renaturação (t) e uma constante que depende da concentração de cátions do tampão
(Britten et al., 1974; Britten e Kohne, 1968). Desta forma, se alterar qualquer uma
destas variáveis, o resultado das sequências que são isoladas por esta técnica pode ser
diferente, o que explica não ter sido obtidos os DNAs repetitivos DNAr 5s, genes da
tropomiosina1 e os retrolementos Rex 1 e SINE que também compõem a fração
repetitiva das cinco espécies de teídeos analisadas.
Alguns clones apresentaram similaridade com parte do gene TAP-2 de Oryzias
latipes. A TAP (transportador associado a processamento de antígenos) é codificada
119
pelos genes do MHC de classe I (Complexo Principal de Histocompatibilidade) e
responsável pelo transporte dos peptídeos antigênicos do citoplasma para o retículo
endoplasmático (Zhao et al., 2006; Murata et al., 2009). Este transportador consiste
pelas subunidades TAP-1 e TAP-2, são essenciais nos processamentos antigênicos e
altamente conservadas entre diversas espécies de eucariotos (Zhao et al., 2006; Murata
et al., 2009). Alguns genes podem estar associados com DNAs repetitivos no genoma
de diferentes espécies e podem implicar em diversas funções, tais como a estabilidade
do genoma e regulação da expressão gênica, a formação de cromatina e miRNAs
(Roberts et al., 2014; Liang et al., 2015). Isto já foi encontrado em algumas espécies de
lagartos, peixes e mamíferos (Valente et al., 2011; Porkoná et al., 2011; Terencio et al.,
2015), estando bem evidente também para as espécies analisadas no presente estudo.
O mapeamento físico cromossômico das sondas homólogas e/ou heterólogas
do Cot1-DNA corroborou parcialmente o padrão heterocromático descritos para as
mesmas, mostrando marcações associadas com regiões heterocromáticas nas regiões
centroméricas e teloméricas dos cromossomos de Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata,
Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin. Além disso, marcações intersticiais também
foram localizados em regiões intersticiais dos menores pares de cromossomos de
Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata e Kentropyx pelviceps o que confirma a presença
destas sequências nesta região. Contudo, se compararmos a localização destes DNAs
moderada e altamente repetitivos obtidas a partir de Cot1-DNA com os outros DNAs
repetitivos já mapeados para as mesmas (Carvalho et al., 2015b), o padrão de marcações
são similares, estando alocados em regiões heterocromáticas nas regiões centroméricas
e teloméricas dos cromossomos destas espécies de teídeos (Figuras 3, 4, 5, 6 e 7).
Apesar de diferentes classes de DNAs repetitivos poderem estar localizados na mesma
região cromossômica de espécies diferentes, a quantidade de cópias de cada um dos
elementos pode ser diferente (Chaiprasertsri et al., 2013).
Já em Cnemidophorus sp.1, a hibridização das sequências moderada e altamente
repetitivas obtidas a partir de Cot1-DNA de Ameiva ameiva evidenciou múltiplas
marcações ao longo dos cromossomos, com blocos compartimentalizados em regiões
intersticiais dos cromossomos, as quais estão localizadas em regiões eucromáticas. Este
padrão é semelhante ao padrão de distribuição dos outros DNAs repetitivos (Carvalho et
al., 2015b), evidenciando que o padrão de organização cromossômica dos elementos
120
repetitivos é diferente das demais espécies de teídeos analisadas. Ainda, os DNAs
repetitivos localizados em regiões eucromáticas podem influenciar significativamente
nas regiões reguladoras de uma expressão de um gene, visto que a distribuição dos
elementos repetitivos no genoma, especialmente uma associação de genes com funções
metabólicas, pode ser o resultado de uma seleção positiva destes elementos durante
evolução e implicam em papéis importantes em funções dos genes (Wang et al., 2007;
Liang et al., 2015). Estudos realizados com Cot1-DNA demostraram que embora os
genomas de ratos e humanos possuem famílias similares de elementos repetitivos, as
sequências primárias diferem significativamente entre os genomas, onde o Cot de
humano não hibridiza nos cromossomos de ratos e o mesmo acontece com humanos
(Hall et al., 2014). Além disso, o Cot1-DNA foram hibridizados em todas as regiões
eucromáticas dos cromossomos (Hall et al., 2014).
Em contrapartida a FISH usando sonda homóloga do Cot1-DNA revelou
marcações principalmente nas regiões centroméricas dos cromossomos de
Cnemidophorus sp.1. Assim, a fração heterocromática centromérica de Cnemidophorus
sp.1 parece ser composta pelos microssatélites e elementos transponíveis obtidos pelo
Cot1-DNA da própria espécie e elucidados pelo sequenciamento, sendo as sequências
diferentes das obtidas pelo Cot1-DNA de Ameiva ameiva, apesar de pertencerem às
mesmas categorias. Ainda, outros elementos repetitivos podem estar presentes na fração
heterocromática desta espécie e não terem sido detectados pelo Cot1-DNA. Na região
centromérica existem outros DNAs repetitivos específicos do centrômero (Rošić et al.,
2014), que podem estar alocadas tanto nos macrocromossomos quanto nos
microcromossomos, uma vez que compartilham os mesmos DNAs repetitivos
(Giovannotti et al., 2014; Matsubara et al., 2015; presente estudo).
Embora a sua função e componentes multiprotéicos sejam conservados entre os
organismos, esses DNAs repetitivos são extremamente divergentes com relação a sua
estrutura, organização, dinâmica e mecanismos de propagação, influenciando na
diversificação e evolução dos centrômeros (Plohl et al., 2014). Portanto, é nítido que
vários mecanismos podem estar atuando na diversificação dessas regiões, tais como
crossing-over desigual, genes de conversão, mudanças mediadas por elementos
transponíveis e deslizamento da DNA polimerase na replicação, resultando na
composição diferencial da heterocromatina em espécies estreitamente relacionadas,
entre diferentes cromossomos da mesma espécie ou podem ser espécie-especifica
121
(Chaiprasertsri et al., 2013; Aldrup-MacDonald e Sullivan, 2014; He et al., 2015; Gao
et al., 2015).
Assim, os resultados encontrados neste trabalho contribuíram para a
compreensão acerca da composição da fração heterocromática, bem como estrutura e
organização dos DNAs repetitivos do genoma dos teídeos e indicaram que diferentes
classes de DNAs moderada e altamente repetitivos fazem parte do genoma de Ameiva
ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis
teguixin, estando estas sequências compartilhadas entre as espécies de teídeos
analisadas, apesar de nem sempre estarem alocadas na mesma porção cromossômica.
Ainda, o mapeamento físico dos DNAs repetitivos revelou semelhança entre as espécies
Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin e
demonstrou que a fração centromérica de Cnemidophorus sp.1 é diferente das demais
analisadas.
122
8. Conclusão
o As análises citogenômicas empregadas neste estudo nas espécies de teídeos não
revelaram diferenças genéticas entre indivíduos de uma mesma espécie
provenientes de diferentes localidades amostradas.
o Os genomas das espécies Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx
pelviceps e Tupinambis teguixin apresentam diferentes classes de DNAs
repetitivos estando associadas com regiões heterocromáticas centroméricas e
teloméricas, os quais estão atuando estruturalmente na organização centromérica
e telomérica, bem como na composição da fração heterocromática. Já o genoma
de Cnemidophorus sp.1 estes DNAs repetitivos apresentam múltiplas marcações
ao longo de todos os cromossomos, localizadas em regiões eucromáticas,
provavelmente exercendo papéis funcionais no genoma desta espécie.
o A fração repetitiva heterocromática de Cnemidophorus sp.1 difere das demais
espécies de teídeos.
o Os DNAs repetitivos podem estar alocados tanto nos macrocromossomos quanto
nos microcromossomos, uma vez que compartilham os mesmos DNAs
repetitivos entre as espécies de teideos.
123
9. Referências Bibliográficas
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Anexo I. Sequências obtidas após clonagem e sequencimanento dos DNAs repetitivos
DNA ribossomal 5s, gene da tropomiosina 1 e os retrolementos Rex 1 e SINE de Ameiva
ameiva.