METODO PREPARACIÓN DEL COLORANTEHEMATOXILINA DE HARRIS

RICHARD BEDONTECNÓLOGO MÉDICOSERVICIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICAHOSPITAL “VRG” - Hz

TINCIÓN NUCLEAR

OBJETIVOS

El alumno deberá identificar los reactivos principales para lapreparación del colorante Hematoxilina de Harris.

Entender el fundamento de la coloración nuclear. Al final de la práctica el alumno deberá presentar un mapa

conceptual de lo aprendido

TINCIÓN NUCLEAR

La Hematoxilina de Harris esta compuesta por unamezcla de Hematoxilina (5 g), Alcohol 100% (50 mL),Alumbre de Potasio (100 g), Agua destilada (1000 mL)y Oxido de rojo de Mercurio (2,5 g).

TINCIÓN NUCLEAR

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES:

FUNDAMENTO – QUE ES UNA SOLUCIÓN?

Son mezclas homogéneas de dos o mas sustancias, una solución es la mezclade un soluto en un disolvente, entendiéndose por soluto la sustancia que estaen menor proporción y disolvente la sustancia que esta en mayor proporción

TIPOS DE SOLUCIONES:

Sólidas, Líquidas y gaseosas

TINCIÓN NUCLEAR Cada uno de los componentes de la Hematoxilina cumple una función.

Alcohol 96% es solvente de la hematoxilina

Agua destilada es solvente del mordiente

Alumbre de potasio es mordiente

Oxido de Mercurio que oxida la Hematoxilina a Hemateina que es su ingredienteactivo

Finalmente la Hematoxilina que es el colorante

TINCIÓN NUCLEAR

La Hematoxilina necesita de un mordiente(intermediario) entre el tejido y el colorante,formando un complejo Tejido-Mordiente-Hematoxilina, compuesto por un complejo decoordinación formado entre un ion polivalente deun metal y el colorante, que no es fácil disociarlo.

TINCIÓN NUCLEAR

La Hematoxilina colorante básico reacciona congrupos aniónicos (cargados negativamente) decomponentes de los tejidos, como grupos fosfatoionizados (PO3-) de heterocromatina, nucléolos yácidos nucleicos (ADN y RNA) del núcleo, grupossulfato ionizados (SH-) en el citoplasma y matriz delcartílago, y grupos carbonilo (COOH-) de lasproteínas, por lo que son basófilos

TINCIÓN NUCLEAR

Existen dos métodos para teñir el núcleo

Se tiñe el núcleo con la intensidad de color deseada:

METODO PROGRESIVO

Se sobre-tiñe con hematoxilina no acidificada, luego seremueve el exceso de tinción con ácido clorhídricodiluido:

METODO REGRESIVO

TINCIÓN NUCLEAR

Grupos auxocromos de las moléculas de hematoxilina

Tonalidad rojiza pH < 3:

Tonalidad azulada pH > 3:

En pH 8 el núcleo adopta un color fuertemente azulado

Reactivo Función del colorante Función en la célula

HematoxilinaComponente activo:Hemateina (carganegativa) se obtiene de lamaduración (oxidación)

Cuando madura toma uncolor rojo vinoso, tonalidadque toman los núcleos

Sulfato de Potasio yaluminio

Mordiente – le da el color ala hematoxilina

Suministra cargas positivasque actúa como puentespara unirse a las cargasnegativas de la Hemateinay del ácido fosfórico delDNA nuclear

Ácido acético glacial Diferenciador, estabiliza elcolorante, previeneoxidación

Incrementa la precisión dela tinción nuclear

Agua destilada Disuelve el sulfato depotasio y aluminio porcalentamiento

Óxido de mercurio (rojo oamarillo)

Activa la hematoxilinapara obtener poroxidación: Hemateina

La Hemateina le da latonalidad a los núcleos

PROBLEMAS CON LA TINCIÓNCOLORACIÓN NUCLEARDEMASIADO PÁLIDA

Deficiente remoción del fijador,tiempo insuficiente de coloración,hematoxilina diluida con agua,HCl muy concentrado odemasiadas inmersiones, lavadocon agua corriente con muchocloro.

COLORACIÓN NUCLEAR MUYOSCURO

Frotis con áreas gruesas y finas,frotis hemorrágicos cambia el pH yhay mayor afinidad porhematoxilina, mal enjuague,pocas inmersiones en HCl o suconcentración es muy baja.

Definition of cytopathology

Cytopathology is the study of normal and abnormal exfoliated cells in

tissue fluid.

The individual cells reflect the normal and abnormal morphology of the

tissue from which they are derived.

Types of exfoliated cyto-pathology

Natural spontaneous exfoliation

Natural covering epithelium: skin, urinary tract, vagina, and cervix.

Glandular epithelial secretion: Breast (Nipple secretion).

Sputum

Urine

Exudates and transudate:

Pleural fluid Peritoneal fluid

Pericardial fluid

Artificial enhanced exfoliation:

Scrapings from cervix, vagina, oral cavity, and skin

Brushing and lavage: bronchi, GIT, and urinary tract

Fine needle aspiration (FNA) for:

Body cavity fluid: pleural, pericardial & peritoneal fluids

Cysts: neck, breast & ovary

Solid tissue: body organs, tumors

Role of cytopathology

Early detection of unsuspected diseases (malignant

or pre-malignant lesions).

Confirmation of suspected diseases without surgical

trauma.

Diagnosis of hormonal imbalance.

Useful in flow up the course of disease or

monitoring therapy.

Advantage of Cytopathology

Rapid diagnosis - Inexpensive - Simple

It is better in evaluating the infectious diseases.

Supplement or replace frozen section or biopsy

No injury to tissue allowing repeated sampling

It is better for hormonal assay

Cytopathological smear cover a wider surface than that

involved in surgical biopsy.

Disadvantage of Cytopathology

Interpretation of the morphological cellular changes is based only on

individual cell observation.

Not always finally diagnosis, so it is confirmed by histopathology in some

cases.

Not determine the size and type of lesion of some cases.

Factors that determine the appearance of cells

Type of the technique used.

Level of cell maturation at the time of cell collection.

Nature of the parents tissue: soft tissue, cyst, or solid organ.

Medium of the exfoliated cells.

Interval between the stain of the exfoliated cells and collection of samples.

Type of fixative, stain, and processing of the technique used.

PAP smear: named afterDr. George Papanicolaou (1883-1962)

Vaginal smears from guinea pigs (1917)

Women (1920)Hormonal cycles

Pathological conditions (1928)

Normal Cervix

Taking the Sample

Liquid Based Cytology – lab processing

The Pap Smear

Pap smears are not perfect

For a high grade lesion, the sensitivity of a single pap smear is only

60-80%

Estimated false negative rate is 30-50%

Requires adequate specimen collection

Requires adequate cytological review

Requires adequate patient and physician follow-up

10% of women with cervical cancer had inappropriate follow-up.

Requires access to care

50% of women with cervical cancer were never screened and 10% had

not been screened within 5 years of diagnosis.

Who to screen

Any woman with a cervix who has ever had sexual activity.

Screening frequency

Yearly until three consecutive normal pap smears, then may decrease

frequency to every three years

Annual screening for high-risk women is highly recommend.

When to stop routine screening

Age 65 and “adequate recent screening”

Three consecutive normal pap smears

No abnormal pap smears in last 10 years

No history of cervical or uterine cancer

Hysterectomy for benign disease

Hysterectomy for invasive cervical cancer

Cervical histology

Original Squamous Epithelium

Vagina and outer ectocervix

4 cell layers

Well-glycogenated (pink) unless atrophic

Columnar Epithelium

Upper and middle endo-cervical canal

Single layer of columnar cells arranged in folds

Mucin producing (not true glands)

Squamous Metaplasia

Central ectocervix and proximal endocervical canal

Replacement of columnar cells by squamous epithelium

Progressive and stimulated by

Acidic environment with onset of puberty

Estrogen causing eversion of endocervix

Transformation Zone

Zone between original squamo-columnar junction and the “new” squamo-columnar junction

Nabothian cysts visually identify the transformation zone if present

SquamousEpithelium

Parabasal Cells

Intermediate Cells

Superficial Cells

Endocervix

Endocervical Cells

Endometrial Cells

Non-Epithelial Cells

sperms

Lymphocytes Polymorphs

Normal smear

Metaplastic Cells