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CITOMETRIA DE FLUJO
Inmunologia – Curso 2008
Citometría de Flujo
SISTEMA FLUÍDICO
COMPONENTES DEL EQUIPO SISTEMA ÓPTICO
SISTEMA ELECTRÓNICO
Citometría de Flujo
PARÁMETROS CELULARES MEDIDOS • El tamaño celular relativo ( Forward Scatter o
FSC)
• La complejidad interna o granularidad relativa (Side Scatter o SSC)
• Intensidades relativas de emisión de fluorescencia
( FL1, FL2, FL3 ,FL4…..etc..)
Citometría de Flujo
FORWARD SCATER – LUZ DIFRACTADA - SE RELACIONA CON LA SUPERFICIE Y AREA CELULARES -SE DETECTA EN EL EJE DE INCIDENCIA DEL LASER
SIDE SCATER – LUZ REFLEJADA Y REFRACTADA -SE RELACIONA CON LA COMPLEJIDAD INTERNA DE LA CELULA Y SU GRANULARIDAD -SE DETECTA EN UN ANGULO DE 90 GRADOS CON EL HAZ DEL LASER
Citometría de Flujo
MARCACION DE CELULAS CON ANTICUERPOS FLUORESCENTES
•Se utilizan, generalmente, inmunoglobulinas monoclonales contra antígenos de la supercicie de las celulas, marcadas con colorantes fluorescentes.
•Control negativo: Anticuerpo del mismo isotipo marcado con el mismo fluorocromo pero que no reconoce ninguna de las moléculas de la superficie.
•Control negativo: células que no fueron marcadas para determinar autofluorescencia.
•Control positivo: células normales, células de líneas celulares.
Citometría de Flujo
Fluorocromos utilizados
Citometría de Flujo
FL1
FL2
FL3FL4
ANALISIS DE DATOS
Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras:
1) Histograma
Eventos medidos
FLUORESCENCIA
Citometría de Flujo
HISTOGRAMA
Intensidad de fluorescencia y sitios de unión
Intensidad de fluorescencia FITC
Número de eventos
FITC
FITC
FITC
FITCFITC
FITC
FITC
FITC
FITC FITC
Citometría de Flujo
Citometría de Flujo
Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras:
2) Dot-plot
Linfocitos
Monocitos
Analisis de datos
Granulocitos
CD3- CD4 en sangre total CD3 – CD4 en gate de linfocitos
Elijo un gate:
Ej. linfocitos
Expresión de Resultados
• Datos porcentuales• Datos absolutos : Partículas de cuantificación• Datos estadísticos
Quadrant Statistics
File: Normal01.05 Log Data Units: Linear Values
Sample ID: Patient ID:
Tube: CD3/CD8 Panel: IMK-Lymphocyte
Acquisition Date: 15-Jun-95 Gate: G1
Gated Events: 2383 Total Events: 6000
X Parameter: FL1-H CD3 (Log) Y Parameter: FL2-H CD8 (Log)
Quad Location: 17, 17
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean
UL 126 5.29 2.10 4.51 4.12 324.82 171.35
UR 508 21.32 8.47 268.00 249.17 2472.09 1624.51
LL 420 17.62 7.00 3.92 3.50 3.13 2.53
LR 1329 55.77 22.15 306.66 289.43 1.50 1.28
Citometría de Flujo
Separación de células usando citometría de flujo(Cell sorting)
-El citómetro permite separar físicamente, poblaciones de células-Se puede realizar en condiciones de esterilidad.
Citometría de Flujo
Determinación de citoquinas intracelulares por citometría
DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO
TUNEL: Determina ADN fragmentado, incorporando a los extremos de ADN 12-dUTP-FITC
DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO
TUNEL: Determina ADN fragmentado, incorporando a los extremos de ADN 12-dUTP-FITC
DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO
ANEXINA V
DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO
IODURO DE PROPIDIO
PROLIFERACION CELULAR: CFSE
- Carboxifluorescein diacetato succinimidil ester (CFSE)
- Sonda fluorescente que se une a proteínas intracelulares y que se
reparte por igual entre las células hijas
CFSE
XX
Fluorescencia / célulaFluorescencia / célula
X / 2X / 2 X / 4X / 4
Después del Después del cultivocultivo
BasalBasal
M1
Cytometric bead arrays (CBA)
Tonos de un color
Ac. unidos a beads, emitiendo a distintas intesidades de FL3
Varios analitos
Ac conjugados con PE (emitiendo en FL2), proporcionales a la conc del analito.
Multiplex ensayo por CFCitoquinas – Determinación de citoquinas secretadas por citometría
10 10 10 10 100 1 2 3 4
muestra.005FL2-Height ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
muestra.001FL2-Height ->
IL-6
IL-10
MCP-1
IFN-g
TNF-a
IL-12
CBA para citoquinas inflamatorias
PBS CBEFL-3
FL-2 FL-2
FL-3
FL-2: Da cuenta de la concentración de la citoquina.
FL-3: Da cuenta de las diferentes citoquinas.
Citoquinas – Determinación de citoquinas secretadas por citometría