Citotoxicidad Celular y

Fagocitosis

Dra. Sabrina Andara. Profesora invitada

Cátedra de Inmunología

Escuela de Medicina José María Vargas

Facultad de Medicina

Universidad Central de Venezuela

2016

1.- Describir los mecanismos de citotoxicidad mediada por células,

precisando mediadores solubles, de membrana y celulares

implicados

2.- Describir las características morfológicas y funcionales de los

fagocitos

3.- Describir el proceso de fagocitosis y destrucción intracelular

de patógenos

4.- Explicar el fundamento de las diversas pruebas de la función

fagocítica

5.- Enumerar los trastornos de la función fagocítica en humanos

Objetivos específicos

CITOTOXICIDAD CELULAR

Mecanismo efector esencial de la respuesta inmunitaria

Rama celular

Defensa contra: Patógenos intracelulares (Virus, algunas bacterias y parásitos)

Células tumorales

Células propias alteradas sometidas a estrés térmico o traumático.

Importante en el rechazo de tejidos alógenicos(Trasplantes)

Citotoxicidad Celular

Células Citotóxicas

Linfocitos T citotóxicos

Específicos de antígeno

CTL

Células Asesinas Naturales

Inespecíficas de antígeno

Linfocitos NK

Linfocitos NKT

Cada tipo de linfocito T efector expresa un conjunto particularde moléculas efectoras

IFN-TNF-β

IFN-IL-2 IL-4, IL-5

GRÁNULOSTÓXICOS:

FAS-L CD40L CD40L

CITOCINAS:

MOLÉCULASDE MEMBRANA:

Perforinasy Granzymas

FAS

CD40CD40

• CD45 RO

Mayor

sensibilidad a la

activación por

PP/MHC –TCR

• No requieren

coestimulación

• Alta expresión

moléculas de

adhesión

Células T Citotóxicas CTL

Marcadores: CD3 y CD8

Maduran en timo

Pre-CTL: Ly T CD8 que todavía no tienen actividad citotóxica

Generación de CTL efectores:

1.- Señal específica de Ag transmitida por el complejo

TCR (reconocimiento péptido-MHC clase I)

2.- Señal co-estimuladora (CD28-B7)

3.- Interacción IL-2 con receptor IL-2:

Proliferación y diferenciación de CTL-P

activado por Ag hacia CTL efector

Después de

5 días del

encuentro

con el Ag

Proliferación de CTL memoria no requiere de TH1

Mecanismos de Citotoxicidad

1. Interacciones Celulares

Directas

2. Interacciones Celulares

Indirectas: Citoquinas,

Fas-Fas L soluble

1. Reconocimiento TCR-

PP/MHC 1

2. Adherencia firme. Mayor

afinidad LFA-1 por ICAM-

1(5-10min) luego disminuye

afinidad y se disocian.

1. Formación de conjugado CTL-Célula Blanco. (aumento de Ca 2+ intracelular)

2. Orientación de gránulos (Aparato de Golgi) hacia membrana y fusión con esta

(exocitosis)

3. Liberación perforina monomérica

4. Cambio de conformación monomeros de perforina (inducido por Ca2+) Se

insertan en membrana célula blanco

5. Se polimerizan dentro de la membrana

6. Formación de poros Entrada de granzimas

Proteína de los gránulos

de las células T citotóxicas

Acción sobre la célula

diana

Perforina Se polimeriza para formar un

poro en la membrana

Granzimas Serin-proteasas

Activan la apoptosis (Vía

apoptósica) al llegar al

citoplasma de la célula diana.

Fragmentación del DNA.

Granulisina Media la despolarización de la

membrana mitocondrial en

células diana y liberación de

citocromo C, promoviendo

apoptosis

5 Granzimas en humanosGranzimas A, B y C

Fas - Fas L

Muerte celular mediada por

Receptores

Citotoxicidad indirecta mediada por

Citoquinas

Muerte celular mediada por

Receptores

Entrecruzamiento de CD95 o TNFR1

Trimerización del receptor

Unión de proteínas adaptadoras a dominios de

muerte

Reclutamiento y activación de caspasas

Apoptosis.

Apoptosis

Proceso de autodestrucción activo

Requiere expresión de genes y síntesis proteica activa

Culmina en desnaturalización del genoma por endonucleasas

Formación de cuerpos apoptóticos

Encogimiento celular

Degradación de la cromatina

Los eventos son ordenados

No hay inflamación

Necrosis

Daño tisular masivo por noxas

como: Trauma, calor, hipoxia,

tóxicos, etc.

Asociada a lesiones de

membrana (lisis osmótica).

Se pierde organización celular.

Conduce a inflamación del

tejido circundante

No ocurre bajo condiciones

fisiológicas

Tipos de Muerte Celular

NECROSIS APOPTOSIS

Fragmentación del núcleo

Integridad de lamembrana

Cuerpos apoptóticos

Fagocitosis sinINFLAMACION

Diseminación del contenido intracelular

Fagocitosis conINFLAMACION

Son linfocitos grandes granulares

No tienen TCR, no expresan Ig de membrana

Se activan por IFN- y TNF

Su mecanismo de destrucción no es específico,pero no es al azar (células infectadas y algunaslíneas tumorales pero no células normales)

No tienen restricción por MHC

Defensa contra virus y tumores

Citotóxicas de manera constitutiva. Siempretienen gránulos en su citoplasma.

No genera memoria inmunitaria

Celulas NK

Natural Killer o Citotóxicas Naturales

Activación Ly NK

Balance entre señales activadoras e inhibidoras de receptores en células NK

Las células modificadas pueden expresar bajos niveles de MHC I.

Los virus pueden inhibir la síntesis de proteínas entre ellas la mayor producción de MHC I inducida por IFN.

Proteína virales pueden bloquear el ensamblaje y transporte de las moléculas clase I.

Los virus pueden alterar la glicosilación de proteínas celulares del hospedador.

La unión de Receptores Activadores (como NKR-P1) junto con una baja expresión o unión a Receptores KIR activa a las células NK para que maten a las células blanco por Apoptosis.

Las señales inhibitorias tienden a superar a las activadoras

Activación Ly NK

Receptores:

1. Activadores

- Tipo Lectina:

CD94/NKG2D o C

(dominios ITAM)

ligando MIC A y B

- Tipo

Inmunoglobulina:

NKp30,44,46

- CD16 (R de Ac)

2. Inhibidores

- Tipo Lectina:

CD94/NKG2A

(dominios ITIM)

ligando HLA-E

- Tipo

Inmunoglobulina:

KIR. Ligando

móleculas HLA B o

C

ADCC. Citotoxicidad Celular

Dependiente de Anticuerpos

Actividad efectora anti-viral de linfocitos NK y linfocitos T citotóxicos

IL-12

Poseen TCR (invariante)

Ligando Glicolipidos por CD1d

No forman células memoria

Marcadores de células NK

Secretan Il-4 INF- Il-2

Ly NKT

FAGOCITOSIS

Fagocitosis

Fagocitosis se define como el acto de engullir,

con el propósito de destruir, un objeto, tal

como un microorganismoLiu H, Pope RM. Phagocytes: mechanisms of inflammation and tissue destruction. Rheum Dis Clin N Am 30 (2004) 19-39

Células Fagocíticas

Neutrófilos Macrófagos

Localización Sangre

periférica

Tejidos

Vida Media Horas Prolongada

Blanco Bacterias

Piógenas

Bacterias,Virus

y Protozoarios

intracelulares

Otras funciones:

Presentación Antigénica

y Citotoxicidad.

Gránulos Específicos

Gránulos Azurófilos

Gránulos Azurófilos0,5 μM1.500/ célula

LisozimaMieloperoxidasaElastasaCatepsina GH+ Hidrolasas

DefensinasBPI

Gránulos Específicos0,2 μM3.000/ célula

LisozimaCitocromo b558

OH- fosfatasa

Lactoferrina

Proteína Fijadora de Vitamina B12

- Depósitos de Glucógeno Les permite actuar

de forma eficiente en Anaerobiosis.

- Estallido respiratorio mayor que MO

generan mayor cantidad de reactivos de O2 y

Nitrógeno.

Monocitos y Macrofagos

- Tamaño 5-10 veces

- Complejidad estructural y

organelas

- Capacidad fagocítica

- Enzimas líticas

Macrófagos

ACTIVADOS:

Aumento de su

eficacia por mayor:

- Capacidad

fagocítica

- Potencial para

destruir patógenos

- Secreción

mediadores

inflamatorios

- Actividad

citotóxica

- Expresión MHC II

Fases de la Fagocitosis

1.Movilidad

2.Reconocimiento y

Adhesión

3. Ingestión

4.Desgranulación

5.Muerte intracelular

Fases de la Fagocitosis

Moléculas de Adhesión

Quimiocinas

Complemento

Sistema de la Coagulación

Interacción PAMP-PRR

Opsonización

Complemento

IgG

Patrones Moleculares Asociados a Patógenos

PAMPs

Receptores de ReconocimientoDe Patrones

PRR

También receptores para

moléculas opsonizantes:

- Inmunoglobulinas

- Complemento

Moléculas de Reconocimiento

Infecciones Extracelulares

Lipopolisacárido Bacterias Gamnegativas

Ácido lipoteicoico Bacterias Grampositivas

Mananos Pared celular de levaduras

Glicolípidos Micobacterias

Infecciones Intracelulares

Secuencias no metiladas CpG DNA Bacteriano

RNA bicatenario Virus RNA

PAMPs

Fagocitosis en ausencia de señal de

Peligro

Fagocitosis de células

apoptóticas

Señales de “cómeme”

No desencadena eventos

inflamatorios

Molécula Candidata: C1q

Fases de la Fagocitosis

Activación del Citoesqueleto

Emisión de Pseudópodos

Englobamiento

Formación del Fagosoma

Fases de la Fagocitosis

En minutos

Formación del fagolisosoma

Clase de Mecanismo Productos específicos

AcidificaciónpH = ~ 3.5-4.0, bacteriostático o

bactericida

Productos tóxicos derivados de

Oxígeno

Superóxido, Peróxido de Hidrógeno, radical

hidroxilo, hipoclorito

Productos tóxicos derivados de

NitrógenoNO

Péptidos Antimicrobianos Defensinas y proteínas catiónicas

Enzimas

Lisozima (disuelve la pared celular de

ciertas bacterias grampositivas)

Hidrolasas ácidas (digestión de la bacteria)

CompetidoresLactoferrina (une Fe) y proteína fijadora de

vitamina B12

Fases de la Fagocitosis

Destrucción mediante intermediarios

reactivos de Oxígeno

Citosol

Gránulo

Proceso fagocítico

Desencadenante

Membrana

Flavo-citocromo

b558

12

3

4

Proceso oxidativo

1. Anión

superóxido (para

pasar a 2 enzima:

superoxido

dismutasa)

2. Peróxido de

Hidrogeno

3. Radicales

hidroxilo

4. Hipoclorito (Por

enzima

Mieloperoxidasa)

Destrucción mediante intermediarios

reactivos de Nitrógeno

NO Sintetasa

L-NMMA

L-ARGININA CITRULINA

1

23

1. Óxido Nítrico

2. Superóxido

3. Dióxido de Nitrógeno

Destrucción mediante mecanismos

independientes de Oxígeno

Catepsina G

Defensinas de bajo PM

Proteínas catiónicas de alto PM

Proteína incrementadora de la

permeabilidad bacteriana (BPI)

Daño a las Membranas microbianas

LisozimaEscinde los mucopéptidos de la pared

celular bacteriana

Lactoferrina Forma complejos con el hierro

Enzimas proteolíticas

Otras enzimas hidrolíticas diversas

Digestión de microorganismos

digeridos

Factores secretados por Macrófagos

Activados

Interleukina 1 (IL-1)Promueve respuestas inflamatorias y fiebre

Interleukina 6 (IL-6)

Factor de Necrosis Tumoral α (TNF-α)

Promueven la inmunidad Innata y la eliminación de Patógenos

Proteínas del ComplementoPromueven la respuesta Inflamatoria y la eliminación de patógenos

Enzimas hidrolíticas Promueven la respuesta Inflamatoria

Interferón α (IFN-α)Activa genes celulares, dando lugar a la producción de proteínas que confieren un estado antiviral a la célula

Factor de Necrosis Tumoral α (TNF-α) Destruye algunas células tumorales

GM-CSF

G-CSF

M-CSF

Promueve la hematopoyesis inducible

Métodos de Estudio de la Fagocitosis

Conteo de PMN – Conteo de monocitos y

Macrófagos

Pruebas de Movilidad de PMN

Prueba de Movilidad al azar: Método del tubo

capilar

Prueba de la membrana para quimiotaxia

Pruebas de reconocimiento y adherencia

CD18 (Subunidad β de LFA-1, Mac-1 y CR4)

Receptores para CC e IG – FcR y CR

Cámara de Boyden

Two chambers are separated by a filter through which cells migrate. Chemotactic gradients can be set up by placing different concentrations of theputative chemo-attractant in the upper and lower chambers. The advantage of the Boyden chamber is that is can discriminate between chemo-kinetic and chemotactic influences. The use of this chamber requires that the cells undertest have to move in three dimensions (most do) and to squeeze between thepore size of the particular filter. Filters are available in different average poresizes, so this latter point is seldom a problem. The Boyden chamber isreproducible and the chemokinetic, chemotactic response easy to quantify.

Prueba para quimiotaxia de PMN

PMN

Sust. Quimiotáctica

Sust. No

Quimiotáctica

Prueba para quimiotaxia de PMN

Métodos para el Estudio de la

Fagocitosis

Pruebas de Ingestión

Cuenta Directa al Microscopio de Luz

Estimación de la radioactividad emitida por

fagocitos que han ingerido partículas marcadas

Medición de la tinción de lípidos

Análisis mediante citometría de flujo

Métodos para el Estudio de la

Fagocitosis

Pruebas de Desgranulación

Fagocitosis Frustrada

Pruebas de Muerte Intracelular

Prueba de Reducción del Azul de Tetrazolio

Nitrado

Quimioluminiscencia

Citometría de Flujo (Estallido Oxidativo)

Análisis Microbicida de Neutrófilos

Fagocitosis Frustrada

IgG agregada

PMN

Enzimas Lisosómicas

Prueba Cuantitativa del NBTazul de tetrazolio nitrado

LátexNBT

Formazán Piridina

Quimioluminiscencia

O2H2 O2

O2-

O2

O2

O2

H2 O2

H2 O2

H2 O2

O2-

O2-

O2-

Quimioluminiscencia

O2H2 O2

O2-

O2

O2

O2

H2 O2

H2 O2

H2 O2

O2-

O2-

O2-

Quimioluminiscencia

O2H2 O2

O2-

O2

O2

O2

H2 O2

H2 O2

H2 O2

O2-

O2-

O2-

Quimioluminiscencia

O2

H2 O2

O2-

O2O2

O2

H2 O2H2 O2

H2 O2

O2-

O2-

O2-

COO-

Inestable

Quimioluminiscencia

O2

H2 O2

O2-

O2O2

O2

H2 O2H2 O2

H2 O2

O2-

O2-

O2-

COOH

Edo. Basal

Citometría de Flujo

Análisis Microbicida de Neutrófilos

Alteraciones de la Función Fagocitaria

Neutropenia congénita o adquirida

Síndrome de Job

Deficiencia de Mieloperoxidasa

Deficiencia de Glucosa-6-P Deshidrogenasa

Leucemia aguda

Disfunción Transitoria del Neutrófilo Infecciones agudas

Ataxia-Telangiectasia

Crioglobulinemia

Enfermedad Granulomatosa Crónica

Síndrome de Chédiak-Higashi

Déficit de Adhesión leucocitaria

Prematuridad

Síndrome de Down

Susceptibilidad a infección por micobacterias

Modelo de Enfermedades autoinmunes

Bibliografía

Roitt: Inmunología Fundamentos

Kuby: 5ta. Edición

Stites (Sección de métodos de estudio)

Muchas Gracias!