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CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN MATERIALES AVANZADOS DEPARTAMENTO DE ESTUDIOS DE POSGRADO
CITOTOXICIDAD DE NANOTUBOS DE CARBONO FUNCIONALIZADOS CON PROTEINAS DE
SUPERFICIE DE Entamoeba histolytica
Tesis para obtener el grado de:
DOCTORADO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA AMBIENTAL
Que presenta:
M.C. Silvia Lorena Montes Fonseca
Asesores:
Dr. Erasmo Orrantia Borunda y Dra. Blanca Estela Sánchez Ramírez
CHIHUAHUA, CHIH., MÉXICO, ENERO DEL 2014
i
TABLA DE CONTENIDO
Página
ÍNDICE i
INDICE DE TABLAS iii
INDICE DE FIGURAS iv
LISTA DE ABREVIATURAS vi
AGRADECIMIENTOS viii
RECONOCIMIENTOS ix
1. RESUMEN 1
2. ANTECEDENTES 2
2.1 Generalidades de los nanotubos de carbono
2.2 Síntesis de los nanotubos de carbono
2.2.1 Deposición química de vapor (CVD)
2.3 Purificación de los nanotubos de carbono
2.4 Funcionalización de los nanotubos de carbono
2.5 Toxicidad en los nanotubos de carbono
2.5.1 Impacto de los nanomateriales en la salud y el medio ambiente
2.5.2 Toxicidad de los nanotubos de carbono in vitro
2.6 Aplicaciones médicas de los nanotubos de carbón
2.7 Generalidades de Entamoeba histolytica
2
3
4
5
7
8
10
13
15
18
3. JUSTIFICACIÓN Y RELEVANCIA CIENTÍFICA
4. HIPOTESIS Y OBJETIVOS
20
21
5. MATERIALES Y MÉTODOS 22
5.1 Síntesis de los NTC 22
5.2 Purificación de los NTC 22
5.3 Caracterización de los NP-NTC y los P-NTC 22
5.4 Purificación del a proteína de 46KDa de Entamoeba histolytica 23
5.4.1 Cultivo de Entamoeba histolytica 23
5.4.2 Extracción de la proteína de 46KDa de Entamoeba histolytica 24
5.4.3 Purificación de la proteína de 46KDa de Entamoeba histolytica por
fraccionamiento proteico
24
5.4.4 Electroforesis SDS-PAGE 25
5.4.4.1. Armado del gel y corrida electroforética 25
5.4.5 Limpieza de las fracciones proteicas 26
5.5.6 Cuantificación de proteínas totales por el método de Bradford 27
ii
5.5 Funcionalización de los P-NTC 27
5.6 Liofilización de los f-NTC 27
5.7 Caracterización de los P46S y P46P-NTC 28
5.8 Estudios in vitro 28
5.8.1 Interacción de los P46S y P46P-NTC con los Macrófagos 28
5.8.2 Mantenimiento de la Línea Celular J774 29
5.8.3 Ensayo de MTT en microplaca 29
5.8.4 Determinación de apoptosis celular 30
5.8.5 Análisis morfológico de los MOs interaccionados con los NTC 31
5.8.6 Análisis estadístico 32
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 33
6.1 Síntesis y Purificación de los NTC 33
6.2 Purificación de la proteína de 46 KDa de Entamoeba histolytica 36
6.3 Funcionalización de los P-NTC 37
6.4 Estudios in vitro 44
6.4.1 Ensayos de viabilidad celular por MTT en microplaca 44
6.4.2 Determinación de la apoptosis celular 46
6.4.3 Análisis morfológico en los MOs interaccionados con los NTC 49
7. Conclusiones 52
8. Bibliografía 53
iii
INDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1. Ventajas y limitaciones de los métodos de síntesis de los NTC 4
Tabla 2. Patrones de citocinas de células Th 19
Tabla 3. Análisis elemental de los NP-NTC y los P-NTC 34
Tabla 4. Bandas específicas de diferentes aminoácidos en
espectroscopia infrarrojo
41
Tabla 5. Bandas Amidas de espectros infrarrojo de proteínas 43
iv
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Estructura de los enlaces entre los átomos de carbono del grafito
y de los NTC
2
Figura 2. Estructura de los SWNT y los MWNT 3
Figura 3. Síntesis de NTC por el método de CVD 5
Figura 4. Funcionalización iónica mediante amidación con una
carbodiimida activada
8
Figura 5. Rutas de exposición y biocinética de los nanomateriales 11
Figura 6. Rutas de exposición, distribución y degradación de los NTC en el
medio ambiente
12
Figura 7. Evaluación y gestión de riesgo de las nanopartículas 12
Figura 8. F-NTC utilizados en estudios de toxicidad 17
Figura 9. Tráfico intracelular de f-NTC con un marcador fluorescente 18
Figura 10. Programa de liofilización 28
Figura 11. Micrografías de los NP-NTC y los P-NTC obtenidas mediante
MEB
34
Figura 12. Espectro Raman de los NTC 35
Figura 13. Extracción y purificación de la proteína de 46 KDa de
Entamoeba histolytica
36
Figura 14. Reacción de funcionalización de los P-NTC mediante una
carbodimina activada
37
Figura 15. Fotografías de los P46-NTC obtenidos del sobrenadante (A) y
del precipitado (B)
38
Figura 16. Espectro Raman de los P46-NTC 40
Figura 17. Espectros infrarrojo en absorbancia de los P46-NTC 42
Figura 18. Espectro de infrarrojo de proteínas 43
Figura 19. Comparación entre los espectros infrarrojos de los P46-NTC y la
D-Glucosa
43
v
Figura 20. Ensayos de viabilidad celular de los Macrófagos interaccionados
con los NTC
44
Figura 21. Determinación de apoptosis celular en los macrófagos
interaccionados con los NTC
48
Figura 22. Análisis morfológico de los macrófagos interaccionados con los
NTC
50
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
°C Grados centígrados
µg Microgramos
µl Microlitros
ANOVA Análisis de varianza
cm2 Centímetros cuadrados
COOH Carboxilo
DMEM Medio de cultivo Dulbecco modificado por Eagle
CVD Deposición química de vapor
f-NTC Nanotubos de carbón funcionalizados
IL Interleucina
IFN-γ Interferón gamma
KDa Kilodaltones
Min Minutos
Mg Miligramo
MOs Macrófagos
MTT Sales de tetrazolium
MWNT Natotubos de pared múltiple
NP-NTC Nanotubos de carbono no purificados
H Hora
L Litro
mL Mililitro
PBS Solución salina de fosfatos
pH Potencial de hidrógeno
P46 Proteína de 46 KDa
P-NTC Nanotubos de carbono purificados
P46P-NTC Nanotubos de carbono funcionalizados con la proteína de
46 KDa obtenidos del precipitado
vii
P46S-NTC Nanotubos de carbono funcionalizados con la proteína de
46 KDa recuperados del sobrenadante
Rpm Revoluciones por minuto
SE Sin estímulo
Seg Segundo
SFB Suero fetal bovino
SWNT Nanotubos de pared sencilla
viii
AGRADECIMIENTOS
Le agradezco en primer lugar con todo mi cariño y mi amor a mis padres que hicieron
todo en la vida para que yo pudiera lograr mis sueños, por motivarme y darme la
mano cuando sentía que el camino se terminaba, sin ellos jamás habría tenido la
motivación necesaria para lograr mis metas, ni las fuerzas para luchar por ellas.
También a mis hermanos por ser parte importante de mi vida y apoyarme
incondicionalmente en mi desarrollo profesional. A mi hermana Geo por sacrificar su
tiempo para ayudarme a cuidar a mi hijo para que yo pudiera seguir trabajando y a mi
hermano Paco por siempre mostrar admiración e interés por mí, lo cual fue una gran
motivación para seguir adelante.
A mi hijo Ander que siempre fue mi más grande motivación y siempre mostró
paciencia y consideración hacia mi trabajo. Siempre me hacía olvidar las
preocupaciones y los problemas con una simple sonrisa o un abrazo. Espero ser un
ejemplo para ti para que tú también alcances las metas que te propongas y jamás te
rindas en el camino.
A Carlos, por su enorme paciencia y comprensión, prefirió sacrificar su tiempo para
que yo pudiera cumplir mis metas. Por tu bondad y sacrificio me inspiraste a ser
mejor para ti y esta tesis es el resultado de eso. Gracias por estar siempre a mi lado.
Finalmente le agradezco a todas aquellas personas que estuvieron a mi lado, me
apoyaron, me dieron ánimos y me mostraron su amor y su aprecio durante este gran
recorrido, a mis amigos y compañeros de laboratorio.
ix
RECONOCIMIENTOS
Esta tesis representa el esfuerzo de mucha gente que gracias a su dedicación a lo
largo de estos tres años y medio me permitieron culminar no solo con la
investigación, si no también me ayudaron a alcanzar la madurez académica
necesaria para este grado.
En primer lugar le quiero agradecer a la Dra. Blanca Sánchez por apoyarme en cada
etapa de este trabajo, con sus consejos, así como con su ejemplo de superación y
emprendimiento. De ella aprendí que no hay meta que no puedas alcanzar siempre y
cuando trabajes duro, con la mente abierta y sin dejarse influenciar por las malas
experiencias. Siempre al final verás la recompensa de tu trabajo.
También le quiero hacer un grato reconocimiento al Dr. Erasmo Orrantia porque
desde un inicio confío plenamente en nuestro grupo de trabajo y apoyó
incondicionalmente todas las necesidades que se fueron presentando. Gracias a él
este sueño se pudo cumplir y aún sigue atendiendo el futuro de ésta servidora.
De igual modo quiero hacer el reconocimiento a mis asesores que durante esta
estancia doctoral fueron enriqueciendo este trabajo con sugerencias y comentarios. A
la Dra. Antonia Luna porque a pesar de haberse incorporado a la mitad del trabajo se
mostró atenta, comprensiva y sus observaciones siempre fueron valiosas. A la Dra.
Carmen González y a la Dra. Rocío Infante por siempre estar presentes en cada
evaluación y mostrar interés a aprecio en mis presentaciones. Al Dr. Daniel
Glossman porque a pesar de no entender mucho del área siempre hacía comentarios
acertados y mostró interés por aprender y entender la investigación.
Finalmente le quiero agradecer al Centro de Investigación en Materiales Avanzados
por darme la oportunidad de realizar esta estancia, la cual me permitió desarrollar las
habilidades y competencias necesarias para el grado de Doctor en Ciencias.
1
1. RESUMEN
Los NTC son nanopartículas cilíndricas compuestas por láminas de grafito enrolladas y
exhiben propiedades físico-químicas importantes por lo que tienen muchas aplicaciones
nanotecnológicas. En el área biológica los NTC son utilizados como acarreadores debido
a su capacidad de ser funcionalizados con sustancias químicas de interés. El objetivo de
este proyecto es evaluar el efecto citotóxico de NTC funcionalizados con proteínas de
superficie de Entamoeba histolytica en cultivos de macrófagos de la línea celular J774.
Para esto los NTC fueron sintetizados mediante spray pirólisis y purificados por
sonicación en una mezcla de ácidos concentrados H2SO4/HNO3 3:1 por 48 h. Los NP-
NTC y los P-NTC obtenidos fueron caracterizados mediante MEB y espectroscopia
Raman. La proteína de 46 KDa de Entamoeba histolyticia fue purificada a partir de
cultivos de trofozoitos y posteriormente funcionalizada sobre los P-NTC. Los f-NTC fueron
caracterizados mediante espectroscopia Raman e Infrarrojo. Finalmente los MOs fueron
interaccionados con los diferentes NTC a concentraciones de 6, 0.6 y 0.06 mg/L por 24 h
y la citotoxicidad se evaluó mediante viabilidad celular por MTT, determinación de
apoptosis y análisis morfológico.
Los NP-NTC presentaron un diámetro entre 40-50 nm y una longitud de 30µm. Los P-
NTC mostraron longitudes <1µm, así como un aumento en el contenido de O de 1.22 a
22.21%. Estos también presentaron un contenido de grupos COOH de un 7%, así como
una menor calidad estructural de acuerdo a los espectros Raman en comparación con los
NP-NTC. Los P46-NTC recuperados del sobrenadante mostraron una mayor densidad de
funcionalización, así como la presencia de una glucoproteína de acuerdo a los espectros
IR. Los MOs interaccionados con los NP-NTC presentaron un mayor efecto tóxico en
comparación con los otros NTC. Por otro lado los MOs interaccionados con los P-NTC y
los P46-NTC obtenidos del precipitado no mostraron diferencias con respecto al control.
Los MOs interaccionados con los P46-NTC recuperados del sobrenadante presentaron
una disminución de la viabilidad celular significativa, sin embargo, no se observó una
actividad apoptótica importante. El análisis morfológico mostró que los MOs
interaccionados con los NP-NTC presentaron alteraciones morfológicas importantes
características de muerte celular. Los MOs interaccionados con P-NTC y los P46-NTC
del precipitado no mostraron cambios en comparación con el control. Los P46-NTC
recuperados del sobrenadante originaron deformaciones en la membrana y disminución
de la adherencia celular. Esto resultados nos permiten concluir que los P46-NTC
recuperados del precipitado no presentan efecto tóxico, por lo tanto son buenos
candidatos para su aplicación como nanovacuna. Sin embargo mayores estudios son
requeridos.
2
2. ANTECEDENTES
2.1 Generalidades de los nanotubos de carbono
Los nanotubos de carbono (NTC) son estructuras cilíndricas formadas por láminas de
grafito enrolladas, las cuales están compuestas por anillos de átomos de carbono
perfectamente estructurados. Los NTC son unos de los nanomateriales con mayor
diversidad en cuanto a las propiedades químicas que presentan (Dai H et al., 2002). Para
poder entender la estructura y las propiedades fisicoquímicas de los NTC primero hay
que recordar que el átomo de carbono tiene 6 electrones, dos de los cuales se
encuentran en el orbital 1s y los otros 4 restantes se reparten en los orbitales sp2 y/o sp3.
El enlace entre los átomos de carbono en las láminas de grafito es esencialmente de tipo
sp2, pero la curvatura circular puede causar una rehibridización δ-π, en donde 3 enlaces
δ se encuentran ligeramente fuera del plano y por compensación el enlace π está
localizado fuera del tubo (Figura 1). Esta característica le confiere a los NTC mayor
fuerza mecánica, conductividad eléctrica y térmica, así como mejor actividad química y
biológica que el grafito.
Figura 1. Estructura de los enlaces entre los átomos de carbono del grafito y de
los NTC. Cuando una lámina de grafito se enrolla para formar un nanotubo, el orbital
híbrido sp2 es deformado para formar una rehibridización del orbital sp2 al orbital sp3 o
un cambio δ-π (Modificado de Meyyappan M et al., 2005).
La estructura de los NTC también puede diferir de acuerdo al número de láminas de
grafito que los conformen, por lo que podemos encontrar nanotubos de pared sencilla
(SWNT; del inglés single-walled carbon nanotubes) y nanotubos de pared compuesta
3
(MWNT; del inglés multi-walled carbon nanotubes) (Figura 2).
Figura 2. Estructura de los SWNT y los MWNT. Los SWNT están formados por una
sola lámina de grafito enrollada, mientras que los MWNT están formados por varias
láminas de grafito superpuestas (Tomado de Tagmatarchis y Prato, 2005).
Los SWNT consisten en una sola lámina de grafito perfectamente envuelta en un tubo
cilíndrico con un diámetro de 0.4 a 3 nm (Tagmatarchis y Prato, 2005). Los SWNT
exhiben propiedades eléctricas importantes, diferenciales a las que presentan las
variantes de pared compuesta, por lo tanto, han sido los mejores candidatos para la
miniaturización electrónica (Martel et al., 2001). También presentan una fluorescencia
cercana a la infrarroja entre una longitud de onda de 900 y 1600 nm por lo que han sido
utilizados para el estudio de la ingestión activa de los NTC por diferentes células (Bachilo
et al., 2002; O'Connell et al., 2002; Cherukuri et al., 2006).
Los MWNT conforman un arreglo de cilindros concéntricos con un diámetro de 1.4 a 100
nm. Estos presentan mayor resistencia mecánica por lo que son utilizados en la
fabricación de ciertos materiales industriales. También son buenos candidatos para la
funcionalización ya que sus múltiples capas de grafito le permiten tener una mayor
posibilidad de enlace con el grupo funcional sin perder sus características estructurales
(Flahaut et al., 2003).
2.2 Síntesis de los nanotubos de carbono
La ciencia hoy en día ha desarrollado varias técnicas para la producción de NTC con
diferentes características estructurales, pero las más importantes son la vaporización
láser, el método de arco y la deposición química de vapor (CVD). Cada una de éstas
técnicas ofrece diferentes ventajas así como ciertas limitaciones, mismas que se
describen en el Tabla 1.
La vaporización por láser y el método de arco utilizan al carbono en fase sólida como
4
precursor para el crecimiento de los NTC e involucra su vaporización a altas
temperaturas (miles de grados centígrados). Sin embargo, debido al costo elevado del
primero y al bajo rendimiento del segundo, la CVD es la técnica más utilizada. La CVD
utiliza gases de hidrocarburos como fuentes de átomos de carbono y partículas de
metales como centros de crecimiento del NTC a bajas temperaturas (500-1000°C) (Dai H,
2002). A continuación se detallará esta técnica.
Tabla 1. Ventajas y limitaciones de los métodos de síntesis de los NTC (Alcca
Quispe, 2005).
Método de
síntesis de NTC Ventajas Limitaciones Rendimiento
Vaporización por
láser
Producción de SWNT con
una gama de diámetros que
se pueden controlar
variando la temperatura de
reacción.
Es muy costoso. Hasta un 70%
Método de arco
Se pueden sintetizar tanto
SWNT como MWNT con
pocos defectos
estructurales.
Los NTC tienden a ser
cortos y depositarse en
formas y tamaños
aleatorios. También se
forman carbonos
amorfos y fullerenos.
Hasta un 30%
Deposición
química de vapor
o spray pirólisis
Aplicación a escala
industrial. Se pueden
fabricar NTC de grandes
longitudes.
Solamente se pueden
sintetizar MWNT
plagados de defectos
por lo que tienen menor
resistencia de tracción
que los fabricados con
el método de arco.
De un 20 a
100%
2.2.1 Deposición química de vapor (CVD)
El método CVD, también conocido como spray pirólisis, utiliza un sustrato que actúa
como catalizador (Fe, Co, Ni) formando una capa fina de 1 a 50 nm de espesor en un
horno de atmósfera inerte de helio a baja presión. Este horno se calienta a 600ºC y
lentamente se añade gas metano, acetileno o benceno, los cuales liberan átomos de
carbono que se pueden recombinar en forma de NTC. Debido a las altas temperaturas el
5
metal catalizador se aglutina en nanopartículas separadas que sirven como centros de
crecimiento y forman la base de los NTC. El diámetro del NTC se define por el diámetro
de la partícula aglutinada (Alcca Quispe, 2005).
El método de síntesis CVD es el más aplicado a nivel industrial debido a sus bajos costos
y sus altos niveles de rendimiento (Figura 3). Sin embargo, los NTC sintetizados por CVD
tienden a depositar residuos en su superficie como restos de catalizadores y carbonos
amorfos. Para eliminar estos residuos no deseados se ha implementado un tratamiento
posterior a la síntesis que es la purificación, el cual se describe más adelante y nos
permite obtener NTC de mejor calidad.
Figura 3. Síntesis de NTC por el método de CVD. Para éste método se utiliza una
mezcla de la fuente de carbono junto con un metal catalizador (Fe, Co, Ni). La mezcla es
vaporizada y mediante un flujo de argón pasa a un tubo de cuarzo, el cual se encuentra
dentro de un horno a 600ºC. Debido a las altas temperaturas utilizadas el catalizador
forma nanopartículas que funcionan como centros de crecimiento del NTC (Aguilar-
Elguézabal et al., 2006).
2.3 Purificación de los Nanotubos de Carbono
La purificación ha sido un tema de interés ya que para algunas aplicaciones como son los
dispositivos electrónicos y los sensores químicos y biológicos, los NTC deben tener un
alto grado de pureza. Los NTC usualmente se encuentran contaminados con
6
catalizadores metálicos, carbonos amorfos y nanopartículas de grafito que pueden
obstaculizar algunas de sus aplicaciones (Hu et al, 2003).
La purificación puede realizarse con un tratamiento con ácido nítrico el cual remueve los
catalizadores metálicos y algunos carbonos amorfos. Dillon et al., (1999) reportaron que
los NTC tratados con ácido nítrico en reflujo por 4 a 16 h remueve los catalizadores
metálicos de su superficie de una manera eficiente, pero también se observó una pérdida
significativa de los NTC tratados (Dillon et al., 1999). Por esta razón Hu et al., (2003)
evaluaron diferentes tratamientos con ácido nítrico y concluyeron que la pureza y el
rendimiento de los NTC después del tratamiento dependen de la concentración del ácido
así como del tiempo de reflujo (Hu et al., 2003).
Saito et al., (2002) optimizaron la técnica de purificación utilizando una mezcla
concentrada de H2SO4/HNO3 3:1 v/v en sonicación en un baño de agua por 22 h. Este
grupo de investigación obtuvo NTC con longitudes menores a <1µm y estos presentaron
una mayor dispersión en solventes polares como etanol, dimetilsulfoxido y
dimetilformamida, en comparación con los P-NTC obtenidos solamente con una dilución
de HNO3 (Saito et al., 2002). Del mismo modo, Montes-Fonseca et al., (2012a)
aumentaron el tiempo de sonicación de 22 h a 48 h y los P-NTC obtenidos presentaron
longitudes que alcanzaban los 100 nm, así como una buena dispersión incluso en agua
(Montes-Fonseca et al., 2012a).
El ácido nítrico y el ácido sulfúrico son considerados como agentes oxidantes con la
capacidad de oxidar los átomos de carbono presentes en los extremos de los NTC, así
como en los sitios defectuosos de su superficie (Zhang et al., 2003). El reflujo o
sonicación con estos ácidos abre los extremos de los NTC (Dujardin et al., 1998) y logra
romper los anillos aromáticos estructurales mediante un ataque electrofílico sobre los
grupos CH y CH2. Este proceso oxidativo produce grupos hidroxil (OH) que a su vez
pueden ser transformados a grupos carboxílicos (COOH) y aumentar así su afinidad por
solvente polares (Zhang et al., 2003).
Los grupos COOH generados son de carácter ácido, por lo tanto pueden ser
cuantificados mediante una titulación ácido-base (Hu et al., 2001). La importancia de la
cuantificación de estos grupos nace a raíz de la funcionalización de los NTC, ya que los
COOH pueden ser utilizados como puentes para la formación de un enlace iónico entre el
NTC y otro grupo químico de interés y de esta manera potencializar sus aplicaciones en
áreas biológicas (Chen et al., 2001).
7
2.4 Funcionalización de los Nanotubos de Carbono
La funcionalización de los NTC se refiere a la unión de un grupo químico de interés a la
superficie del mismo. Este grupo químico puede ser utilizado solamente para solubilizar al
NTC o bien puede servir para agregar alguna sustancia marcadora o incluso alguna
sustancia con actividad biológica.
La unión puede ser mediante un enlace covalente o un enlace iónico. En el enlace
covalente la reacción química más utilizada es la cicloadición 1-3 dipolar con
intermediarios de azometina, donde hay una condensación entre un aldehído y α-
aminoácido (Gorgakilas et al., 2002). Los intermediarios de azometina formados por esta
condensación son muy reactivos y atacan los carbonos sp2 del NTC permitiendo una
conjugación entre el carbono afectado del NTC y un grupo amino externo.
Por otro lado, la funcionalización iónica utiliza los grupos COOH de los NTC formados
durante el proceso de purificación. Entre ambos tipos de funcionalización el enlace iónico
ofrece mayores ventajas sobre la funcionalización covalente ya que: (1) tiene un mayor
rendimiento; (2) las reacciones ácido-base son técnicas simples e implican costos bajos;
y (3) los cationes adicionados pueden ser cambiados fácilmente por otros cationes
orgánicos e inorgánicos (Chen et al., 2001).
Existen varias rutas alternativas que nos permiten formar un enlace iónico entre un grupo
COOH y un grupo amino. La amidación es una alternativa viable para la funcionalización
de los NTC en donde se utiliza como catalizador una cabodiimida activdada (Figura 4)
(Huang et al., 2003). En esta reacción los NTC purificados (P-NTC) se colocan en
sonicación con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimina (EDAC) y el compuesto
químico a unir, el cual debe tener un grupo amino terminal, por 24 h en una solución
amortiguadora a pH 7 (Huang et al., 2002a). Mediante éste método se han conjugado
NTC con diferentes sustancias como el PEG (Dumortier et al., 2006), algunas proteínas
como la streptavidina (Wong et al., 2004) y la albúmina bovina (Huang et al., 2002b); y
diversos marcadores fluorescentes (Wong et al., 2004; Durmortier et al., 2006). En
algunos de estos casos, los f-NTC obtenidos han sido probados en diferentes sistemas
biológicos para evaluar su toxicidad así como su capacidad de introducirse en las células,
lo cual se discutirá más adelante.
La funcionalización de los NTC ha sido un gran paso para la nanotecnología ya que los f-
NTC pueden ser utilizados en una gran variedad de aplicaciones en diversas áreas
biológicas. Por otro lado, el grupo químico funcionalizado al NTC puede modificar algunas
8
de sus propiedades fisicoquímicas, por lo tanto también es importante analizar el impacto
que éstos puedan tener sobre los sistemas biológicos. Actualmente se han desarrollado
diversas investigaciones que evalúan el impacto tanto de los NTC como de los f-NTC
sobre estos sistemas y se ha encontrado que la funcionalización disminuye el efecto
tóxico de los NTC. La razón de éste hallazgo se discute en las siguientes secciones.
Figura 4. Funcionalización iónica mediante amidación con una carbodimida
activada. Los P-NTC se colocan en sonicación con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
carbodiimina (EDAC) y el compuesto químico a unir, el cual debe tener un grupo amino
terminal, durante 24 h (Huang y et al., 2002a).
2.5 Toxicidad de los nanotubos de carbono
La toxicidad de los NTC ha suscitado numerosos estudios tanto a nivel ambiental como a
nivel biológico debido a que son un tipo de nanomaterial particularmente insoluble que al
acumularse dentro de células, órganos y tejidos, puede tener efectos peligrosos (Colvin
V. L., 2003). El área encargada de investigar la toxicidad de los NTC es la
nanotoxicología, la cual es una disciplina emergente que estudia el efecto de la
interacción de nanodispositivos y nanoestructuras con los organismos vivos (Oberdörster
et al., 2005).
Diversos investigadores afirman que los efectos de los NTC dependen de las
modificaciones físicas y químicas que se les hayan realizado, así como la manera en
cómo éstos fueron obtenidos. Por ejemplo, durante la síntesis de los NTC se utilizan
catalizadores como el níquel y el fierro los cuales pueden quedar retenidos en sus
paredes y aumentar su toxicidad. Un tratamiento posterior puede modificar el tamaño, la
pureza, el grado de agregación, la estructura de la pared y la funcionalización de la
superficie de los NTC, todas estas alteraciones determinan la toxicidad de la partícula
(Helland et al., 2007). Por esta razón se han propuesto algunos factores importantes en
la toxicidad de los NTC los cuales son: área superficial, tamaño, pureza, tiempo de
retención y la reactividad o toxicidad inherente de los compuestos químicos unidos a los
9
NTC, los cuales serán definidos a continuación.
Área superficial: determina el número de átomos en la superficie de los NTC, los cuales
aumentan exponencialmente cuando disminuye el tamaño de los mismos. El área
superficial juega un papel importante ya que determina las propiedades de los agregados
de las nanopartículas y le confiere una gran actividad biológica dada por la masa en
comparación con partículas de mayor tamaño (Oberdörster et al., 2005). Este aumento
de actividad biológica puede ser positiva y deseable (acarreadores con capacidad
terapéutica, penetración de barreras celulares para la liberación de drogas) o negativa y
no deseable (toxicidad, inducción de stress oxidativo o disfunción celular), o una mezcla
de ambas.
Tamaño: los NTC cortos (<0.22 µm) inducen un menor efecto tóxico ya que se integran
mejor dentro de las células y no producen ninguna respuesta inflamatoria en comparación
con NTC de longitudes mayores a 0.8 µm (Poland et al., 2008; Sato et al., 2005).
Pureza: como ya se mencionó anteriormente, los residuos de catalizadores contribuyen al
potencial tóxico de los NTC. El Fe y/o Ni, utilizados como catalizadores, pueden llegar a
constituir un 25 a un 40% del peso de los NTC y contribuyen en la generación de
radicales libres en células y tejidos (Firme y Bandaru, 2010).
Tiempo de retención: cuando las partículas se encuentran en contacto por largo tiempo
con células y tejidos, estas pueden inducir un mayor efecto tóxico en comparación con
aquellas que tienen un corto tiempo de retención. Este factor incorpora el concepto de
biopersistencia, que es la capacidad de cualquier partícula de permanecer en un
organismo vivo al acumularse en órganos y/o tejidos (Firme y Bandaru, 2010).
Reactividad o toxicidad inherente de los compuestos químicos unidos a los NTC: cuando
los NTC son funcionalizados muchas de sus propiedades fisicoquímicas se pueden ver
modificadas, como por ejemplo la solubilidad, dependiendo del compuesto químico unido.
Cuando éste último resulta ser un compuesto químicamente inestable o tóxico, al ser
funcionalizado al NTC, los efectos nocivos pueden aumentar debido a la capacidad
acarreadora de estas partículas.
Después de haber detallado algunos factores que determinan la toxicidad de los NTC en
los siguientes apartados nos enfocaremos a discutir el impacto de las nanopartículas en
el medio ambiente y en la salud, así como algunos estudios realizados sobre los NTC
tanto en su forma cruda, purificada y/o funcionalizada en sistemas in vitro.
10
2.5.1 Impacto de los Nanomateriales en la Salud y el Medio Ambiente
En los últimos años se ha observado un creciente desarrollo de la nanotecnología, la cual
es definida por el Comité de Ciencia y Tecnología como: “Investigación y desarrollo
tecnológico a nivel atómico, molecular y macromolecular, con un tamaño entre 1-100 nm,
que nos provee de un entendimiento fundamental de fenómenos y materiales a
nanoescala y que nos permite crear estructuras, dispositivos y sistemas que tienen
nuevas propiedades y funciones debido a su tamaño” (National Research Council, 2002).
También se ha observado un aumento en el número de nanopartículas con propiedades
eléctricas, térmicas y mecánicas únicas por lo que su aplicación en el área comercial,
médica y en el sector medio ambiental es muy amplia (National Research 2002; US
Environmental Protection Agency, 2003); incluso actualmente son utilizadas para mejorar
la calidad de algunos productos de consumo público. Por lo tanto, la exposición
ocupacional y pública a estos nuevos nanomateriales puede aumentar dramáticamente
en un futuro cercano (Dreher, 2004).
Los nanomateriales tienen diferentes rutas de exposición como inhalación, ingestión,
contacto dérmico o inyección directa al torrente sanguíneo, siendo la más frecuente la
primera (Figura 5) (Oberdöster et al., 2005). El principal mecanismo de deposición de las
nanopartículas inhaladas en el tracto respiratorio es mediante la difusión de las partículas
contenidas en el aire aspirado. Las nanopartículas con un tamaño entre 1-100 nm se
depositan en las regiones nasofaríngea, traqueobroquial y alveolar. Una vez depositadas,
estas son translocadas rápidamente a la circulación sanguínea directamente o mediante
vía linfática y/o por translocación al nervio sensorial; y así pueden alcanzar otros órganos
(hígado y bazo) e incluso originar problemas cardiovasculares (Utell y Frampton, 2000).
La exposición mediante ingestión o por contacto con la piel no ha sido muy estudiada.
Cuando las nanopartículas son expulsadas del tracto respiratorio mediante el moco, estas
pueden ser ingeridas y entrar al tracto gastrointestinal; o bien, pueden ser ingeridas
directamente en la comida, el agua o si se utiliza algún cosmético o droga con dichos
nanomateriales. Algunos estudios revelan que las nanopartículas atraviesan el tracto
gastrointestinal y son eliminadas mediante la orina o la heces; pero también hay
investigaciones donde los nanomateriales son adsorbidos a la circulación sanguínea.
Estas diferencias en la absorción dependen de la superficie química de la partícula así
como de su tamaño. En cuanto a la exposición por contacto cutáneo, hay que recordar
que la dermis es una capa de la piel altamente vascularizada, con macrófagos, vasos
linfáticos y células dentríticas que pueden de cierta manera transportar a los
11
nanomateriales al interior.
Figura 5. Rutas de exposición y biocinética de los nanomateriales. Aunque muchas
rutas de exposición e internalización ya han sido demostradas, otras aún son hipotéticas
y necesitan ser investigadas (Tomado de Oberdörster et al., 2005).
Una vez en el medio ambiente los NTC son considerados como agentes transportadores
de contaminantes ya que metales, contaminantes orgánicos, fluoruros e hidrocarburos
aromáticos pueden adherirse a su superficie (Helland et al., 2007). Aunado a esto, los
NTC pueden ser absorbidos por el sedimento y/o el suelo, o acumularse en raíces y
plantas debido a su alta área superficial y a su naturaleza lipofílica (Oberdörster et al.,
2005; Helland et al., 2007). El transporte biológico propuesto de los NTC se muestra en la
Figura 6 y podría ocurrir mediante la ingestión de sedimentos y plantas contaminados e
introducirse así a la cadena alimenticia (Oberdörster et al., 2005).
12
Figura 6. Rutas de exposición, distribución y degradación de los NTC en el medio
ambiente. Las líneas sólidas indican rutas que ya han sido demostradas en el laboratorio
o que actualmente ya están en uso (remediación). Las letras magenta indican posibles
rutas de degradación, las letras azules indican posibles fuentes y deposición de los NTC
(Modificado de Oberdörster et al., 2005).
Figura 7. Evaluación y gestión de riesgo de las nanopartículas. La evaluación de
riesgo de las nanopartículas tiene como finalidad determinar, gestionar y regular el
manejo y disposición de los nanomateriales dentro de la población (Tomado de
Oberdörster et al., 2005).
13
Debido a la ausencia de datos concretos sobre los efectos tóxicos de las nanopartículas
no se puede realizar una evaluación de riesgos adecuada. Por esta razón Oberdörster et
al., (2005) proponen una evaluación y gestión de riesgos (Figura 7), donde en primer
lugar se realiza la identificación y el mecanismo del efecto tóxico de las partículas en
estudios in vitro e in vivo, así como una evaluación de las rutas de exposición y por último
una caracterización del riesgo mediante la regulación del manejo y disposición de estos
materiales.
Esta evaluación y gestión de riesgo aún no se ha realizado para los NTC ya que debido a
su estructura molecular y a sus propiedades eléctricas son clasificados como una especie
de grafito sintético. La hoja de seguridad para el grafito sintético indica un límite de
exposición permisible es de 15 mg/m3 de polvo total y 5 mg/m3 para la fracción respirable,
establecido por la Administración de Seguridad y Salud Ocupacional de los Estados
Unidos (Occupational Safety and Health Administration, OSHA) (NIOSH/OSHA, 1998).
Sin embargo, en estudios donde se utilizan concentraciones similares o menores al límite
establecidos por la NIOSH se ha observado un alto grado de toxicidad pulmonar (Lam et
al., 2004). En México no existe alguna norma que regule el uso y disposición de los NTC,
a pesar de ser un tipo de nanomaterial con grandes expectativas para su aplicación en el
sector público e industrial. Por esta razón, estudiar los posibles efectos tóxicos en
sistemas biológicos resulta ser estrictamente necesario antes de su liberación tanto al
medio ambiente como a la población.
2.5.2 Toxicidad de los nanotubos de carbono in vitro
Los primeros estudios que evaluaron el efecto tóxico de los NTC se realizaron en cultivos
celulares en donde estos resultaron ser partículas altamente tóxicas ya a que se encontró
que disminuyen la proliferación celular y aumentan los porcentajes de apoptosis. Entre
estos estudios se puede mencionar a Magrez et al., (2006) quienes estudiaron el efecto
de los NTC sobre la proliferación de una línea celular de cáncer de pulmón (H596) y
observaron una disminución de la proliferación celular dosis-dependiente, así como
severas alteraciones morfológicas características de la muerte celular (Magrez et al.,
2006). El mismo efecto tóxico dosis-dependiente fue observado en otros tipos de células
como en linfocitos T (Bottini et al., 2006) y en queratinocitos de la dermis humana (HEK)
(Monteiro-Riviere et al., 2005). También hay evidencia de que los NTC inducen apoptosis
celular (Bottini et al, 2006; Ding et al., 2005) así como una diferencia de expresión de
genes involucrados en la respuesta inflamatoria (Ding et al., 2005).
14
Adicionalmente, un estudio realizado por Cui et al., (2005) revela que los NTC inducen un
cambio en la regulación de la expresión de genes asociados al ciclo celular (aumento de
expresión: p126, bax, p57, hrk, cdc42 y cdc37; disminución de expresión: cdk2, cdk4,
cdk6 y ciclina D3), así como una disminución en la expresión de genes asociados a
señales de transducción (mad2, jdk1, ttk, pcdha9 y erk). Estos resultados indican que las
células interaccionadas con los NTC sufren un arresto en la fase G1 del ciclo celular y en
consecuencia la inducción de apoptosis (Cui et al., 2005). Posteriormente Alazzam et al.,
(2010) encontraron que de 54,675 genes analizados en células interaccionadas con NTC,
14,294 sufrieron algún cambio en su expresión. De estos genes 7,029 sufrieron un
aumento en su expresión y 7,265 una disminución de la misma. En general estos genes,
cuya expresión fue modificada, están asociados al ciclo celular, a la apoptosis, a la
supervivencia de la célula, a la adhesión y motilidad celular, a señales de transducción y
de regulación de transcripción (Alazzam et al., 2010).
Por otro lado, Shvedova et al., (2003) encontraron que los NTC inducen un stress
oxidativo en células. El mismo efecto fue observado por Pulskamp et al., (2007) quienes
encontraron que la interacción de diferentes tipos de NP-NTC con células humanas de
pulmón de la línea A549 induce una liberación dosis y tiempo-dependiente de especies
reactivas al oxígeno (ROS). Adicionalmente se observó que la liberación de estos
radicales conlleva a alteraciones moleculares severas, así como la activación de rutas de
señalización y de factores de transcripción asociados con la carcinogénesis (Pacurari et
al., 2008).
Debido a estos resultados se concluyó que los NTC inducen toxicidad debido a su alto
contenido de catalizadores en su superficie. Sin embargo, otros estudios han observado
que los P-NTC presentan un mayor efecto tóxico que los NP-NTC (Magrez et al., 2006;
Bottini et al., 2006). Por otro lado, en estudios donde se utilizan NTC con una pureza del
99%, sin ningún tratamiento previo de oxidación, no se observa ningún efecto tóxico en
cultivos celulares (Pulskamp et al., 2007; Vittorio et al., 2009). Esto sugiere que la
presencia de los grupos C=O, COOH y OH agregados sobre la superficie de los NTC
durante la purificación pudieran inducir stress sobre las células (Magrez et al., 2006).
Otro factor importante en la toxicidad de los NTC es el nivel dispersión que pueden
alcanzar en la solución que posteriormente será adicionada al cultivo en el estudio. En
diversos trabajos se ha visto que los agregados de NTC inducen un mayor efecto tóxico
en comparación con NTC más dispersos (Raja et al., 2007). La dispersión de los NTC se
puede lograr mediante la funcionalización de los NTC y conforme aumenta el grado de
15
funcionalización de los NTC estos resultan ser menos tóxicos (Sayes et al., 2006; Coccini
et al., 2010).
Actualmente existe una gran variedad de reportes en donde se evalúan los posibles
efectos tóxicos de los f-NTC sobre cultivos celulares. Estas investigaciones utilizan f-NTC
con diversas sustancias (Figura 8) como son algunos péptidos como por ejemplo f-NTC
con un péptido proveniente del virus de la fiebre aftosa (FMDV) (Figura 8d), así como f-
NTC con un péptido proveniente del virus del papiloma humano. También se han
funcionalizados NTC con diferentes proteínas como la ovoalbúmina y en ningún caso se
encontró un efecto tóxico (Pantarotto et al., 2003b; Fifis et al., 2004).
De la misma manera los f-NTC con amonio o con FITC (Figura 8a y 8c) no mostraron
ningún efecto sobre la viabilidad de linfocitos y macrófagos. Pero los f-NTC que utilizaron
al PEG como puente de unión entre el amonio y el FITC con los NTC (Figura 8e y 8h)
tuvieron impacto positivo sobre los macrófagos al inducir la liberación de TNF-α e IL-6.
Este comportamiento se atribuyó a que estos f-NTC tienden a formar agregados en el
medio de cultivo ya que no son totalmente solubles debido a la presencia del PEG que
los rodeaba (Dumortier et al., 2006).
Con base a los antecedentes anteriores podemos concluir que la toxicidad de los NTC
disminuye significativamente cuando éstos son funcionalizados, debido a que el grupo
funcional mejora la solubilidad de los NTC y disminuye los agregados de los mismos,
además de tener una menor cantidad de residuos de catalizadores expuestos (Bianco et
al., 2004). Por otro lado, la toxicidad de los f-NTC también depende del grupo funcional
unido al NTC, ya que la funcionalización no elimina la toxicidad de la sustancia química
unida. Debido a los resultados satisfactorios obtenidos en las investigaciones anteriores
con algunos de los f-NTC, se han buscado varias aplicaciones de estos en el área
médica, donde son utilizados primordialmente como partículas acarreadoras.
2.6 Aplicaciones médicas de los nanotubos de carbono
La biocinética de los NTC es una cualidad atractiva para su aplicación en la medicina
como diagnóstico y dispositivos terapéuticos, así como herramienta para investigar y
entender procesos moleculares y estructurales en células vivas. La nanomedicina es
definida como la aplicación médica de la nanotecnología y sus investigaciones
relacionadas, esta ha surgido con el fin de diseñar, cuestionar y optimizar estas
aplicaciones para que sean eventualmente utilizadas (Oberdöster et al., 2005).
16
Actualmente, el desarrollo de nuevas terapias biomédicas es dependiente de la habilidad
de la droga y otras especies extracelulares para cruzar la barrera celular. Por esta razón,
los NTC han sido utilizados en diversas investigaciones uniéndoles ligandos de interés a
su superficie y servir de esta manera como biosensores, marcadores fluorescentes a
escala molecular, sondas y/o acarreadores. Los NTC pueden transitar libremente a
través de la circulación sanguínea y atravesar la barrera encefálica, el epitelio estomacal
y ser filtrados por el bazo y riñón. Además, por su tamaño y por su capacidad de
internalizarse a las células sin ningún efecto nocivo (Figura 9) y sin la necesidad de
algún sistema de transporte externo, los NTC son un candidato prometedor para un
nuevo sistema de transporte biológico (Kam y Dai, 2006).
Un uso potencial que se ha contemplado para los NTC es en la fabricación de
nanovacunas. Actualmente se cuenta con un alto repertorio de vacunas con la capacidad
de generar una respuesta inmune adaptativa que provean de protección contra varias
enfermedades. Sin embargo, muchas de ellas utilizan proteínas con poca capacidad de
distribución en el organismo y no producen una respuesta inmune efectiva. En los últimos
años se han desarrollado nuevas vacunas que utilizan nanopartículas como acarreadores
de moléculas antigénicas a fin de mejorar su biodistribución. Por otro lado, el tamaño de
un NTC se puede comparar con un virus y es capaz de producir una respuesta inmune
específica contra microorganismos intracelulares (Fitis et al., 2004).
Los NTC pueden ser considerados como acarreadores de péptidos antigénicos, lo que
ha generado gran interés por estudiar sus propiedades inmunogénicas (Bianco et al.,
2004). Pantarotto et al., (2006) funcionalizaron NTC con un péptido del virus de la fiebre
aftosa y demostraron que el péptido funcionalizado no pierde su capacidad antigénica y
conserva sus características estructurales. También se evaluó la capacidad
inmunogénica del f-NTC con el péptido en un sistema experimental murino. La
producción de anticuerpos fue mayor en los ratones inmunizados con los f-NTC con el
péptido, en relación con los niveles encontrados en los ratones inmunizados únicamente
con el péptido (Pantarotto et al., 2006). Un dato importante fue el hecho de no encontrar
anticuerpos contra el NTC desnudo, esto sugiere que no existe una respuesta cruzada
entre el NTC y el péptido, lo cual suele presentarse cuando se utilizan proteínas como
vectores. Estos resultados ubican a los NTC como uno de los mejores candidatos en
cuanto a la fabricación de vacunas.
17
Figura 8. f-NTC utilizados en estudios de toxicidad. (a) NTC-amonio; (b) NTC-
acetamida; (c) NTC-FITC (marcador fluorescente); (d) NTC-FMDV (péptido del virus de la
fiebre aftosa); (e) NTC-FITC (unido mediante un enlace iónico mediante PEG); (f) NTC-
anfotericina B y FITC (antibiótico); (g) NTC-metotrexato (droga utilizada en terapias contra
el cáncer); (h) NTC- amonio (unido mediante un enlace iónico mediante PEG) (i) NTC-
[111In]DTPA. (Tomado de Kostarelos et al., 2007; Dumortier et al., 2006; Singh et al.,
2006).
18
Figura 9. Tráfico intracelular de f-NTC con un marcador fluorescente. En A y B se
observa una imagen confocal de células A549 (células de carcinoma del epitelio basal
alveolar humano) incubadas por 2 h en (A) ausencia de los f-NTC (control) y (B) con 25
µg de f-NTC (verde). La membrana plasmática está teñida con WGA-TRITC (rojo) y el
núcleo con TO-PRO3 (azul). La escala barra de escala corresponde a 20 µm. En (B) se
pueden observar a los f-NTC en el interior de las células con mayor concentración en la
región perinuclear (Kostarelos et al., 2007).
2.7 Generalidades de Entamoeba histolytica
Entamoeba histolytica es un parásito capaz de invadir la mucosa intestinal y diseminarse
a otros órganos originando infección. Adicionalmente la amiba tiene la capacidad de
evadir el sistema inmunológico del huésped ya que durante la fase aguda de la invasión
se presenta un estado de inmunosupresión de la inmunidad celular, aunado a una
vigorosa respuesta humoral. Este estado peculiar de inmunosupresión es inducido por el
parásito a través de sus actividades citotóxicas y fagocíticas (Jarumilinta et al., 1964),
también por medio de una actividad mitogénica sobre linfocitos CD4+ (Diamanstein et al.,
1981).
Cuando algún agente infeccioso logra introducirse dentro del cuerpo humano ocurren una
serie de eventos que impiden su propagación. Entre estos se encuentran los sistemas
antimicrobianos inespecíficos que son innatos ya que no dependen del tipo de agente
infeccioso como la fagocitosis. Por otro lado, también puede ocurrir una respuesta
adquirida específica al patógeno donde juegan un papel importante las células T helper
(Th) del sistema inmunitario. Las células Th se dividen en dos tipos principales de
19
acuerdo a la interacción del patógeno con el sistema inmune innato y estas poseen
distintos fenotipos de secreción de citocinas (Tabla 2). Las células Th1 que son
estimuladas por la secreción de IL-12 e IFN-γ son eficaces contra infecciones
intracelulares producidas por virus y algunos microorganismos. Las células Th2 son
diferenciadas por la producción de IL-4, son buenas colaboradoras con las células B
(generadoras de anticuerpos), y son eficaces contra organismos extracelulares como los
parásitos. Adicionalmente, puede haber otras subpoblaciones de células Th como las
células Th3 y las células Th17. Las primeras debido a que son productoras de IL-10,
pueden mediar efectos inmunosupresores y están involucradas en la inducción de
tolerancia en las mucosas. Las células Th17 son protectoras de superficies biológicas
como la piel y el recubrimiento del intestino contra bacterias extracelulares y generan una
gran secreción de IL-17 (Roitt y Delves, 2003).
Tabla 2. Patrones de citocinas de células Th (Modificado de Roitt y Delves, 2003)
Célula Th Patrón de Citocinas
Th1 INF-γ, IL-2, IL-3. IL-12, TNF-β, TNF-α, GM-CSF
Th2 IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α, GM-CSF
Th3 IL-2, IL-4, IL-10, TGF-β
Th17 IL-6, IL-17, IL-22, TGF-β
Durante la invasión del trofozoíto, forma infectante de la amiba, se induce una fuerte
migración de polimorfonucleares a la zona de infección debido tanto a la producción de
quimiocinas por las células del epitelio intestinal, como a la producción de citocinas
proinflamatorias por parte de los macrófagos presentes en el área. Debido a ésta
producción de citocinas y a la activación del factor nuclear NF-κβ de los macrófagos,
éstos últimos liberan prostaglandina E2 (PGE2) la cual inhibe una respuesta inmune
celular (Th1) y favorece a la respuesta inmune humoral (Th2) o mediada por anticuerpos
(Ac). Este tipo de respuesta suele ser ineficaz contra el parásito ya que éste, además de
tener enzimas proteolíticas que degradan los Ac, también es capaz de liberarse de los
complejos Ag-Ac depositados en su superficie. Por otro lado, la PGE2 aumenta la
producción de IL-10, la cual inhibe a los macrófagos dejando al huésped
inmunosuprimido (Sánchez-Ramírez y Talamás-Rohana, 2007).
Se sabe poco sobre la participación de las células Th en la amibiasis aunque, la
identificación de los antígenos o epítopes que pueden estimular a células T es
importante. Por ello se han aislado algunas moléculas que puedan proporcionar una
inmunoprotección y utilizarlas en el desarrollo de una vacuna contra este parásito.
20
3. JUSTIFICACIÓN Y RELEVANCIA CIENTÍFICA
La amibiasis, infección intestinal producida por Entamoeba histolytica, actualmente no
cuenta con una vacuna. Por tal razón en este estudio se pretende combinar una proteína
de superficie de E. histolytica capaz de generar una respuesta inmune celular específica
y la habilidad adyuvante de los NTC; esto con el fin de lograr una respuesta con
especificidad y magnitud adecuada para eliminar a la amiba.
El impacto en la salud y el medio ambiente que puedan tener las nanovacunas es de gran
importancia ya que su aplicación tiene contacto directo con la población, por lo que la
evaluación de su potencial tóxico es necesaria para optimizar la gestión de riesgo.
La toxicidad de los NTC ha sido un tema de gran interés en la comunidad científica
debido a los diferentes resultados obtenidos por diversos grupos de investigación. Hasta
este momento no se han estandarizado las características óptimas de los NTC para su
aplicación en el área biológica. Este trabajo determinará cuales son las características
físicas ideales para que los NTC no produzcan efecto tóxico en cultivos celulares.
También se evaluará una nueva metodología para la purificación de proteínas de
Entamoeba histolytica mediante fraccionamiento por isoelectroenfoque utilizando el
equipo OFFGEL3100 (Agilent). Esta técnica ahorrará tiempo y costos.
Del mismo modo se evaluará el efecto tóxico del sistema NTC-proteína antigénica en
cultivos de macrófagos, los cuales son células del sistema inmune. Esto nos permitirá
buscar candidatos para la fabricación de una nanovacuna contra Entamoeba histolytica.
Y utilizar el mismo sistema para la fabricación de otras nanovacunas contra muchos
parásitos que no cuentan con un sistema de vacunación adecuado.
21
4. HIPOTESIS Y OBJETIVOS
4.1 Hipótesis
Los NTC funcionalizados con una proteína de superficie de Entamoeba histolytica no
producirán efecto tóxico en cultivos de macrófagos de la línea celular J774.
4.2 Objetivo General
Evaluar el efecto citotóxico de NTC funcionalizados con proteínas de superficie de
Entamoeba histolytica en cultivos de macrófagos de la línea celular J774.
4.3 Objetivos Específicos
1. Obtención de P-NTC de 500 nm de longitud y 40 nm de diámetro con bajo efecto
citotóxico.
2. Extracción y purificación de la proteína de 46 KDa de Entamoeba histolytica.
3. Funcionalización y caracterización de los P-NTC con la proteína de 46 KDa de
Entamoeba histolytica.
4. Evaluar el efecto tóxico de los f-NTC en cultivos de macrófagos mediante ensayos de
MTT, determinación de apoptosis y análisis morfológico.
22
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Síntesis de los NTC
Los NTC fueron sintetizados en el Centro de Investigación en Materiales Avanzados
(CIMAV) mediante el método de spray pirólisis (Elguézabal et al., 2006). Se utilizó una
mezcla de 25 ml de tolueno y 0.25 g ferroceno como fuente de carbono y catalizador,
respectivamente. La mezcla se inyectó a un vaporizador a 180°C a una velocidad de
1ml/min. Del vaporizador las gotas de la mezcla fueron transportadas mediante un flujo
constante de gas argón (0.32 L/min) hacia un tubo de cuarzo, el cual estaba dentro de un
horno a 800°C. Este procedimiento se dejó en marcha por dos minutos, al término de los
cuales se cerró el flujo de la solución tolueno-ferroceno hacia el sistema. Finalmente se
retiró el tubo de cuarzo del horno y se obtuvieron los NTC no purificados (NP-NTC)
raspando la pared del mismo.
5.2 Purificación de los NTC
Para la purificación de los NP-NTC se utilizó el método de Saito et al., (2002) con las
siguientes modificaciones. 0.2 g de NP-NTC fueron suspendidos en 400 mL de una
mezcla concentrada de H2SO4 (90%)/ HNO3 (70%) 3:1v/v y sonicados en un baño de
agua a 50°C por 48 h. Los P-NTC resultantes fueron filtrados a través de una membrana
de politetrafluoretileno (PTFE) con un tamaño de poro de 0.45 µm y lavados cuatro veces
con agua y metanol respectivamente. Finalmente los P-NTC se secaron a temperatura
ambiente por 24 h (Saito et al., 2002; Montes-Fonseca et al., 2012a).
5.3 Caracterización de los NP-NTC y los P-NTC
El diámetro, la longitud, así como las características topográficas y la composición
elemental de los NP-NTC y los P-NTC fueron determinados mediante microscopia
electrónica de barrido (MEB) en un microscopio JEOL SEM, modelo JSM-5800 LV
equipado con un analizador de dispersión con rayos X (EDS) (para el análisis elemental).
Para ello los diferentes NTC fueron colocados en portamuestras seguidos de un baño con
plata para su análisis.
La calidad estructural de los NP-NTC y lo P-NTC se determinó mediante espectroscopia
Raman utilizando un micro-Raman LabRAM HR de Horiba Jobn Yvon, acoplado a un
microscopio Olympus BX-4. Para esto una pequeña muestra de NP-NTC y de P-NTC se
colocaron en portaobjetos y se excitaron con un láser de 632.8 nm. Todas las mediciones
se realizaron en seco a temperatura ambiente (Montes-Fonseca et al., 2012a).
23
Los grupos carboxílicos (COOH) presentes en la superficie de los P-NTC se cuantificaron
por titulación con carbonato de sodio (NaHCO3) de acuerdo al método establecido por Hu
et al. (2001), con las siguientes modificaciones: 0.1 g de P-NTC se adicionaron a 50 mL
de una solución acuosa de NaHCO3 0.05 N y se agitó por 48 h. Después la mezcla fue
filtrada a través de una membrana de 0.45 µm de poro y los P-NTC obtenidos fueron
lavados con agua desionizada para remover los residuos de NaHCO3. Al filtrado y al
agua de los lavados se les adicionaron 50 mL de HCl 0.05 N y esta mezcla se sometió a
ebullición por 20 min para eliminar el CO2 disuelto. Posteriormente la mezcla se dejó
enfriar a temperatura ambiente, el exceso de HCl fue titulado con una solución de NaOH
0.05 M hasta alcanzar un pH de 7.00 (Hu et al., 2001). El porcentaje en peso de grupos
COOH se calculó de la siguiente manera:
a) Se calculó la cantidad de moles de NaOH utilizados para neutralizar el exceso de
HCl mediante la siguiente fórmula:
Esta cantidad de mmoles calculada corresponde a la cantidad de mmoles de
grupos COOH en los P-NTC.
b) Se calculó el porcentaje en peso de grupos COOH. Para el cálculo se tomó como
12 g la masa del carbono de acuerdo a la siguiente fórmula:
5.4 Purificación de la proteína de 46KDa de Entamoeba histolytica
5.4.1 Cultivo de Entamoeba histolytica
La cepa patógena HM1:IMSS de E. histolytica fue cultivada en forma axénica (cultivos
provenientes de una sola célula) en medio TYI-S33 complementado con 20% de suero
bovino adulto, 1% de penicilina/estreptomicina y vitaminas Diamond (5:1). Los cultivos en
fase logarítmica (48-60 h) fueron depositados en baño de hielo (4°C) por 15 min para
despegar los trofozoitos de las paredes del tubo. Finalmente se tomaron 0.1 mL de la
suspensión celular y se añadieron a un tubo con 10 mL de medio de cultivo
complementado y se incubó a 37°C para continuar con el mantenimiento de la cepa.
24
Para la purificación de proteínas, los trofozoitos provenientes de un tubo con crecimiento
confluente fueron resembrados en un frasco de cultivo de 50 mL de acuerdo al siguiente
protocolo. Los tubos de cultivo en fase logarítmica fueron depositados en un baño de
hielo por 15 min para despegar los trofozoitos de las paredes de los mismos. Luego, el
contenido de todos los tubos fue recuperado en un tubo cónico de 50 mL estéril seguido
de una centrifugación a 1500 rpm por 5 min a 4°C. Posteriormente la pastilla celular
obtenida fue resuspendida en 50 mL de medio de cultivo con suero bovino adulto
vitaminado. Finalmente 10 mL de esta solución celular fueron colocados en 5 frascos de
cultivo y se incubaron a 37°C hasta un crecimiento confluente.
5.4.2 Extracción de la proteína de 46KDa de Entamoeba histolytica
Frascos de cultivo en crecimiento exponencial se depositaron en hielo por 10 a15 min y el
contenido se traspasó a tubos cónicos de 50 mL estériles. La suspensión celular se
centrifugó a 1500 rpm por 5 min y la pastilla de trofozoitos obtenida se lavó tres veces
con 10 mL PBS 1X a las mismas condiciones de centrifugación. En el último lavado los
trofozoitos fueron cuantificados y se ajustó la pastilla a una densidad de 5 x 106
trofozoitos/mL de amortiguador A (Tris-HCl 0.05M, pH 6.8, 5% Tritón X-100 y un coctel de
inhibidores de proteinasas; 1 mM de fluoruro de fenilmetil-sulfonilo, 2 µM de leupeptina y
5mM de N-etilmaleimida). Los trofozoitos fueron lisados mecánicamente con un
homogenizador Potter acoplado a un rotor a 3000 rpm con 80 golpes constantes en baño
de hielo. Finalmente el lisado se traspasó a tubos eppendorf de 1.5 mL y se centrifugó a
12,000 rpm por 30 min a 4°C. Se retiró el sobrenadante y la pastilla obtenida se
resuspendió en 0.36 mL de amortiguador A y 1.44 mL de solución stock de proteína
OFFGEL (1.25X).
5.4.3 Purificación de la proteína de 46KDa de Entamoeba histolytica por
fraccionamiento proteico
La purificación de la proteína de 46KDa de E. histolytica se realizó mediante
fraccionamiento proteico utilizando el equipo Agilent 3100 OFFGEL Fractionator (Agilent
Technologies). El fraccionador separa e inmoviliza proteínas y péptidos en cubetas de
acuerdo a su a su punto isoeléctrico (IPG, inmmobilized pH-gradient). Para la separación
de la proteína de 46 KDa se adicionó el lisado de los trofozoitos obtenido en la sección
anterior en una tira IPG de baja resolución con un rango de pH de 3 a10 previamente
hidratada con 0.56 mL de la solución stock de proteína OFFGEL (1.25X) diluida con 0.14
mL de agua desionizada por 15 min. Dicha tira se divide en 12 pozos separados por
cubetas independientes. Posteriormente se corrió el programa de fraccionamiento
25
OG12PR00 el cual tiene una duración de 100 h. Al término de la corrida el contenido de
cada pozo se colocó en tubos eppendorf y se almacenaron a -80°C.
5.4.4 Electroforesis SDS-PAGE
La electroforesis SDS-PAGE se realizó para analizar el contenido de proteínas en cada
una de las fracciones obtenidas en la sección anterior, así como para comprobar la
presencia de la proteína de 46 KDa en los purificados. Con este fin, alícuotas de las
fracciones y de los purificados obtenidos se sometieron a electroforesis en geles de SDS-
PAGE.
5.4.4.1 Armado del gel y corrida electroforética
Todos los componentes de la cámara de electroforesis se limpiaron con gasas
impregnadas con alcohol de limpieza al 70% previo al armado de los vidrios para hacer
los geles. Una vez ensamblados los vidrios y los espaciadores del equipo de minigeles en
el portavidrios se adicionaron los reactivos en el orden que se presenta a continuación:
1. Gel inferior o gel separador (gel de poliacrilamida al 7.5%)
Para minigeles de 1.00 mm
Reactivos Para 3 minigeles
H2O bidestilada 7.5 mL
4x Tris-Cl/SDS pH 8.8 3.75 mL
Acrilamida 30%/bisacrilamida 0.8% 3.75 mL
Antes de usar agregar
Persulfato de amonio all 10% 0.05 mL
TEMED 0.01 mL
Se cargó la solución entre los vidrios y se dejó polimerizando por 30 min.
2. Gel superior o gel concentrador (4%)
Reactivos Para 3 minigeles
H2O bidestilada 3.05 mL
4x Tris-Cl/SDS pH 6.8 1.25 mL
Acrilamida 30%/bisacrilamida 0.8% 0.65 mL
26
Antes de usar agregar
Persulfato de amonio al 10% 0.025 mL
TEMED 0.005 mL
Se cargó la solución entre los vidrios encima del gel concentrador polimerizado e
inmediatamente después se colocaron los peines. Se dejó polimerizar por otros 30 min.
Una vez que polimerizó por completo, se retiraron con cuidado los peines y se limpiaron
los residuos de los carriles con ayuda de papel filtro. Posteriormente se colocaron los
geles en el soporte de la cámara y la cuba de electroforesis se llenó con el amortiguador
de corrida 1X.
Las muestras se diluyeron en el amortiguador de muestra 4X en una relación 3:1 volumen
muestra/ volumen amortiguador y se incubaron a 95°C por 8 min. Posteriormente el
volumen se depositó en el pozo correspondiente en el gel a usar. Una vez cargadas las
muestras, se inició la corrida electroforética a 120 V hasta que el frente de corrida llegó al
borde inferior del gel. En este punto el gel se extrajo de la cámara y se depositó con
cuidado en un recipiente para su tinción. Los geles se tiñeron con azul de Comassie R-
250 por 1 h y finalmente se aplicó la solución desteñidora cuantas veces fuera necesario
para revelar la bandas de proteínas. Una vez visualizadas las bandas los geles fueron
analizados en un fotodocumentador EL Logic 200 imaging system (Kodak).
5.4.5 Limpieza de las fracciones proteicas
Las fracciones correspondientes a la proteína de 46K Da se sometieron al protocolo del
kit de limpieza ReadyPrep 2-D CleanUp (BIO-RAD) para eliminar los restos de
amortiguadores y sustancias que pudieran interferir con la funcionalización de los NTC.
Para esto, al volumen de la fracción se le adicionaron 300 µl del reactivo precipitante 1 y
se dejó incubando en hielo por 15 min. Al término de la incubación se colocaron 300 µl
del reactivo precipitante 2 seguido de una centrifugación a 12,000 x g por 5 min a 4°C. Se
descartó el sobrenadante y la pastilla obtenida fue lavada con 40 µl del reactivo de lavado
1 y se centrifugó a las mismas condiciones. Posteriormente se extrajo el sobrenadante y
la pastilla resultante se suspendió en 25 µl de agua desionizada, 1 mL del reactivo de
lavado 2 y 5 µl del aditivo de lavado 2. Esta mezcla se homogenizó por vortex por un
minuto y se incubó a -20°C por 30 min. Después de la incubación la mezcla se centrifugó
a 12,000 x g por 5 min a 4°C y la pastilla obtenida se resuspendió en 100 µl de agua
desionizada.
27
5.4.6 Cuantificación de proteínas totales por el método de Bradford
En una microplaca de 96 pozos de fondo plano se depositaron por duplicado estándares
de albúmina sérica bovina (BSA), en una concentración de 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.5, 2 y 2.5 µg;
para las muestras problema se depositaron por duplicado volúmenes de 5 µl. Tanto los
pozos de la curva como a los de las muestras se les adicionaron 200 µl del reactivo de
Bradford 1X para determinar la absorción en el lector de microplacas VARIOSKAN
FLASH (Thermo Scientific) a 595 nm.
5.5 Funcionalización de los P-NTC
Los P-NTC fueron funcionalizados con la P46 KDa obtenida de los trofozoitos de E.
histolytica HM1: IMSS, mediante un enlace iónico entre el grupo amino de la proteína y
los grupos COOH de los P-NTC. Para ello se utilizó como catalizador una carbodimida
activada; 5.5 mg de P-NTC fueron resuspendidos en 10 mL del amortiguador de fosfatos
(KH2PO4) 0.1 M pH 7.5 con 10 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodimida. Esta
mezcla se sonicó durante 2 h y posteriormente se adicionaron 66.74 µg de la proteína de
46 KDa. Se dejó en agitación por 24 h a 4°C, al término se centrifugó a 5000 rpm por 30
min a 4°C. Finalmente los f-NTC suspendidos en el sobrenadante, así como los f-NTC
que precipitaron en el fondo del tubo fueron recuperados en membranas de 0.45 µm de
diámetro de poro de forma separada. Las membranas con los f-NTC con la proteína de
46 KDa del sobrenadante y del precipitado (P46S-NTC y P46P-NTC, respectivamente)
fueron almacenados a -80°C.
5.6 Liofilización de los f-NTC
Para la caracterización y el análisis in vitro de los f-NTC se requiere el uso de
nanopartículas secas. El agua de los P46S y P46P-NTC fue eliminada mediante
liofilización. Las membranas con los diferentes f-NTC se colocaron en tubos eppendorf de
1.5 mL con 1 mL de agua desionizada y los P46S y P46P-NTC fueron recuperados
mediante sonicación por 10 min. Una vez que la totalidad de los f-NTC se encontraron
dispersos en el agua, se sacaron las membranas y se colocaron los tubos en el
liofilizador FreeZone Triad Frezee Dry System modelo 74000 de Labconco. La liofilización
se llevó a cabo siguiendo el programa de la Figura 10. Una vez terminado el proceso se
sacaron los tubos del equipo y se sellaron inmediatamente para impedir la reabsorción de
agua. Los tubos fueron almacenados a -80°C hasta su uso.
28
Figura 10. Programa de liofilización. El programa comienza con un precongelado de la muestra a -50°C por 3 h, seguido de un primer secado a -30°C por 8h. Finalmente el agua de la muestra se eliminó mediante un segundo secado a 20°C por 12 h.
5.7 Caracterización de los P46S y P46P-NTC
La caracterización de los f-NTC se realizó mediante espectroscopia Raman descrita en la
sección 5.5.3. De igual manera para identificar la sustancia unida a los NTC, estos fueron
analizados por espectroscopia de infrarrojo en el equipo Spectrum Gx (Perkin Elmer).
5.8 Estudios in vitro
5.8.1 Interacción de los P46S y P46P-NTC con los Macrófagos
Para la evaluación de la citotoxicidad de los diferentes NTC se realizaron cultivos de
macrófagos (MOs) de la línea celular J774, los cuales fueron interaccionados con los NP-
NTC, los P-NTC y los P46P-NTC a concentraciones de 0.06, 0.6 y 6 mg/L por 24 h para
viabilidad en placa por MTT y análisis morfológico. La apoptosis se determinó a las 24 h
de interacción. Los P46S-NTC fueron interaccionaron a una sola concentración a las
mismas condiciones de la nanopartículas anteriores. Finalmente MOs sin estímulo fueron
utilizados como control. Se utilizaron cultivos de macrófagos de ésta línea celular debido
a que son células provenientes de ratón mus musculus, y éstas crecen indefinidamente
sin necesidad de su extracción previa.
Para las interacciones se prepararon soluciones stock a concentraciones de 1, 0.1 y 0.01
mg/L de los NP-NTC, P-NTC y P46P-NTC. Con este fin se pesaron 1 mg de los NTC y se
homogenizaron mediante sonicación en 10 mL de DMEM suplementado con 10% de
suero fetal bovino (SFB) para el stock de 1 mg/L. Una vez homogenizada la solución
stock de 1 mg/L se tomó 1 ml y se adicionó a 9 mL de DMEM suplementado con 10%
29
SFB para prepara el stock de 0.1 mg/L. Finalmente para preparar la solución stock de
0.01 mg/L se tomó 1 mL del stock anterior (0.1mg/L) y se homogenizó en 9 mL de DMEM
suplementado con 10% SFB. En el caso de los P46S-NTC se trabajó con una sola
concentración, donde los f-NTC obtenidos de la liofilización se homogenizaron en 1 mL
de DMEM suplementado con 10% SFB. Todas las soluciones de NTC fueron sonicadas
previo a la interacción con los MOs.
5.8.2 Mantenimiento de la Línea Celular J774
Los MOs de esta línea celular tienen la capacidad de crecer hasta que las células
alcanzan una confluencia de aproximadamente el 70% de la superficie del frasco de
cultivo. En este punto, las células fueron despegadas mediante un raspador de células, el
cual nos permite despegar completamente las células de las paredes y bordes del frasco
de cultivo. Las células se transfirieron a un tubo cónico estéril de 50 mL y se centrifugaron
a 1500 rpm por 5 min a 4°C. Posteriormente se retiró el sobrenadante y la pastilla celular
obtenida se lavó dos veces con 10 mL de DMEM centrifugando a las mismas
condiciones. En el último lavado se retiró el sobrenadante y las células se resuspendieron
en 10 mL de DMEM y se cuantificaron para ajustar a la densidad deseada con DMEM
suplementado con 10% SFB, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de glutamina y 0.5%
de gentamicina. Los MOs fueron incubados a 37°C en una atmósfera húmeda al 5% de
CO2.
5.8.3 Ensayos de MTT en microplaca
Para medir la viabilidad de los MOs en presencia de los diferentes NTC se realizó un
ensayo con sales de tetrazolium (MTT) en microplaca de acuerdo a lo descrito por
Cuéllar, (2006). Para dicho ensayo se realizó una curva de calibración con densidades de
0.025, 0.050, 0.075, 0.1, 0.15, 0.175 y 0.2 x 106 células/pozo en placas de 96 pozos, se
adicionaron 20 µl de MTT a cada pozo y se incubó durante 4 h a 37ºC en atmósfera
húmeda al 5% de CO2. El sobrenadante se retiró del cultivo de un solo golpe sobre la
tarja y se agregaron 100 µL de isopropanol ácido, la placa se agitó vigorosamente y se
realizó la lectura de absorción a 590 nm en el lector multiplaca VARIOSKAN (Thermo
Scientific); estos ensayos se realizaron por duplicado.
Para analizar el efecto de los NTC se realizaron cultivos a una densidad celular de
0.1x106 células/pozo y se interaccionaron con las diferentes concentraciones de NTC
descritas en el protocolo experimental. Posteriormente las células se incubaron durante
20 h a 37ºC en atmósfera húmeda al 5% de CO2. Al término de dicho tiempo se
adicionaron 20µl de MTT a cada pozo y se incubaron por 4 h más en las mismas
30
condiciones. Finalmente, se retiró el sobrenadante y se agregaron 100 µl de isopropanol
ácido, la placa se agitó vigorosamente y se determinó la absorción a 590 nm. Los
ensayos se realizaron por triplicado con 2 repeticiones.
Todas las absorbancias fueron registradas en una base de datos en EXCEL. Dicho
programa nos permite trazar un gráfico de regresión a partir de las absorbancias
registradas de la curva de calibración. Posteriormente, se obtuvo la ecuación de la recta
de dicho gráfico:
Donde:
y = absorbancia
m= pendiente de la recta
x= el número de células
b= intersecto y
Después se despejó el valor de x de la fórmula y se obtuvo la siguiente ecuación:
Finalmente se calculó el número de células metabólicamente viables sustituyendo las
absorbancias de cada interacción en la ecuación anterior.
5.8.4 Determinación de la apoptosis celular
Los cultivos para la determinación de apoptosis se realizaron en placas de 24 pozos
donde se sembraron 1 x 106 células/ pozo en un volumen de 500 µl de medio DMEM
suplementado. Las células fueron interaccionadas con los NTC de acuerdo al protocolo
establecido anteriormente y se incubaron a 37°C en atmósfera húmeda al 5% de CO2 por
24 h. La evaluación de la apoptosis celular se realizó utilizando el Kit RediPlate 96
EnzChek Caspase-3 Assay (Molecular Probes). Este sistema nos permite medir la
apoptosis celular de una forma rápida, simple y directa, a través de la detección de la
señal fluorescente producido por la actividad enzimática de la caspasa 3 en lisados
celulares. La caspasa 3 ha sido identificada como un mediador crucial de la apoptosis
celular, la cual reconoce como sustrato la secuencia de aminoácidos Asp-Glu-Val-Asp
(DEVD).
31
Una vez que los MOs fueron interaccionados con los NTC, estos fueron despegados de
la caja de cultivo mediante un raspador celular. El contenido de cada pozo se traspasó a
tubos eppendorf de 1.5 mL previamente etiquetados y se centrifugaron a 1500 rpm por 5
min a 4°C. Posteriormente se retiró el sobrenadante y la pastilla celular obtenida se lavó
con 1 mL de PBS 1X estéril centrifugando a las mismas condiciones. En este punto las
células se pueden almacenar a -80°C hasta su análisis. La pastilla de MOs obtenida en el
lavado anterior fue resuspendida en 50 µl de amortiguador de lisis 1X (50 µl de
amortiguador de lisis 20X en 950 µl de agua desionizada). Para la completa lisis celular
se dejó la mezcla en baño de hielo (4°C) por 30 min. Posteriormente el lisado se
centrifugó a 5,000 rpm por 5 min a 4°C. Finalmente 50 µl del sobrenadante obtenido se
colocaron en los pozos de la placa del kit donde el sustrato fue resuspendido previamente
con 50 µl del amortiugador de reacción 2X y se incubó por 30 min a temperatura
ambiente protegido de la luz. La apoptosis se determinó midiendo la UAF de cada pozo
utilizando el lector multiplaca VARIOSKAN (Thermo Scientific) con una longitud de
excitación de 496 nm y de emisión de 520 nm.
5.8.5 Análisis morfológico de los MOs interaccionados con los NTC
Los cultivos para el análisis morfológico ser realizaron en cajas de 8 pozos (Lab Tek
Chamber slide system) las cuales tienen un sistema que permite desprender los pozos de
la cámara superior para analizar las células ancladas a la superficie del vidrio. La cámara
es de poliestireno y está fija en un portaobjetos de 25 x 75 mm lo que permite el
crecimiento de las células y además sirve como soporte para la detección. Esta cámara
es desechable y permite que las células sean cultivadas, fijadas, teñidas y analizadas en
el mismo portaobjetos.
En las cajas de 8 pozos se sembraron 1 x 106 células/pozo en un volumen de 200 µL de
medio DMEM suplementado. Las células se interaccionaron con los NTC a la
concentración de 6 mg/L y se incubaron a 37°C en atmósfera al 5% de CO2 durante 24 h.
Una vez transcurrido el tiempo de interacción, se retiró el medio y se desprendieron los
pozos de la cámara de cultivo. Las células se dejaron secar a temperatura ambiente y
después se tiñeron mediante el equipo de tinción Hemocolorante rápido (Hycel). Para
esto los portaobjetos fueron sumergidos completamente 3 veces en la solución fijadora,
seguido del hemocolorante 1 y el hemocolorante 2. Una vez terminado el tren de tinción
se escurrió el exceso de colorante y se dejó secar a temperatura ambiente. Las laminillas
fueron analizadas en el microscopio óptico Olympus BX41 en un aumento de 10X y 40X y
con el software Image-Pro Plus V.4.1.
32
5.8.6 Análisis estadístico
Los datos de viabilidad celular y apopotosis fueron analizados mediante un ANOVA de
una vía mediante el programa estadístico MINITAB. Para dicho análisis se comparó la
diferencia entre las concentraciones de cada una de las interacciones, así como la
diferencia de cada interacción con el control. Por último se compararon cada una de las
interacciones con los diferentes tipos de NTC.
33
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 Síntesis y Purificación de los NTC Los NTC fueron sintetizados mediante la técnica de spray pirólisis (Aguilar-
Elguézabal et al., 2006). En esta técnica los átomos de Fe provenientes del
catalizador (ferroceno) son depositados sobre un sustrato sólido (cuarzo). Estos
funcionan como centros de crecimiento donde los átomos de carbono, derivados del
tolueno, se apilan de manera perpendicular al sustrato. Esto da como resultado un
creciendo longitudinal de los NTC, el cual es dependiente del tiempo de síntesis. Por
tal razón la mezcla tolueno/ferroceno fue inyectada al sistema por 2 min únicamente.
Esto con la finalidad de obtener NTC con una menor longitud. Posterior a la síntesis
los NP-NTC obtenidos fueron purificados mediante sonicación con una solución
concentrada de H2SO4/HNO3 3:1 v/v por 48 h con el fin de remover los residuos del
catalizador (Fe) depositado sobre la superficie de los NP-NTC, así como promover
una disminución de su longitud.
Los resultados de caracterización de los NP-NTC y los P-NTC mediante MEB y
análisis EDS se muestran en la Figura 11 y en la Tabla 4 respectivamente. Los NP-
NTC tuvieron una longitud de 30 µm y un diámetro de 40-50 nm (Figura 11A y B), en
tanto que los P-NTC exhibieron longitudes <1µm (Figura 11C). El % de Fe mostró
una disminución de 3.23 a 1.81% (Tabla 3) de los NP-NTC a los P-NTC. Aunado a
esto el contenido de O aumentó de 1.22 a 22.21% en los P-NTC (Tabla 3). Estos
resultados nos permiten concluir que la purificación de los NP-NTC nos permitió
obtener una remoción del Fe de la superficie de las nanopartículas, así como una
disminución de la longitud de los mismos. Algunos autores atribuyen el aumento del
contenido de O de los P-NTC a la adición de grupos oxidados en su superficie
(COOH, OH y CO) en la purificación (Saito et al., 2002; Cheng et al., 2009). Durante
este proceso los ácidos de la solución chocan constantemente con la superficie de
los NTC y por ende se forman defectos sobre la misma, incluso algunos son tan
violentos que pueden favorecer la aparición de extremos totalmente abiertos en los
P-NTC. Los carbonos en estos sitios quedan expuestos y son oxidados a los grupos
anteriormente mencionados (Zhang et al., 2003).
Para confirmar que el contenido de O en la superficie de los P-NTC está relacionado
con la adición de grupos COOH, estos últimos fueron medidos mediante una
titulación con NaHCO3. Los resultados de este ensayo mostraron un porcentaje de
34
grupos COOH sobre los P-NTC de un porcentaje en peso del 7%. Este porcentaje es
similar a lo reportado por otros trabajos en donde se utilizaron las mismas
condiciones de purificación (Hu et al., 2001; Motes-Fonseca et al., 2012b).
Figura 11. Microfotografías de los NP-NTC y los P-NTC obtenidas mediante
MEB. En A y B se muestra la longitud y el diámetro del os NP-NTC respectivamente.
En C se muestran los P-NTC.
Tabla 3. Análisis elemental de los NP-NTC y los P-NTC
% Peso
Elemento NP-NTC P-NTC
C 95.56 75.98
O 1.22 22.21
Fe 3.23 1.81
Total 100 100
Por otro lado, la calidad estructural de los NTC fue determinada mediante
espectroscopia Raman. En la Figura 12 se muestran los espectros Raman obtenidos
para los NP-NTC y los P-NTC (Figura 12A y 12B, respectivamente). En cada
espectro se observan las dos bandas características de los NTC llamadas banda D la
cual se encuentra a una longitud de onda de 1338 cm -1 y la banda G a 1600 cm-1. La
banda G corresponde a la vibración tangencial de los enlaces de los átomos de
carbono en la lámina de grafito (Domingo et al., 2007). En cambio, la intensidad de
la banda D es atribuida a la cantidad de carbonos amorfos o desordenados en las
muestras de los NTC (Domingo et al., 2007). Una medida de la calidad estructural de
35
los NTC se obtiene mediante la relación de las intensidades de estos dos picos
(IG/ID). Si ambas bandas tiene una intensidad similar indica una alta cantidad de
defectos estructurales en los NTC (Keszler et al., 2004; Datsyuk et al., 2008).
Los espectros obtenidos mostraron un aumento en la intensidad en la banda D en los
P-NTC, lo cual dio como resultado una disminución de la relación IG/ID de 1.38 en los
NP-NTC a 0.81 en los P-NTC. Estos resultados son similares a los publicados por
Datsyuk et al., (2008) en donde la relación IG/ID disminuyó en los P-NTC. Del mismo
modo, los P-NTC presentaron una menor calidad estructural en comparación con lo
NP-NTC, debido a una mayor cantidad de defectos. Esto concuerda con nuestra
suposición de que la disminución de la longitud de los P-NTC se debe a la formación
de defectos durante el proceso de purificación.
Figura 12. Espectro Raman de los NTC. Espectro Raman obtenido para los NP-
NTC (A) y los P-NTC (B). Cada Figura muestra la banda D a 1338 cm -1 y la banda G
a 1600 cm-1 (Láser de excitación de 632.8nm)
Todos estos resultados nos permiten concluir que los procesos de síntesis y
purificación utilizados para lo obtención de los NTC fue satisfactoria, ya que fue
posible obtener nanopartículas con un diámetro de 40 nm y una longitud <1µm, las
cuales son las dimensiones recomendadas para el uso de los NTC en aplicaciones
biológicas debido a su bajo efecto tóxico (Montes-Fonseca et al., 2012a). Aunado a
esto el porcentaje de grupos COOH obtenido convierte a los P-NTC en excelentes
candidatos para ser funcionalizados y ser utilizados como acarreadores.
36
6.2 Purificación de la proteína de 46 KDa de Entamoeba histolytica
La proteína de 46 KDa fue obtenida a partir de cultivos de E. histolytica de acuerdo a
la metodología descrita. En la Figura 13 se muestra el contenido proteico del lisado y
del fraccionamiento (Figura 13A y B, respectivamente) en geles de poliacrilamida al
7.5%. En dichos geles se puede observar que las bandas de proteínas de los lisados
se reparten en las 12 fracciones analizadas. Es de especial interés el carril
correspondiente a la fracción 3 ya que se observa una banda aislada de
aproximadamente 46 KDa, la cual corresponde un punto isoeléctrico de 4.6 a 5.4.
Una vez separada esta fracción la proteína de 46 KDa fue precipitada y resuspendida
en agua ultrapura para eliminar los restos de amortiguadores que pudieran interferir
con los procesos de cuantificación y funcionalización. Al finalizar la purificación de 13
extracciones se obtuvo un total de 66.74 µg de proteína. De acuerdo a trabajos
previos esta cantidad es suficiente para funcionalizar 5 mg de P-NTC (Montes-
Fonseca et al., 2012b).
Figura 13. Extracción y purificación de la proteína de 46 KDa de Entamoeba
histolytica. Geles de poliacrilamida al 7.5% del lisado de los trofozoitos de E.
histolytica (A) y del fraccionamiento proteico mediante punto isoeléctrico (B). En la
fracción 3 se observa un proteína aislada de aproximadamente 46 KDa (B).
46 kDa
37
6.3 Funcionalización de los P-NTC
Una vez obtenida la proteína de 46 KDa de Entamoeba histolytica, se procedió a la
funcionalización de los P-NTC. En este proceso se une mediante un enlace iónico el
grupo amino de la proteína y el grupo COOH de los P-NTC. Esta reacción es
catalizada por una carbodiimida activada, la cual reacciona con los grupos COOH de
los P-NTC produciendo un intermediario inestable y favorece la amidación de este
grupo con las aminas procedente de las proteínas (Figura 14). Una vez terminada la
reacción, la mezcla fue centrifugada a 5000 rpm por 30 min con la finalidad de
separar los f-NTC, los cuales quedan resuspendidos en el sobrenadante, de los NTC
con menor funcionalización (precipitado). Ambas fracciones (sobrenadante y
precipitado) fueron filtradas y lavadas en diferentes membranas y finalmente
liofilizadas de acuerdo a lo descrito en el protocolo.
Figura 14. Reacción de funcionalización de los P-NTC mediante una
carbodimina activada. Primero la carbodiimida reacciona con los grupos COOH de
los P-NTC produciendo un intermediario inestable llamado O-acilisourea.
Posteriormente se adiciona la proteína y los grupos aminos de ésta reaccionan con
el intermediario generando un enlace iónico entre el grupo amino de la proteína y el
grupo COOH de los P-NTC.
Los f-NTC con la proteína de 46 KDa (P46-NTC) obtenidos (Figura 15) fueron
caracterizados mediante espectroscopia Raman e Infrarrojo cuyos espectros se
muestran en las Figuras 16 y 17, respectivamente. Como se observa en la Figura
38
15A los P46-NTC obtenidos del sobrenadante presentaron mayor solubilidad en
solución acuosa, sin embargo fueron recuperados en menor cantidad (datos no
disponibles). Por otro lado el volumen de NTC (dato no disponible) de los P46-NTC
obtenidos de la fracción del precipitado fue mayor a los recuperados del
sobrenadante, pero mostraron menor solubilidad en solución acuosa ya que se
precipitaron en menos de 30 min (Figura 15B).
Figura 15. Fotografías de los P46-NTC obtenidos del sobrenadante (A) y del
precipitado (B).
En el espectro de los P-NTC y de los P46-NTC del precipitado las bandas D y G
presentan intensidades similares, pero en los P46-NTC del sobrenadante éstas
disminuyen considerablemente. Por otro lado la banda G’ presenta una mayor intensidad
en los P46-NTC del precipitado y del sobrenadante en comparación con los P-NTC. En
los P46-NTC del sobrenadante además de las bandas ya descritas también se observan
numerosas señales inespecíficas a lo largo de todo el espectro.
Específicamente la banda G’ a 2650 cm-1 corresponde a un sobretono de la banda D y su
intensidad aumenta cuando los NTC son sometidos a tensiones mecánicas como
estiramiento y compresión (Domingo et al., 2007). Estos resultados nos sugieren que el
proceso de funcionalización y liofilización produjeron una tensión mecánica sobre los
P46-NTC del precipitado y sobrenadante, ya que independientemente de su grado de
funcionalización ambos presentan un aumento en la intensidad de esta banda. Por otro
lado, la disminución de las intensidades de las bandas D y G en los P46-NTC del
39
sobrenadante, así como la aparición de numerosas señales a lo largo del espectro nos
sugiere la presencia de grupos funcionales adheridos a la superficie de los NTC, pero
este tipo de análisis no nos permite determinar la composición de los mismos.
Los estudios de espectroscopia infrarroja, por otro lado, son utilizados para evaluar los
grupos funcionalizados sobre las paredes de los NTC, sin embargo la actividad IR
asociada a estos grupos en algunas casos es difícil de observar (Kim et al., 2005). Por lo
tanto es preferible contar con un mínimo de 5 wt% de grupos funcionalizados sobre la
muestra para poder detectar su actividad IR, de lo contario la absorción óptica del
espectro será dominada por las contribuciones electrónicas de los NTC (Kim et al., 2005).
En el espectro IR de los P46-NTC del precipitado (Figura 17A) se pueden observar
pequeñas elevaciones a las longitudes de onda de 868 cm-1 y 1588 cm-1, las cuales son
vibraciones características de los NTC (Kastner et al., 1994). No se puede observar
ninguna señal procedente de los grupos funcionalizados. En cambio en el espectro de los
P46-NTC del sobrenadante se observan numerosas bandas procedentes de la actividad
IR del grupo funcional a diferentes longitudes de onda (Figura 17B).
Para poder determinar el compuesto unido a los NTC se procedió a buscar patrones
de bandeo correspondientes a proteínas. De acuerdo a Arrondo et al., (1993) el
espectro infrarrojo de las proteínas está compuesto por nueve bandas Amidas
específicas que corresponden a las diferentes vibraciones del enlace peptídico
(CONH) (Figura 18 y Cuadro Tabla 5). Asimismo Barth (2000) publicó las longitudes
de onda a la cual vibran algunos enlaces característicos de los aminoácidos, las
cuales se presentan en el Tabla 4. En dicha tabla podemos observar que las señales
se encuentran en un rango de longitudes de onda entre 1000 a 1630 cm-1. En el
espectro infrarrojo de los P46-NTC del sobrenadante se señala con franjas verdes la
posición de las bandas Amidas, así como en un recuadro amarillo el rango
correspondiente a la vibración de los enlaces específicos de aminoácidos. Como se
puede observar en dichas zonas existe la presencia de numerosas bandas. Del
mismo modo también se puede tomar en consideración que el espectro de los P46-
NTC del sobrenadante también cuenta con una banda ancha a los 3000 – 2850 cm-1,
la cual corresponde a la vibración de los grupos OH de los carbohidratos. Al
comparar el espectro de absorbancia de los P46-NTC del sobrenadante con el
espectro de transmitancia de la D-Glucosa se observa un patrón similar. No obstante
en la región comprendida entre 1600 y 1000 cm-1, característica de las proteínas,
existen bandas adicionales en el espectro de los P46-NTC del sobrenadante que no
40
se observan en el espectro de la glucosa (Figura 19). Estos nos sugiere que la
proteína de 46 KDa funcionalizada a los NTC podría ser una glucoproteína.
Finalmente podemos concluir que la centrifugación al final del proceso de
funcionalización nos permitió separar de manera efectiva los f-NTC de acuerdo a la
densidad de grupos químicos adheridos a su superficie. En donde los P46-NTC del
precipitado no presentaron señales que nos indicaran la presencia de algún grupo
funcional, sin embargo hay que recordar que las técnicas utilizadas son poco sensibles y
pudieran no detectar substancias a concentraciones menores al 5% wt. En cambio, los
P46-NTC además de tener una mayor estabilidad acuosa, los espectros Raman e IR
indican la presencia de una mayor cantidad de grupos funcionales adheridos.
Figura 16. Espectro Raman de los P46-NTC. Espectro Raman obtenido para los P-
NTC (A), los P46-NTC obtenidos del precipitado (B) y los P46-NTC recuperados del
sobrenadante (C). Cada Figura muestra la banda D a 1338 cm -1, la banda G a 1600
cm-1 y la banda G’ a 2650 cm-1 (Láser de excitación de 632.8nm).
41
Tabla 4. Bandas específicas de diferentes aminoácidos en espectroscopia
infrarrojo
Aa´s Λ (cm-1
)
His 1631, 1575, 1594, 1217, 1229, 1199, 1104, 1090, 1106, 1094
Lys 1626-1629, 1526-1527
Tyr 1614-1621, 1599-1602, 1594-1602, 1516-1518, 1498-1500, 1269-1273, 1235-1270, 1169-1260
Asn 1612-1622
Trp 1622, 1509, 1496, 1352-1361, 1334-1342, 1315-1350, 1276, 1245, 1203, 1092, 1064, 1012-1016
Gln 1586-1610
Asp 1574-1579, 1264, 1450, 1120-1253.
Glu 1556-1560, 1264, 1450, 1120-1253.
Ser 1181, 1030, 983
Phe 1494
Obtenido de Barth (2000)
42
Figura 17. Espectros infrarrojo en absorbancia de los P46-NTC. Espectros
infrarrojos en absorbancia de los P46-NTC obtenidos del precipitado (A) y los P46-
NTC recuperados del sobrenadante (B). Las barras en verde indican las bandas
Amidas características de las vibraciones del enlace peptídico y el recuadro amarillo
la zona de vibraciones específicas de algunos aminoácidos.
43
Tabla 5. Bandas Amidas de espectros
infrarrojo de proteínas.
Banda Amida
Λ (cm-1) Descripción
A 3300 NH
B 3100
I 1650 CO, CN, CCN
II 1550 NH, CN, CO, CC, NC
III 1300 CN, NH, CC, CO
IV 625 CO, CC, CN
V 725 NH, CN
VI 600 CO, CN
VII 200 NH, CN, CO
Figura 18. Espectro de Infrarrojo de
proteínas. El enlace peptítido de las
proteínas (A) vibra d diferentes longitudes
de onda mostrando un patrón
característico (B).
Obtenida de Arrondo et al., 1993
Figura 19. Comparación entre los espectros infrarrojos de los P46-NTC y la D-
Glucosa. En A se muestra el espectro en absorbancia de los P46-NTC recuperados
del sobrenadante y en B el espectro en transmitancia de la D-glucosa.
44
6.4 Estudios in vitro
6.4.1 Ensayos de viabilidad celular por MTT en microplaca
Para evaluar el efecto de los NTC en la viabilidad celular, MOs de la línea celular
J774 fueron interaccionados con los NP-NTC, los P-NTC y los P46-NTC obtenidos
del precipitado a concentraciones de 0.06, 0.6 y 6 mg/L por 24 h. Los P46-NTC
recuperados del sobrenadante se interaccionaron a una sola concentración (datos no
disponibles). MOs sin estímulo fueron utilizados como control. Los resultados de
viabilidad celular se muestran en la Figura 20. Los MOs interaccionados con los NP-
NTC a la concentración de 6 mg/L presentaron un mayor efecto tóxico en
comparación con los otros tratamientos, observándose una disminución de la
viabilidad celular en un 80%. Las concentraciones de 0.6 y 0.06 mg/L no mostraron
diferencias con respecto al control sin estímulo. Los MOs interaccionados con los P-
NTC mostraron una disminución de la viabilidad celular dosis-dependiente, sin
embargo no se observó una diferencia significativa con respecto al control a ninguna
de las concentraciones probadas. Por otro lado los MOs interaccionados con los P46-
NTC obtenidos del precipitado (P46P-NTC) manifestaron un aumento no significativo
en el número de células metabólicamente viables en comparación con el control y
con los otros tratamientos, donde a la concentración de 0.06 mg/L se observó un
aumento de casi un 30%. Finalmente los MOs interaccionados con los P46-NTC
recuperados del sobrenadante (P46S-NTC) mostraron una disminución de la
viabilidad celular de un 50% la cual fue significativa en comparación con el control y
con los otros tratamientos.
Figura 20. Ensayos de viabilidad celular de los MOs J774 interaccionados con
los diferentes tipos de NTC. Cada barra representa la media de dos experimentos
por triplicado (n=6). a, p<0.01 diferencia con respecto al control. b, p<0.01 diferencia
45
entre concentraciones de un mismo tratamiento. c, p<0.01 diferencia a la misma
concentración entre tratamientos.
Estudios previos donde se interaccionaron NP-NTC con diferentes cultivos celulares
observaron el mismo efecto tóxico a altas concentraciones (Magrez et al., 2006;
Thurnherr et al., 2011; Montes-Fonseca et al., 2012a y b). No obstante a
concentraciones menores de 1 mg/L de NTC, los resultados obtenidos varían de
acuerdo a la longitud de las nanopartículas utilizadas. NTC con longitudes mayores a
100 µm producen una disminución de la viabilidad celular hasta de un 50% a bajas
concentraciones (Magrez et al., 2006; Montes-Fonseca et al., 2012a y b). Por otro
lado NP-NTC con longitudes menores a 30 µm no producen efecto tóxico significativo
en cultivos celulares a concentraciones similares (Prylutska et al., 2008; Thurnherr et
al., 2011; Montes-Fonseca et al., 2012a). De acuerdo a lo anterior la longitud de los
NP-NTC es un factor importante para la producción de la toxicidad de los NTC.
Otro factor relacionado con la toxicidad celular es la purificación de los NTC. Durante
la síntesis de los NTC se utilizan catalizadores (Fe), los cuales quedan remanentes
sobre la superficie de los mismos y producir efecto tóxico. Para eliminarlos se utilizan
diferentes procesos de purificación que adicionalmente introducen grupos cargados a
la superficie de los P-NTC como se explicó anteriormente. Los resultados obtenidos
de viabilidad celular de los MOs interaccionados con estas nanopartículas difieren
con los observados con otros trabajos en donde se observa un mayor efecto tóxico al
utilizar los P-NTC en comparación con los NP-NTC (Vittorio et al., 2009; Coccini et
al., 2010; Montes-Fonseca et al., 2012b). Algunos autores atribuyen este
comportamiento a los grupos COOH agregados a la superficie de los P-NTC, los
cuales originan un estrés sobre las células (Magrez et al., 2006; Bottini et al., 2006).
Por otro lado, Pulskamp et al., (2007) demostraron que los P-NTC son menos tóxicos
que los NP-NTC. Estos resultados tan contradictorios están relacionados con los
procesos de purificación utilizados, esto debido a las modificaciones químicas y
estructurales que originan sobre los NTC. En este estudio los NTC fueron purificados
mediante sonicación en una solución concentrada de H2SO4/HNO3 3:1 para obtener
P-NTC con una longitud de <1µm, así como una pureza del 98.2% y un porcentaje en
peso de grupos COOH del 7%. Los P-NTC con longitudes <1µm y un alto contenido
de grupos COOH presentan un menor efecto tóxico debido a su alto grado de
dispersión en solución acuosa (Raja et al., 2007; Pulskamp et al., 2007).
46
La dispersión de los NTC también se puede lograr mediante la funcionalización.
Numerosos estudios han comprobado que los f-NTC presentan un menor efecto
tóxico que los NP-NTC y los P-NTC (Bianco et al., 2005). En estudios previos donde
se funcionalizaron NTC con una proteína de 220 KDa de Entamoeba histolytica se
obtuvieron resultados similares a los obtenidos con los P46-NTC del precipitado
(Montes-Fonseca et al., 2012b). Este trabajo encontró, al igual que nosotros, una
ligera proliferación en la viabilidad celular debido probablemente al reconocimiento
de los MOs hacia la proteína funcionalizada a los NTC, sin embargo estudios
adicionales son necesarios para corroborar esta teoría. Por otro lado, se esperaba
que los P46-NTC recuperados del sobrenadante no produjeran efecto tóxico, debido
a la evidencia de una mayor funcionalización, sin embargo los resultados mostraron
lo contrario. Liu et al., (2008) evaluaron el efecto citotóxico de f-NTC con diferentes
densidades de PEG y encontraron que a mayor densidad, el efecto tóxico producido
era más evidente. Este grupo le atribuye este comportamiento al PEG, el cual es un
compuesto altamente ramificado que puede producir efecto tóxicos a altas
concentraciones (Liu et al., 2008). Por tal razón nosotros podemos concluir que el
efecto tóxico observado en los P46-NTC recuperados del sobrenadante se debe a la
proteína de 46 KDa utilizada, la cual se encuentra en mayor cantidad en estos NTC
en comparación con los P46-NTC obtenidos del precipitado. Estos resultados
muestran la importancia de la selección adecuada de la proteína para hacer una
nanovacuna.
Finalmente los P46-NTC obtenidos del precipitado presentaron un menor efecto
tóxico en comparación con las otras nanopartículas. Esto debido a que estos NTC
poseen las tres características indispensables en estudio de citotoxicidad: longitud
pequeña, pureza y alta solubilidad. En cambio, los NP-NTC fueron los más tóxicos
debido a su elevada longitud, presencia de Fe y baja solubilidad en solución acuosa.
Los mecanismos por los cuales los NTC interfieren en la viabilidad celular
produciendo un efecto tóxico no han sido totalmente descubiertos, por tal razón son
necesarios más estudios de citotoxicidad como apoptosis y análisis morfológico, los
cuales se describen a continuación.
6.4.2 Determinación de la apoptosis celular
La apoptosis celular o muerte celular programada, es una forma de muerte celular
que se desencadena por señales celulares controladas. La apoptosis tiene la función
de destruir células dañadas genéticamente, evitando algunas enfermedades como el
47
cáncer. Algunos inductores de la apoptosis hasta ahora estudiados son la unión de
ligandos a receptores específicos, estrés oxidativo, el calor, la radiación, la falta de
nutrientes, una infección viral, hipoxia, aumento intracelular de calcio, entre otras
(Elmore, 2007).
La apoptosis celular se determinó midiendo la actividad de la caspasa-3 en los
lisados de los MOs interaccionados con los NTC mediante fluorescencia. La caspasa-
3 es una enzima se encuentra activa en la mayoría de los procesos apoptóticos, de
tal manera que la intensidad de la fluorescencia es directamente proporcional al
número de células en apoptosis. Los resultados de este ensayo se muestran en la
Figura 21, en donde los MOs interaccionados con los NP-NTC mostraron un
incremento en los niveles de caspasa-3 a las tres concentraciones probadas en
comparación con los otros NTC y el control sin estímulo. Solamente la concentración
de 0.6 mg/L mostró una diferencia con respecto al control sin estímulo. Por otro lado,
los MOs interaccionados con los P-NTC, y los P46-NTC obtenidos del precipitado no
mostraron diferencia con respecto al control. Estos resultados concuerdan con los
obtenidos en el ensayo de viabilidad celular en donde los macrófagos
interaccionados con los NP-NTC presentaron un menor número de células viables en
comparación con los otros tratamientos. Estudios previos han encontrado resultados
similares (Magrez et al., 2006; Montes-Fonseca et al., 2012b) y algunos autores
sugieren que la apoptosis celular originada por los NP-NTC se debe al estrés
oxidativo producido por estas nanopartículas en las células (Yuang-Guo et al., 2011).
Por otro lado, los MOs interaccionados con los P46-NTC recuperados del
sobrenadante presentaron un aumento no significativo de la actividad apoptótica con
respecto a los P46-NTC obtenidos del precipitado. Estos resultados difieren a los
obtenidos en viabilidad celular en donde los MOs interaccionados con los P46-NTC
obtenidos del sobrenadante presentaron un efecto tóxico significativo. Esto sugiere
que la disminución de la viabilidad celular observada en los MOs interaccionados con
los P46-NTC recuperados del sobrenadante se debe a un mecanismo diferente a la
apoptosis celular mediada por la caspasa-3. Una posible explicación pudiera ser que
los P46-NTC del sobrenadante originen apoptosis mediante una vía diferente, en
donde estas nanopartículas interaccionen directamente con receptores intracelulares
sin la necesidad de la activación de la caspasa-3. O bien, que los macrófagos
interaccionados con estos NTC no proliferen debido a la proteína de 46 KDa unida a
las nanopartículas.
48
Figura 21. Apoptosis MOs J774 interaccionados con los diferentes tipos de
NTC. Cada barra representa la media de un experimento (n=3). a, p<0.01 diferencia
con respecto al control. b, p<0.01 diferencia entre concentraciones de un mismo
tratamiento. c, p<0.01 diferencia a la misma concentración entre tratamientos.
Con el fin de identificar a la proteína de 46 KDa de E. histolytica y tratar de explicar el
efecto observado sobre los MOs, se realizó una búsqueda bibliográfica de todas
aquellas proteínas del mismo peso y con un punto isoeléctrico de 4.6 a 5.4. Stanley
et al., (1990) aislaron una proteína rica en serina de E. histolytica (SREHP), la cual
se localiza en la membrana de los trofozoitos. La SREHP fue identificada como una
glucoproteína altamente inmunogénica cuya función aún no es clara. Algunos autores
mencionan que la SREHP participa en la fagocitosis de E. histolytica y sugieren que
juega un rol importante al adherirse a las células apoptóticas e iniciar su fagocitosis
(Teixeira et al., 2008). En la caracterización de los P46-NTC recuperados del
sobrenadante se explicó que el espectro infrarrojo nos indicaba que la proteína unida
a los NTC es una glucoproteína. Asimismo, el espectro infrarrojo contiene bandas
específicas del aminoácido serina. Estas pruebas no son concluyentes y estudios
complementarios son necesarios para la identificación de la proteína de 46 KDa
funcionalizada a los NTC. Sin embargo, esto nos ayudaría a confirmar que el efecto
tóxico observado en los P46-NTC recuperados del sobrenadante se debe a la
interacción de los MOs con la proteína de 46 KDa funcionalizada, sin descartar que
este efecto haya sido potencializado por su unión al NTC.
49
6.4.3 Análisis morfológico de los MOs interaccionados con los NTC
La finalidad de este análisis fue evaluar las alteraciones morfológicas producidas por
lo NTC en los MOs. Para esto, las células interaccionadas con los NTC por 24 h
fueron teñidas mediante una tinción rápida y analizadas por microscopia óptica. Las
imágenes obtenidas se muestran en la Figura 22, en donde los MOs sin estímulo
(Figura 22A) muestran una morfología normal, con un núcleo grande y un citoplasma
íntegro, así como una adherencia entre las células.
Los MOs interaccionados con los NP-NTC (Figura 22B) presentan citoplasmas
deformados, hay una predominancia de núcleos pequeños y condesados, así como
una disminución de la confluencia de la monocapa celular. Estas alteraciones son
características de apoptosis y concuerdan con los resultados obtenidos en viabilidad
celular y apoptosis. Resultados similares fueron reportados por trabajos previos en
diferentes líneas celulares (Magrez et al., 2006), así como en MOs (Montes-Fonseca
et al., 2012b).
Los MOs interaccionados con los P-NTC y los P46-NTC obtenidos del precipitado
(Figura 22C y D) no mostraron cambios en su morfología. Por otro lado los MOs
interaccionados con los P46-NTC recuperados del sobrenadante (Figura 22E)
muestran citoplasmas ligeramente deformados, así como una disminución de la
confluencia de la monocapa celular. No se observaron modificaciones en el núcleo.
Todos estos resultados concuerdan con los análisis previos de citotoxicidad
discutidos en secciones anteriores. Montes-Fonseca et al., (2012b) observaron
alteraciones morfológicas en el citoplasma producidas por los P-NTC en los MOs.
Los autores sugieren que estos daños fueron originados por acción directa de los
NTC sobre la membrana de los MOs debido a su tamaño (100 µm).
50
Figura 22. Análisis morfológico de los macrófagos interaccionados con los
NTC. Las imágenes muestran macrófagos teñidos con una tinción de hemocolorante
rápido en un objetivo de 40X. En A se muestran los macrófagos sin estímulo; B
macrófagos interaccionados con los NP-NTC; C macrófagos interaccionados con los
P-NTC; D y E macrófagos interaccionados con los P46-NTC obtenidos del
precipitado y del sobrenadante respectivamente.
Estudios previos han reportado que los f-NTC no producen alteraciones morfológicas
en células (Kostarelos et al., 2007; Montes-Fonseca et al., 2012b) como se observó
en los MOs interaccionados con los P46-NTC obtenidos del precipitado. Esto no
ocurre en los MOs interaccionados con los P46-NTC recuperados del sobrenadante,
los cuales presentan alteraciones en el citoplasma. No se observan células en
apoptosis, lo cual concuerda con la determinación anterior donde no se observó un
aumento significativo de la apoptosis con respecto al control. Pero tampoco se
51
pueden observar células activadas, las cuales presentan citoplasmas con largas
proyecciones en forma de estrella. Estos resultados sugieren que probablemente la
proteína de 46 KDa funcionalizada interfiriera en la morfología del citoplasma. Sin
embargo posteriores estudios son necesarios.
52
7 CONCLUSIONES
El efecto citotóxico de NTC funcionalizados con proteínas de superficie de Entamoeba
histolytica en cultivos de MOs es dependiente de la proteína utilizada. Esto debido a que
los P46-NTC recuperados del sobrenadante presentaron un mayor efecto tóxico, pero
existe evidencia en donde al utilizar otras proteínas de E. hitolytica este efecto
desaparece. Además de la funcionalización, la longitud resultó ser otro factor
determinante en el efecto de citotoxicidad. Esto debido a al disminuir la longitud de los P-
NTC mediante la purificación el efecto tóxico observado en los NP-NTC desapareció.
53
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