Citozolinių karboanhidrazių slopiklių struktūros ir ......1.1.1. Biotermodinamika Pagrindinis parametras apibūdinantis molekulių sąveiką yra laisvoji Gibso energija ( G). Tiek

Vilniaus universitetasGamtos mokslų fakultetas

Neurobiologijos ir biofizikos katedra

Biofizikos studijų programos IV kurso studentė

Miglė Kišonaitė

Citozolinių karboanhidrazių slopiklių struktūrosir termodinaminių jungimosi parametrų sąryšis

Baigiamasis bakalauro darbas

Darbo recenzentas:Dr. Andrius Sazonovas

Darbo vadovė:Dr. Asta Zubrienė

Darbo konsultantas:Prof. Daumantas Matulis

Vilnius, 2014



Darbas paruoštas:

Vilniaus universiteto Biotechnologijos institutoBiotermodinamikos ir vaistų tyrimų skyriuje

Studentė:Miglė Kišonaitė

Darbo vadovė:Dr. Asta Zubrienė

Darbo konsultantas:Prof. Daumantas Matulis

Vilnius, 2014

Turinys

Sutrumpinimų sąrašas 3

Įvadas 4

1. Literatūros apžvalga 61.1. Vaistų kūrimas ir termodinaminiai tyrimai . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.1.1. Biotermodinamika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61.1.2. Entalpijos ir entropijos kompensavimas . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.2. Karboanhidrazės . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91.2.1. Karboanhidrazių šeimos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91.2.2. Žinduolių karboanhidrazių izoformos, struktūra ir pasiskirstymas . . 101.2.3. Karboanhidrazių katalizuojamos CO2 hidratacijos reakcijos mecha-

nizmas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111.2.4. Ligos, susijusios su karboanhidrazių pakitimais . . . . . . . . . . . . 12

1.3. Karboanhidrazių slopikliai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131.4. Terminis baltymų stabilumas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.4.1. Baltymo stabilizavimo ir destabilizavimo ligandais modelis . . . . . 171.5. Izoterminio titravimo kalorimetrija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.5.1. Kalorimetrai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201.5.2. Eksperimento planavimas ir analizės metodai . . . . . . . . . . . . 211.5.3. Protonizacijos reiškiniai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2. Medžiagos ir metodai 262.1. Medžiagos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262.2. Fluorescencinis terminio poslinkio metodas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262.3. Izoterminio titravimo kalorimetrija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.3.1. Baltymų-ligandų sąveikos matavimas . . . . . . . . . . . . . . . . . 282.3.2. Ligandų protonizacijos entalpijos nustatymas . . . . . . . . . . . . . 28

2.4. Ligandų pKa nustatymas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3. Rezultatai ir jų aptarimas 303.1. Stebimieji termodinaminiai parametrai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303.2. Tikriniai termodinaminiai parametrai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3.2.1. Ligandų pKa ir protonizacijos entalpija . . . . . . . . . . . . . . . . 323.2.2. Karboanhidrazės aktyviajame centre esančios H2O molekulės pKa

ir protonizacijos entalpija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363.3. Tikrinių termodinaminių parametrų skaičiavimas . . . . . . . . . . . . . . 373.4. Struktūros – tikrinių parametrų sąryšis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

4. Išvados 43

Santrauka 44

Summary 45

Mokslinių darbų sąrašas 46

Literatūra 48

Priedai 54

Miglė Kišonaitė

Sutrumpinimų sąrašas

∆Cp Šiluminės talpos pokytis∆G Laisvosios Gibso energijos pokytis∆H Entalpijos pokytis∆S Entropijos pokytisANS 1,8-anilino naftaleno sulfonatasAZM AcetazolamidasBSA BenzensulfonamidasCA Karboanhidrazė (angl. carbonic anhydrase)CARP Į karboanhidrazę panašus baltymas (angl. carbonic anhydrase related pro-

tein)DMSO DimetilsulfoksidasDSF Diferencinio skenavimo fluorimetrijaEZA EtokzolamidasEZnH2O Prie karboanhidrazės baltymo aktyviojo centro Zn2+ koordinuota H2OFTSA Fluorescencinė terminio poslinkio analizė (angl. fluorescent thermal shift

assay)GPI Glikozilfosfatidilinozitolio inkarasITC Izoterminio titravimo kalorimetrija (angl. isothermal titration calorimetry)Kb Jungimosi konstanta [M−1]

Kd Disociacijos konstanta [M ]

LMA Levenbergo Markardo algoritmasMETHZ MetazolamidasN Baltymo ir ligando jungimosi stechiometrijaPAMBS p-AminobenzilsulfonamidasPi Natrio fosfato buferinis tirpalasR Universalioji dujų konstantaRSO2NH2 Sulfonamido grupę turintis junginysRPTP Receptorinė baltymų tirozino fosfatazė (angl. receptor protein tyrosine pho-

sphatase)SULFA Sulfanilamidass.v. Santykiniai vienetaiT TemperatūraTFMSA TrifluormetansulfonamidasTm Baltymo lydymosi temperatūra (angl. melting temperature)TOP Termodinaminio optimizavimo grafikas (angl. thermodynamic optimization

plot)Tris 2-amino-2-hidroksimetil-1,3-propandiolio buferinis tirpalas

3

Miglė Kišonaitė

Įvadas

Termodinamikos mokslo šaka šiandien plačiai naudojama tiek fundamentaliuose ty-rimuose, tiek naujų produktų kūrime pramonėje. Kartu su struktūriniais ir molekuliniomodeliavimo tyrimais, biotermodinamika suteikia esminės informacijos ir dažniausiai yravaistų kūrimo ir tobulinimo pagrindas.

Vaistų kūrime siekiama atrasti ypatingai stipriai su taikiniu besijungiančių cheminiųmolekulių bei pagerinti fizikines jų savybes. Dažniausiai net nesistengiama suprasti irištirti kokia entalpija ir entropija lemia stiprią sąveiką, nors būtent jos sudaro Gibso ener-gijos dydį. Garsūs biotermodinamikos mokslo atstovai, tokie kaip Freire (Freire, 2008)bei Whitesides (Whitesides and Krishnamurthy, 2005) teigia, kad ligandai, kurių sąveikąsu taikiniais varo (angl. drive) entalpija, yra pranašesni už entropijos varomus. Didinantligandų entalpiją, gerinamas jų atrankumas konkrečiam taikiniui, o didinant entropijągaliausiai pasiekiama hidrofobiškumo riba, kuomet cheminis junginys pasidaro netirpusarba nebegali pereiti ląstelės plazminės membranos. Taigi, tokie uždaviniai kaip entalpi-jos ir entropijos indėlių subalansavimas, struktūros ir termodinaminių parametrų sąryšionustatymas gali būti atlikti tik naudojant biotermodinaminius metodus.

Vaistų kūrimas vis dar yra sudėtingas, brangiai kainuojantis ir ilgai užtrunkantis pro-cesas. Būtent termodinaminis požiūris gali paaiškinti vykstančios sąveikos energetiką irbūti nepakeičiamu medicininės chemijos ir farmaciniuose tyrimuose.

Šiame baigiamajame bakalauro darbe yra analizuojamos individualios cheminės struk-tūros jas susiejant su entalpijos ir entropijos vertėmis. Biofizikinis požiūris į vykstančiaschemines reakcijas gali padėti racionaliai kurti naujus vaistus ir prognozuoti jų sąveiką sutaikiniais.

Šio baigiamojo darbo tyrimo objektas yra karboanhidrazės – aktyviajame centre cinkąturintys metalofermentai. Jie katalizuoja vieną iš esminių fiziologinių reakcijų – angliesdioksido grįžtamąją hidrataciją iki bikarbonato jono ir protono (CO2 + H2O�HCO3

– +

H+)(Aggarwal et al., 2012a). Ši reakcija labai svarbi daugumai biologinių procesų: CO2 irbikarbonato transportui, pH ir CO2 homeostazei, biosintezės procesams (gliukoneogene-zei, lipogenezei), kaulų formavimuisi, elektrolitų sekrecijai bei auglių susidarymui (Matuliset al., 2005). Žmogaus organizme yra 12 kataliziškai aktyvių CA izoformų. Šių baltymųaktyvumo pakitimai yra susiję su tokiomis patologijomis kaip glaukoma, retinitas, epilep-sija, nutukimas bei vėžys. Taigi, daugelis CA yra perspektyvūs taikiniai slopinant šiasligas (Alterio et al., 2012; Supuran, 2008b).

Karboanhidrazių slopinimas, panaudojant įvairius slopiklius, stabdo minėtų ligų vys-tymąsi (Aggarwal et al., 2012b). Viena iš pagrindinių CA slopiklių klasių yra sulfonamidai(Lopez et al., 2010; Supuran, 2010). Biotechnologijos instituto, Biotermodinamikos ir vais-tų tyrimų skyriuje yra atliekami karboanhidrazių ir jų slopiklių tyrimai. Karboanhidraziųslopikliai yra kuriami ir sintetinami kaip priešvėžiniai junginiai bei galimi vaistai nuo kitų

4

Miglė Kišonaitė

su CA aktyvumo pakitimais susijusių ligų. Tiriamų junginių sąveikai su CA nustatytinaudojama fluorescencinė terminio poslinkio analizė, izoterminio titravimo kalorimetrijabei baltymų-ligandų kompleksų rentgenostruktūrinė analizė.

Šio darbo tikslas – ištirti laboratorijoje susintetintų benzensulfonamidinių junginių,kaip karboanhidrazių slopiklių, struktūros ir tikrinių termodinaminių jungimosi paramet-rų sąryšį.

Darbo uždaviniai:

1. Fluorescenciniu terminio poslinkio ir izoterminio titravimo kalorimetrijos metodaisišmatuoti citozolinių karboanhidrazių I, II, VII ir XIII bei transmembraninės kar-boanhidrazės XII sąveikos su benzensulfonamidiniais junginiais termodinaminiusparametrus.

2. Nustatyti chloro pakaito įvedimo į benzensulfonamido žiedą įtaką pKa vertei irprotonizacijos entalpijai.

3. Apskaičiuoti nuo eksperimento sąlygų nepriklausančius tikrinius jungimosi para-metrus ir nustatyti chloro pakaito įvedimo į benzensulfonamido žiedą įtaką sąveikossu karboanhidrazėmis stiprumui bei įvertinti dominuojantį sąveikos energijų indėlįgiminingumui.

4. Nustatyti sulfonamidinės grupės padėties benzeno žiede įtaką sąveikos su karboan-hidrazėmis stiprumui.

5. Nustatyti dimetilo, metilo, okso bei tret-butilo grupių įvedimo į pirimidino žiedąįtaką sąveikos su karboanhidrazėmis stiprumui bei įvertinti entalpijos ir entropijosindėlį jungimosi giminingumui.

6. Atrinkti didžiausiu giminingumu ir atrankumu pasižyminčius junginius bei nustatytidominuojantį sąveikos energijų indėlį giminingumui.

5

Miglė Kišonaitė Literatūros apžvalga

1. Literatūros apžvalga

1.1. Vaistų kūrimas ir termodinaminiai tyrimai

Efektyviam naujų vaistų kūrimui ir tobulinimui yra svarbi visapusė išsami taikinio irsu juo sąveikaujančio vaisto analizė, apimanti informaciją, gautą iš struktūrinių, termo-dinaminių bei biologinių tyrimų. Termodinaminis jungimosi reakcijos charakterizavimassuteikia išskirtinės informacijos apie sąveiką lemiančias molekulines jėgas. Suprantant iroptimizuojant šias jėgas, bei atsižvelgiant į turimą struktūrinę ir funkcinę informaciją apieligos taikinius ir vaistus-kandidatus, sukuriamos naujos strategijos efektyvesniam vaistųtobulinimui. Taigi, biotermodinaminiai tyrimai suteikia esminės informacijos, kuri negalibūti gauta vien struktūrinės analizės ar kompiuteriniais metodais (Garbett and Chaires,2012; Whitesides and Krishnamurthy, 2005).

1.1.1. Biotermodinamika

Pagrindinis parametras apibūdinantis molekulių sąveiką yra laisvoji Gibso energija(∆G). Tiek Gibso laisvosios energijos dydis, tiek ženklas apibūdina vykstančią reakciją.Procesas, kurio laisvoji Gibso energija turi neigiamą skaitinę reikšmę pastovaus slėgioir temperatūros sąlygomis vyks spontaniškai. Teigiama ∆G reikšmė, priešingai, rodo,jog tokiam procesui bus reikalinga papildoma energija iš aplinkos (Chaires, 2008). ∆G

apibrėžiama (1) lygtimi.

∆G = −RT lnKb (1)

(1) lygtyje simbolis R yra universalioji dujų konstanta, T – temperatūra, kurioje atlik-tas matavimas, o Kb – jungimosi konstanta. Kb yra vienas dažniausiai slopiklių jungimosistiprumui vertinti naudojamų parametrų. Taip pat dažnai naudojamas atvirkštinis jaidydis – disociacijos konstanta Kd:

Kd =

(1

Kb

)(2)

Taip pat yra detalesnė ∆G apibrėžianti lygtis, kuri parodo laisvąją energiją sudaran-čius komponentus:

∆G = ∆H − T∆S (3)

(3) lygtyje ∆H yra entalpinis indėlis į laisvąją Gibso energiją, o T∆S – entropijosindėlis. Biotermodinamikoje, ∆H apibūdina šilumos pokytį susijusį su vykstančia reakci-ja, o T∆S – netvarkos pokytį sistemoje (ligande, baltyme, receptoriuje, buferinio tirpalokomponentuose) (Chodera and Mobley, 2013). Entalpija ir entropija padeda detaliau su-

6


prasti ligandų ir baltymų jungimąsi, įvertinti sąveikos stiprumą lemiančias molekulinesjėgas.

Entalpijos pokytis gali būti nustatytas atliekant kalorimetrinius matavimus arba ap-skaičiuotas naudojantis van’t Hoff lygtimi. Kol nebuvo sukurti biologinių molekulių ty-rimams pritaikyti kalorimetrijos prietaisai, paprasčiausias metodas entalpijai nustatytibuvo jungimosi konstantos Kb priklausomybės nuo temperatūros analizė (Chaires, 2008).Tokią priklausomybę apibūdina van’t Hoff lygtis:

lnK = −∆H

RT+

∆S

R(4)

Kb priklausomybės nuo temperatūros grafike atkarpos polinkio kampas yra lygus−∆H. Idealiu atveju eksperimentiškai išmatuota entalpija ir suskaičiuota iš lygties (4)turėtų būti lygios. Tačiau, dažnai netiesiogiai suskaičiuota entalpija nesutampa su iš-matuotąja, nes van’t Hoff lygtyje neatsižvelgiama į šiluminę talpą Cp priklausančią nuotemperatūros:

∆Cp =

(δ∆H

δT

)p

(5)

Kaip jau minėta entropijos pokytis ∆S yra sistemos netvarką apibūdinantis dydis.Entropiją sudaro dvi dedamosios: konformacinė entropija, parodanti molekulės konforma-cinių laisvės laipsnių skaičiaus sumažėjimą vykstant jungimuisi, bei desolvatacijos entro-pija, atsirandanti dėl hibrofobinių grupių slėpimosi nuo tirpiklio molekulių (Ruben et al.,2006). Neigiama ∆S reikšmė parodo, jog tvarka sistemoje didėja. Žinant ∆G ir ∆H,entropiją apskaičiuoti labai nesudėtinga:

∆S =

(∆H −∆G

T

)(6)

Baltymo-ligando sąveikos stiprumas (∆G) gali būti padidintas, didinant jungimosi en-talpiją, desolvatacijos entropiją ar mažinant konformacinę entropiją. Iš (3) lygties matyti,kad skirtingos ∆H ir ∆S reikšmės gali lemti tokią pačią laisvąją Gibso energiją, tačiaušios energijos prigimtis bus skirtinga. Manoma, kad toks entalpijos ir entropijos kom-pensavimas yra vienas esminių aspektų, į kuriuos reikėtų atsižvelgti kuriant vaistus iroptimizuojant cheminius junginius (Olsson et al., 2011).

1.1.2. Entalpijos ir entropijos kompensavimas

Tiriant ligandų jungimąsi su baltymu, entropijos-entalpijos kompensavimas reiškia,jog ligando cheminė modifikacija sąlygoja entalpijos pokytį (∆∆H = ∆H2−∆H1), kurisdalinai ar pilnai kompensuojamas entropijos pokyčiu (T∆∆S = (T∆S2)−(T∆S1)). Jeigustebimas kompensavimo reiškinys, tuomet ∆∆H ir T∆∆S yra tokio paties ženklo ir esant

7


visiškam kompensavimui ∆∆G ≈ 0, taigi ∆∆H ≈ T∆∆S (Chodera and Mobley, 2013;Freire, 2008). Pavyzdžiui, cheminės molekulės modifikacija, kurios dėka atsiranda daugiaucheminiu ryšių su taikiniu, padarys entalpijos vertę neigiamesnę. Tačiau, ši modifikacijagali sumažinti cheminės molekulės ir jos taikinio komplekso laisvės laipsnių skaičių, taigi,entropijos vertę padarys neigiamesnę. Mokslinėje literatūroje, kompensavimo reiškinysdažnai vaizduojamas termodinaminio optimizavimo grafiku (TOP), kuriame ašyse yraatidėtos −T∆S ir ∆H reikšmės, kaip parodyta 1 paveikslėlyje.

BiologiniaiMedicininiaiKiti

varančioji jėgaentalpija

varančioji jėgaentropija

1 pav. Izoterminio titravimo kalorimetrijos duomenys iš duomenų bazės SCORPIO. Ap-skritimais pažymėti baltymo ir biologinio ligando kompleksai, trikampiais pažymėti sin-tetinių medicininių ligandų su baltymais kompleksai, kvadratais – kiti ligandų-baltymųkompleksai. Mėlyna linija atskiria baltymo-ligando kompleksus kurių varančioji sąveikosjėga yra entalpija (virš linijos) bei kurių – entropija (po linija). Modifikuota pagal (Olssonet al., 2008).

Dažnai sintetinant cheminius vaistus, atrankumas yra pasiekiamas didinant moleku-lės komplementarumą su baltymo aktyviuoju centru, o jungimosi stiprumas – didinanthidrofobiškumą. Naudinga entropija dažniausiai atsiranda dėl vandens molekulių atpa-laidavimo vykstant komplekso susidarymui. Desolvatacijos entropija yra nespecifinė jėga,proporcinga cheminės molekulės hidrofobiškumui. Taigi, prijungiant hidrofobines chemi-nes grupes sintetiniai vaistai stipriau jungiasi su baltymais taikiniais. Tačiau, egzistuojahidrofobiškumo riba, kurią pasiekus cheminis junginys tampa netirpus ir nebegali būtinaudojamas kaip vaistas.

Optimizuoti entalpiją yra daug sudėtingesnis uždavinys. Netgi žinant baltymo akty-

8


viojo centro struktūrą, a priori sukurti tikslias cheminės sąveikos vietas labai sudėtinga.Entalpiją sudaro dvi pagrindinės dalys: naudinga entalpija, atsiradusi dėl nekovalentiniųvandenilinių ryšių ir van der Waals sąveikų, ir nepalanki entalpija, atsiradusi dėl poliniųjunginio grupių desolvatacijos. Stipri vandenilinė jungtis gali prisidėti prie palankios jun-gimuisi entalpijos iki −20 kJ/mol, tačiau būti kompensuota didelės nepalankios entropijosdėl baltymo aktyviojo centro ir ligando konformacijos apribojimų (Garbett and Chaires,2012; Reynolds and Holloway, 2011).

Svarbus žingsnis vaistų kūrime bei tobulinime siekiant stiprios ir atrankios sąveikos,yra subalansuoti entalpijos ir entropijos indėlius į sąveikos energiją. Pirmiausia, reikianustatyti kokios jėgos lemia sąveiką ir atrinkti molekules, kurios sudaro palankius chemi-nius ryšius su taikiniu, t.y. jų sąveika yra lemiama palankios entalpijos. Tolimesniamedarbe labai svarbu atlikti struktūros ir termodinaminių parametrų sąryšio analizę. Galu-tinis tikslas yra sukurti tokius prognozavimo metodus, kurie padėtų sukonstruoti erdvinįvaisto-taikinio modelį, kuris leistų 1 Å tikslumu suplanuoti vandenilinių ryšių susidarymoporas (Chaires, 2008; Ruben et al., 2006).

1.2. Karboanhidrazės

Karboanhidrazės (CA, angl. carbonic anhydrases, EC 4.2.1.1) tai visuose organizmuose(Bacteria, Archea ir Eukarya) randami metalofermentai, koduojami evoliuciškai negimi-ningų genų šeimų (Supuran, 2008b). CA katalizuoja CO2 hidrataciją iki bikarbonato irprotono. Ši reakcija taip pat vyksta ir be fermentų, tačiau per lėtai. Karboanhidrazėsšią reakciją pagreitina 10 milijonų kartų (Nelson and Cox, 2008). CO2, bikarbonatas irprotonai labai svarbūs daugumai fiziologinių funkcijų, todėl CA yra aptinkamos visosekaralystėse.

1.2.1. Karboanhidrazių šeimos

Yra skiriamos penkios skirtingos karboanhidrazių šeimos: α-, β-, γ-, δ- ir ζ-CA. α-CArandamos stuburiniuose, bakterijose, dumbliuose, žaliųjų augalų citoplazmoje. Dažniau-siai tai monomerai, retais atvejais dimerai (Hassan et al., 2012). Kadangi α-CA randamosžinduoliuose, jos plačiausiai ištyrinėtos, tačiau ir kitos klasės turi įtakos žmogaus sveikataibei visuotiniam anglies ciklui. Dimerinės, tetramerinės arba oktamerinės β-CA dominuojabakterijose, dumbliuose bei vienaskilčių ir dviskilčių augalų chloroplastuose. Aerobiniuoseprokariotuose β-CA palaiko vidinį pH ir CO2/bikarbonato balansą reikalingą biosintezėsreakcijoms. Anaerobiniuose prokariotuose β-CA svarbios CO2 ir bikarbonato transportuiper ląstelės plazminę membraną. Fototrofiniuose organizmuose ši klasė ypač reikalingaCO2 ir bikarbonato transportui ir kaupimui, kuris lemia fotosintezę (Ludwig, 2011). Tri-merinės γ-CA daugiausiai randamos archėjose ir kai kuriose bakterijose, o δ- ir ζ-CA - tiktitnagdumbliuose, kur atlieka CO2 kaupimo fotosintezei funkciją (Ferry, 2010; Zimmer-

9


man and Ferry, 2008). CO2 hidratacijos iki bikarbonato ir protono katalizei esminis yraZn2+ jonas. Dauguma CA, tai yra α-, β- ir δ-CA klasės, aktyviajame centre turi cinko– Zn(II) metalo joną. γ-CA dažniausiai aktyviajame centre turi geležies – Fe(II) joną,tačiau gali būti aktyvios ir su Zn(II) ar Co(II). ζ-CA metalo vietoje dažniausia turi kadmį– Cd(II) (Alterio et al., 2012; Supuran, 2010).

1.2.2. Žinduolių karboanhidrazių izoformos, struktūra ir pasiskirstymas

Iš 16 šiuo metu žinomų žinduolių α-CA izoformų, 13 yra aktyvios (CA I–IV, VA, VB,VI, VII, IX, XII–XV). Tik CA XV išskirtinai nėra aptinkama žmogaus organizme (Pasto-rekova et al., 2006). Šiuo metu visų CA izoformų, išskyrus CA VB, trimatės struktūrosyra nustatytos. Struktūrų analizė rodo, kad nepaisant skirtingo pasiskirstymo audiniuoseir organuose, šie fermentai turi panašią struktūrą: centre antiparaleliai susisukusias βklostes apsuptas spiralių ir papildomas β juostas. Visų α izofermentų aktyvusis centrasyra didelėje, kūgio pavidalo erdvėje, maždaug 12 Å pločio ir 13 Å gylio. Šios ertmės gi-lumoje yra cinko jonas, kurį laiko trys konservatyvūs histidinai ir vandens molekulė arbahidroksido jonas (Christianson and Fierke, 1996; Supuran, 2008a). Pastarasis formuojavandenilinių jungčių tinklą, padedantį padidinti nukleofiliškumą. Ketvirtasis aktyviojocentro histidinas atlieka protonų pernešimo funkciją. Visų CA izofermentų aktyvųjį cent-rą galima padalinti į dvi sritis: hidrofobinę ir hidrofilinę (2 pav.). Hidrofobinis regionasyra reikalingas CO2 atskyrimui ir teisingai anglies atomo orientacijai, kad galėtų vyktisu cinku sujungto hidroksido nukleofilinė ataka. Hidrofilinė sritis svarbi protono perkėli-mui iš vandens molekulės tirpikliui (Alterio et al., 2012). Trys neaktyvios CA izoformos(CARP VIII, X, XI) neturi vieno iš trijų kritiškai svarbių histidinų, todėl negali atliktiCO2 hidratacijos reakcijos. Taip pat, rastas karboanhidrazių tipo baltymas – receptorinėbaltymų tirozino fosfatazė (RPTP), ji reikalinga nervų sistemos vystymuisi ir turi vienąCA domeną (Peles et al., 1995).

Izoformos skiriasi savo kataliziniu aktyvumu, pasiskirstymu audiniuose ir organuo-se, vieta ląstelėje bei biologinėmis funkcijomis. 3 paveiksle pateikta CA pasiskirstymožmogaus ląstelėje schema. Yra penkios citozolinės izoformos (CA I , II, III, VII ir XI-II), keturios transmembraninės CA formos (CA IX, XII, XIV) arba susijusios su ląstelėsmembrana per GPI inkarus (CA IV), dvi randamos mitochondrijose (CA VA ir VB) irviena sekretuojama CA izoforma (CA VI). (Pastorekova et al., 2006; Supuran, 2008c).

α-CA izoformos yra veiklios visame žmogaus organizme. Kai kurios labai dažnos irpaplitusios po visą organizmą (CA II), kitos pasisklaidžiusios įvairiose organizmo vietose(CA IV, XII, XIII). CA III randama tik raumenyse ir adipocituose, CA VA – tik kepeny-se, CA VI aptinkama seilėse ir piene. CA daugiausiai pasireiškia raudonuosiuose kraujokūneliuose, smegenyse, plaučiuose, kepenyse, inkstuose, sėklidėse. Šiose ląstelėse ar or-ganuose veikia ne viena CA izoforma, kurių dėka vyksta kvėpavimas, skrandžio sulčių

10


2 pav. Žmogaus CA II struktūra. Kairėje pusėje β klostės nuspalvintos geltonai, α spi-ralės – raudonai. Violetinis rutuliukas – tai cinko jonas, laikomas trijų histidino liekanų.Dešiniajame paveikslėlyje hidrofobinė aktyviojo centro dalis pažymėta raudonai (Ile91,Phe131, Val121, Val135, Leu141, Val143, Leu198, Pro202, Leu204 Val207 ir Trp209), ohidrofilinė dalis – mėlyna spalva (Asn62, His64, Asn67 and Gln92). Paveiklėlis modifi-kuotas pagal (Domsic et al., 2008)

išskyrimas, akies skysčio susidarymas, spermatozoidų brendimas (Parkkila, 2000). VisųCA sąrašas pateiktas 1 lentelėje.

1.2.3. Karboanhidrazių katalizuojamos CO2 hidratacijos reakcijos mechaniz-mas

Karboanhidrazės katalizuoja labai paprastą, bet esminę fiziologinę reakciją: angliesdioksido grįžtamąją hidrataciją iki bikarbonato jono ir protono (CO2 + H2O�HCO3

– +

H+). Ši reakcija labai svarbi daugumai fiziologinių procesų: CO2 ir bikarbonato trans-portui, pH ir CO2 homeostazei, gliukoneogenezei, lipogenezei, elektrolitų sekrecijai, kaulųvystymuisi, nervų sistemos funkcijoms, auglių formavimuisi ir daugeliui kitų fiziologinių

3 pav. CA pasiskirstymas ląstelėje, modifikuota pagal (Pastorekova et al., 2006). Mono-merinės formos yra pažymėtos vienu skrituliu, baltymai dimerai – dvigubu skrituliu.

11


1 lentelė. α-CA izoformų pasiskirstymas organuose bei audiniuose ir CO2 hidratacijosaktyvumas. Modifikuota pagal (Alterio et al., 2012).CA izoforma Organas/audinys AktyvumasCA I eritrocitai, virškinamasis traktas, akys žemasCA II eritrocitai, virškinamasis traktas, akys, osteo-

klastai, inkstai, plaučiai, sėklidės, smegenysaukštas

CA III skersaruožiai raumenys, adipocitai labai žemasCA IV inkstai, plaučiai, kasa, smegenų kapiliarai,

gaubtinė žarna, širdies raumenys, akysaukštas

CA VA kepenys vidutinisCA VB širdies ir skeleto raumenys, kasa, inkstai, nu-

garos smegenys, virškinamasis traktasaukštas

CA VI seilių ir pieno liaukos vidutinisCA VII centrinė nervų sistema aukštasCA VIII centrinė nervų sistema neaktyviCA IX augliai, virškinamojo trakto gleivinė aukštasCA X centrinė nervų sistema neaktyviCA XI centrinė nervų sistema neaktyviCA XII inkstų, žarnų ir reprodukcinių organų epitelis,

akys, augliaiaukštas

CA XIII inkstai, smegenys, plaučiai, žarnos, reproduk-ciniai organai

žemas

CA XIV inkstai, smegenys, kepenys, akys vidutinis

bei patologinių procesų (Supuran et al., 2010). Visos CA izoformos turi tokį patį fer-mentinį veikimo mechanizmą – „Ping-pong”, susidedantį iš dviejų nepriklausomų etapų(Lindskog, 1997). Hidratacijos kryptimi, pirmasis etapas yra CO2 virtimas bikarbonatu,vykstantis nukleofilinės atakos metu, kai prie cinko prisijungęs hidroksido jonas atakuojaCO2. Po to bikarnonatą aktyviajame centre pakeičia vandens molekulė ((7) reakcija).Antrasis etapas lemia visos reakcijos greitį. Jo metu vandens molekulė prisijungusi priecinko atiduoda protoną buferiui (B) ir grąžina fermento aktyvųjį centrą į pirminę būseną((8) reakcija) (Alterio et al., 2012; Domsic et al., 2008).

CO2 + EZnOH− −−⇀↽−− EZnHCO3− H2O−−⇀↽−− EZnH2O + HCO3 (7)

EZnH2O + B −−⇀↽−− EZnOH− + BH+ (8)

1.2.4. Ligos, susijusios su karboanhidrazių pakitimais

CA yra svarbūs taikiniai gydant įvairias ligas. Jų aktyvatoriai ir slopikliai yra plačiainaudojami šiuolaikinėje medicinoje. Daug skirtingų simptomų yra susiję su CA aktyvu-mo pakitimais. CA yra atsakingos už daugumos tipų anemiją. CA II yra būtina jonųtransportui eritrocituose. CA III atlieka svarbų vaidmenį prieš oksidacinį stresą, o jos

12


pakitimai sukelia β-talasemiją. Defektai CA II izoformoje sukelia osteopetrozę bei inkstųkanalėlių acidozę. CA II trūkumas yra pagrindinė CA nepakankamumo sindromo prie-žastis (Borthwick et al., 2003; Hassan et al., 2012).

CA atlieka svarbų vaidmenį akyse. CA II katalizuotas bikarbonato formavimasis yrasvarbus natrio transportui į akį. Natrio patekimas į akį daro įtaką ir vandens patekimui įvidų. Šie abu procesai svarbūs akispūdžio palaikymui. CA II slopinimas smarkiai suma-žina akispūdį, todėl CA II slopikliai yra naudojami kaip vaistai nuo glaukomos. DefektaiCA IV izoformoje sukelia pigmentinį retinitą (lot. retinitis pigmentosa), tai yra tinklainėsfotoreceptorių degeneraciją (Krishnamurthy et al., 2008).

Nervų sistemoje CA atlieka keletą funkcijų. Gysliniame rezginyje esančios CA svar-bios cerebrospinalinio skysčio gamybai. Smegenyse CA yra randamos oligodendrocituose,glijos ląstelėse, o didžiausia jų koncentracija yra juntamuosiuose neuronuose, kur ji svarbisignalų perdavimui, ilgalaikėms sinapsinėms transformacijoms. CA aktyvavimas smarkiaipadidina bikarbonato koncentraciją ir su atmintimi susijusiose nervinėse struktūrose.

Per didelė CA IX ekspresija yra susijusi su kiaušidžių bei gimdos gleivinės vėžiu. CAIX yra auglio hipoksijos ir kai kurių žmogaus vėžio formų biožymuo. Didesnė CA XIIekspresija taip pat susijusi su auglių formavimusi (Lopez et al., 2010). CA VA ir VB yraaptinkamos mitochondrijose, kur yra įtrauktos į biosintezės procesus. Būtent šių izoformųslopinimas gali būti panaudojamas nutukimui gydyti (De Simone et al., 2008; Supuran,2008b).

1.3. Karboanhidrazių slopikliai

Klasikiniai CA slopikliai yra sulfonamidai (RSO2NH2), kurie jau 50 metų naudojamiklinikoje kaip diuretikai ir sisteminiai vaistai prieš glaukomą. Šiuo metu gydymui yranaudojami apie 30 sulfonamidų ar sulfamatų klasei priklausančių junginių. Keleto ko-mercinių CA slopiklių cheminės struktūros pateiktos 4 paveikslėlyje. Kiekvienas iš jų turisulfonamido grupę, kuri jungiasi su cinko atomu aktyviajame baltymo centre, bei hidro-fobinę grupę, kuri sąveikauja su baltymo hidrofobine kišene ir daro įtaką sulfonamidogrupės pKa (Matulis and Todd, 2004).

CA slopikliai gali būti naudojami ne tik glaukomai gydyti, bet ir kaip vaistai priešnutukimą, skausmą, infekcijas ir vėžį. Dauguma slopiklių veikia nespecifiškai visas CAizoformas, o norint gydyti konkrečią ligą, slopiklis turi veikti tik tą CA izoformą, kuriospakitimas sukėlė ligą (Zubrienė et al., 2013). Iš visų klinikoje naudojamų vaistų nėra neivieno, kuris atrankiai slopintų tik vieną izoformą (Capkauskaitė et al., 2012; Supuran,2010)

Tiazidas ir kiti smarkiai besijungiantys diuretikai, tokie kaip indapamidas, furosemi-das buvo atrasti 6 – 7 dešimtmečiuose, kai apie CA izoformas buvo žinoma labai mažai.5 paveiksle pateikti slopikliai struktūriškai yra panašūs, tačiau skirtingai jungiasi su or-

13


4 pav. Keleto komercinių CA slopiklių cheminės struktūros.

ganizme plačiai paplitusia CA II izoforma. Indapamidas su CA II jungiasi daug silpniaunei kiti junginiai. Rentgeno kristalografijos būdu gautose žmogaus CA II jungimosi suchlortalidonu, indapamidu, trichlormetiazidu ir furosemidu struktūrose aktyviajame cent-re pastebėtos kelios vandens molekulės, kurios prisijungia prie chlortalidono, trichlorme-tiazido ir furosemido junginių ir gali lemti skirtingo stiprumo sąveiką, nors, didžiausiąįtaką jungimuisi daro sulfonamidinė grupė, kuri jungiasi koordinaciniu ryšiu su aktyvia-jame baltymo centre esančiu Zn(II) jonu. 5 paveikslėlyje matyti, kad būtent indapamidasir nesudaro ryšių su vandens molekulėmis aktyviajame fermento centre. (Temperini et al.,2008, 2009)

Pagrindiniai sulfonamidai, pavyzdžiui acetazolamidas, yra efektyvūs vaistai nuo glau-komos, bet menkai naudojami dėl daugelio nepageidaujamų pašalinių poveikių, kurie at-siranda dėl neatrankaus visų CA slopinimo. Vaistai nuo glaukomos turėtų slopinti tik CAII, IV ir XII, kurios yra aptinkamos akyse. Tirpius vandenyje vaistus nuo glaukomos gali-ma lašinti tiesiogiai į akis. Plačiai naudojami vandenyje tirpūs junginiai yra dorzolamidas,brinzolamidas, timololis (Gitto et al., 2010; Krishnamurthy et al., 2008).

Topiramatas ir zonisamidas yra naudojami epilepsijos gydymui ir yra veiksmingi dau-gumos smegenyse esančių CA slopikliai. Topiramatu ar zonisamidu gydant turinčiusviršsvorį epilepsija sergančius pacientus kaip pašalinis poveikis pastebėtas didelis svoriosumažėjimas. Taip yra todėl, kad šie du vaistai yra ir lipogenezės slopikliai. Taigi, šiuometu topiramatas yra viena iš vaistų nuo nutukimo sudedamųjų dalių (Supuran, 2010).

Aromatiniai ir heterocikliniai sulfonamidai ir sulfamatai stipriai jungiasi su CA IX irCA XII, kurios yra randamos tik vėžinėse ląstelėse. Tačiau šie junginiai slopina ir kitassu vėžiu nesusijusias CA. Kadangi CA IX ir CA XII yra ekstraląstelinės izoformos, jų

14


5 pav. Detalios sąveikos tarp chlortalidono (A), indapamido (B), trichlorometiazido (C),furosemido (D) ir žmogaus CA II aktyviojo centro. Schemose parodytos metalo jonąkoordinuojančios (His94, 96, 119) ir kitos sąveikoje dalyvaujančios aminorūgščių liekanosbei raudonais rutuliukais pažymėtos vandens molekulės. Modifikuota pagal (Temperiniet al., 2009).

slopinimui pradėti naudoti teigiamai ar neigiamai įkrauti sulfonamidai, cukrų turintysslopikliai, hipoksijos aktyvuojami slopikliai, kurie negali pereiti ląstelės membranos irtodėl jungiasi tik su IX ir XII izoformomis (Baranauskienė et al., 2010).

1.4. Terminis baltymų stabilumas

Šiuo metu farmacijos tyrimuose yra naudojama nemažai metodų nustatyti slopikliojungimąsi su baltymu taikiniu. Dauguma žinomų metodų turi būti optimizuoti konkre-čiam eksperimentui. Vienas iš pagrindinių nespecializuotų metodų, turintis platų pri-taikymą yra fluorescencinis terminio poslinkio metodas, kitaip vadinamas ThermoFluorarba diferencinio skenavimo fluorimetrija (DSF). Šis metodas taip pat naudojamas tirtibaltymo-baltymo sąveikai ir plačiai taikomas slopiklių jungimosi konstantoms su karbo-

15


anhidrazėmis nustatyti (Cimmperman et al., 2008; Matulis et al., 2005).Norint įvertinti terminį baltymo stabilumą, eksperimento metu yra keliama tempera-

tūra ir matuojamas tam tikras baltymo struktūros parametras. Temperatūrai pasiekustokią vertę, kai baltymo natyvi forma yra mažiau termodinamiškai palanki, baltymasišsivynioja. Tm yra vidurio taškas baltymo denatūracijos kreivėje ir rodo temperatūrą,kai natyvios ir denatūravusios baltymo formos laisvoji energija yra lygios (Kranz andSchalk-Hihi, 2011; Matulis, 2008). Ligando poveikis baltymo stabilumui yra ekspermen-tiškai nustatomas matuojant baltymo Tm pokytį (6 pav.). Tm pokytis yra proporcingastiek ligando koncentracijai, tiek jungimosi konstantai (Murphy, 2001). Į tiriamąjį baltymotirpalą reikia pridėti dažo reporterio – 1,8-anilino naftaleno sulfonato (ANS), kurio fluores-cencija kinta, baltymui išsivyniojant. Veikiamas temperatūros baltymas išsivynioja, tadaatsiveria naujos hidrofobinės baltymo vietos, kuriose ANS gali prisijungti ir fluorescuotistipriau nei vandeniniame tirpale (Daniel and Weber, 1966; Matulis et al., 1999).

6 pav. Diferencinio skenavimo fluorimetrijos kreivės, kuriose parodytas Tm reikšmės pos-linkis, vykstant baltymo sąveikai su slopikliu. Modifikuota pagal (Kemp et al., 2012).

Fluorescencijos intensyvumas baltymo denatūracijos kreivėse yra aprašomas lygtimi:

y(T ) = yN +yU − yN

1 + e∆UG/RT= yU +

yN − yU1 + e−∆UG/RT

(9)

Šioje lygtyje yN yra natyvaus baltymo fluorescencijos intensyvumas, o yU – išsivynio-jusio baltymo. Eksponentė parodo baltymo, kurio laisvoji energija ∆UG(T ), tikimybę būtiišsivyniojusiu.

yN(T ) = yN,Tm +mN(T − Tm), (10)

yU(T ) = yU,Tm +mU(T − Tm), (11)

16


Šiose lygtyse yN,Tm ir yU,Tm yra ANS fluorescencijos intensyvumas lydymosi tempera-tūroje Tm atitinkamai esant natyviam ir išsivyniojusiam baltymui. mN ir mU atitinkamaiyra natyvaus ir išsivyniojusio baltymo fluorescencijos tiesių pokrypio kampai.

Laisvoji Gibso energija kaip temperatūros funkcija gali būti išreikšta per baltymo išsi-vyniojimo entalpiją (∆UHTr), entropiją (∆USTr) ir šiluminę talpą (∆UCp), kai standartinėtemperatūra Tr be ligando yra lygi Tm (Cimmperman et al., 2008).

∆UG(T ) = ∆UH(T )−T∆US(T ) = ∆UHTr + ∆UCp(T −Tr)−T(

∆USTr + ∆UCp ln

(T

Tr

))(12)

Išsprendus (9)-(12) lygčių sistemą gauname galutinę lygtį, naudojamą baltymo išsivy-niojimo kreivėms modeliuoti.

y(T ) = yN,Tm +mN(T − Tm) +yU,Tm − yN,Tm + (mU −mN)(T − Tm)

1 + e(∆UHTr+∆UCp(T−Tr)−T (∆USTr+∆UCp ln(T/Tr)))/RT(13)

Šeši parametrai yN,Tm ,mN , yU,Tm ,mU ,∆UHTr ir Tm yra derinami naudojant Levenbergo-Markardo algoritmą (LMA), kad išvestinių kvadratų suma pasidarytų mažiausia. ∆UCp

yra diferencinė žvalgos kalorimetrijos metodu kiekvienam baltymui nustatoma konstanta.(Baranauskienė et al., 2010).

1.4.1. Baltymo stabilizavimo ir destabilizavimo ligandais modelis

Ligandas gali jungtis prie natyvaus (N) ir/ar išsivyniojusio (U) baltymo. Jei ligandasstipriau jungiasi su išsivyniojusia baltymo struktūra nei su natyvia, tada galime sakyti jogligandas destabilizavo baltymą (Cimmperman et al., 2008). Analogiškai, priešingu atveju,baltymas yra stabilizuojamas. Jungimasis gali būti pavaizduotas sujungtomis reakcijomis:

[UL]KbU

� [U ] + [L]KU

�[N ] + [L]KbN

[NL] (14)

Reakcijoje (14) [UL] yra denatūravusio baltymo ir ligando komplekso koncentracija,[U] yra denatūravusio baltymo koncentracija, [L] - ligando koncentracija, [N] - natyvausbaltymo koncentracija, o [NL] natyvaus baltymo ir ligando komplekso koncentracija. KU

yra baltymo išsivyniojimo konstanta, kai ligando nėra ir egzistuoja tik dvi baltymo kon-formacijos (Cimmperman et al., 2008; Kranz and Schalk-Hihi, 2011).

KU =[U ]

[N ](15)

KbN ir KbU atitinkamai yra ligando jungimosi prie natyvios ir denatūravusios baltymoformos konstantos.

17


KbN =[NL]

[N ][L](16)

KbU =[UL]

[U ][L](17)

Pt = [N ] + [U ] + [NL] + [UL] (18)

Lt = [L] + [NL] + [UL] (19)

(18) ir (19) lygtys atitinkamai parodo suminius baltymo (Pt) ir ligando (Lt) kiekius.Išsivyniojusio baltymo frakcija gali būti išreikšta:

fU =[U ] + [UL]

Pt

(20)

Išsprendus (15)-(20) lygčių sistemą, visa pridėto ligando koncentracija yra fU , Pt, KU , KbN

ir KbU funkcija:

Lt = (fU +KU(fU − 1))×(PT (KbN +KbUKU)

KU(KbU −KbN)+

1

KUKbU − fU(KbN +KbUKU)

)(21)

Ši lygtis gali būti supaprastinta, nes esant baltymo lydymosi temperatūrai, išsivynio-jusio baltymo frakcija yra lygi pusei vieneto (fU = 0,5) (Kazlauskas et al., 2012), taigiišsivyniojusio ir natyvaus baltymo koncentracijos yra lygios:

Lt = (1−KU_Tm)×(PT

2

KbN_Tm +KbU_TmKU_Tm

KU_Tm(KbU_Tm −KbN_Tm)+

1

KU_TmKbU_Tm −KbN_Tm

)(22)

Lygtis (22) galioja tik esant sąlygai T = Tm

Norint rasti santykį tarp ligando koncentracijos ir baltymo lydymosi temperatūros,turėtų būti atsižvelgta į pusiausvyros konstantos priklausomybę nuo temperatūros. Pu-siausvyros konstantos priklausomybė nuo temperatūros gali būti išreikšta:

KU = e−∆UGT /RT = e−(∆UHT−T∆UST )/RT

= e−(∆UHTr+∆UCp(T−Tr)−T (∆USTr+∆UCp ln(T/Tr)))/RT(23)

Čia ∆UGT , ∆UHT , ∆UST ir ∆UCp atitinkamai yra baltymo išsivyniojimo laisvosiosGibso energijos, entalpijos, entropijos ir šiluminės talpos pokyčiai. R yra universaliojidujų konstanta. Tr yra palyginamoji temperatūra. Natyvios baltymo formos jungimosi

18


konstantos priklausomybė nuo temperatūros yra:

KbN = e−∆bNGT /RT = e−(∆bNHT−T∆bNST )/RT

= e−(∆bNHT0+∆bNCp(T−T0)−T (∆bNST0

+∆bNCp ln(T/T0)))/RT(24)

Kur ∆bNGT , ∆bNHT , ∆bNST ir ∆bNCp atitinkamai yra ligando jungimosi prie naty-vaus baltymo laisvosios Gibso energijos, entalpijos, entropijos ir šiluminės talpos pokyčiai(Cimmperman et al., 2008). Palyginamoji temperatūra T0 yra 37 ◦C. Išsivyniojusios bal-tymo formos jungimosi konstantos priklausomybė nuo temperatūros yra:

KbU = e−∆bUGT /RT = e−(∆bUHT−T∆bUST )/RT

= e−(∆bUHT0+∆bUCp(T−T0)−T (∆bUST0

+∆bUCp ln(T/T0)))/RT(25)

Kur ∆bUGT , ∆bUHT , ∆bUST ir ∆bUCp atitinkamai yra ligando jungimosi prie išsi-vyniojusio baltymo laisvosios Gibso energijos, entalpijos, entropijos ir šiluminės talpospokyčiai.

Iš (22) – (25) formulių sudarome lygčių sistemą, kai T = Tm. Tokia išraiška parodo,kokia ligando koncentracija reikalinga, norint pasiekti baltymo lydymosi temperatūrą Tm:

KU_Tm = e−(∆UHTr+∆UCp(Tm−Tr)−Tm(∆USTr+∆UCp ln(Tm/Tr)))/RTm

KbN_Tm = e−(∆bNHT0+∆bNCp(Tm−T0)−Tm(∆bNST0

+∆bNCp ln(Tm/T0)))/RTm

KbU_Tm = e−(∆bUHT0+∆bUCp(Tm−T0)−Tm(∆bUST0

+∆bUCp ln(Tm/T0)))/RTm

Lt = (1−KU_Tm)×(PT

2

KbN_Tm +KbU_TmKU_Tm

KU_Tm(KbU_Tm −KbN_Tm)+

1

KU_TmKbU_Tm −KbN_Tm

)(26)

Ši lygčių sistema aprašo ryšį tarp visų baltymo išsivyniojimo ir ligando jungimosi priedviejų baltymo formų termodinaminių parametrų ir susieja juos su ligando ir baltymokoncentracijomis. (26) lygčių sistema yra sudėtinga ir gali būti supaprastinta padarantįvairias prielaidas, pavyzdžiui, kad ligandas jungiasi tik prie natyvaus baltymo ar tik prieišsivyniojusios jo formos. (Cimmperman et al., 2008; Matulis et al., 2005). Jei ligandasnesijungia prie išsivyniojusio baltymo (KbU → 0) arba prie išsivyniojusios formos jungiasidaug silpniau nei prie natyvios, tai yra KbU << KbN ir KUKbU << KbN , tuomet:

Lt = (KU_Tm − 1)×(

PT

2KU_Tm

+1

KbN_Tm

)(27)

Šiame darbe tirti ligandai jungiasi tik prie natyvios baltymo formos, todėl jungimosikonstanta nustatyta pagal (27) lygtį.

19


1.5. Izoterminio titravimo kalorimetrija

Norint suprasti mažų ligandų ir biologinių makromolekulių sąveikos procesus, reikiapilnai charakterizuoti jungimosi energetiką ir nustatyti sąryšį tarp termodinaminių pa-rametrų ir reakcijoje dalyvaujančių molekulių struktūrų. Farmacijos tyrimuose termodi-naminiams parametrams nustatyti dažnai naudojamas metodas yra izoterminio titravimokalorimetrija (ITC). Nors yra sukurta daug metodų molekulių sąveikoms tirti, tačiau ITCyra vienintelis leidžiantis vienu eksperimentu nustatyti visus pagrindinius termodinami-nius parametrus: entalpiją ∆H, entropiją ∆S ir laisvąją Gibso energiją ∆G. ITC taippat yra vienintelis metodas, kuriuo galima tiesiogiai pamatuoti beveik bet kurio bimole-kulinio proceso sąveikos entalpiją, jungimosi konstantą (Kb) ir susijungiančių medžiagųstechiometriją (Rogez-Florent et al., 2014).

Kalorimetras buvo vienas pirmųjų mokslinėje literatūroje aprašytų instrumentų. 1780m. Lavoisier sukūrė ledo kalorimetrą, kuriuo pamatavo metabolinę šilumą, kurią išskyrėjūros kiaulytė patalpinta į matavimo kamerą. Titravimo kalorimetrijos metodą Kb ir ∆H

nustatymui pirmą kartą aprašė Christensen ir Izatt prieš daugiau kaip 50 metų (Izattet al., 1966). Metodas buvo panaudotas silpnų rūgščių-bazių pusiausvyros ir metalų jo-nų reakcijoms tirti. Šiandien ITC metodas yra naudojamas ir biomolekulių jungimositermodinaminei charakteristikai nustatyti. Metodas galėjo būti pritaikytas biologinėmsmolekulėms tik patobulinus patį instrumentą, padidinus jo jautrumą ir sukūrus naująprograminę įrangą duomenų analizei. Modernus ITC instrumentas gali pamatuoti labainedidelį šilumos pokytį (nuo 0,4 µJ), o tai leidžia nustatyti labai didelę jungimosi kons-tantą (iki 108–109 M−1) (Freyer and Lewis, 2008).

Izoterminio titravimo kalorimetrija yra universalus metodas. Beveik kiekviena che-minė reakcija ar fizinis molekulės pokytis yra lydimas šilumos išsiskyrimo ar sugėrimoreakcijos. Šilumos kiekis paimtas iš aplinkos (endoterminis procesas) ar atiduotas ap-linkai (egzoterminis procesas) yra lygus reakcijoje dalyvaujančių medžiagų kiekiui (mo-liais) ir reakcijos entalpijos pokyčiui ∆H (kJ/mol) (Freyer and Lewis, 2008; Matulis,2008). ITC yra naudojamas baltymo-ligando, baltymo-baltymo, DNR-baltymo, baltymo-angliavandenilio, baltymo-lipido, antigeno-antikūno sąveikoms tirti (Velazquez-Campoyet al., 2004).

1.5.1. Kalorimetrai

Kalorimetriniai matavimai gali būti atliekami trimis skirtingais būdais. Pagal taikalorimetrai gali būti suskirstyti į tris pagrindines grupes: adiabatinius, šiluminio laidumoir galios kompensavimo (izoterminius) kalorimetrus (Freyer and Lewis, 2008; Matulis,2008).

Adiabatiniame kalorimetre nėra šilumos perdavimo tarp kalorimetro kiuvečių ir aplin-kos. Šiluma, išsiskyrusi (ar sunaudota) vykstant reakcijai, pakeičia kalorimetro matavimo

20


celės temperatūrą. Matuojamas temperatūros pokytis yra pakeičiamas į šilumos pokytį,kalorimetro šiluminę talpą (cal/◦C) padauginus iš pamatuoto temperatūros pokyčio ∆T

(◦C).Šiluminio laidumo kalorimetruose matavimo celėje yra pasyviai palaikoma pastovi

temperatūra. Išsiskyrusi arba susigėrusi šiluma keliauja iš arba į šilumos gertuvę. Į šilu-mos srauto pokyčius reaguoja jutikliai esantys tarp matavimo kiuvetės ir šilumos gertuvės.Matuojamas signalas yra įtampa proporcinga temperatūros pokyčiui ∆T , kuris atsiradojutiklyje dėl reakcijos išskirto šilumos srauto.

Galios kompensavimo kalorimetruose matavimo kiuvetėje yra palaikoma pastovi tem-peratūra (izoterminės sąlygos). Tai pasiekiama nuolat šaldant celę bei naudojant tempe-ratūros kontroliavimo sistemą ir elektrinį šildytuvą. Galia, susidariusi dėl egzoterminėsreakcijos, yra kompensuojama šaldant, o matuojant endoterminius procesus, kiuvetė turibūti šildoma. Taigi, matuojamas signalas yra galia, kuri reikalinga palaikyti pastovią tem-peratūrą matavimo kiuvetėje, kaip laiko funkcija. Šilumos pokytis yra apskaičiuojamasintegruojant galią pagal laiką (Velazquez-Campoy et al., 2004).

1.5.2. Eksperimento planavimas ir analizės metodai

Izoterminio titravimo kalorimetrą sudaro dvi monetos formos celės (mėginio ir paly-ginamoji) uždengtos terminiu skydu kaip parodyta paveikslėlyje 7. Palyginamoji kiuvetėyra užpildoma vandeniu ir palaikoma pastovioje temperatūroje. Grįžtamojo ryšio sistemamatuoja temperatūros skirtumą tarp mėginio ir palyginamosios kiuvečių. Šis temperatū-ros skirtumas palaikomas pastovus ir artimas nuliui. Darbinė celė ir švirkštas yra užpil-domi tirpalais, kurių sąveiką norima tirti. ITC eksperimento metu, ligando tirpalas yratitruojamas į baltymo tirpalą esantį darbinėje mėginio kiuvetėje. Vykstant injekcijoms irsusidarant baltymo-ligando kompleksui išsiskiria ar yra sugeriama šiluma. Po kiekvienosinjekcijos nusistovi pusiausvyra ir temperatūra yra grąžinama į pradinę eksperimentinętemperatūrą, todėl užrašytas signalas dažniausiai yra smailių pavidalo. Eksperimentasyra suplanuojamas taip, kad pusėje injekcijų vyktų jungimosi reakcija, o likusioje pusėjenebevyktų. Reakcijai nebevykstant stebimos nedidelės smailės, atsiradusios dėl maišymoir tirpalų prasiskiedimo. Integruodami plotą po kiekviena smaile nustatome išsiskyrusiąar sugertą reakcijos šilumą (Matulis, 2008).

Izoterminio titravimo kalorimetrijos metodu gauti duomenys apkroksimuojami nau-dojant vienos ir dviejų jungimosi vietų modelius (Manual, 2004; Matulis, 2008). Vienosjungimosi vietos modelyje stechiometrija yra 1:1.

Kb =[ML]

[M ][L](28)

Formulėje (28) [ML] yra baltymo ir ligando komplekso koncentracija, [M] yra baltymokoncentracija, [L] – ligando koncentracija. Mt ir Lt yra visos makromolekulės ir ligando

21


stechiometrija

mėginio celė

palyginamoji celė

kompiuteris

[ligandas]/[baltymas]

Q (

kcal

/mol

)dQ

/dt (

ucal

/s)

terminis skydas

7 pav. Kairėje parodyta izoterminio titravimo kalorimetro schema. Dešinėje – tipiškasITC eksperimentas. Viršutiniame grafike esančios smailės parodo tirpalo iš švirkšto injek-cijas į darbinę celę ir galios pokytį reikalingą palaikyti pastoviai temperatūrai. Šiame pa-vyzdyje vyksta endoterminė reakcija. Apatiniame grafike parodyti integruoti duomenys,iš kurių galime sužinoti pagrindinius termodinaminius parametrus: entalpiją, jungimo-si konstantą (Kb) ir stechiometriją. Paveikslėlis modifikuotas pagal (Velazquez-Campoyet al., 2004).

koncentracijos atitinkamai.

Mt = [M ] + [ML] (29)

Lt = [L] + [ML] (30)

Pertvarkę (28), (29) ir (30) lygtis gauname:

[ML]2 + [ML]

(−Mt − Lt −

1

Kb

)+MtLt = 0 (31)

Vienos jungimosi vietos modelyje šilumos kiekis Q yra lygus ligando-baltymo komp-lekso koncentracijos kitimo [ML], reakcijos molinės integralinės entalpijos ir kiuvetės tūrioV0 sandaugai:

Q = [ML]∆HV0 (32)

22


Diferencijuodami ir pertvarkydami gauname išraišką, aprašančią, kaip titravimo metukiekvienos injekcijos išsiskyręs ar sunaudotas šilumos kiekis priklauso nuo pridėto ligandokiekio, makromolekulės koncentracijos, reakcijos entalpijos ir kiuvetės tūrio:

Q = ∆HV0

1

2+

1− 0.5(

1 + 1KbMt

)− Lt

2Mt√(Lt

Mt

)2

− 2(

Lt

Mt

)(1− 1

KbMt

)+(

1 + 1KbMt

)2

(33)

Dviejų jungimosi vietų modelis šiek tiek sudėtingesnis ir plačiai aprašomas kalorimetronaudojimosi vadove (Manual, 2004).

Izoterminio titravimo kalorimetrijos metu gauti duomenys yra patikimi tik tuometkai c faktoriaus ribos yra nuo 5 iki 500 (Wiseman et al., 1989; Zubrienė et al., 2011). cfaktorius tai makromolekulės koncentracijos kiuvetėje ir jungimosi konstantos sandauga:

c = MtKb (34)

Praktikoje vykdant eksperimentus aukščiausia išmatuojama jungimosi konstanta Kb

yra 109 M−1. Paveikslėlyje 8 galima matyti, kad c faktoriui esant >5000 nebegalime tiks-liai nustatyti jungimosi konstantos. Antrame ir trečiame grafikuose integruotų duomenųkreivės būtų per daug statmenos bei labai panašios ir negalėtume tiksliai nustatyti Kb

(Leavitt and Freire, 2001). Tokiu atveju sąveikos stiprumui nustatyti tenka naudoti ki-tus metodus, pavyzdžiui fluorescencinį terminio poslinkio metodą, aprašytą ankstesniameskyriuje.

8 pav. Paveikslėlyje parodyti ITC duomenys kai jungimosi konstanta (Kb) didinama,taip didinant c faktoriaus reikšmę. Visi kiti parametrai palaikomi pastovūs ([M ] = 0,05mM, [L] = 0,6 mM). Paveikslėlis modifikuotas pagal (Leavitt and Freire, 2001).

1.5.3. Protonizacijos reiškiniai

Dauguma baltymo-slopiklio jungimosi reakcijų yra susijusios su protonizacijos ar depro-tonizacijos reiškiniais (Baker and Murphy, 1996). Atlikdami ITC ar FTSA eksperimentą

23


gauname suminę entalpiją ar jungimosi konstantą, kurie yra ne tik baltymo-ligando jun-gimosi parametrai. Stebimoji jungimosi entalpija ∆Hsteb yra tikrinės entalpijos ∆Hb,nepriklausančios nuo buferinio tirpalo, ir buferinio tirpalo jonizacijos entalpijos ∆Hprot

suma (Matulis, 2008; Velazquez-Campoy et al., 2004). ∆Hsteb aprašoma lygtimi:

∆Hsteb = ∆Hb + nH+∆Hprot (35)

Lygtyje (35) proporcingumo koeficientas nH+ yra protonų, apsikeitusių tarp buferiniotirpalo ir baltymo-ligando komplekso, skaičius (Leavitt and Freire, 2001; Parker et al.,1999).

Karboanhidrazių ir jų slopiklių sąveikos reakcijoje taip pat stebimi protonizacijos irdeprotonizacijos reiškiniai. Galima išskirti 5 reakcijas, vykstančias, kai sulfonamidinisslopiklis jungiasi su karboanhidraze:

1. protonų jungimasis prie buferinio tirpalo komponentų,

2. protonų atskilimas nuo buferinio tirpalo komponentų,

3. slopiklio sulfonamidinės grupės deprotonizacija,

4. CA aktyviajame centre prie Zn2+ koordinuoto OH– jono protonizacija,

5. tiesioginė deprotonizuoto ligando jungimosi su karboanhidraze reakcija, kai CA ak-tyviajame centre Zn2+ susijungęs su H2O molekule.

Stebimoji jungimosi entalpija ∆Hsteb yra šių 5 reakcijų entalpijų suma.

∆Hsteb = ∆Hb + nsulf∆HRSO2NH2 + nCA∆HCAZnH2O + nbuf∆Hbuf (36)

36 lygtyje, ∆Hb – tikrinė entalpija, ∆HRSO2NH2 – ligando sulfonamidinės grupės pro-tonizacijos entalpija, ∆HCAZnH2O – su CA aktyviajame centre esančiu cinko jonu susijun-gusio hidroksido jono protonizacijos entalpija, ∆Hbuf – buferinio tirpalo protonizacijosentalpija. Atitinkamai n yra sulfonamido grupės, CAZnH2O ir buferinio tirpalo suriša-mų/išskiriamų protonų skaičius.

Karboanhidrazės aktyviajame centre prie cinko prisijungusi vandens molekulė privalobūti protonizuotos formos, o slopiklis jungiasi su karboanhidraze tik būdamas deprotoni-zuotas. Šių formų frakcijos tirpale priklauso nuo buferinio tirpalo pH ir molekulių pKa

(Baranauskienė and Matulis, 2012) ir yra išreiškiamos kaip funkcijos nuo pH :

fRSO2NH− =10pH−pKa−sulf

1 + 10pH−pKa−sulf(37)

fCAZnH2O = 1− 10pH−pKa−CA−Zn−H2O

1 + 10pH−pKa−CA−Zn−H2O(38)

24


Žinodami eksperimentiškai išmatuotą jungimosi konstantąKb_steb bei kokios molekuliųfrakcijos dalyvauja jungimosi reakcijoje galime apskaičiuoti tikrinę jungimosi konstantą:

Kb_tikr =Kb_steb

(fRSO2NH−fCAZnH2O)(39)

Norėdami įvertinti baltymo-slopiklio jungimosi parametrus nepriklausomus nuo pro-tonizacijos reiškinių, turime žinoti buferinio tirpalo, baltymo bei slopiklio jonizacijos en-talpiją bei pKa. Buferinių tirpalų parametrus galima rasti žinynuose. Cheminių junginiųparametrai nustatomi atlikus titravimo rūgštimi eksperimentus, o karboanhidrazių – at-likus jų jungimosi su gerai charakterizuotu slopikliu izoterminio titravimo kalorimetrijoseksperimentus skirtingų pH ir skirtingos sudėties buferiniuose tirpaluose.

Tik nepriklausantys nuo protonizacijos reiškinių termodinaminiai parametrai gali būtinaudojami sąryšiui su baltymo-ligando komplekso struktūra nustatyti. Tuomet galimesužinoti vienos susidariusios cheminės jungties energetinį indėlį į baltymo-ligando komp-lekso formavimosi energiją. Nors šiandien dauguma publikacijų nagrinėja tik išmatuotusstebimuosius parametrus, vis labiau suprantama tikrinių parametrų svarba farmaciniamsir fundamentaliems tyrimams.

25

Miglė Kišonaitė Medžiagos ir metodai

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Medžiagos

1. HCl (gamintojas „Fluka“)

2. Na2HPO4 (gamintojas „Fluka“)

3. NaH2PO4 (gamintojas „Fluka“).

4. Na3PO4 (gamintojas „Sigma-Aldrich“).

5. DMSO (gamintojas „Roth“).

6. ANS (gamintojas „Sigma-Aldrich“).

7. NaOH (gamintojas „Sigma-Aldrich“).

8. HNO3 (gamintojas „Sigma-Aldrich“).

9. Benzensulfonamidiniai junginiai susintetinti Vilniaus Universitete, Biotechnologijosinstitute. Junginių sintezė aprašyta publikacijoje (Capkauskaitė et al., 2012, 2013).

10. Rekombinantinės žmogaus karboanhidrazės CA I (Baranauskienė et al., 2010), CAII (Cimmperman et al., 2008), CA VII (Sūdžius et al., 2010), CA XII (Jogaitė et al.,2013) ir CA XIII (Sūdžius et al., 2010) gautos ir grynintos Vilniaus Universitete,Biotechnologijos institute pagal publikacijose nurodytą metodiką.

2.2. Fluorescencinis terminio poslinkio metodas

Fluorescenciniu terminio poslinkio metodu (FTSA) buvo tirta baltymo ir ligando są-veika. Eksperimentai atlikti naudojant detekcijos sistemą „Rotor – Gene 6000” (Qiagen).Matavimo eigoje temperatūra buvo keliama nuo 30 ◦C iki 99 ◦C, 1 ◦C per minutę greičiu.Sužadinimo bangos ilgis – 365 nm, o emisijos – 460 nm.

Eksperimentui atlikti reikalingi atskirai paruošti baltymo ir ligando tirpalai. Pirmiau-sia, yra ruošiami skirtingų koncentracijų ligando tirpalai. Sintetinio junginio milteliai yraištirpinami DMSO, taip, kad junginio koncentracija būtų 10 mM. FTSA eksperimentuiserijiniu dukartiniu skiedimu paruošiami įvairių koncentracijų ligando DMSO tirpalai. Šietirpalai vėliau skiedžiami 25 kartus 50 mM fosfato buferiniu tirpalu (pH 7), kuriame yra100 mM NaCl. Galiausiai gaunami tokių koncentracijų tirpalai: 400, 200, 100, 50, 25, 13,6, 0 µM.

Paruošiamas 10 µM koncentracijos baltymo tirpalas, pradinį baltymo tirpalą skiedžianttuo pačiu 50 mM fosfato buferiniu tirpalu, kuris naudotas ir ligando tirpalų ruošime. Įbaltymo tirpalą pridedama 100 µM fluorescuojančio dažo 1,8-anilino naftaleno sulfonato

26


(ANS). 10 µM koncentracijos baltymo tirpalas ir skirtingų koncentracijų ligando tirpalailygiu santykiu yra supilami į mėgintuvėlius. Galutinė baltymo tirpalo koncentracija mė-ginyje yra 5 µM, o ligando koncentracijos 200, 100, 50, 25, 13, 6, 3, 0 µM. Vienu metugalima pamatuoti 36 arba 72 mėginius.

FTSA metodu taip pat nustatyta CA I sąveikos su komerciniu slopikliu EZA jungimosigiminingumo priklausomybė nuo pH. Matavimai atlikti fosfatiniame buferiniame tirpalekeičiant pH vertes nuo 5 iki 10.

Eksperimentiškai gautos fluorescencijos priklausomybės nuo temperatūros kreivės ma-žiausių kvadratų metodu derinamos pagal (13) lygtį ir taip gaunamos baltymo lydymositemperatūros – Tm. Grafike atidėjus lydymosi temperatūros priklausomybę nuo pridėtoligando koncentracijos, modeliuojant kreivę pagal (27) lygtį, nustatoma baltymo-ligandojungimosi konstanta.

Fluorescenciniu terminio poslinkio metodu gauti duomenys apdoroti naudojant Ther-moFluor++ 1.4.2 ir Microsoft Office Excel 2010 programinę įrangą.

Šio metodo tikslumas buvo parodytas „RSC Biomolecular Sciences” knygoje, atlikusvienos baltymo-slopiklio poros statistinę analizę (Cimmperman and Matulis, 2011). 9paveikslėlyje parodytas 50 baltymo be ligando lydymosi tempertūrų ir 50 baltymo esantligandui Tm pasiskirstymas. Duomenų standartinis nuokrypis su 95 % pasikliovimo lyg-meniu yra mažesnis nei 1 ◦C .

9 pav. Tm pasiskirstymas. Pilka spalva pažymėtas baltymo be ligando Tm pasiskirs-tymas, o juoda spalva – baltymo Tm pasiskirstymas esant ligandui. Modifikuota pagal(Cimmperman and Matulis, 2011).

27


2.3. Izoterminio titravimo kalorimetrija

Izoterminio titravimo kalorimetrijos (ITC) eksperimentai atlikti naudojant „VP-ITC“kalorimetrą (gamintojas „Microcal, Inc.“). Šio instrumento matavimo kiuvetės tūris yra1,4 ml, o švirkšto – 0,3 ml.

2.3.1. Baltymų-ligandų sąveikos matavimas

Baltymų-ligandų sąveikos tyrimo eksperimentuose kalorimetro matavimo kiuvetė yraužpildoma baltymo tirpalu, o švirkštas – ligando tirpalu. ITC matavimui atskirai ruošia-mas baltymo tirpalas, kurio koncentracija 6 – 15 µM ir ligando tirpalas, kurio koncent-racija yra 60 – 150 µM. Tirpalai ruošiami 50 mM fosfatiniame buferiniame tirpale (pH7), kuriame yra 100 mM NaCl, bei vienoda DMSO koncentracija (∼ 1 %). Prieš ma-tavimą atliekama karboanhidrazių dializė reakcijos buferiniame tirpale. Eksperimentasatliekamas 37 ◦C temperatūroje, injekuojant 25 ligando tirpalo injekcijas į kiuvetėje esan-tį baltymo tirpalą. Tarpai tarp injekcijų yra 3 minutės, o maišymo greitis – 260 aps./min.Matavimai pakartoti 2 – 3 kartus.

Gauti eksperimentiniai duomenys apdoroti naudojant „MicroCal Origin 5.0“ progra-mos ITC modulį. Tiriamos reakcijos entalpija (∆H), jungimosi konstanta (Kb) ir ste-chiometrija nustatomos prie išmatuotų duomenų derinant vienos jungimosi vietos modelį(32). Stechiometrijos nustatymo paklaida yra ∼ 5 %, o ∆H ir Kb – ∼ 10 % (Tellinghuisen,2003).

2.3.2. Ligandų protonizacijos entalpijos nustatymas

Matuojant ligando protonizacijos entalpiją, matavimo kiuvetė yra užpildoma deproto-nizuoto junginio tirpalu, gaunamu pridedant 1,5 ekvivalento NaOH, o švirkštas – rūgštiestirpalu. Paruošiamas pradinis 50 mM koncentracijos ligando tirpalas DMSO. Matavimuiruošiama 0,25 mM ligando tirpalas, pradinį 50 mM tirpalą skiedžiant virintu vandeniu(H2O virinamas prieš kiekvieną eksperimentą 10 min, kad pašalinti ištirpusį CO2) ir pride-dama 0,375 mM NaOH. Rūgšties HNO3 tirpalas yra gaminamas 2,5 mM koncentracijos,naudojant virintą vandenį bei pridedama DMSO. Abiejuose tirpaluose DMSO kiekis turibūti vienodas (0,5 %). Eksperimentas atliekamas 37 ◦C temperatūroje, injekuojant 58rūgšties tirpalo injekcijas į kiuvetėje esantį ligando tirpalą. Tarpai tarp injekcijų yra 3minutės, o maišymo greitis – 260 aps./min. Matavimai pakartoti 3 – 4 kartus.

Gauti eksperimentiniai duomenys apdoroti naudojant tą patį „MicroCal Origin 5.0“programos ITC modulį kaip ir baltymų-ligandų sąveikos matavimuose. Slopiklio pro-tonizacijos entalpija nustatyta prie išmatuotų duomenų derinant dviejų jungimosi vietųmodelį, kuris aprašytas (Manual, 2004).

28


2.4. Ligandų pKa nustatymas

Ligandų sulfonamidinės grupės pKa vertės buvo suskaičiuotos naudojant kompiuterinęprogramą Marvin Sketch bei išmatuotos eksperimentiškai. Naudojant spektrofotometrą„Agilent 89090A“ buvo matuojama ligando šviesos sugertis skirtinguose pH (nuo 6 iki 12,kas 0,5 pH vieneto). Matavimui buvo paruošti skirtingų pH fosfatiniai buferiniai tirpalai,kuriuose ligando koncentracija 25 µM. Eksperimentas atliekamas 25 ◦C temperatūroje.Užrašomas ligando šviesos sugerties spektras 200 – 600 nm bangos ilgiuose, iš spektrųrandamas izobestinis taškas. Tuomet apskaičiuojamas sugerties ties 267 ir 247 nm santykis(10 nm į abi puses nuo izobestinio taško). Tiriant šio santykio priklausomybę nuo pHgaunama sigmoidinė kreivė, kurios vidurio taškas parodo junginio pKa reikšmę.

29

Miglė Kišonaitė Rezultatai ir jų aptarimas

3. Rezultatai ir jų aptarimas

Darbo metu ITC ir FTSA metodais buvo ištirta 16 benzensulfonamidinių (BSA) jun-ginių, turinčių pirimidino grupę (10 pav.), sąveika su karboanhidrazėmis. Stebimieji jun-gimosi duomenys yra publikuoti tarptautiniame moksliniame leidinyje Bioorganic & Me-dicinal Chemistry (žiūrėti prieduose). Junginius susintetino Vilniaus Universiteto, Bio-technologijos institute Dr. Edita Čapkauskaitė. Juos galima suskirstyti į 4 grupes: t.y.sulfonamidinės grupės atžvilgiu orto- padėtyje chlorą bei pakaitą meta- padėtyje turin-čius BSA (1a-d), tik pakaitą meta- padėtyje turinčius BSA (2a-d), para- padėtyje pakaitąturinčius (3a-d) ir orto- padėtyje chlorą bei para- padėtyje pakaitą turinčius junginius(4a-d). Taip pat, junginius galima skirstyti pagal pakaitus prijungtus prie pirimidino gru-pės: t.y. dimetilpirimidino grupę turintys (1-4a), 4-metil-6-okso-pirimidino grupę turintys(1-4c) ir 4-tret-butil-6-okso-pirimidino grupę turintys benzensulfonamidai (1-4d).

O

S

SO O

NH2

N

N

Cl

O

S

SO O

NH2

N

N O

SNH

2

S

O

O N

N

O

SNH

2

S

ClO

O N

N

1a 2a 3a 4a

O

S

SO O

NH2

ClN

N

O

S

SO O

NH2

N

N O

SNH

2

S

O

O N

N

O

SNH

2

S

ClO

O N

N

1b 2b 3b 4b

O

S

SO O

NH2

N

NH O

Cl

O

S

SO O

NH2

N

NH O O

SNH

2

S

O

O N

NH

OO

SNH

2

S

ClO

O N

NH O

1c 2c 3c 4c

O

S

SO O

NH2

N

NH O

Cl

O

S

SO O

NH2

N

NH O O

SNH

2

S

O

O N

NH

OO

SNH

2

S

ClO

O N

NH O

1d 2d 3d 4d

10 pav. Darbe tirtų pirimidino grupę turinčių benzensulfonamidų cheminės struktūros.

3.1. Stebimieji termodinaminiai parametrai

Sintetinių junginių sąveika fluorescenciniu terminio poslinkio ir izoterminio titravimokalorimetrijos metodais buvo matuota su keturiomis citozolinėmis karboanhidrazių izo-

30


formomis CA I, II, VII ir XIII bei palyginimui su viena membranine izoforma CA XII.Šiais metodais išmatuoti karboanhidrazės-slopikio stebimieji (angl. observed) termodi-naminiai parametrai. Stebimieji parametrai priklauso nuo eksperimento atlikimo sąlygų:temperatūros, buferinio tirpalo sudėties ir pH. Kaip jau minėta 1.5.3 skyriuje, stebimiejiparametrai apima visas sumines reakcijas vykstančias tuo pačiu metu kaip ir baltymo-slopiklio sąveika. Karboanhidrazių ir benzensulfonamidų jungimosi eksperimentai atliktisąlygose, artimose fiziologinėms (pH = 7, 37 ◦C), taigi manoma, jog ir žmogaus organizmeturėtų vykti panaši baltymo-slopiklio sąveika.

Pirmiausia stebimieji termodinaminiai parametrai nustatyti izoterminio titravimo ka-lorimetrijos metodu. Paveiksle 11 pateikti CA II jungimosi su 2b ir 4b slopikliais duome-nys. Viršutiniai grafikai rodo pirminius duomenis. Apatiniuose grafikuose taškai atitin-ka integruotus smailių plotus ir yra aproksimuoti pagal vienos jungimosi vietos modelį.Pagal integruotos kreivės polinkio kampą nustatytos jungimosi konstantos: 4b junginioKb = 2,6× 107 M−1, 2b – Kb = 1,4× 106 M−1. Iš 11 paveikslo matyti, kad chloro įvedi-mas ir pakaito padėties sulfonamidinės grupės atžvilgiu pakeitimas iš meta- į para- padėtįpadidina jungimosi konstantą Kb ∼ 19 kartų. Iš eksperimentų taip pat buvo nustatytosstebimosios entalpijos (∆H) bei stechiometrija (N ).

Laikas, min

Gal

ia, µ

cal/s

Molinis santykis

H, k

cal/m

olΔ

Laikas, min

Molinis santykis

Gal

ia, µ

cal/s

H, k

cal/m

olΔ

N = 0,85Kb = 2,6E7ΔH = -9,1

N = 0,66Kb = 1,4E6ΔH = -7,2

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

-6

-4

-2

0

-0,1

0,0

0 20 40 60 80 100

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

-0,1

0,0

0 20 40 60 80 100

11 pav. CAII sąveikos su 2b ir 4b junginiais duomenys gauti izoterminio titravimo kalo-rimetrijos metodu.

31


Ypatingai stipriai besijungiančių slopiklių Kb siekia 109 M−1 (CA I jungimosi su 3dir 4d atvejis). Tokios stiprios sąveikos ITC metodu tiksliai išmatuoti negalime, dėl cfaktoriaus, kuris baltymo koncentracijai esant 5 – 10 µM, siekia 5000 – 10000 (c faktoriausribos plačiau aprašytos 1.5.2 skyriuje). Silpnos sąveikos atveju, kuomet Kb < 106 M−1,reikia naudoti didesnes baltymo ir ligando koncentracijas, kad c faktorius būtų > 5. CAXII ir 4d sąveikos išmatuoti nepavyko, nes 100 µM koncentracijos tirpale 4d yra mažaitirpus ir iškrito į nuosėdas. Labai stiprios ir silpnos baltymo-slopiklio sąveikos atvejupatikimesni rezultatai gauti fluorescenciniu terminio poslinkio metodu.

12 paveiksle esantys FTSA grafikai rodo CA I ir CA XIII jungimąsi su sulfonamidinėsgrupės atžvilgiu para- ir meta- padėtyse tą patį pakaitą turinčiais junginiais (1a ir 4a).Sulfonamidinės grupės padėtis benzeno žiede daro didelę įtaką junginio sąveikos su CAizoformomis stiprumui. 1a ir 4a skiriasi tik pakaito padėtimi, tačiau 4a (para- padėtyjepakaitą turintis slopiklis) su CA I jungiasi apie 200 kartų stipriau, o su CA XIII apie 34kartus stipriau nei 1a (meta- padėtyje pakaitą turintis junginys).

Prieduose esančioje 4 lentelėje pateiktos ITC ir FTSA metodais nustatytos Kd reikš-mės penkioms CA izoformoms (išreikštos nM) ir laisvosios Gibso energijos, entalpijos beientropijos reikšmės.

Iš stebimųjų parametrų nustatyta, kad su transmembranine CA XII izoforma visi tirtislopikliai jungiasi silpniau nei su citozolinėmis CA izoformomis. Nustatyta, jog sulfona-midinės grupės atžvilgiu para- padėtyje pakaitą turintys junginiai su visomis karboan-hidrazėmis jungiasi stipriau nei meta- padėtyje turintys pakaitą. Junginiai pirimidinožiede turintys tret-butilo grupę (1-4d) stipriausiai jungiasi su CA (tiek para-, tiek meta-padėtyse turintys pakaitus), o junginys 4d atrankus CA I.

ITC ir FTSA metodais eksperimentiškai nustatyti jungimosi parametrai gerai kore-liuoja tarpusavyje. 13 pav. pavaizduoti visų tirtų slopiklių ∆G duomenys, gauti FTSA(x ašis) ir ITC (y ašis) metodais. Koreliaciją parodo taškų determinacijos koeficientasR2 = 0,72.

3.2. Tikriniai termodinaminiai parametrai

Tikriniai termodinaminiai parametrai nepriklauso nuo eksperimento sąlygų – buferiniotirpalo pH ir sudėties. Slopikio sąveikos su CA metu visuomet vyksta susijusios reakcijos:baltymo, slopiklio ir buferio protonizacija/deprotonizacija, kurios plačiau aprašytos 1.5.3skyriuje. Tikrinių parametrų apskaičiavimui reikia žinoti baltymo ir ligando jonizacijosentalpiją bei pKa.

3.2.1. Ligandų pKa ir protonizacijos entalpija

Slopiklių pKa reikšmės buvo apskaičiuotos naudojant kompiuterinę programą Mar-vin Sketch. Junginių grupėms 1a-d ir 4a-d, turinčioms prijungtą chlorą, apskaičiuotos

32


Flu

ores

cenc

ijosA

inte

nsyv

uma

s,As

.v.

A200uMA133uMA59uMA26uMA12uMA0

Flu

ores

cenc

ijosA

inte

nsyv

uma

s,As

.v.

Flu

ores

cenc

ijosA

inte

nsyv

uma

s,As

.v.

Temperatūra,°C

CAAI1a

CAAI4a

0

4a

1a

CAAI

CAAXIII1a

CAAXIII4a

CAAXIII

0

4a

1a

Lt,AM 10AAAA-A5 10AAAA-4 10AAAA-3

55

60

65

70

75

Tm, °C

Lt,AM 10AAAA-A5 10AAAA-4 10AAAA-3

55

60

65

70

75

Tm, °C

Temperatūra,°C

Flu

ores

cenc

ijosA

inte

nsyv

uma

s,As

.v.

A200uMA133uMA40uMAA12uMA0

A200uMA133uMA59uMA26uMA12uMA0

Temperatūra,°C Temperatūra,°C

A200uMA133uMA40uMAA12uMA0

50 60 70 8010

20

30

40

50

60

70

80

50 60 70 8010

20

30

40

50

60

70

80

50 60 70 8010

20

30

40

50

60

70

80

50 60 70 8010

20

30

40

50

60

70

80

12 pav. Junginių 1a ir 4a sąveika su CA I (grafikai kairėje) ir CA XIII (dešinėje). Duviršutiniai grafikai rodo pradinius duomenis, kai slopiklio koncentracija kinta nuo 0 iki200 µM. Apačioje parodyti integruoti duomenys, atspindintys baltymo–ligando sąveikosstiprumą.

33


ΔG

_IT

C, k

J/m

ol

ΔG_FTSA, kJ/mol-60 -55 -50 -45 -40 -35 -30 -25

-60

-55

-50

-45

-40

-35

-30

-25

CAI CAII CAVII CAXII CAXIII

13 pav. Tirtų slopiklių jungimosi su karboanhidrazėmis ∆G, išmatuotų FTSA ir ITCmetodais, palyginimas. Raudona linija – tai eksperimentinių taškų tendencijos linija,kurios R2 = 0,72, o punktyrinė – 1:1 modelis. Tarp horizontalių punktyrinių linijų ITCduomenys yra patikimi, t.y. 5 < c < 500.

pKa vertės yra ∼8,7, o 2a-d ir 3a-d, neturinčioms prijungto chloro – ∼9,7. Tačiau kom-piuterinių metodų paklaidos gali būti iki 1 pH vieneto, todėl junginių pKa įvertintoseksperimentiškai.

Slopiklių sulfonamidinės grupės pKa vertės taip pat buvo išmatuotos spektrofotomet-riniu būdu, matuojant junginių sugertį skirtinguose pH. 14 paveiksle pateikta dviejų jun-ginių absorbcijų ties 267 ir 247 nm santykio priklausomybė nuo pH. Gauta sigmoidinėkreivė, kurios vidurio taškas parodo junginio pKa vertę. Buvo išmatuota junginių 1-4bpKa ir nustatyta, kad junginių 1b ir 4b, turinčių prijungtą chlorą, pKa vertės yra 8,9±0,2,o 2b ir 3b, neturinčių prijungto chloro – 9,4 ± 0,2. Funkcinės grupės (okso, metilo, tret-butilo) pirimidino žiede bei pakaito padėtis (para-, meta-) sulfonamidinės grupės atžvilgiupraktiškai neturi įtakos junginių pKa, taigi junginių grupių 1a-d ir 4a-d pKa yra 8,9±0,2,o 2a-d ir 3a-d, – 9,4 ± 0,2. Tolimesniuose tikrinių parametrų skaičiavimuose naudotosišmatuotos pKa vertės, kurių paklaida mažesnė.

Slopiklių protonizacijos entalpijos ∆Hprot buvo išmatuotos atliekant izoterminio titra-vimo kalorimetrijos eksperimentą – deprotonizuotą junginio tirpalą, gaunamą pridedant1,5 ekvivalento NaOH, titruojant rūgšties tirpalu. ∆Hprot buvo nustatytos 1-4b junginiųgrupei. Titravimo rūgštimi kreivės pateiktos 15 paveiksle. Pirmasis perėjimas kreivėjerodo natrio šarmo pertekliaus titravimą, o antrasis – junginio titravimą. Nedidelis kal-nelis eksperimento pabaigoje prie junginio perėjimo matyt atsiranda dėl CO2 išsiskyrimo

34


pKa= 9,4 ± 0,2

O

SNH2

S

O

O N

N

6 7 8 9 10 11 12pH

A(267nm)/A(247nm) 1

0

0,5

pKa= 8,9 ± 0,2

O

SNH2

S

ClO

O N

N4b 3b

240 250 260 270 280 2900,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ab

sorb

cija

Bangos.ilgis,.nm

.pH.7.0.

.pH.7.5

.pH.8.0

.pH.8.5

.pH.9.0

.pH.9.5

.pH.10.0

.pH.10.5

.pH.11.0

.pH.11.5

.pH.12.0

247 267

14 pav. Chlorinto junginio 4b ir nechlorinto junginio 3b šviesos sugerties ties 267 ir 247nm santykio priklausomybės nuo pH grafikai. Viršuje įterptas grafikas rodo 3b junginioskirtingų pH tirpalų sugertį.

Laikas,4min

Gal

ia,4µ

cal/s

Molinis4santykis

Gal

ia,4µ

cal/s

Molinis4santykis

4ΔH

,4kca

l/mol

ΔH = -5,8 ± 0,3 kcal/mol ΔH = -7,1 ± 0,3 kcal/mol

O

S

SO O

NH2

N

N

2b 1b

O

S

SO O

NH2

ClN

N

4ΔH

,4kca

l/mol

Laikas,4min

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

-8

-6

-4

-2

0

-2

-1

0

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5-10

-8

-6

-4

-2

0

-2

-1

0

0 50 100 150 200 250 300 0 50 100 150 200 250 300

15 pav. Chlorinto junginio 1b ir nechlorinto junginio 2b titravimo rūgštimi ITC duomenys.Viršutiniuose paveikslėliuose pavaizduoti pirminiai duomenys, o apatiniuose – integruotiduomenys.

35


(NaOH tirpale gali būti ištirpusių karbonatų, kuriuos titruojant rūgštimi, skiriasi CO2).Nustatyta, kad chlorą turinčių junginių protonizacijos entalpija yra −5,8 ± 0,3 kcal/mol(tikrinių parametrų skaičiavimui naudota −24,3 kJ/mol), o junginių be chloro protoniza-cijos entalpija yra −7,1 ± 0,3 kcal/mol (tikrinių parametrų skaičiavimui naudota −29,7

kJ/mol). ∆Hprot nepriklauso nuo pakaito padėties ar prie pirimidino žiedo prijungtųcheminių grupių. 2 lentelėje pateiktos junginių 1-4b pKa ir ∆Hprot vertės.

2 lentelė. Slopiklių pKa ir protonizacijos entalpijos (∆Hprot) vertės.Junginys pKa (apskaičiuota) pKa (išmatuota) ∆Hprot, kJ/mol1b 8,7 8,9 -24,32b 9,7 9,4 -29,73b 9,7 9,4 -29,74b 8,7 8,9 -24,3

3.2.2. Karboanhidrazės aktyviajame centre esančios H2O molekulės pKa irprotonizacijos entalpija

Norint nustatyti prie karboanhidrazės baltymo aktyviojo centro Zn2+ koordinuotosH2O molekulės pKa ir ∆Hprot vertes, reikia atlikti ITC matavimus dviejuose skirtinguosebuferiniuose tirpaluose, plačiose pH ribose. Tipiniai duomenys pateikti 16 paveikslėly-je. Komercinio slopiklio EZA ir CA I sąveika tirta Tris ir Pi buferiniuose tirpaluose irstebėta ∆H. FTSA metodu atliekant eksperimentus plačiose pH ribose nustatyta ∆G

priklausomybė nuo pH.

CA I - EZA

tikrinė

Pi

Tris

pH

ΔbH

ste

b, k

J/m

ol

ΔbG

ste

b, k

J/m

ol

pH

tikrinė

CA I - EZA -20

-30

-40

-50

-60

-70

-80

-906 7 8 9 5 6 7 8 9 10

-30

-35

-40

-45

-50

-55

16 pav. Grafike kairėje pateikta CA I ir EZA sąveikos ∆H priklausomybė nuo buferi-nio tirpalo sudėties ir pH. Duomenys iš (Morkūnaitė et al., 2014) šaltinio. Pi žymimasnatrio fosfato buferinis tirpalas, Tris – 2-amino-2-hidroksimetil-1,3-propandiolio buferinistirpalas. Grafike dešinėje pateikta CA I ir EZA sąveikos ∆G priklausomybė nuo pH.

Gautiems duomenims taikant 37, 38, 39 bei 36 lygtis, apskaičiuojamos pKa ir ∆Hprot

vertės. Visų tirtų CA izoformų pKa ir ∆Hprot vertės pateiktos 3 lentelėje.

36


3 lentelė. Karboanhidrazės aktyviajame centre esančios H2O molekulės pKa ir protoniza-cijos entalpijos (∆Hprot) vertės 37 ◦C temperatūroje.CA pKa ∆Hprot, kJ/molCAI-Zn-H2O 8,1a -38,5aCAII-Zn-H2O 6,9a -23,5aCAVII-Zn-H2O 6,8b -30,5bCAXII-Zn-H2O 6,8c -25,5cCAXIII-Zn-H2O 8,0d -41,5

a Duomenys iš (Morkūnaitė et al., 2014) šaltinio.b Duomenys iš (Kazlauskas et al., 2012) šaltinio.c Duomenys iš (Jogaitė et al., 2013) šaltinio.d Duomenys iš (Baranauskienė and Matulis, 2012) šaltinio.Kiti duomenys – nepublikuoti laboratorijos duomenys.

3.3. Tikrinių termodinaminių parametrų skaičiavimas

Skaičiuodami tikrinius termodinaminius jungimosi parametrus turime atmesti susiju-sias reakcijas ir įvertinti tik tiesioginę deprotonizuoto sulfonamido jungimosi su karbo-anhidraze reakciją. Susijusios reakcijos, kurias stebime vykstant CA-slopiklio sąveikaiyra buferio protonizacija/deprotonizacija, ligando sulfonamidinės grupės deprotonizacijair CA aktyviajame centre prie Zn2+ koordinuoto hidroksido jono protonizacija.

17 paveikslėlyje pateikiama detali CA I jungimosi su 3b slopikliu tikrinių paramet-rų skaičiavimo schema. CA I pKa = 8,1 ir ∆Hprot = −38,5 kJ/mol. 3b junginiopKa = 9,4 ir ∆Hprot = −29,7 kJ/mol. Fosfatinio buferinio tirpalo ∆Hprot = −2,876

kJ/mol. Deprotonizuoto sulfonamido ir protonizuotos CA frakcijos išreiškiamos 37 ir38 lygtimis. fRSO2NH− = 0,004, o fCAZnH2O = 0,926. nsulf = 1 − fRSO2NH− = 0,996,nCA = 1 − fCAZnH2O = 0,074 ir nbuf = nsulf + nCA. nsulf – tai protonų skaičius, išlaisvi-namų deprotonizuojant slopiklio sulfonamidinę grupę, nCA – prie Zn2+ koordinuotų OH–

jonų skaičius, protonizuojamų reakcijos metu, o nbuf – reakcijos metu buferinio tirpaloišlaisvinamų/paimamų protonų skaičius.

Tuomet iš 36 lygties deprotonizuoto sulfonamido jungimosi su karboanhidraze tikrinėentalpija ∆Hb = ∆Hsteb − nsulf∆HRSO2NH2 − nCA∆HCAZnH2O − nbuf∆Hbuf = −27,9 −(0,996× (29,7))− (0,074× (−38,5))− ((0,996 + 0,074)× (−2,876)) = −51,98 kJ/mol.

3.4. Struktūros – tikrinių parametrų sąryšis

18 paveiksle pateikti 16 benzensulfonamidų jungimosi su CA I (žydri kvadratai), CA II(žali kvadratai), CA VII (rausvi kvadratai), CA XII (pilki kvadratai) ir CA XIII (geltonikvadratai) tikriniai termodinaminiai parametrai: ∆G, ∆H ir T∆S (kJ/mol). Šių para-metrų pavadinimuose žodis „pokytis” praleidžiamas teksto sutrumpinimo ir skaitomumopagerinimo tikslais. Karboanhidrazės izoformos yra išdėliotos pagal jų aktyviojo centro

37


N SS

OO

O

NN

HCA-- --Zn

NH2 SS

OO

O

NN

HN SS

OO

O

NN

H+

H2PO4- HPO4

2-

nsulf=10.996

-2.8761kJ/mol1x10.996=1-2.86511kJ/mol1

pKa1=19.4 29.71kJ/mol1x10.996=129.581kJ/mol1

CA-- --OH-Zn CA-- --H2OZn

H+

H2PO4- HPO4

2-

nCA=10.074

-38.51kJ/mol1x1°0.074)=1-2.8491kJ/mol1pKa1=18.1

2.8761kJ/mol1x1°0.074)=10.211kJ/mol11

H2O

∆bHtikrinė = -51.98 kJ/mol

∆bHstebimoji1=1-27.91kJ/mol

pH17.0,1371°C1

17 pav. CA I sąveikos su 3b junginiu tikrinių parametrų skaičiavimo schema.

panašumą: t.y. CA I aktyviojo centro aminorūgštys labiausiai sutampa su CA XIII, CAXIII su CA I ir CA II ir t.t., atitinkamai pagal išdėstymą paveiksle. Šalia rodyklių pateikti∆∆G, ∆∆H ir T∆∆S skirtumai tarp kaimyninių ligandų, parodantys chloro bei pakaitobenzensulfonamidinės grupės atžvilgiu esančio meta- ir para- padėtyse indėlį termodi-naminiams parametrams (horizontalios rodyklės) arba funkcinių grupių pirimidino žiedeindėlį jungimosi parametrams (vertikalios rodyklės). Neigiama ∆∆G reikšmė rodo, joggiminingumas po struktūros modifikacijos padidėjo. Jungimosi konstantos padidėjimas10 kartų atitinka Gibso energijos pokytį ∆∆G = −5,94 kJ/mol.

Nagrinėjant CA I jungimąsi su slopikliais matyti, kad ∆G tampa neigiamesnė šių jun-ginių grupių kryptimi: 1 → 2 → 3 → 4. Nors 3 → 4 kryptimi jungimosi giminingumaskeičiasi nestipriai (∆∆Gvid = −1,0 kJ/mol), tačiau ∆∆H ir ∆∆S indėliai pasikeičia daugsmarkiau. 3 slopiklių grupės jungimosi su CA I varomoji jėga yra entalpija, o įvedus chlo-ro atomą (4 slopiklių grupė) entalpijos indėlis sumažėja 8,8 kJ/mol, o entropijos indėlispadidėja 9,8 kJ/mol. Junginių struktūroms pasikeičiant 2→ 1 kryptimi (įvedamas chloroatomas) jungimosi giminingumas sumažėja 3,9 kJ/mol, dėl didesnio nepalankios entalpi-jos indėlio ( ∆∆Hvid = 14,7 kJ/mol), kuris dalinai kompensuojamas palankios entropijos(T∆∆Svid = 10,8 kJ/mol). Chloro įvedimas sulfonamidinės grupės atžvilgiu ir para-, irmeta- padėtyje pakaitą turintiems junginiams lemia, jog entropija tampa labiau palankinei junginiuose be chloro. Tai paaiškinama tuo, kad chloras yra hidrofobiškas. Hidro-fobinė baltymo-ligando sąveika daugeliu atvejų yra entropinės prigimties, nes baltymoaktyviajame centre fiksuotos H2O molekulės yra išstumiamos į supantį H2O (angl. bulkwater), tokiu būdu padidėja sistemos laisvės laipsnių skaičius. Junginiui pasikeičiant 2→ 3 kryptimi (pasikeičia pakaito padėtis sulfonamidinės grupės atžvilgiu) giminingumaspadidėja (∆∆Gvid = −7 kJ/mol). a, b, c junginiams šį palankų Gibso energijos pokytįlemia palankesnė entropija ( T∆∆S = 7,3÷ 10,3 kJ/mol, ∆∆H = 1÷ 3,8 kJ/mol).

38

O

SNH2

S

ClO

O N

N

O

S

SO O

NH2

ClN

N1b

0.7 ± 2.4-1.8 ± 7.1-2.5 ± 9.4

-2.0 ± 0.5-1.7 ± 1.20.3 ± 1.4

0.0 ± 2.29.2 ± 3.19.2 ± 1.9

-46.1-51.1-5.0

-57.9-51.66.3

-56.0-59.1-3.1

-50.2-29.520.7

-50.2-39.310.9

-50.3-33.017.3

-56.4-54.81.7

-56.1-57.1-1.0

1.1 ± 1.96.5 ± 12.55.4 ± 14.3

CA 2

CA 7

CA 13CA 1

-46.9-20.226.7

-58.7-23.635.1

-56.8-67.3-10.5

-51.8-27.824.0

4.97.6 2.7

-9.9-47.1-37.2

-1.943.745.6

-52.7-37.814.9

-59.8-41.118.7

-59.9-48.411.5

-53.5-23.729.8

0.8-14.1-14.9

-7.2-10.6-3.4

0.17.37.2

4.1-21.6 -25.7

-9.9-8.01.9

1.97.59.4

-1.3

± 1

.5

6.1

± 3

.9

7.4

± 5

.3

-7.1

± 3

.2

-9.3

± 9

.0

-2.3

± 1

1.5

3.2

± 2

.1-1

1.0

± 7

.9-1

4.2

± 8

.8

O

S

SO O

NH2

N

NO

S

SO O

NH2

N

N

Cl

O

SNH2

S

ClO

O N

NO

SNH

2

S

O

O N

N3a 4a1a 2a-4.1

-20.7-16.6

-6.81.98.7

-0.97.78.6

-0.8

± 1

.4

32

.7 ±

13

.9

33

.5 ±

15

.3

-9.9

± 2

.0

-38

.5 ±

10

.8-2

8.7

± 1

2.6

5.6

± 4

.41

2.7

± 1

2.0

7.1

± 1

4.7

-48.1-41.36.8

-50.5-36.414.1

-54.3-36.318.0

-48.5-25.523.0

0.4-15.8 -16.2

-6.25.011.2

3.8-0.1-3.9

-49.9-19.930.0

-50.4-48.91.5

-59.3-35.823.5

-59.0-60.4-1.4

-0.324.624.9

0.529.028.5

-9.1-40.5-31.4

-1.421.122.5

3.0-0.3-3.3

2.2-6.9-9.1

0.612.211.6

-52.3-45.37.0

-51.6-33.018.6

-59.0-47.611.4

-63.0-62.01.0

4.014.410.4

-0.7-12.3-11.6

-10.7-16.7-6.0

-1.99.311.2

-0.47.57.9

3.113.610.5

-0.86.57.3

-0.42.32.7

0.1-6.3-6.4

-5.9-17.8-11.9

0.13.53.4

4.1-11.8-15.9

0.1-2.0-2.1

-1.43.24.6

-0.64.85.4

-5.3-20.7-15.4

-6.53.8

10.3

O

S

SO O

NH2

N

N2b 4b

O

SNH2

S

O

O N

N3b

-2.7-1.51.2

-1.5-1.50.0

-1.8-3.4-1.6

-2.1-0.51.6

-51.4-28.323.1

-50.6-32.018.6

-54.4-43.510.9

-50.4-26.723.7

-1.0-1.6-0.6

-3.0-15.2-12.2

3.811.57.7

3.3-13.0-16.3

1.91.2-0.7

0.17.27.1

0.1-4.4-4.5

1.4 ± 1.6-2.3 ± 8.6-3.6 ± 9.7

CA 12

1.4

± 2

.3-8

.7 ±

5.9

-10

.1 ±

7.0

1.2

± 1

.5-5

.4 ±

9.3

-6.6

± 8

.1

-1.0

± 0

.48

.8 ±

4.2

9.8

± 4

.3

-5.4

± 1

.8-1

.7 ±

9.2

3.7

± 1

0.8

-8.3

± 1

.7-1

0.7

± 4

.2-2

.5 ±

2.8

-7.0

± 1

.0-1

.1 ±

6.8

5.9

± 5

.9

-3.9

± 1

.1-1

4.7

± 7

.3-1

0.8

± 6

.5

2.2

± 2

.31

0.8

± 3

.38

.6 ±

1.3

4.4

± 1

.95

.6 ±

5.8

2.2

± 5

.8

= - .6∆ Gb 44�kr

= -35.1∆ Hb �kr

= 9.5T∆ Sb �kr

= -49.9∆ Gb �kr

= -55.8∆ Hb �kr

= -5.9T∆ Sb �kr

= -56.4∆ Gb �kr

= -52.0∆ Hb �kr

= 4.4T∆ Sb �kr

= -57.0∆ Gb �kr

= -47.2∆ Hb �kr

= 9.8T∆ Sb �kr

= -59.1∆ Gb �kr

= -47.7∆ Hb �kr

= 11.4T∆ Sb �kr

= -58.2∆ Gb �kr

= -55.4∆ Hb �kr

= 2.8T∆ Sb �kr

= -51.4∆ Gb �kr

= -57.3∆ Hb �kr

= -5.9T∆ Sb �kr

= -47.3∆ Gb �kr

= -36.6∆ Hb �kr

= 10.7T∆ Sb �kr

vidurkis

vidurkis

Tikriniai (pH bet koks, 37 °C):

b �kr∆ G , kJ/mol ∆ H , kJ/mol b �kr

T∆ S , kJ/mol b �kr

-47.4-20.427.0

-57.2-18.838.4

-55.2-64.1-8.9

-53.4-21.232.2

6.00.8 -5.2

-7.8-43.7-35.9

-2.045.347.3

-47.9-38.09.9

-54.1-41.412.7

-51.6-29.522.1

-59.0-29.030.0

-59.4-37.821.6

-53.8-29.124.7

2.2-0.4-2.6

-7.8-8.3-0.5

0.48.88.4

-51.0-52.3-1.3

-52.4-34.118.3

4.5-3.9 -8.4

-3.1-14.3-11.2

-3.110.914.0

O

S

SO O

NH2

N

NH O

O

S

SO O

NH2

N

NH O

Cl

O

SNH2

S

ClO

O N

NH O

O

SNH

2

S

O

O N

NH

O

∆ Gb �kr= -55.8= -47.4∆ Hb �kr

T∆ Sb �kr= 8.4

3c 4c1c 2c

∆ G = -46.5b �kr

∆ H = -36.8b �kr

T∆ S = 9.7b �kr

-3.0-11.6-8.6

-6.31.07.3

-1.68.09.6

-49.3-25.423.9

-51.7-19.132.6

-54.5-24.629.9

-51.0-18.132.9

1.7-7.3 -9.0

-5.20.86.0

2.85.52.7

-45.5-14.431.1

-56.6-27.928.7

-57.1-19.937.2

-58.1-37.220.9

1.017.316.3

11.113.52.4

-12.6-22.8-10.2

-3.2-6.7-3.5

1.96.04.1

-2.926.929.8

0.1-1.1-1.2

-53.3-27.525.8

-55.8-32.623.2

-56.3-22.034.3

-60.6-34.725.9

4.312.78.4

2.55.12.6

-7.3-7.20.1

-2.0-3.5-1.5

-1.72.03.7

-1.23.14.3

2.77.04.3

0.13.63.5

4.0-12.3-16.3

-9.32.8

12.1-51.5-50.90.6

-55.5-38.616.9

-60.7-44.516.2

-60.8-48.112.7

-3.1-4.5-1.4

-3.6-12.9-9.3

-9.84.2

14.0

-6.6-3.13.5

-0.914.815.7

-3.1-5.8-2.7

-8.4-11.2-2.8

O

S

SO O

NH2

N

NH O

∆ Gb �kr= -55.0= -50.3∆ Hb �kr

T∆ Sb �kr= 4.7

2dO

S

SO O

NH2

N

NH O

Cl

= -51.9∆ Gb �kr

= -44.5∆ Hb �kr

= 7.4T∆ Sb �kr

1dO

SNH2

S

ClO

O N

NH O4d

O

SNH2

S

O

O N

NH O3d

-5.4-7.7-2.3

-5.5-1.93.6

-7.6-14.1-6.5

-6.9-7.3-0.4

-52.1-26.225.9

-52.2-59.4-23.635.8

-56.6-16.340.3

4.5-9.9

-14.4

-7.32.69.9

7.2--

-2.8-0.82.0

-5.61.87.4

-4.91.05.9

-0.5--

-5.8 ± 3.1-4.1 ± 7.01.7 ± 9.7

-6.4 ± 1.1-7.8 ± 5.0-1.4 ± 4.2

-0.5 ± 2.22.2 ± 4.32.7 ± 2.8

-1.0 ± 2.56.3 ± 14.77.3 ± 15.3

-3.5 ± 2.30.7 ± 1.35.1 ± 2.8

1.9 ± 3.04.6 ± 6.32.7 ± 5.6

-0.3 ± 1.14.5 ± 4.44.9 ± 3.6

0.5 ± 2.415.6 ± 8.615.1 ± 6.4

1.4 ± 3.010.1 ± 14.88.8 ± 17.5

0.1 ± 1.410.8 ± 6.810.8 ± 7.7

-3.027.730.7

-2.23.96.1

-2.1-1.11.0

-1.9-1.70.2

-0.68.69.2

2.5-0.5-3.0

0.715.815.1

2.31.3-1.0

0.47.47.0

2.12.90.8

3.8-3.7-7.5

3.624.220.6

5.14.8-0.3

0.64.64.0

-0.118.919.0

2.117.014.9

0.018.618.6

2.413.411.0

-0.47.88.2

-1.112.914.0

∆∆ G = -3.1b �kr

∆∆ H = -5.8b �kr

T∆∆ S = -2.7b �kr

∆ G = -49.5b �kr

∆ H = -48.4b �kr

T∆ S = 1.1b �kr

∆ Gb �kr= -63.4= -61.5∆ Hb �kr

T∆ Sb �kr= 1.9

∆ Gb �kr= -64.3= -46.7∆ Hb �kr

T∆ Sb �kr= 17.6

∆ Gb �kr= -57.4= -39.4∆ Hb �kr

T∆ Sb �kr= 18.0

∆∆ G = -8.4b �kr

∆∆ H = -11.2b �kr

T∆∆ S = -2.8b �kr

∆∆ G = -0.9b �kr

∆∆ H = -14.8b �kr

T∆∆ S = 15.7b �kr

18 pav. Termodinaminių parametrų – struktūros sąryšio schema.


Visų 2 ir 3 grupės slopiklių jungimosi su CA I reakcija yra varoma entalpijos (∆H <

−47 kJ/mol), o entropija labai maža (T∆S < 10 kJ/mol). Tai, kad sąveikos su CA Ivaromoji jėga yra entalpija, galima matyti ir termodinaminio optimizavimo grafike (19pav.). Tiriant pirimidino žiede esančio pakaito įtaką CA I sąveikai su junginiais matyti,kad giminingumas didėja a → b → c → d junginių grupių kryptimi, t.y. tret-butilogrupę turintys slopikliai jungiasi su CA I stipriausiai. Okso ir metilo grupių įvedimasį pirimidino žiedą (b → c modifikacija) turi nedidelę įtaką jungimosi laisvajai energijai(∆∆Gvid = −0,3 kJ/mol). CA I stipriausiai jungiasi su 3d ir 4d slopikliais, dominuojantisenergijos indėlis yra entalpija, o entropijos indėlis daug mažesnis (ypač 3d junginio).

CA XIII sąveikos su junginiais giminingumas didėja 2 → 1 ir 2 → 3 → 4 kryptimis.3 → 4 kryptimi jungimosi giminingumas keičiasi labai nežymiai, tačiau entalpijos indėlissumažėja, o entropijos padidėja. Chloro įvedimas į meta- padėtyje pakaitą turinčiusjunginius (2→ 1 modifikacija) sumažina entalpijos indėlį ir padidina entropijos indėlį ∆G.Kaip ir CA I atveju chloro įtaką galima paaiškinti tuo, kad jis yra hidrofobiškas, taigimažina entalpijos ir didina entropijos indėlį. Pakeičiant tik pakaito padėtį sulfonamidinėsgrupės atžvilgiu iš meta- į para- (2→ 3 modifikacija), jungimosi giminingumas padidėja ∼7,1 kJ/mol. 2→ 3 kryptimi a, b ir c junginių grupėse padidėjusį giminingumą lemia ypačpalankus entalpijos indėlis (∆∆H = −17,8 ÷ −8,0 kJ/mol) ir nepalanki entropija, kurisumažina giminingumą (T∆S < 10). Tuo tarpu d junginių kryptimi (2d→ 3d) entropijosindėlis padidėja (T∆∆S = 12,1 kJ/mol), o entalpijos nežymiai sumažėja (∆∆H = 2,8

kJ/mol). 3a, 3b ir 3c junginių sąveikai su CA XIII entropija yra nepalanki (T∆S < 0

kJ/mol) ir jungimosi varomoji jėga yra entalpija. Dimetilo bei okso ir metilo grupiųįvedimas (b → a ir b → c modifikacijos) stiprios įtakos jungimosi giminingumui neturi,tik tret-butilo grupę turintiems junginiams (1-4d) giminingumas padidėja 5,8 kJ/mol. CAXIII stipriausiai jungiasi su 3d ir 4d slopikliais. Kaip ir jungiantis su CA I, dominuojantisenergijos indėlis yra entalpija, o entropijos indėlis daug mažesnis. Ši tendencija geraipastebima 19 paveiksle pateiktuose grafikuose.

CA II sąveikos su junginiais giminingumas pastebimai didėja tik 2 → 3 kryptimi(∆∆Gvid = −8,3 kJ/mol), o 1 → 2 ir 3 → 4 kryptimis – jis nežymiai sumažėja. Tokius∆G pokyčius lemia tai, jog 2 → 3 kryptimi labai padidėja entalpijos indėlis, o entropi-jos nežymiai sumažėja, tuo tarpu 2 → 1 ir 3 → 4 kryptimis sumažėjęs entalpijos indėlis(∆∆H > 0 kJ/mol) dalinai kompensuojamas padidėjusiu entropijos indėliu (T∆∆S > 0

kJ/mol). Tiriant pakaito pirimidino žiede įtaką jungimosi termodinamikai b→ a ir b→ ckryptimis ∆G nekinta. c→ d kryptimi, priešingai nei CA I ir CA XIII, jungimosi giminin-gumas taip pat nesikeičia. CA II stipriausiai jungiasi su 3b ir 3d slopikliai, dominuojantisenergijos indėlis yra entalpija, o entropijos indėlis žymiai mažesnis, pavyzdžiui 3b junginiogiminingumą (∆G = −63,0 kJ/mol) lemia dominuojanti entalpija (∆H = −62,0 kJ/mol).

40


-70 -60 -50 -40 -30 -20 -10

-40

-30

-20

-10

0

10 CA XIII

CA XII

ΔH, kJ/mol ΔH, kJ/mol

ΔH, kJ/mol ΔH, kJ/mol

ΔH, kJ/mol

-TΔ

S, k

J/m

ol -

TΔ

S, k

J/m

ol

-TΔ

S, k

J/m

ol -

TΔ

S, k

J/m

ol -

TΔ

S, k

J/m

ol

-70 -60 -50 -40 -30 -20 -10

-40

-30

-20

-10

0

10 CA I

-70 -60 -50 -40 -30 -20 -10

-40

-30

-20

-10

0

10 CA II CA VII

-70 -60 -50 -40 -30 -20 -10

-40

-30

-20

-10

0

10

-70 -60 -50 -40 -30 -20 -10

-40

-30

-20

-10

0

10 1a 1b 1c 1d

2a 2b 2c 2d

3a 3b 3c 3d

4a 4b 4c 4d

Kd = 0,01 nM(ΔG = -65,3 kJ/mol)

Kd = 100 nM (ΔG = -45,5 kJ/mol)

Kd = 0,01 nM(ΔG = -65,3 kJ/mol)

Kd = 100 nM (ΔG = -45,5 kJ/mol)

Kd = 0,01 nM(ΔG = -65,3 kJ/mol)

Kd = 100 nM (ΔG = -45,5 kJ/mol)

Kd = 0,01 nM(ΔG = -65,3 kJ/mol)

Kd = 100 nM (ΔG = -45,5 kJ/mol)

Kd = 0,01 nM(ΔG = -65,3 kJ/mol)

Kd = 100 nM (ΔG = -45,5 kJ/mol)

19 pav. Slopiklių sąveikos su CA termodinaminio optimizavimo grafikai.

CA VII sąveikos su junginiais giminingumas žymiai padidėja tik 2 → 3 kryptimi(∆∆Gvid = −9,9 kJ/mol). 1 → 2 kryptimi ∆G didėja, o 3 → 4 – giminingumas pa-stebimai nesikeičia. Chloro įvedimas į para- padėtyje pakaitą turinčius junginius (3 → 4modifikacija) entalpijos indėlį smarkiai sumažina (32,7 kJ/mol), o entropijos – padidina33,5 kJ/mol. Čia stebime labai aiškų entalpijos-entropijos kompensavimą. Kitaip nei CA

41


I, II ir XIII atveju, chloro įvedimas į meta- padėtyje pakaitą turinčius junginius (2 → 1modifikacija) entalpijos indėlį padidina, o entropijos – sumažina. 2→ 3 kryptimi entalpi-jos indėlis labai smarkiai padidėja (∆∆Hvid = −38,5 kJ/mol), o entropijos indėlis stipriaisumažėja (T∆∆Svid = −28,7 kJ/mol). Įdomu tai, kad stipriai besijungiančių 3a, 3b ir3c junginių sąveikos su CA VII entropija yra nepalanki (T∆∆S < 0 kJ/mol), jungimosienergiją sudaro entalpija. Toks pat reiškinys buvo stebimas ir CA XIII. Kaip ir CA IIatveju, vykstant b → a ir b → c → d modifikacijoms, žymių ∆G pokyčių nėra. CA VIIstipriai jungiasi su visais 3 ir 4 grupių junginiais (∆G − 59 ÷ −55 kJ/mol ribose). Stip-riausia sąveika pasižymi 3b ir 4b slopikliai (∆G = −59 kJ/mol). Nors 3b ir 4b jungimosigiminingumas vienodas (∆G = −59 kJ/mol), tačiau entalpijos-entropijos indėliai skiria-si. 3b atveju dominuoja entalpijos indėlis (∆H = −60,4 kJ/mol, T∆S = −1 kJ/mol),o 4b atveju labai padidėja entropijos indėlis giminingumui (chloro įtaka) (∆H = −35,8

kJ/mol, T∆S = 23,5 kJ/mol) (19 pav.).CA XII sąveikos su junginiais giminingumas didėja tik 2 → 3 kryptimi (∆∆Gvid =

−5,4 kJ/mol), o 1 → 2 ir 3 → 4 – jis nesmarkiai mažėja. Nors ∆G keičiasi nežymiai,tačiau 2 → 1 ir 3 → 4 entalpijos indėlis sumažėja, o entropijos padidėja. 2 → 3 kryptimiaiškios entalpijos/entropijos pokyčių tendencijos nėra. Kaip ir CA I bei CA XIII atveju,dimetilo bei okso ir metilo grupių įvedimas (b → a ir b → c modifikacijos) pastebimosįtakos jungimosi giminingumui neturi, o d junginių grupei giminingumas padidėja 3,5kJ/mol. CA XII stipriausiai jungiasi su tret-butilo grupę turinčiais 1d ir 3d slopikliais,dominuojantis energijos indėlis yra entropija, o entalpijos indėlis mažesnis. Membraninėizoforma CA XII išsiskiria iš kitų tirtų citozolinių CA tuo, kad sąveikai su visais junginiaisyra palankios ir entropija, ir entalpija.

42

Miglė Kišonaitė Išvados

4. Išvados

1. Nustatyta chloro įvedimo į benzensulfonamido žiedą įtaka pKa vertei ir protoniza-cijos entalpijai. orto- padėtyje chlorą turinčių junginių pKa = 8,9, o protonizacijosentalpija ∆Hprot = −24,3 kJ/mol. Nechlorintų benzensulfonamidų pKa = 9,4, o∆Hprot = −29,7 kJ/mol.

2. Tikriniai karboanhidrazių I, II, VII, XII ir XIII sąveikos su benzensulfonamidiniaisjunginiais parametrai parodė, jog chloro įvedimas į para- ir meta- padėtyje pakaitusturinčius junginius sumažina entalpijos ir padidina entropijos indėlį giminingumui(išskyrus karboanhidrazės VII sąveiką su meta- padėtyje pakaitą turinčiais jungi-niais).

3. Visos tirtos karboanhidrazių izoformos su para- padėtyje pakaitą turinčiais slopik-liais jungiasi stipriau, nei su meta- padėtyje pakaitą turinčiais junginiais. Para-padėtyje pakaitą turinčių junginių tiek stebimoji, tiek tikrinė Gibso energija yraneigiamesnė.

4. Dimetilo, metilo ir okso grupių įvedimas į pirimidino žiedą daro nedidelę įtaką są-veikos su karboanhidrazėmis stiprumui. Metilo grupės pirimidino žiede pakeitimastret-butilo grupe ypatingai padidina giminingumą I ir XIII izoformoms, Gibso ener-gijų skirtumų vidurkis ∆∆Gvid lygus -6,4 ir -5,9 kJ/mol, atitinkamai.

5. Nustatyta, kad stipriausiai su I ir XIII izoformomis jungiasi 4-[(4-tret-butil-6-okso-1,6-dihidro-2-pirimidinil)sulfanil]acetil benzensulfonamidas (3d) ir 4-[(4-tret-butil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-2-il)tio]acetil-2- chlorbenzensulfonamidas (4d), su II izo-forma – 4-[(2-pirimidinilsulfanil)acetil] benzensulfonamidas (3b) ir 4-[(4-tret-butil-6-okso-1,6-dihidro-2-pirimidinil)sulfanil]acetil benzensulfonamidas (3d), su VII – 4-[(2-pirimidinilsulfanil)acetil] benzensulfonamidas (3b) ir 4-[(4-tret-butil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-2-il)tio]acetil-2-chlorbenzensulfonamidas (4b), su XII – 3-[(4-tret-butil-6-okso-1,6- dihidropirimidin-2-il)tio]acetil-2- chlorbenzensulfonamidas (1d) ir4-[(4-tret-butil-6-okso-1,6-dihidro-2-pirimidinil)sulfanil]acetilbenzensulfonamidas (3d).Šių junginių sąveikos su citozolinėmis karboanhidrazėmis I, II, VII ir XIII dominuo-jantis energijos indėlis yra entalpija, o su transmembranine karboanhidraze XII –entropija.

43

Miglė Kišonaitė

Vilniaus universitetasGamtos mokslų fakultetas

Neurobiologijos ir biofizikos katedra

Biofizikos studijų programos IV kurso studentėMiglė Kišonaitė



Santrauka

Efektyvių vaistų kūrimas yra paremtas stipriai su baltymu-taikiniu sąveikaujan-čių junginių atranka ir entropijos/entalpijos įnašo į jungimosi energiją analize. Daugumabaltymo-slopiklio sąveikos reakcijų taip pat yra susijusios su protonų jungimusi ar at-skilimu nuo ligando ar nuo baltymo. Tik nepriklausantys nuo protonizacijos reiškiniųtermodinaminiai parametrai gali būti naudojami sąryšio su baltymo-ligando kompleksostruktūra nustatymui ir racionaliam vaistų kūrimui.

Šiame baigiamajame bakalauro darbe buvo ištirta 16 [(2-pyrimidinyltio)acetil]benzensulfonamidų sąveika su penkiomis rekombinantinėmis žmogaus karboanhidrazėsizoformomis. Dauguma karboanhidrazių izoformų yra svarbūs terapeutiniai taikiniai gy-dant įvairias ligas: tokias kaip glaukoma, nutukimas, epilepsija ir vėžys. Jungimosi gimi-ningumas buvo nustatytas izoterminio titravimo kalorimetrijos ir fluoresceciniu terminioposlinkio metodais. Izoterminio titravimo kalorimetrijos metodas taip pat panaudotassusijusių protonizacijos/deprotonizacijos reakcijų įvertinimui bei entalpijos ir entropijosindėlių sąveikos energijai nustatymui. Junginiai išdėstyti schemoje funkcinių grupių didė-jimo kryptimi siekiant susieti struktūras su termodinaminiais jungimosi parametrais.

Vilnius, 2014

44

Miglė Kišonaitė

Vilnius UniversityFaculty of Natural Sciences

Department of Neurobiology and Biophysics

IVth year student of Biophysics BScMiglė Kišonaitė

Bachelor thesis

Structure and thermodynamics correlation ofcytosolic carbonic anhydrase inhibitors

Summary

The lead design in drug discovery is based on selecting the highest affinity com-pounds and understanding enthalpy/entropy contributions to the binding energy. Manybinding reactions are also coupled to the absorption or release of protons by the proteinor the ligand. An investigation of the binding energetics requires the dissection of theprotonation/deprotonation processes, because only intrinsic parameters can be correlatedwith molecular structure and used for rational drug design.

In this work, 16 [(2-pyrimidinylthio)acetyl]benzenesulfonamides were investigatedas inhibitors of five recombinant human carbonic anhydrase isozymes. Many of the carbo-nic anhydrase isozymes are important therapeutic targets to treat a range of disordersincluding glaucoma, obesity, epilepsy and cancer. The binding affinity was determinedusing isothermal titration calorimetry and fluorescent thermal shift assay. Isothermaltitration calorimetry was also used to evaluate protonation/deprotonation coupling andcontributions of enthalpy and entropy to the binding affinity. Compounds were mappedin the direction of increasing functional groups to correlate with the increments in theintrinsic thermodynamic parameters.

Vilnius, 2014

45

Miglė Kišonaitė

Mokslinių darbų sąrašas

Mokslinės publikacijos:

1. Čapkauskaitė E, Zubrienė A, Smirnov A, Torresan J, Kišonaitė M, Kazokaitė J,Gylytė J, Michailovienė V, Jogaitė V, Manakova E, Gražulis S, Tumkevičius S,Matulis D. Benzenesulfonamides with pyrimidine moiety as inhibitors of humancarbonic anhydrases I, II, VI, VII, XII, and XIII. Bioorganic & Medicinal Chemistry,2013 Nov 15;21(22):6937-6947.

2. Zubrienė A, Čapkauskaitė E, Gylytė J, Kišonaitė M, Tumkevičius S, Matulis D.Benzenesulfonamides with benzimidazole moiety as inhibitors of carbonic anhydra-ses I, II, VII, XII and XIII. Journal Of Enzyme Inhibition & Medicinal Chemistry,2014 Feb 29(1):124-31.

3. Morkūnaitė V, Gylytė J, Zubrienė A, Baranauskienė L, Kišonaitė M, MichailovienėV, Juozapaitienė V, Todd MJ, Matulis D. Intrinsic thermodynamics of sulfonami-de inhibitor binding to human carbonic anhydrases I and II. Journal Of EnzymeInhibition & Medicinal Chemistry, priimtas spaudai 2014.

Mokslinių pranešimų tezės:

1. 2012 birželis. Kišonaitė M, Zubrienė A. Žodinis pranešimas „Karboanhidrazių są-veikos su slopikliais biofizikiniai tyrimai”, LMT Studentų mokslinių tyrimųkonferencija, Vilnius, Lietuva.

2. 2012 rugsėjis. Kišonaitė M. Žodinis pranešimas „Biophysical analysis of interactionbetween carbonic anhydrases and inhibitors”, Tarptautinė studentų mokslinėkonferencija „The Coins”, Vilnius, Lietuva.

3. 2012 spalis. Kišonaitė M, Matulis D. Žodinis pranešimas „Baltymų – ligandų sąvei-kos matavimas ITC ir TSA metodais”, LMT Studentų mokslinės praktikoskonferencija, Vilnius, Lietuva.

4. 2012 lapkritis. Timm D, Kasiliauskaitė A, Kišonaitė M, Zubrienė A, ČapkauskaitėE, Michailovienė V, Matulis D. Stendinis pranešimas „Inhibitor binding to recom-binant carbonic anhydrases I, VII, and XIII”, COST CM0804 Meeting, Salerno,Italija.

5. 2013 vasaris. Čapkauskaitė E, Zubrienė A, Baranauskienė L, Tamulaitienė G, Ma-nakova E, Kairys V, Gražulis S, Tumkevičius S, Kišonaitė M, Gylytė J, MorkūnaitėV, Matulis D. Stendinis pranešimas „Design of [(2-pyrimidinylthio)acetyl] benzene-sulfonamides as inhibitors of human carbonic anhydrase”, Biophysical Society57th Annual Meeting, Philadelphia, Pennsylvania, JAV.

46

Miglė Kišonaitė

6. 2013 kovas. Kišonaitė M, Zubrienė A, Matulis D. Stendinis pranešimas „Intrinsicthermodynamics of benzenesulfonamides binding to human carbonic anhydrases”,Tarptautinė studentų mokslinė konferencija „Open Readings”, Vilnius,Lietuva.

7. 2013 gegužė. Kišonaitė M, Čapkauskaitė E, Zubrienė A, Gylytė J, Matulis D. Sten-dinis pranešimas „Structure – thermodynamics correlation of benzenesulfonamidesbinding to carbonic anhydrases”, COST Action CM0804: Chemical Biologywith Natural Products, Izmir, Turkija.

8. 2013 birželis. Kišonaitė M, Zubrienė A. Stendinis pranešimas „Karboanhidraziųsąveikos su slopikliais tikrųjų parametrų nustatymas”, LMT Studentų moksliniųtyrimų konferencija, Vilnius, Lietuva.

9. 2013 rugsėjis. Kišonaitė M, Zhao L, Körner R, Hayer-Hartl M, Hartl F. Stendinispranešimas „Identification of thermolysin digested proteins using mass spectromet-ry”, Symposium of Amgen Scholar Program, Cambridge, Anglija.

10. 2013 spalis. Zubrienė A, Baranauskienė L, Kazlauskas E, Gylytė J, Timm D, Mor-kūnaitė V, Kišonaitė M, Čapkauskaitė E, Dudutienė V, Jogaitė V, Kazokaitė J,Kasiliauskaitė A, Michailovienė V, Mickevičiūtė A, Bakšytė S, Petrikaitė V, Pet-rauskas V, Smirnov A, Manakova E, Gražulis S, Kairys V, Matulienė J, Matulis D.Stendinis pranešimas „The pitfalls of intrinsic thermodynamics – structure correla-tions of lead binding to target proteins”, The 27th Annual Gibbs Conferenceon Biothermodynamics, Carbondale, Illinois, JAV.

11. 2014 kovas. Kišonaitė M, Zubrienė A, Čapkauskaitė E, Matulis D. Žodinis pra-nešimas „Thermodynamics – structure correlations of lead compounds binding totarget proteins”, Tarptautinė studentų mokslinė konferencija „Open Re-adings”, Vilnius, Lietuva.

12. 2014 balandis. Kišonaitė M, Zhao L, Körner R, Hayer-Hartl M, Hartl F. Stendinispranešimas „Identification of thermolysin digested proteins using mass spectromet-ry”, British Conference of Undergraduate Research: BCUR, Notting-ham, Anglija.

47

Miglė Kišonaitė

Literatūros sąrašas

Aggarwal M, Boone CD, Kondeti B, McKenna R. Structural annotation of human carbo-nic anhydrases. J Enzyme Inhib Med Chem. 2012a;.

Aggarwal M, Kondeti B, McKenna R. Insights towards sulfonamide drug specificity inalfa-carbonic anhydrases. Bioorg Med Chem. 2012b;.

Alterio V, Di Fiore A, D’Ambrosio K, Supuran CT, De Simone G. Multiple bindingmodes of inhibitors to carbonic anhydrases: how to design specific drugs targeting 15different isoforms? Chem Rev. 2012;112(8):4421–4468.

Baker BM, Murphy KP. Evaluation of linked protonation effects in protein binding reac-tions using isothermal titration calorimetry. Biophys J. 1996;71(4):2049–2055.

Baranauskienė L, Hilvo M, Matulienė J, Golovenko D, Manakova E, Dudutienė V, Mi-chailovienė V, Torresan J, Jachno J, Parkkila S, Maresca A, Supuran CT, Gražulis S,Matulis D. Inhibition and binding studies of carbonic anhydrase isozymes I, II and IXwith benzimidazo[1,2-c][1,2,3]thiadiazole-7-sulphonamides. J Enzyme Inhib Med Chem.2010;25(6):863–870.

Baranauskienė L, Matulis D. Intrinsic thermodynamics of ethoxzolamide inhibitor bindingto human carbonic anhydrase XIII. BMC Biophys. 2012;5:12.

Borthwick KJ, Kandemir N, Topaloglu R, Kornak U, Bakkaloglu A, Yordam N, Ozen S,Mocan H, Shah GN, Sly WS, Karet FE. A phenocopy of CAII deficiency: a novel geneticexplanation for inherited infantile osteopetrosis with distal renal tubular acidosis. J MedGenet. 2003;40(2):115–121.

Capkauskaitė E, Zubrienė A, Baranauskienė L, Tamulaitienė G, Manako-va E, Kairys V, Gražulis S, Tumkevičius S, Matulis D. Design of [(2-pyrimidinylthio)acetyl]benzenesulfonamides as inhibitors of human carbonic an-hydrases. Eur J Med Chem. 2012;51:259–270.

Capkauskaitė E, Zubrienė A, Smirnov A, Torresan J, Kišonaitė M, Kazokaitė J, Gylytė J,Michailovienė V, Jogaitė V, Manakova E, Gražulis S, Tumkevičius S, Matulis D. Ben-zenesulfonamides with pyrimidine moiety as inhibitors of human carbonic anhydrasesI, II, VI, VII, XII, and XIII. Bioorg Med Chem. 2013;21(22):6937–6947.

Chaires JB. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Annu Rev Biophys. 2008;37:135–151.

Chodera JD, Mobley DL. Entropy-enthalpy compensation: role and ramifications inbiomolecular ligand recognition and design. Annu Rev Biophys. 2013;42:121–142.

48

Miglė Kišonaitė

Christianson D, Fierke C. Carbonic anhyrdase: evolution of the zinc binding site bynature and design. Accts Chem Res. 1996;29:331–339.

Cimmperman P, Baranauskiene L, Jachimoviciūte S, Jachno J, Torresan J, MichailovieneV, Matuliene J, Sereikaite J, Bumelis V, Matulis D. A quantitative model of thermalstabilization and destabilization of proteins by ligands. Biophys J. 2008;95(7):3222–3231.

Cimmperman P, Matulis D. RSC Biomolecular Sciences No. 22. Biophysical ApproachesDetermining Ligand Binding to Biomolecular Targets: Detection, Measurement andModelling. Royal Society of Chemistry. 2011.

Daniel E, Weber G. Cooperative effects in binding by bovine serum albumin I. Thebinding of 1-anilino-8-naphthalenesulfonate. Fluorimetric titration. Biochemistry. 1966;12(3):512–517.

De Simone G, Di Fiore A, Supuran CT. Are carbonic anhydrase inhibitors suitable forobtaining antiobesity drugs? Curr Pharm Des. 2008;14(7):655–660.

Domsic JF, Avvaru BS, Kim CU, Gruner SM, Agbandje-McKenna M, Silverman DN,McKenna R. Entrapment of carbon dioxide in the active site of carbonic anhydrase II.J Biol Chem. 2008;283(45):30766–30771.

Ferry JG. The gamma class of carbonic anhydrases. Biochim Biophys Acta. 2010;1804(2):374–381.

Freire E. Do enthalpy and entropy distinguish first in class from best in class? DrugDiscov Today. 2008;13(19-20):869–874.

Freyer MW, Lewis EA. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analy-sis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods CellBiol. 2008;84:79–113.

Garbett NC, Chaires JB. Thermodynamic studies for drug design and screening. ExpertOpin Drug Discov. 2012;7(4):299–314.

Gitto R, Agnello S, Ferro S, De Luca L, Vullo D, Brynda J, Mader P, Supuran CT, Chimir-ri A. Identification of 3,4-Dihydroisoquinoline-2(1H)-sulfonamides as potent carbonicanhydrase inhibitors: synthesis, biological evaluation, and enzyme–ligand X-ray studies.J Med Chem. 2010;53(6):2401–2408.

Hassan M, Shajee B, Waheed A, Ahmad F, Sly W. Structure, function and applicationsof carbonic anhydrase isozymes. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2012;.

49

Miglė Kišonaitė

Izatt RM, Rytting JH, Hansen LD, Christensen JJ. Thermodynamics of proton dissocia-tion in dilute aqueous solution. V. An entropy titration study of adenosine, pentoses,hexoses, and related compounds. J Am Chem Soc. 1966;88(12):2641–2645.

Jogaitė V, Zubrienė A, Michailovienė V, Gylytė J, Morkūnaitė V, Matulis D. Characte-rization of human carbonic anhydrase XII stability and inhibitor binding. Bioorg MedChem. 2013;21(6):1431–1436.

Kazlauskas E, Petrikaitė V, Michailovienė V, Revuckienė J, Matulienė J, Grinius L, Matu-lis D. Thermodynamics of aryl-dihydroxyphenyl-thiadiazole binding to human Hsp90.PLoS One. 2012;7(5):e36899.

Kemp MM, Weıwer M, Koehler AN. Unbiased binding assays for discovering small-molecule probes and drugs. Bioorg Med Chem. 2012;20(6):1979–1989.

Kranz JK, Schalk-Hihi C. Methods in Enzymology. Elsevier Inc. 2011.

Krishnamurthy VM, Kaufman GK, Urbach AR, Gitlin I, Gudiksen KL, Weibel DB, Whi-tesides GM. Carbonic anhydrase as a model for biophysical and physical-organic studiesof proteins and protein-ligand binding. Chem Rev. 2008;108(3):946–1051.

Leavitt S, Freire E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermaltitration calorimetry. Curr Opin Struct Biol. 2001;11(5):560–566.

Lindskog S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacol Ther. 1997;74(1):1–20.

Lopez M, Bornaghi LF, Innocenti A, Vullo D, Charman SA, Supuran CT, Poulsen SA.Sulfonamide linked neoglycoconjugates–a new class of inhibitors for cancer-associatedcarbonic anhydrases. J Med Chem. 2010;53(7):2913–2926.

Ludwig M. The molecular evolution of beta-carbonic anhydrase in Flaveria. J Exp Bot.2011;62(9):3071–3081.

Manual. Itc data analysis in origin®, tutorial guide, version 7.0. 2004.

Matulis D. Baltymų fizikinė chemija. Kaunas:Technologija. 2008.

Matulis D, Baumann CG, Bloomfield VA, Lovrien RE. 1-anilino-8-naphthalene sulfonateas a protein conformational tightening agent. Biopolymers. 1999;49(6):451–458.

Matulis D, Kranz JK, Salemme FR, Todd MJ. Thermodynamic stability of carbonicanhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor.Biochemistry. 2005;44(13):5258–5266.

50

Miglė Kišonaitė

Matulis D, Todd M. Thermodynamics–Structure Correlations of Sulfonamide InhibitorBinding to Carbonic Anhydrase. John Wiley & Sons. 2004.

Morkūnaitė V, Gylytė J, Zubrienė A, Baranauskienė L, Kišonaitė M, Michailovienė V,Juozapaitienė V, Todd MJ, Matulis D. Intrinsic thermodynamics of sulfonamide in-hibitor binding to human carbonic anhydrases I and II. J Enzyme Inhib Med Chem.Priimtas spaudai 2014;.

Murphy KP. Stabilization of protein structure. Methods Mol Biol. 2001;168:1–16.

Nelson DL, Cox MM. Lehninger Principles of Biochemistry 5 th edition. W.H. Freemanand Company. 2008.

Olsson TSG, Ladbury JE, Pitt WR, Williams MA. Extent of enthalpy-entropy compen-sation in protein-ligand interactions. Protein Sci. 2011;20(9):1607–1618.

Olsson TSG, Williams MA, Pitt WR, Ladbury JE. The thermodynamics of protein-ligandinteraction and solvation: insights for ligand design. J Mol Biol. 2008;384(4):1002–1017.

Parker MH, Lunney EA, Ortwine DF, Pavlovsky AG, Humblet C, Brouillette CG. Analy-sis of the binding of hydroxamic acid and carboxylic acid inhibitors to the stromelysin-1(matrix metalloproteinase-3) catalytic domain by isothermal titration calorimetry. Bio-chemistry. 1999;38(41):13592–13601.

Parkkila S. An overview of the distribution and function of carbonic anhydrase in mam-mals. EXS. 2000;(90):79–93.

Pastorekova S, Parkkila S, Zavada J. Tumor-associated carbonic anhydrases and theirclinical significance. Adv Clin Chem. 2006;42:167–216.

Peles E, Nativ M, Campbell PL, Sakurai T, Martinez R, Lev S, Clary DO, Schilling J,Barnea G, Plowman GD, Grumet M, Schlessinger J. The carbonic anhydrase domain ofreceptor tyrosine phosphatase beta is a functional ligand for the axonal cell recognitionmolecule contactin. Cell. 1995;82(2):251–260.

Reynolds C, Holloway MK. Thermodynamics of Ligand Binding and Efficiency. MedicinalChemistry Letters. 2011;2:433–437.

Rogez-Florent T, Duhamel L, Goossens L, Six P, Drucbert AS, Depreux P, Danzé PM,Landy D, Goossens JF, Foulon C. Label-free characterization of carbonic anhydrase-novel inhibitor interactions using surface plasmon resonance, isothermal titration calo-rimetry and fluorescence-based thermal shift assays. J Mol Recognit. 2014;27(1):46–56.

Ruben AJ, Kiso Y, Freire E. Overcoming roadblocks in lead optimization: a thermody-namic perspective. Chem Biol Drug Des. 2006;67(1):2–4.

51

Miglė Kišonaitė

Sūdžius J, Baranauskienė L, Golovenko D, Matulienė J, Michailovienė V, Torresan J,Jachno J, Sukackaitė R, Manakova E, Gražulis S, Tumkevičius S, Matulis D. 4-[N-(substituted 4-pyrimidinyl)amino]benzenesulfonamides as inhibitors of carbonic anhyd-rase isozymes I, II, VII, and XIII. Bioorg Med Chem. 2010;18(21):7413–7421.

Supuran CT. Carbonic anhydrases–an overview. Curr Pharm Des. 2008a;14(7):603–614.

Supuran CT. Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications for inhibitors andactivators. Nat Rev Drug Discov. 2008b;7(2):168–181.

Supuran CT. Development of small molecule carbonic anhydrase IX inhibitors. BJU Int.2008c;101 Suppl 4:39–40.

Supuran CT. Carbonic anhydrase inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 2010;20(12):3467–3474.

Supuran CT, Di Fiore A, Alterio V, Monti SM, De Simone G. Recent advances in struc-tural studies of the carbonic anhydrase family: the crystal structure of human CA IXand CA XIII. Curr Pharm Des. 2010;16(29):3246–3254.

Tellinghuisen J. A study of statistical error in isothermal titration calorimetry. AnalBiochem. 2003;321(1):79–88.

Temperini C, Cecchi A, Scozzafava A, Supuran CT. Carbonic anhydrase inhibitors. In-teraction of indapamide and related diuretics with 12 mammalian isozymes and X-raycrystallographic studies for the indapamide-isozyme II adduct. Bioorg Med Chem Lett.2008;18(8):2567–2573.

Temperini C, Cecchi A, Scozzafava A, Supuran CT. Carbonic anhydrase inhibitors.Comparison of chlorthalidone, indapamide, trichloromethiazide, and furosemide X-raycrystal structures in adducts with isozyme II, when several water molecules make thedifference. Bioorg Med Chem. 2009;17(3):1214–1221.

Velazquez-Campoy A, Ohtaka H, Nezami A, Muzammil S, Freire E. Isothermal titrationcalorimetry. Curr Protoc Cell Biol. 2004;Chapter 17:Unit 17.8.

Whitesides GM, Krishnamurthy VM. Designing ligands to bind proteins. Q Rev Biophys.2005;38(4):385–395.

Wiseman T, Williston S, Brandts JF, Lin LN. Rapid measurement of binding constantsand heats of binding using a new titration calorimeter. Anal Biochem. 1989;179(1):131–137.

Zimmerman SA, Ferry JG. The beta and gamma classes of carbonic anhydrase. CurrPharm Des. 2008;14(7):716–721.

52

Miglė Kišonaitė

Zubrienė A, Capkauskaitė E, Gylytė J, Kišonaitė M, Tumkevičius S, Matulis D. Benze-nesulfonamides with benzimidazole moieties as inhibitors of carbonic anhydrases I, II,VII, XII and XIII. J Enzyme Inhib Med Chem. 2013;.

Zubrienė A, Kazlauskas E, Baranauslienė L, Petrauskas V, Matulis D. Izothermal titrationcalorimetry and thermal shift assay in drug design. European Pharmaceutical Review.2011;Volume 16, Issue 3:56–59.

53

Miglė Kišonaitė

Priedai

Prieduose pateikiama 4 lentelė (stebimieji jungimosi parametrai) bei bakalauro studijųmetu išleistos mokslinės publikacijos.

54

Miglė Kišonaitė

4le

ntel

ė.IT

Cir

FTSA

met

odai

sišm

atuo

tist

ebim

ieji

karb

onah

idra

zės

irslo

pikl

ioju

ngim

osip

aram

etra

i.K

d–

diso

ciac

ijos

kons

tant

a,∆G

–la

isvos

ios

Gib

soen

ergi

jos

poky

tis,∆

H–

enta

lpijo

spo

kytis

irT

∆S

–en

trop

ijos

poky

čio

irte

mpe

ratū

ros

sand

auga

.

CA

I

1a1b

1c1d

2a2b

2c2d

3a3b

3c3d

4a4b

4c4d

Kd,n

M(I

TC

)85

023

0020

0024

010

015

0019

0023

085

110

180

2319

4990

7K

d,n

M(F

TSA

)10

0031

0083

010

037

077

083

010

022

6767

1,4

5,0

104,

00,

25∆G

,kJ/

mol

-35,

8-3

3,1

-35,

0-4

0,4

-36,

9-3

5,4

-35,

0-4

0,5

-43,

7-4

1,9

-41,

3-4

9,0

-47,

6-4

5,5

-45,

9-5

2,7

∆H

,kJ/

mol

-18,

1-1

6,6

-18,

3-2

6,0

-33,

2-3

1,7

-24,

3-2

6,2

-31,

3-2

7,9

-23,

3-3

7,4

-29,

2-2

8,6

-20,

8-2

8,1

T∆S

,kJ/

(mol

K)

17,9

16,5

16,7

14,4

3,7

3,7

10,7

14,3

12,4

14,0

18,0

11,6

18,4

16,9

25,1

24,6

CA

II

Kd,n

M(I

TC

)15

043

013

010

057

073

011

0074

064

1249

2714

3820

90K

d,n

M(F

TSA

)22

033

020

050

1000

1100

1300

500

3317

6745

1711

2140

∆G

,kJ/

mol

-40,

0-3

8,1

-40,

4-4

2,4

-36,

4-3

5,9

-35,

2-3

6,9

-43,

6-4

6,6

-43,

0-4

4,2

-46,

4-4

5,6

-45,

6-4

2,9

∆H

,kJ/

mol

-14,

0-2

3,3

-19,

4-2

2,9

-22,

6-3

0,1

-14,

2-1

2,3

-33,

2-4

6,8

-22,

6-1

9,5

-31,

4-3

7,9

-19,

4-1

2,4

T∆S

,kJ/

(mol

K)

26,0

14,8

21,0

19,5

13,8

5,8

21,0

24,6

10,4

-0,2

20,4

24,7

15,0

7,7

26,2

30,5

CA

VII

Kd,n

M(I

TC

)46

066

032

092

1000

016

0012

000

3500

260

8263

034

061

8968

230

Kd,n

M(F

TSA

)33

071

013

040

6700

4000

4000

500

130

6717

033

135,

036

11∆G

,kJ/

mol

-38,

0-3

6,6

-39,

7-4

2,9

-30,

2-3

3,2

-30,

7-3

0,7

-40,

1-4

2,3

-38,

5-4

1,4

-44,

9-4

5,6

-43,

4-4

3,3

∆H

,kJ/

mol

-23,

6-4

4,7

-17,

0-2

3,7

-10,

4-1

0,2

-10,

6-4

,6-5

4,3

-50,

7-5

4,3

-27,

4-1

9,4

-31,

6-1

4,6

-15,

7T∆S

,kJ/

(mol

K)

14,4

-8,1

22,7

19,2

19,8

23,0

20,1

26,1

-14,

2-8

,4-1

5,8

14,0

25,5

14,0

28,8

27,6

CA

XII

Kd,n

M(I

TC

)14

0037

055

084

7900

620

2800

940

230

370

330

2946

045

050

0-

Kd,n

M(F

TSA

)14

0013

0050

043

3300

3300

3700

1300

910

560

560

140

910

830

330

330

∆G

,kJ/

mol

-34,

8-3

6,6

-37,

3-4

2,9

-31,

4-3

4,7

-32,

6-3

5,4

-37,

6-3

7,7

-37,

8-4

2,7

-36,

7-3

6,9

-38,

5-3

8,5*

∆H

,kJ/

mol

-18,

2-1

9,4

-10,

8-9

,0-2

8,4

-15,

5-1

2,6

-13,

4-2

3,4

-30,

7-1

1,8

-10,

8-2

9,1

-24,

7-2

4,7

-T∆S

,kJ/

(mol

K)

16,6

17,2

26,5

33,9

3,0

19,2

20,0

22,0

14,2

7,0

26,0

31,9

7,6

12,2

13,8

-

CA

XII

I

Kd,n

M(I

TC

)30

027

088

6223

000

700

3500

2100

130

7715

0050

2544

144

5,6

Kd,n

M(F

TSA

)33

033

020

025

1000

1300

1500

170

8313

036

05,

010

1733

5,0

∆G

,kJ/

mol

-38,

6-3

8,7

-40,

8-4

4,0

-31,

6-3

5,7

-33,

4-3

7,0

-41,

4-4

1,6

-36,

4-4

6,3

-46,

3-4

4,9

-42,

5-4

9,2

∆H

,kJ/

mol

-11,

9-1

5,4

-16,

5-2

0,9

-27,

9-1

6,0

-14,

8-2

7,7

-35,

9-3

3,9

-29,

1-2

4,9

-33,

9-3

7,1

-23,

8-2

6,9

T∆S

,kJ/

(mol

K)

26,7

23,3

24,3

23,1

3,7

19,7

18,6

9,3

5,5

7,7

7,3

21,4

12,4

7,8

18,7

22,3

*∆G

reik

šmės

išmat

uoto

sFT

SAm

etod

u.IT

Cm

etod

ure

zulta

tain

egau

tidė

lrib

oto

jung

inių

tirpu

mo.

55

Bioorganic & Medicinal Chemistry 21 (2013) 6937–6947

Contents lists available at ScienceDirect

Bioorganic & Medicinal Chemistry

journal homepage: www.elsevier .com/locate /bmc

Benzenesulfonamides with pyrimidine moiety as inhibitorsof human carbonic anhydrases I, II, VI, VII, XII, and XIII

0968-0896/$ - see front matter � 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.http://dx.doi.org/10.1016/j.bmc.2013.09.029

⇑ Corresponding author. Tel.: +370 5 269 1884; fax: +370 5 260 2116.E-mail addresses: [email protected], [email protected] (D. Matulis).

Edita Capkauskaite a, Asta Zubriene a, Alexey Smirnov a, Jolanta Torresan a, Migle Kišonaite a,Justina Kazokaite a, Joana Gylyte a, Vilma Michailoviene a, Vaida Jogaite a, Elena Manakova b,Saulius Grazulis b, Sigitas Tumkevicius c, Daumantas Matulis a,⇑a Department of Biothermodynamics and Drug Design, Institute of Biotechnology, Vilnius University, Graici�uno 8, Vilnius LT-02241, Lithuaniab Department of Protein–DNA Interactions, Institute of Biotechnology, Vilnius University, Graici�uno 8, Vilnius LT-02241, Lithuaniac Department of Organic Chemistry, Faculty of Chemistry, Vilnius University, Naugarduko 24, Vilnius LT-03225, Lithuania

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 2 July 2013Revised 6 September 2013Accepted 11 September 2013Available online 20 September 2013

Keywords:Carbonic anhydrase isozymesIsothermal titration calorimetryThermal shift assayThermoFluor�

Sulfonamides as CA inhibitorsPyrimidine

a b s t r a c t

Two groups of benzenesulfonamide derivatives, bearing pyrimidine moieties, were designed and synthe-sized as inhibitors of carbonic anhydrases (CA). Their binding affinities to six recombinant human CA iso-forms I, II, VI, VII, XII, and XIII were determined by the thermal shift assay (TSA). The binding of severalinhibitors was measured by isothermal titration calorimetry (ITC). Direct demonstration of compoundinhibition was achieved by determining the inhibition constant by stopped-flow CO2 hydration assay.The most potent compounds demonstrated selectivity towards isoform I and affinities of 0.5 nM. Thecrystal structures of selected compounds in complex with CA II, XII, and XIII were determined to atomicresolution. Compounds described here were compared with previously published pyrimidinebenzene-sulfonamides.1 Systematic structure–activity analysis of 40 compound interactions with six isoformsyields clues for the design of compounds with greater affinities and selectivities towards target CAisoforms.

� 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

Carbonic anhydrases (CAs) are ubiquitous metalloenzymes thatcatalyze the hydration of carbon dioxide to bicarbonate. There are12 catalytically active and highly homologous CA isoforms in hu-man body.2–4 Most CA isozymes constitute targets for the designand development of CA inhibitors for clinical applications. ClassicalCA inhibitors are aromatic sulfonamides.3,5–7 There are at least 30clinically used CA inhibitors as drugs and more in clinical develop-ment.2 Diffuse localization of CA isoforms in many tissues/organslimits potential pharmacological applications.7–10 The design ofisozyme-specific inhibitors is the current challenge in the develop-ment of new therapeutic agents.

In our previous studies,1 the synthesis of 4-substituted-ben-zenesulfonamides and 5-substituted-2-chlorobenzensulfonamidesof series 1 and 4 incorporating phenyl or pyrimidine moieties havebeen described (Fig. 1). These compounds exhibited nanomolaraffinities toward CA isozymes I, II, VII, and XIII. In most cases, thecompounds bearing 2-Cl-benzenesulfonamide headgroup (com-pounds 4) had lower binding affinity than benzenesulfonamide

headgroup (compounds 1). Introduction of the pyrimidine substi-tuent instead of benzene weakened the binding affinity to alltested CAs. However, pyrimidine-bearing compounds were moreselective towards a particular CA isozyme.

The S-alkylated benzimidazoles are stronger CA binders than N-alkylated benzimidazoles and indapamide.11 Therefore, com-pounds 1–4 were designed as the S-alkylated pyrimidines. Herewe have designed [(2-pyrimidinylthio)acetyl]benzenesulfona-mides 2a–j, 3a–j (Scheme 1) in the search for more potent andselective CA inhibitors. Furthermore, the binding measurementsof compounds 1(a–j) and 4(a–j) have been extended to the cata-lytic domain of recombinant human CA VI and CA XII that has beenimplicated in cancer.8,12,13 The compounds are grouped accordingto four headgroups (compounds 1–4) and were compared witheach other according to their CA affinity and atomic position incrystal structures with CA II, XII, and XIII.

Detailed compound structure–affinity correlations were drawn.Comparison between the six tested CA isoforms showed selectivityprofiles towards CA I, II, VII, and XIII. The correlations are useful forthe design of compounds with greater affinities and selectivitiestowards target CA isoform and the development of lead com-pounds for therapeutic applications.

http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1016/j.bmc.2013.09.029&domain=pdf

http://dx.doi.org/10.1016/j.bmc.2013.09.029

mailto:[email protected]



http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680896

http://www.elsevier.com/locate/bmc

a-j

1k, 4k

1- 4( a- j) 1: R 1=SO 2NH 2, R 2=H, 2: R 1=SO 2NH 2, R 2=Cl, 3: R 1=H, R 2=SO 2NH 2, 4: R 1=Cl, R 2=SO 2NH 2

a: R 3=OH, R 4=H, R 5=Me, b: R 3=OH, R 4=Bn, R 5=Me, c: R 3=OH, R 4=H, R 5=Pr, d: R 3=OH, R 4=H, R 5= tert-Bu, e : R 3=OH, R 4=CO 2Et, R 5=H, f: R 3=Me, R 4=H, R 5=Me, g: R 3=H, R 4=Et, R 5=H, h: R 3=H, R 4=Pr, R 5=H, i: R 3=H, R 4=Bu, R 5=H, j: R 3=H, R 4=H, R 5=H

R1

OS

R2

R1R2

O

R5R4

R3N

N

S

Figure 1. The structures of S-alkylated pyrimidine derivative compounds. Com-pounds are grouped into four sulfonamide headgroups (1–4) and 10 tailgroups (a–j)totaling 40 compounds. Compounds of series 1 and 4 have been publishedpreviously.1

R1

R2

O SH

N N

R3R5

R4

2: R1=SO2NH2, R2=Cl,3: R1=H, R2=SO2NH2

R1

R2

OS

N

N R3

R5R4

a-j

Br

+NaOAc, THF

r.t., 24h

2a-j,3a-j

Scheme 1. Synthesis of compounds 2a–j and 3a–j.

6938 E. Capkauskaite et al. / Bioorg. Med. Chem. 21 (2013) 6937–6947

2. Results and discussion

2.1. Chemistry

A series of benzenesulfonamides with a pyrimidine moiety-bearing substituent 1–4(a–j) were designed and synthesized asCA inhibitors (Fig. 1). The synthesis of S-alkylated pyrimidines1(a–j) and 4(a–j) have been described previously.1 S-substitutedpyrimidine derivatives 2–3(a–j) were prepared by S-alkylation ofpyrimidines a–j with 4-(bromoacetyl)-2-chlorobenzenesulfona-mide (2) and 3-(bromoacetyl)benzenesulfonamide (3) using thesame reaction conditions as described previously (Scheme 1).

2.1.1. Binding and inhibition studiesThe dissociation constants Kd for compounds 1–4(a–j) binding

to six CA isozymes CA I, II, VI, VII, XII, and XIII were determinedby the thermal shift assay (TSA). Standard compounds such asindapamide (IND), acetazolamide (AZM), and ethoxzolamide(EZA) were used as controls. The Kds of all newly synthesizedinhibitors of series 2–3(a–j) are summarized in Table 1. The Kd val-ues for compounds of series 1(a–j) and 4(a–j) from our earlier pub-lication1 are also shown, providing additional data for the catalyticdomain of recombinant CA VI and cancer-associated isoform CAXII.

Several selected compounds, namely, 2a, 2f, and 2h, were cho-sen to determine their affinities towards CAs I, II, VII, XII, and XIIIby isothermal titration calorimetry (ITC) in order to compare withthe TSA measurements (Table 2). ITC is a standard and convenientmethod to measure ligand affinities in the 10–1000 nM range.However, it consumes significantly more protein than TSA andhas limitations in determining affinities stronger than 10 nM dueto Wiseman factor14 exceeding 1000 at such conditions. Our mea-sured Kds by ITC confirmed the TSA measurements with the dis-crepancy in most cases not exceeding two fold in Kd. Thisconfirmed the sufficient precision of TSA data.

Furthermore, CA II inhibition constant Ki for compounds 2f and3h was determined using stop flow method which directly mea-sures CO2 hydration.15,16 The Kis were equal to 11 and 167 nM,for 2f and 3h, respectively. The values were slightly lower thanthe ones determined by TSA, most likely due to the different tem-peratures used in TSA experiment (37 �C) as compared to the stop-flow CO2 hydration experiment (25 �C). However, there was a gen-eral agreement between two methods and it directly confirmedthat such compounds were inhibitors of CA.

All three techniques showed that the meta-substituted ben-zenesulfonamides were less potent binders of all tested CAs thanthe para-substituted benzenesulfonamides. Figure 2 shows theCA VII melting curves (panels A and B) and the concentration–re-sponse curves of compounds 2j and 3j (panel C) obtained by TSA.Compound 2j exhibited approximately 1000 times higher affinityto CA VII than the meta-substituted benzenesulfonamide 3j.

Figure 2, panel D shows typical ligand dosing curves for severalselected compounds binding to CA I obtained by TSA. The strongeststabilization effect on CA I has compound 2d, it increased the melt-ing temperature of protein by more than 10 �C depending on ligandconcentration. The Kd value for 2d was equal to 0.5 nM while500 nM for 3c.

In order to draw some conclusions and estimate compoundheadgroup and tail contributions to affinity, the averaged logKd

were drawn for each group of compounds for each CA (Fig. 3).There were four sulfonamide headgroups thus dividing the synthe-sized compounds in four series. The uncertainties in the bar chartshow the range of Kds for all tails (a–j) tested against each CA iso-form. They are not the error bars but instead show the range ofaffinities covered by all tested compounds.

Several conclusions were drawn from this analysis. First, the po-sition of the sulfonamide group on the headgroup benzene ring sig-nificantly influenced the binding strength to various CA isoforms.In most cases, the para-substituted benzenesulfonamide (com-pounds 1–2(a–j)) had higher binding affinity than their meta-substituted benzenesulfonamide equivalents (compounds 3–4(a–j)). Second, the compounds bearing a chlorine atom in the ben-zenesulfonamide headgroup (compounds of series 2 and 4) hadhigher binding affinities than their analogs without chlorine (com-pounds of series 1 and 3).

According to this brief analysis the compound series could besorted by activity in ascending order: 3 < 4 < 1 < 2. Interestingly,the biggest difference between the lowest and highest Kd valueswas for compounds 1(a–j) binding to CA XIII. This difference wasequal to two, which corresponds to difference in Kds by 100 times.As seen from the ranges, the substituents on pyrimidine ring tail-group significantly influenced the binding affinities to CAs. Theweakest binding CA isozyme was CA VI, especially for 1–3. Com-pounds 4(a–j) were weakest binders of CA I. In contrast, com-pounds 1–3 showed higher binding affinity for CA I than forother CAs.

The compounds can also be divided into two groups accordingto their pyrimidine tailgroups: oxopyrimidines (1–4(a–e)) andpyrimidines without the oxo group (1–4(f–j)). In the most cases,the compounds 1(a–j) exhibited strongest binding to CA I, II, andXIII. Pyrimidines without oxo group showed better binding affinityfor CA II (Kd = 12.5–16.7 nM, except 1f) and CA VII (Kd = 55.6–125 nM) than oxopyrimidines (Kd = 18–83 and 143–250 nM,respectively). Conversely, CA XII was better bound by oxopyrimi-dines (Kd = 91–714 nM) than pyrimidines without oxo group(Kd = 909–1430 nM, except 1j). Oxopyrimidine 1d with tert-butylsubstituent exhibited highest binding affinity for CA I and XIII(Kd = 1.9 and 3.5 nM, respectively) among compounds of this ser-ies. Carbon chain elongation in the 5th position of the pyrimidinering 1(g–i) did not affect the binding affinity by more than two foldto any of tested CAs.

Table 1Compound dissociation constants for human recombinant CA isoforms I, II, VI, VII, XII, and XIII, determined by the thermal shift assay (TSA, 37 �C, pH 7.0)

Inhibitor R3 R4 R5 Dissociation constants Kd (nM) for CA isoforms

CA I CA II CA VI CA VII CA XII CA XIII

1a 66.7 66.7 3700 167 556 3572a OH H Me 4.00 21.3 2500 35.7 333 33.33a 833 1250 7100 4000 3700 15704a 833 200 900 133 500 2001b 33.3 25.0 1300 143 714 13.02b OH Bn Me 20.0 66.7 1900 100 1110 25.03b 2220 1110 3300 12,500 8330 14304b 455 33.3 290 143 294 42.01c 17.2 83.3 1250 250 90.9 62.52c OH H Pr 10.0 111 4500 50.0 250 83.33c 500 500 13,000 3330 2000 8334c 667 66.7 830 55.6 100 55.61d 1.9 29.0 5000 180 143 3.52d OH H t-Bu 0.50 40.0 9100 11.1 333 5.03d 100 500 40,000 500 1250 1674d 100 50.0 2000 20.0 43.5 25.01e 17.0 18.0 2500 200 370 2862e OH CO2Et H 14.3 20.0 2800 25.0 250 76.93e 1250 667 2100 1000 1250 22204e 1250 50.0 200 25.0 200 1251f 22.2 33.3 2500 125 909 83.32f Me H Me 5.00 16.7 2900 12.5 909 10.03f 370 1000 13,000 6670 3330 10004f 1000 222 1000 333 1430 3331g 30.3 12.5 5000 55.6 1000 28.62g H Et H 6.67 7.14 5000 10.0 286 2.083g 500 667 8300 2500 3850 5564g 1820 143 670 333 1250 1111h 33.3 12.5 5000 66.7 1430 22.72h H Pr H 5.26 7.14 3300 16.7 345 1.253h 370 556 5000 3330 4170 3334h 1000 100 1100 500 1110 67.01i 41.7 14.3 5000 100 1430 28.62i H Bu H 6.25 7.69 3330 11.1 357 1.823i 500 313 4300 2220 1820 2784i 1430 66.7 500 200 1110 66.71j 66.7 16.7 910 66.7 556 1252j H H H 10.0 11.1 2500 5.00 833 16.73j 769 1110 1900 4000 3330 13304j 4550 333 560 714 1670 333IND 10,000 300 250 300 1400 100EZA 14.0 0.71 33.0 0.71 36.0 13.0AZM 1400 17.0 180 17.0 133 50.0

Average standard deviation for TSA data was below 25%. The Kd for compounds 1(a–j) and 4(a–j) binding to CA I, II, VII, and XIII are taken from our previously published data.1

Table 2Selected compound dissociation constants for human recombinant CA isoforms I, II,VII, XII, and XIII, determined by isothermal titration calorimetry (ITC, 37 �C, pH 7.0)

Compound Dissociation constants Kd (nM), CA isoforms

CA I CA II CA VII CA XII CA XIII

2a 610 20.2 87.5 278 37.52f 610 14.5 60.6 461 8.12h 610 9.9 26.0 282 610

E. Capkauskaite et al. / Bioorg. Med. Chem. 21 (2013) 6937–6947 6939

In the whole series, the compounds 2(a–j) had the highest bind-ing affinity to CA I, II, VII, and XIII. Pyrimidines without oxo groupexhibited the strongest binding to CA II (Kd = 7.1–16.7 nM), VII(Kd = 5.0–16.7 nM), and XIII (Kd = 1.3–16.7 nM) than oxopyrimi-dines (Kd = 20–111 nM, and 25–100 nM, except 2d, and 25–83 nM, except 2d, respectively). Carbon chain elongation in the5th position 2(g–i) did not significantly affect the binding affinityfor CAs but the introduction of carbon chain significantly increasedthe affinity for CA XIII (Kds in the range 1.3–2.1 nM) by more thaneight times as compared to a unsubstituted pyrimidine 2j(Kd = 16.7 nM). Compound 2j bearing no substituent was the mostpotent CA VII inhibitor (Kd = 5 nM).

Compounds 3(a–j) were the weakest CA II, VI, VII, XII, andXIII inhibitors (Kds in the range 170–40000 nM). Most of themhad higher affinity only to CA I, with the exception for oxopyr-imidines 3b and 3e bearing bulky substituents in 5th position,which bound to CA I with micromolar affinity (Kds 2.2 and1.3 lM, respectively). tert-Butyl substituted compound 3d hadthe highest binding affinity to CA I (Kd = 100 nM) and XIII(Kd = 167 nM).

Compounds 4 exibited several interesting features. First, asmentioned above, compounds 4(a–j) showed inverted CA I inhibi-tion properties as compared with series 1–3. Second, the influenceof oxo group in pyrimidines to CA II and VII binding was reversed.Oxopyrimidines exhibited stronger binding to CA I (Kd = 100–830 nM, except 4e), II (Kd = 33–67 nM, except 4a), VI (Kd = 200–900 nM), VII (Kd = 20.0–143 nM), and XII (Kd = 44–500 nM) thanpyrimidines without oxo group (Kd = 1000–4550 nM (CA I), 67–333 nM (CA II), 560–1100 nM (CA VI), 200–714 nM (CA VII), and1110–1670 nM (CA XII), respectively). Compound 4d was the bestinhibitor of CA XII in the whole series of tested compounds(Kd = 44 nM), while compound 4e was the most potent CA VIinhibitor.

020406080 A

CA VII-3j

200

0

Fluo

resc

ence

inte

nsity

, a.u

40 50 60 700

20406080 B

CA VII-2j

200

T, oC

0

45

50

55

60

65C

CA VII

Kd (3j) = 4 µM

Kd (2j) = 5 nM

010-6 10-5 10-4 10-355

60

65

70

75 D

CA I

Kd(2d) = 0.5 nM

Kd (3c) = 500 nM

T m,o C

Lt, M

Figure 2. The measurements of compound binding to CA I and VII as determined bythe thermal shift assay (TSA). Panel A: the fluorescence melting curves of CA VIIwith 2j. Panel B: the fluorescence melting curves of CA I with 3j. Panel C: themelting temperatures (Tm) from data in panel A and B plotted as a function of added2j (j) and 3j (N) concentration. Panel D: TSA data for 2d, 1d, 2c, 1c, 1a, and 3cbinding to CA I. The binding affinities of selected compounds ranged from 0.5 nMfor 2d to 500 nM for 3c.


2.1.2. Analysis of the selectivity of bindingCompounds were termed selective if the affinities towards at

least two isoforms differed at least 25 fold (Table 3). According

Figure 3. Compound affinities grouped according to compound headgroups for each CAeach for 10 tailgroups with the affinity range depicted as error bars. The figure showsstronger than meta-sulfonamides to most CAs, but not to CA VI. Affinities are not only d

to this criterion, the compounds described in this study exhibitedselectivity mostly for CA I, especially the oxopyrimidines withheadgroup 2. The 6-substituted oxopyrimidines, namely, 2a, 2c,and 2d, are the best inhibitors, selective for CA I. tert-Butyl substi-tuted oxopyrimidine 2d (Kd = 0.5 nM) could be distinguished as themost effective and selective CA I inhibitor against CA II, VI, VII, XII,and XIII, with the selectivity ratio in the range of 10–18000 fold.

Three compounds with headgroup 1, 5-alkyl substituted (1gand 1i) and unsubstituted (1j) pyrimidines, showed similar CA IIbinding affinity (Kd = 12.5–16.7 nM). The alkyl chain insertion in-creased the CA XII/II selectivity ratio from 33 to 100 times andCA VI/II selectivity ratio from 55 to 400 times. However, comparedto CA II binding to other CA isoforms in general, the unsubstitutedpyrimidine derivative 1j remained more selective (selectivity ratioover CA I, VII, and XIII was from 4 to 7.5 times).

Compounds 2j and 4e exhibited selectivity for CA VII. However,in almost all cases CA VII was inhibited weaker than CA II (exceptfor 2c, 2d, and 4d where CA VII was inhibited from 2.2 up to 3.6times stronger than CA II) and CA XIII (except 1c, 3e, and 2e, wherethe binding of CA VII was from 2.1 to 3.1 times stronger than CAXIII).

Several of the best CA XIII binding compounds, the 5-ethylpyr-imidine 2g, 5-butylpyrimidine 2i, and 5-propylpyrimidine 2h(Kd = 1.3–2.1 nM) also showed CA XIII selectivity properties (CA I,II and VII were bound from 3.2 to 13 times less, CA XII bound from140 to 280-fold less, and CA VI was bound from 1800 to 2600-foldless strongly than CA XIII).

None of the compounds exhibited selectivity for CA VI or XII iso-forms over other CAs.

2.2. Crystallography

The crystal structures of inhibitors 2j, 2f, and 3j bound to re-combinant human CA isoforms II, XII (catalytic domain), and XIIIwere solved to atomic resolution in order to compare the bindingin the three different CA active sites. The data collection and refine-ment statistics as well as PDB access codes are presented in Sup-plementary Table 1. Electron densities of the compounds arepresented in Supplementary Figure 1. Crystal structures of com-pounds with headgroups 1 and 4 bound to CA II have been

isoform I, II, VI, VII, XII, and XIII. The bars show averages of Kd in logarithmic scale,the tendencies of affinities towards the listed isozymes. para-Sulfonamides bind

ependent on the structure of the compound, but also on the CA isozyme.

Figure 4. Crystal structures of CA isoforms bound with 2j, 2f, and 3j. Compound 2j and 2f bound in the active site of CA II are shown in yellow, 2j and 3j bound to CA XII arecyan, and 2j and 2f bound to CA XIII are colored in pink. Zn2+ is shown as a pink sphere. Amino acids and their surfaces that make van der Waals contacts with inhibitors areshown in orange, side chains and surfaces of active site residues that do not contact with inhibitors are colored in cyan. Hydrogen bonds are shown as red dotted lines. Bluesmall spheres are water molecules. Solvent molecules (ethyleneglycol or PEG) are colored in green.

Table 3Compound binding selectivity for CA isozymes I, II, VII, and XIII

Compound Kd (nM) to CA I Ratio

R3 R4 R5 CA II/I CA VI/I CA VII/I CA XII/I CA XIII/I

Compounds selective for CA I2d (0.5) OH H t-Bu 80 18,000 22 670 102f (5.0) Me H Me 3.3 580 2.5 180 2.02a (4.0) OH H Me 5.3 630 8.9 83 8.32c (10) OH H Pr 11 450 5.0 25 8.31c (17) OH H Pr 4.83 73 14.5 5.27 3.633f (370) Me H Me 2.70 35 18.0 9.00 2.70

Compound Kd (nM) to CA II Ratio

R3 R4 R5 CA I/II CA VI/II CA VII/II CA XII/II CA XIII/II

Compounds selective for CA II1i (14.3) H Bu H 2.9 350 7.0 100 2.01g (12.5) H Et H 2.4 400 4.4 80 2.31j (16.7) H H H 4.0 55 4.0 33 7.5

Compound Kd (nM) to CA VII Ratio

R3 R4 R5 CA I/VII CA II/VII CA VI/VII CA XII/VII CA XIII/VII

Compounds selective for CA VII2j (5.0) H H H 2.0 2.2 500 170 3.34e (25) OH CO2Et H 50 2.0 8.0 8.0 5.0

Compound Kd (nM) to CA XIII Ratio

R3 R4 R5 CA I/XIII CA II/XIII CA VI/XIII CA VII/XIII CA XII/XIII

Compounds selective for CA XIII2h (1.3) H Pr H 4.2 5.7 2600 13 2802i (1.8) H Bu H 3.4 4.2 1800 6.1 2002g (2.1) H Et H 3.2 3.4 2400 4.8 140



published previously1 and thus can be compared with the crystalstructures described in this manuscript (Fig. 4).

The benzenesulfonamide moieties of headgroup 1 (1a, 1i, 1f,and 1j in CA II, PDB ID 3SX8, 3SAP, 3SBH, and 3SBI, respectively1

and headgroup 3 compounds (3j in CA XII) are found in a verysimilar position as in the crystal structure PDB ID 2WEJ17 (Supple-mentary Fig. 2, panel A) in CA II. The position of the 2-chloroben-zenesulfonamide moiety of compounds 2 (2j in CA II, CA XII andCA XIII and 2f in CA II and CA XIII) and 4 (4f and 4g in CA II, PDBID 3S9T and 3SAX, respectively1 is similar in all three isoforms(Supplementary Fig. 2, panel B) and coincides with the crystalstructure PDB ID 2WEH.17 The orientation of the ring is determinedby chlorine substituent17 which is found in the hydrophobicpocket.

Compounds 1 bind in a very similar mode to CA II active sitewith the pyrimidine ring positioned between Phe131 and Pro202as described previously.1 The long hydrophobic butyl group ofcompound 1i is orientated along the hydrophobic edge of the ac-tive site wall in CA II formed by Pro202. It seems that this substi-tuent drives the pyrimidine ring further towards Pro202. Indeed,the binding of 1i to CAII is one of the strongest among compounds1 (Table 1). In other three cases (1a, 1f, and 1j), the binding of com-pounds 1 to the CA II active site does not seem to depend on thepyrimidine ring substituents.

Compounds 2 are represented by the crystal structures of 2jbound to CA II, CA XII, and CA XIII (Fig. 4, panels A–C) and 2f boundto CA II and CA XIII (Fig. 4, panels D and F). Since the CA XIII asym-metric unit cell contains two protein chains, we chose the proteinchain B in the further analysis of CA XIII–2j complex, where 2j wasmodeled in two alternative conformations (panel C in Supplemen-tary Figs. 1 and 4). Similarly, one representative protein chain waschosen in CA XII–2j (chain D) and CA XIII–2f (chain A) crystal struc-tures, because the positions of ligands are very similar betweenprotein subunits in these complexes.

The orientation of 2j in the active sites of CA XIII and CA II is thesame. The pyrimidine is orientated between Pro202 (Pro204 in CAXIII) and Phe131 (Phe133 in CA XIII). The alternative conformationof 2j in CA XIII locates the pyrimidine on the other side of Phe133(Fig. 4, panel C). Interestingly, nitrogen atoms of the pyrimidinering in this alternative conformation make hydrogen bonds withArg93 and Gln94, whereas the sulfur of the linker interacts withGln94. Compound 2f in CA XIII probably due to more bulky dim-ethylpyrimidine substituent is shifted more towards the center ofthe substrate-binding pocket in CA XIII, than 2j (SupplementaryFig. 3, panel A). In CA XII, the pyrimidine ring of 2j compound is ori-ented along the loop that is made of residues with short side chainsAla129 and Ser130 (Supplementary Fig. 3, panel B). Such orienta-tion is impossible in the active sites of neither CA II nor CA XIII, be-cause the position is occupied by phenylalanine. In addition, thereis also a hydrogen bond between pyrimidine nitrogen of 2j andSer130 of CA XII (Fig. 4, panel B and Supplementary Fig. 3, panelB). The Kd of 2j for CA XII is 833 nM, and the Kd s for CA II and XIIIare 11.1 and 16.7 nM, respectively (Table 1). The weaker binding of2j to CA XII could be explained by lesser van der Waals contactswith the protein side chains, not compensated by the hydrogenbond.

Compounds 3 are represented by the crystal structure of 3j inCA XII (Fig. 4, panel E). The asymmetric unit of CA XII crystals con-tains four protein chains; the ligand in all subunits is bound in asimilar way, therefore we chose the ligand bound to the chain Dfor further analysis. The principal difference of the CA XII active sitefrom CA II as well as CA XIII is the absence of phenylalanine sidechain. A small nonpolar side chain of alanine (Ala129) takes placeof Phe131 in CA XII. Therefore, when the first ring of 3j in CA XIIcoincides with those of the compounds 1 in CA II, the meta-posi-tioned linker of 3j is directed towards the loop carrying Ala129.

Such an orientation would not be possible in CA II due to the bulkyside chain of Phe131. The pyrimidine ring of 3j in CA XII is locatedat the same edge of the active site as group 1 pyrimidines, but inthe different (orthogonal) orientation, which is favored addition-ally by the hydrogen bond between pyrimidine and hydroxyl groupof Ser133 in CA XII.

It is interesting to compare the binding of Cl-benzenesulfon-amide containing compounds between groups 2 and 4 which differby the position of pyrimidine substituents. The binding of com-pounds 4, namely, 4f and 4g in the active site of CA II has been de-scribed previously1 (PDB ID 3S9T and 3SAX, respectively). Theorientation of the linker of compounds 4 is fixed by the hydrogenbonds between carbonyl oxygen and Gln92 and Asn67 in CA II. Thishydrogen bonding defines the orientation of the pyrimidine incompounds 4, which is not possible for the para-positioned pyrim-idines of the compounds 2 due to steric clash with phenylalanine.The para-linker, as in groups 1 and 2, allows the second ring to bepositioned further towards the Pro202 and Phe131 and allows forthe van der Waals interaction with Val135, which could not bereached by the pyrimidine moiety of compounds 4. These addi-tional interactions of compounds 2 with hydrophobic amino acidscan influence more than 10 times higher binding affinity of theseinhibitors to tested CAs than compounds 4.

The binding of compounds 2 and 3 can be compared by super-imposing 2j and 3j in the active site of CA XII (SupplementaryFig. 4). Since there is no phenylalanine in the active site of CAXII, the linker is oriented in a different way than in CA II and XIII.In the complexes with CA XII, the pyrimidine rings of both com-pounds coincide, because meta- and para-positions of linkers com-pensate for the different orientations of the chlorobenzene andbenzene rings. Both compounds make hydrogen bonds withSer130 or Ser133 of CA XII. The Kd of 2j for CA XII is 833 nM, andthe Kd of 3j is 3330 nM (Table 1), thus 2j binds four times strongerthan 3j. Therefore, the hydrogen bond of the pyrimidine ring is notimportant for the binding of the ligand. The presence of chlorine inthe headgroup ring influenced the binding more strongly, than thesubstituents in the pyrimidine ring.

3. Conclusions

Two novel series of carbonic anhydrase inhibitors, 2-chloro-4-{[(pyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetyl}benzenesulfonamides and 3-{[(pyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetyl}benzenesulfonamides, weresynthesized and characterized. Their binding to six recombinanthuman CA I, II, VI, VII, XII, and XIII was determined by the thermalshift assay and confirmed by ITC and stopped-flow CO2 hydrationassay. Compounds described here were compared with previouslypublished pyrimidinebenzenesulfonamides. The binding affinity ofpara-substituted benzenesulfonamides was found to be greaterthan meta-substituted derivatives. The introduction of ortho-chlo-rine to the para-substituted benzensulfonamide inverts theselectivity of inhibitors from CA II to CA I. Compound 2d {[(4-tert-butyl-6-oxo-1,6-dihydropyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetyl}-2-chlorobenzenesulfonamide had subnanomolar affinity for CA I(Kd = 0.5 nM) and was highly selective for CA I, a rare featureamong benzenesulfonamides. X-ray crystallographic structuresprovided structural details of inhibitor binding to CA II, XII, and XIIIand will be used for the further development of selective CA inhib-itors. The benzenesulfonamide moieties of headgroup 1 (in CA II)and headgroup 3 (in CA XII) compounds are found in a very similarposition. The position of the 2-chlorobenzenesulfonamide moietyof compounds 2 (in CA II, XII and XIII) and 4 (in CA II) is similarin all three isoforms. Decreased affinity of compounds for CA XII,compared with CA II and XIII can be explained by the more hydro-philic nature of the CA XII binding site and substitution of amino


acid Phe131 (Phe133 in CA XIII), which makes van der Waals con-tacts with inhibitors in CA II and XIII by Ala131 in CA XII.

4. Experimental section

4.1. Chemistry

Synthesis of 4-(bromoacetyl)benzenesulfonamide (1) and 3-(bromoacetyl)benzenesulfonamide (3) was achieved from com-mercially available 1-(4-aminophenyl)ethanone and 1-(3-amino-phenyl)ethanone, respectively, as described in Ref. 18. Synthesisof 4-(bromoacetyl)-2-chlorobenzenesulfonamide (2) was accom-plished from 1-(4-amino-3-chlorophenyl)ethanone as describedin Ref. 18. 1-(4-amino-3-chlorophenyl)ethanone was synthesizedby chlorination of 1-(3-aminophenyl)ethanone with N-chlorosuc-cinimide in acetonitrile.19,20 Synthesis of 5-(2-bromoacetyl)-2-chlorobenzensulfonamide (4) was accomplished from commer-cially available 1-(4-chloro-3-nitrophenyl)ethanone as describedin Refs. 18,21.

2-Mercaptopyrimidines a, c, e, f, h, and j are commerciallyavailable. 6-Alkyl-2-thioxo-2,3-dihydro-4(1H)-pyrimidinones b,22

c,23 and d23 were synthesized by condensation of an appropriatelysubstituted b-keto ester with thiourea. 5-Alkyl-2(1H)-pyrimidin-ethiones g and i were prepared from thiourea and 2-alkyl-1,1,3,3-tetraethoxypropane as described previously.24 All ingredi-ents were purchased from Sigma–Aldrich and Alfa Aesar GmbH.

The melting points of the compounds were determined in opencapillaries on a Thermo Scientific 9100 Series apparatus withoutfurther correction. IR spectra were obtained on a Perkin–ElmerFT-IR spectrophotometer Spectrum BX II in KBr. 1H and 13C NMRspectra were recorded on a Varian Unity Inova spectrometer (300and 75 MHz, respectively) in DMSO-d6 using residual DMSO sig-nals (2.52 and 40.21 ppm for 1H and 13C NMR spectra, respectively)as the internal standard. TLC was performed with silica gel 60 F254aluminum plates (Merck) and visualized with UV light. High-reso-lution mass spectra (HRMS) were recorded on a Dual-ESI Q-TOF6520 mass spectrometer (Agilent Technologies). The purity of tar-get compounds was controled using an HPLC system with UVdetection.

4.1.1. General procedure for the syntheses of 2a–j and 3a–jA mixture of the corresponding pyrimidine (a–j) (0.360 mmol),

appropriate compound 2 or 3 (0.360 mmol), and sodium acetate(33.9 mg, 0.414 mmol) in tetrahydrofuran (3 ml) was stirred atroom temperature for 24 h. The reaction mixture was poured intowater. The precipitate was filtered off, washed with water and thenwith diethyl ether to yield 2a–j or 3a–j.

4.1.1.1. 2-Chloro-4-{[(4-methyl-6-oxo-1,6-dihydropyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetyl}benzenesulfonamide (B18) (2a). Yield79%, mp 179–181 �C. IR m cm�1: 3351, 3257 (NH2, NH), 1699(CO), 1664 (CONH). 1H NMR d ppm: (1:0.92) 1.95 (3H, s, CH3, openchain form (o)), 2.17 (2.79H, s, CH3, cyclic form (c)), 3.55 (0.92H, d,J = 12.6 Hz, CH2COH, c), 3.69 (0.92H, d, J = 12.3 Hz, CH2COH, c), 4.73(2H, s, CH2CO, o), 5.93 (0.92H, s, C50-H, c), 5.97 (1H, br s, C50-H, o),7.55 (0.92H, d, J = 8.1 Hz, C5-H, c), 7.66 (1.84H, s, NH2, c), 7.72(0.92H, s, C3-H, c), 7.85 (2H, s, NH2, o), 7.96 (0.92H, d, J = 8.4 Hz,C6-H, c), 8.14 (2H, s, C5,6-H, o), 8.24 (1H, s, C3-H, o), 12.49 (1H, brs, NH, o). HRMS calcd for C13H12ClN3O4S2 ([M+H]+): 374.0031,found: 374.0027.

4.1.1.2. 3-{[(4-Methyl-6-oxo-1,6-dihydropyrimidin-2-yl)sulfa-nyl]acetyl}benzenesulfonamide (C18) (3a). Yield 77%, mp169–171 �C. IR m cm�1: 3308, 3211 (NH2, NH), 1708 (CO), 1638(CONH). 1H NMR d ppm: (1:0.19) 1.93 (3H, s, CH3, o), 2.19

(0.57H, s, CH3, c), 3,57 (0,19H, d, J = 12,6 Hz, CH2COH, c), 3,63(0,19H, d, J = 12,3 Hz, CH2COH, c), 4.76 (2H, s, CH2CO, o), 5.95(0.19H, s, C50-H, c), 5.97 (1H, br s, C50-H, o), 7.43 (0.38H, s, NH2,c), 7.56–7.63 (2.38H, m, NH2, o, C4,5-H, c), 7.77–7.82 (1.38H, m,C5-H, o, C6-H, c), 7.94 (0.19H, s, C2-H, c), 8.11 (1.19H, d, J = 8.1 Hz,C4-H, o, OH, c), 8.31 (1H, d, J = 8.1 Hz, C6-H, o), 8.45 (1H, s, C2-H,o), 12.62 (1H, br s, NH, o). HRMS calcd for C13H13N3O4S2

([M+H]+): 340.0420, found: 340.0424.

4.1.1.3. 4-{[(5-Benzyl-4-methyl-6-oxo-1,6-dihydropyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetyl}-2-chlorobenzenesulfonamide (B19) (2b). Yield90%, mp 138–140 �C. IR m cm�1: 3386, 3249 (NH2, NH), 1664 (CO),1648 (CONH). 1H NMR d ppm: (1:0.95) 1.94 (3H, s, CH3, o), 2.20(2.85H, s, CH3, c), 3.55–3.74 (5.80H, m, CH2COH, c, CH2Ph, o, c), 4.73(2H, s, CH2CO, o), 7.12–7.27 (9.75H, m, Ph-H, o, c), 7.60 (0.95H, dd,J = 8.4, 1.8 Hz, C5-H, c), 7.68 (1.90H, s, NH2, c), 7.73 (0.95H, d,J = 1.8 Hz, C3-H, c), 7.85 (2H, s, NH2, o), 7.97 (0.95H, d, J = 8.1 Hz,C6-H, c), 8.14 (2H, s, C5,6-H, o), 8.24 (1H, s, C3-H, o), 12.55 (1H, br s,NH, o). HRMS calcd for C20H18ClN3O4S2 ([M+H]+): 464.0500, found:464.0507.

4.1.1.4. 3-{[(5-Benzyl-4-methyl-6-oxo-1,6-dihydropyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetyl}benzenesulfonamide (C19) (3b). Yield73%, mp 165–167 �C. IR m cm�1: 3264, 3234 (NH2, NH), 1688(CO), 1637 (CONH). 1H NMR d ppm: (1:0.27) 1.92 (3H, s, CH3, o),2.20 (0.81H, s, CH3, c), 3.63-3.70 (3.08H, m, CH2COH, c, CH2Ph, o,c), 4.76 (2H, s, CH2CO, o), 7.17–7.25 (6.35H, m, Ph-H, o, c), 7.43(0.54H, s, NH2, c), 7.56–7.63 (2.54H, m, NH2, o, C4,5-H, c), 7.76–7.81 (1.27H, m, C5-H, o, C6-H, c), 7.99 (0.27H, s, C2-H, c), 8.12(1H, d, J = 7.8 Hz, C4-H, o), 8.31 (1H, d, J = 7.2 Hz, C6-H, o), 8.46(1H, s, C2-H, o), 12.80 (1H, br s, NH, o). HRMS calcd for C20H19N3O4-

S2 ([M+H]+): 430.0890, found: 430.0892.

4.1.1.5. 2-Chloro-4-{[(6-oxo-4-propyl-1,6-dihydropyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetyl}benzenesulfonamide (B20) (2c). Yield77%, mp 178–180 �C. IR m cm�1: 3370, 3247 (NH2, NH), 1655(CO), 1641 (CONH). 1H NMR d ppm: (1:0.75) 0.68 (3H, t,J = 7.2 Hz, CH3, o), 0.93 (2.25H, t, J = 7.2 Hz, CH3, c), 1.21–1.33(2H, m, CH2, o), 1.57–1.69 (1.50H, m, CH2, c), 2.12 (2H, t,J = 6.6 Hz, CH2, o), 2.41 (1.50H, t, J = 7.2 Hz, CH2, c), 3.55 (0.75H,d, J = 12.6 Hz, CH2COH, c), 3.71 (0.75H, d, J = 12.3 Hz, CH2COH, c),4.72 (2H, s, CH2CO, o), 5.91 (0.75H, s, C50-H, c), 5.93 (1H, br s, C50-H, o), 7.56 (0.75H, d, J = 8.1 Hz, C5-H, c), 7.67 (1.50H, s, NH2, c),7.73 (0.75H, s, C3-H, c), 7.86 (2H, s, NH2, o), 7.97 (0.75H, d,J = 8.4 Hz, C6-H, c), 8.07 (0.75H, br s, OH, c), 8.15 (2H, s, C5,6-H, o),8.25 (1H, s, C3-H, o), 12.67 (1H, br s, NH, o). HRMS calcd for C15H16-

ClN3O4S2 ([M+H]+): 402.0344, found: 402.0346.

4.1.1.6. 3-{[(6-Oxo-4-propyl-1,6-dihydropyrimidin-2-yl)sulfa-nyl]acetyl}benzenesulfonamide (C20) (3c). Yield 83%, mp189–191 �C. IR m cm�1: 3311 (NH2, NH), 1707 (CO), 1638 (CONH).1H NMR d ppm: (1:0.18) 0.65 (3H, t, J = 7.5 Hz, CH3, o), 0.92(0.54H, t, J = 7.5 Hz, CH3, c), 1.25 (2H, sext, J = 7.2 Hz, CH2, o),1.63 (0.36H, sext, J = 7.5 Hz, CH2, c), 2.13 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2,o), 2.41 (0.36H, t, J =7.2 Hz, CH2, c), 3.59 (0.18H, d, J =12.6 Hz, CH2-

COH, c), 3.63 (0.18H, d, J =12.9 Hz, CH2COH, c), 4.75 (2H, s, CH2CO,o), 5.93 (1.18H, br s, C50-H, c, C50-H, o), 7.43 (0.36H, s, NH2, c), 7.57–7.63 (2.36H, m, NH2, o, C4,5-H, c), 7.77–7.82 (1.36H, m, C5-H, o, C6-H, c), 7.95 (0.18H, s, C2-H, c), 8.03 (0.18H, OH, c), 8.11 (1H, d, J=7.8 Hz, C4-H, o), 8.33 (1H, d, J =8.1 Hz, C6-H, o), 8.44 (1H, s, C2-H, o), 12.42 (1H, br s, NH, o). HRMS calcd for C15H17N3O4S2

([M+H]+): 368.0733, found: 368.0732.

4.1.1.7. 4-{[(4-tert-Butyl-6-oxo-1,6-dihydropyrimidin-2-yl)sulfa-nyl]acetyl}-2-chlorobenzenesulfonamide (B21) (2d). Yield88%, mp 183–185 �C. IR m cm�1: 3347, 3273 (NH2, NH), 1707 (CO),


1641 (CONH). 1H NMR d ppm: (1:0.75) 0.97 (9H, s, (CH3)3, o), 1.22(6.75H, s, (CH3)3, c), 3.54 (0.75H, d, J = 12.3 Hz, CH2COH, c), 3.72(0.75H, d, J = 12.3 Hz, CH2COH, c), 4.82 (2H, s, CH2CO, o), 5.92(0.75H, s, C50-H, c), 5.98 (1H, br s, C50-H, o), 7.57 (0.75H, dd, J = 8.4,1.8 Hz, C5-H, c), 7.67 (1.50H, s, NH2, c), 7.74 (0.75H, d, J = 1.8 Hz,C3-H, c), 7.87 (2H, s, NH2, o), 7.97 (0.75H, d, J = 8.1 Hz, C6-H, c),8.13–8.20 (2H, m, C5,6-H, o), 8.25 (1H, s, C3-H, o), 12.62 (1H, br s,NH, o). HRMS calcd for C16H18ClN3O4S2 ([M+H]+): 416.0500, found:416.0501.

4.1.1.8. 3-{[(4-tert-Butyl-6-oxo-1,6-dihydropyrimidin-2-yl)sul-fanyl]acetyl}benzenesulfonamide (C21) (3d). Yield 88%,mp 191–193 �C. IR m cm�1: 3345, 3225 (NH2, NH), 1707 (CO),1646 (CONH). 1H NMR d ppm: (1:0.20) 0.96 (9H, s, (CH3)3, o),1.22 (1.80H, s, (CH3)3, c), 3.58 (0.20H, d, J = 12.3 Hz, CH2COH, c),3.65 (0.20H, d, J = 12.3 Hz, CH2COH, c), 4.82 (2H, s, CH2CO, o),5.92 (0.20H, s, C50-H, c), 5.97 (1H, br s, C50-H, o), 7.43 (0.40H, s,NH2, c), 7.57–7.63 (2.40H, m, NH2, o, C4,5-H, c), 7.78–7.83 (1.40H,m, C5-H, o, C6-H, c), 7.97 (0.20H, s, C2-H, c), 8.02 (0.20H, OH, c),8.12 (1H, d, J = 7.5 Hz, C4-H, o), 8.35 (1H, d, J = 8.1 Hz, C6-H, o),8.44 (1H, s, C2-H, o), 12.62 (1H, br s, NH, o). HRMS calcd for C16H19-

N3O4S2 ([M+H]+): 382.0890, found: 382.0887.

4.1.1.9. Ethyl 2-({2-[4-(aminosulfonyl)-3-chlorophenyl]-2-oxo-ethyl}sulfanyl)-6-oxo-1,6-dihydropyrimidine-5-carboxylate(B23) (2e). Yield 91%, mp 303–305 �C. IR m cm�1: 3370, 3246(NH2, NH), 1728 (CO2Et, CO), 1702 (CONH). 1H NMR d ppm:(1:0.93) 1.20–1.27 (5.79H, m, CH3, o, c), 3.63 (0.93H, d,J = 12.6 Hz, CH2COH, c), 3.79 (0.93H, d, J = 12.6 Hz, CH2COH, c),4.15–4.23 (3.86H, m, CH2, o, c), 4.93 (2H, s, CH2CO, o), 7.64–7.68(2.79H, m, C5-H, c, NH2, c), 7.83 (0.93H, s, C3-H, c), 7.87 (2H, s,NH2, o), 7.98 (0.93H, d, J = 8.1 Hz, C6-H, c), 8.16 (2H, s, C5,6-H, o),8.24 (1H, s, C3-H, o), 8.32 (1H, s, C40-H, o), 8.46 (0.93H, s, C40-H,c), 13.45 (1H, br s, NH, o). HRMS calcd for C15H14ClN3O6S2

([M+H]+): 432.0085, found: 432.0080.

4.1.1.10. Ethyl 2-({2-[3-(aminosulfonyl)phenyl]-2-oxoethyl}sulfanyl)-6-oxo-1,6-dihydropyrimidine-5-carboxylate (C23)(3e). Yield 89%, mp 255–257 �C. IR m cm�1: 3369, 3232(NH2, NH), 1731 (CO2Et), 1699 (CO), 1687 (CONH). 1H NMR dppm: (1:0.19) 1.17–1.27 (3.57H, m, CH3, o, c), 3.67 (0.19H, d,J = 12.9 Hz, CH2COH, c), 3.73 (0.19H, d, J = 12.9 Hz, CH2COH, c),4.15–4.23 (2.38H, m, CH2, o, c), 4.96 (2H, s, CH2CO, o), 7.45(0.38H, s, NH2, c), 7.58–7.62 (2.19H, m, NH2, o, C5-H, c), 7.70(0.19H, d, J = 8.1 Hz, C4-H, c), 7.79–7.84 (1.19H, m, C5-H, o, C6-H,c), 8.03 (0.19H, s, C2-H, c), 8.13 (1H, d, J = 7.8 Hz, C4-H, o),8.30–8.33 (1.19H, m, C6-H, o, C40-H, c), 8.45 (1H, s, C2-H, o), 8.47(0.19H, s, C40-H, c), 13.47 (1H, br s, NH, o). HRMS calcd forC15H15N3O6S2 ([M+H]+): 398.0475, found: 398.0474.

4.1.1.11. 2-Chloro-4-{[(4,6-dimethylpyrimidin-2-yl)sulfa-nyl]acetyl}benzenesulfonamide (B24) (2f). Yield 68%, mp155–157 �C. IR m cm�1: 3294 (NH2), 1698 (CO). 1H NMR d ppm:2.24 (6H, s, 2CH3), 4.71 (2H, s, CH2CO), 6.95 (1H, s, C50-H), 7.85(2H, s, NH2), 8.15 (2H, s, C5,6-H), 8.25 (1H, s, C3-H). 13C NMR dppm: 23.8, 38.3, 116.8, 127.8, 130.1, 131.5, 131.6, 141.1, 145.0,167.7, 169.3, 194.2. HRMS calcd for C14H14ClN3O3S2 ([M+H]+):372.0238, found: 372.0235.

4.1.1.12. 3-{[(4,6-Dimethylpyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetyl}ben-zenesulfonamide (C24) (3f). Yield 80%, mp 174–176 �C. IR mcm�1: 3287 (NH2), 1701 (CO). 1H NMR d ppm: 2.23 (6H, s, 2CH3),4.72 (2H, s, CH2CO), 6.94 (1H, s, C50-H), 7.55 (2H, s, NH2), 7.78(1H, t, J = 7.8 Hz, C5-H), 8.11 (1H, d, J = 7.8 Hz, C4-H), 8.32 (1H, d,J = 7.8 Hz, C6-H), 8.45 (1H, s, C2-H). 13C NMR d ppm: 23.9, 38.1,116.8, 125.8, 130.4, 130.5, 132.2, 137.9, 145.5, 167.7, 169.4,

194.7. HRMS calcd for C14H15N3O3S2 ([M+H]+): 338.0628, found:338.0627.

4.1.1.13. 2-Chloro-4-{[(5-ethylpyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetyl}benzenesulfonamide (B25) (2g). Yield 85%, mp 87–9 �C. IRm cm�1: 3272 (NH2), 1687 (CO). 1H NMR d ppm: 1.16 (3H, t,J = 7.5 Hz, CH3), 2.54 (2H, q, J = 7.5 Hz, CH2), 4.82 (2H, s, CH2CO),7.87 (2H, s, NH2), 8.16 (2H, s, C5,6-H), 8.24 (1H, s, C3-H), 8.48 (2H,s, C40 ,60-H). 13C NMR d ppm: 15.6, 22.9, 39.0, 127.9, 130.2, 131.7(2C), 133.0, 140.5, 145.2, 157.8, 167.5, 193.4. HRMS calcd for C14-

H14ClN3O3S2 ([M+H]+): 372.0238, found: 372.0241.

4.1.1.14. 3-{[(5-Ethylpyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetyl}benzene-sulfonamide (C25) (3g). Yield 80%, mp 131–133 �C. IR mcm�1: 3321 (NH2), 1679 (CO). 1H NMR d ppm: 1.16 (3H, t,J = 7.8 Hz, CH3), 2.50–2.55 (2H, m, CH2, superposed with DMSO),4.85 (2H, s, CH2CO), 7.57 (2H, s, NH2), 7.80 (1H, t, J = 7.8 Hz, C5-H), 8.12 (1H, d, J = 7.8 Hz, C4-H), 8.33 (1H, d, J = 7.8 Hz, C6-H),8.46 (1H, s, C2-H), 8.49 (2H, s, C40 ,60-H). 13C NMR d ppm: 15.6,22.9, 39.0, 125.8, 130.5, 130.7, 132.3, 133.0, 137.3, 145.5, 157.8,167.7, 193.7. HRMS calcd for C14H15N3O3S2 ([M+H]+): 338.0628,found: 338.0629.

4.1.1.15. 2-Chloro-4-{[(5-propylpyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetyl}benzenesulfonamide (B26) (2h). Yield 86%, mp 80–82 �C. IRm cm�1: 3362 (NH2), 1692 (CO). 1H NMR d ppm: 0.87 (3H, t,J = 7.5 Hz, CH3), 1.56 (2H, sext, J = 7.5 Hz, CH2), 2.48 (2H, t,J = 7.5 Hz, CH2), 4.83 (2H, s, CH2CO), 7.87 (2H, s, NH2), 8.16 (2H,s, C5,6-H), 8.24 (1H, s, C3-H), 8.47 (2H, s, C40 ,60-H). 13C NMR dppm: 14.1, 24.1, 31.5, 39.1, 127.9, 130.2, 131.5, 131.7 (2C), 140.5,145.2, 158.2, 167.6, 193.4. HRMS calcd for C15H16ClN3O3S2

([M+H]+): 386.0394, found: 386.0391.

4.1.1.16. 3-{[(5-Propylpyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetyl}benzene-sulfonamide (C26) (3h). Yield 78%, mp 125–127 �C. IR mcm�1: 3310, 3283 (NH2), 1698 (CO). 1H NMR d ppm: 0.88 (3H, t,J = 7.2 Hz, CH3), 1.56 (2H, sext, J = 7.5 Hz, CH2), 2.49 (2H, t, J =7.8 Hz, CH2), 4.85 (2H, s, CH2CO), 7.57 (2H, s, NH2), 7.80 (1H, t,J = 7.8 Hz, C5-H), 8.12 (1H, d, J = 7.8 Hz, C4-H), 8.33 (1H, d,J = 7.8 Hz, C6-H), 8.48 (3H, s, C2-H, C40 ,60-H). 13C NMR d ppm: 14.1,24.1, 31.5, 39.0, 125.9, 130.5, 130.7, 131.4, 132.3, 137.2, 145.5,158.2, 167.7, 193.7. HRMS calcd for C15H17N3O3S2 ([M+H]+):352.0784, found: 352.0783.

4.1.1.17. 4-{[(5-Butylpyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetyl}-2-chloro-benzenesulfonamide (B27) (2i). Yield 78%, mp 91–93 �C. IRm cm�1: 3327, 3272 (NH2), 1702 (CO). 1H NMR d ppm: 0.88 (3H,t, J = 7.5 Hz, CH3), 1.28 (2H, sext, J = 7.5 Hz, CH2), 1.52 (2H, quint,J = 7.2 Hz, CH2), 2.48–2.53 (2H, m, CH2, superposed with DMSO),4.82 (2H, s, CH2CO), 7.87 (2H, s, NH2), 8.16 (2H, s, C5,6-H), 8.24(1H, s, C3-H), 8.47 (2H, s, C40 ,60-H). 13C NMR d ppm: 14.3, 22.3,29.1, 33.0, 39.1, 127.9, 130.2, 131.7 (3C), 140.5, 145.2, 158.10,167.5, 193.4. HRMS calcd for C16H18ClN3O3S2 ([M+H]+): 400.0551,found: 400.0555.

4.1.1.18. 3-{[(5-Butylpyrimidin-2-yl)sulfanyl]acetyl}benzene-sulfonamide (C27) (3i). Yield 91%, mp 122–124 �C. IR mcm�1: 3310, 3273 (NH2), 1698 (CO). 1H NMR d ppm: 0.89 (3H, t,J = 7.5 Hz, CH3), 1.28 (2H, sext, J = 7.5 Hz, CH2), 1.52 (2H, quint,J = 7.2 Hz, CH2), 2.48–2.53 (2H, m, CH2, superposed with DMSO),4.85 (2H, s, CH2CO), 7.57 (2H, s, NH2), 7.80 (1H, t, J = 7.8 Hz, C5-H), 8.12 (1H, d, J = 7.8 Hz, C4-H), 8.33 (1H, d, J = 7.8 Hz, C6-H),8.47 (3H, s, C2-H, C40 ,60-H). 13C NMR d ppm: 14.3, 22.3, 29.2, 33.0,39.0, 125.9, 130.5, 130.7, 131.6, 132.3, 137.2, 145.5, 158.1, 167.7,193.7. HRMS calcd for C16H19N3O3S2 ([M+H]+): 366.0941, found:366.0943.

R1

R2

III

R1

R2

OS

HN

N R3

OR4

N

SHO N

O R4

R3

Scheme 2. Open chain I and cyclic II forms of compounds 2a–e and 3a–e.


4.1.1.19. 2-Chloro-4-[(pyrimidin-2-ylsulfanyl)acetyl]benzene-sulfonamide (B28) (2j). Yield 81%, mp 174–176 �C. IR mcm�1: 3334 (NH2), 1688 (CO). 1H NMR d ppm: 4.86 (2H, s, CH2CO),7.23 (1H, t, J = 4.8 Hz, C50-H), 7.86 (2H, s, NH2), 8.16 (2H, s, C5,6-H),8.25 (1H, s, C3-H), 8.59 (2H, d, J = 4.8 Hz, C40 ,60-H). 13C NMR d ppm:39.1, 118.2, 128.0, 130.2, 131.7 (2C), 140.4, 145.2, 158.5, 170.5,193.2. HRMS calcd for C12H10ClN3O3S2 ([M+H]+): 343.9925, found:343.9921.

4.1.1.20. 3-[(Pyrimidin-2-ylsulfanyl)acetyl]benzenesulfonamide(C28) (3j). Yield 78%, mp 176–178 �C. IR m cm�1: 3279 (NH2),1702 (CO). 1H NMR d ppm: 4.88 (2H, s, CH2CO), 7.23 (1H, t,J = 4.8 Hz, C50-H), 7.57 (2H, s, NH2), 7.81 (1H, t, J = 8.1 Hz, C5-H),8.12 (1H, d, J = 8.1 Hz, C4-H), 8.33 (1H, d, J = 7.8 Hz, C6-H), 8.47(1H, s, C2-H), 8.60 (2H, d, J = 4.8 Hz, C40 ,60-H). 13C NMR d ppm:38.6, 117.7, 125.4, 130.1, 130.3, 131.9, 136.8, 145.1, 158.0, 170.2,193.2. HRMS calcd for C12H11N3O3S2 ([M+H]+): 310.0315, found:310.0314.

4.1.2. Open and cyclic forms of the pyrimidinonesIn our previous research tautomerism of 1a–e and 4a–e was

investigated.1 An investigation of the 2a–e and 3a–e compoundstructures by NMR spectrocopy showed that the 1H and 13C NMRspectra of pyrimidinones in DMSO-d6 solution contained two setsof signals (Table 4). These results led to a suggestion that this phe-nomenon could be due to the existence of compounds 2a–e and3a–e in two forms: open chain I and cyclic II (Scheme 2).

4.2. Protein preparation

Expression and purification of CA II, VII, XII, and XIII has beenpreviously described: CA II in,25 CA VII and XIII in Ref. 26 and CAXII in Ref. 13.

The cDNA of CA I was purchased from RZPD Deutsches Ressour-cenzentrum für Genomforschung (Berlin, Germany). For recombi-nant protein production, a DNA fragment encoding CA I from 3to 291 amino acids was created from initial construct pCMV—SPORT6—CA I, using restriction endonuclease MboII, blunt-endedwith T4 DNA Polymerase and cloned into XhoI and NcoI sites ofpET15b vector. The recombinant CA I protein represents almostthe full length human protein, missing only two N-terminal aminoacids.

Expression of the recombinant CA I was done in Escherichia coliBL21 (DE3) strain (Novagen). Transformed cells colony was

Table 4Characteristic chemical shifts of 1H and 13C NMR spectra of open chain I and cyclic II form

Compound 13C NMR spectra

SCH2C@O in I SCH2OH in II SCH2C@O in I SCH2

2a 38.2 42.1 193.5 95.7

3a 38.0 42.6 193.9 96.6

2b 37.9 42.4 193.4 96.03b 37.9 42.8 193.9 97.02c 37.9 42.2 193.4 95.7

3c 38.0 42.6 193.7 96.6

2d 37.4 42.2 193.4 95.5

3d 37.4 42.6 192.9 96.4

2e 39.2 42.8 192.3 96.8

3e 39.2 42.6 192.7 96.8

transferred to LB medium, containing 100 ll/mg ampicillin andgrown at 37 �C and 220 rpm for 16 h. Then the saturated culturewas diluted (1:50) in fresh LB medium, containing 100 ll/mgampicillin, 60 lM ZnSO4 and grown at 37 �C and 220 rpm toOD600 � 0.8. The expression of CA I was induced with 0,2 mM iso-propyl b-D-thiogalactoside (IPTG) and 0.4 mM ZnSO4. The cellswere grown for 4 h at 30 �C, harvested by centrifugation at 4000gfor 20 min at 4 �C and lysed by sonication.

Soluble protein was purified using a Sepharose CL-6B, withlinked triazine dye yellow light resistant 2KT,27 followed by anionexchange chromatography on S-Sepharose (Amersham, GE Health-care Bio-Sciences AB, Uppsala).

Eluted protein was dialysed against the storage buffer contain-ing 20 mM N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N0-2-ethanesulphonicacid (HEPES, pH 7.8) and 0.05 M NaCl and stored at �80 �C. TheCA I preparations were analysed by SDS–PAGE to check for purityand found to be higher than 95%. Protein concentrations weredetermined by UV–VIS spectrophotometry using an extinctioncoefficient e280 = 44920 M�1 cm�1 and confirmed by the standardBradford method. Molecular weight of the protein has been con-firmed by mass spectrometry. Theoretical MW is 28799.1 Da andit was found to be 28799.6 Da.

The cDNA encoding CA VI from 21 to 290 amino acids wasamplified by PCR from full CA VI gene purchased from RZPD Deuts-ches Ressourcenzentrum für Genomforschung (Berlin, Germany),using forward primer with NdeI recognition site (underlined)—50

CCAGCATATGTCTGACTGGACCTAC 30 and reverse primer with XhoIrecognition site—50 CTTATGCTCGAGTTACTGGAATTCAGAGCC 30.The PCR product was cloned into the bacterial expression vectorpET15b (Novagen) via NdeI and XhoI restriction sites fusing a6�His-tag to the N terminus of the protein.

The resultant recombinant CA VI has the catalytic domain andlacks the signal and the N terminal sequences. Expression ofrecombinant CA VI was done in E. coli Rosetta2 (DE3) strain(Novagen). A colony of transformed cells was transferred to Brain

s of compounds 2a–e and 3a–e in DMSO-d6 solution

1H NMR spectra

COH in II SCH2CO in I SCH2 in II

4.73 (2H, s) 3.55 (0.92H, d, J = 12.6 Hz),3.69 (0.92H, d, J = 12.3 Hz)

4.76 (2H, s) 3.57 (0.19H, d, J = 12.6 Hz),3.63 (0.19H, d, J = 12.3 Hz)

4.73 (2H, s) 3.55-3.74 (5.80H, m, CH2COH, c, CH2Ph, o, c)4.76 (2H, s) 3.63-3.70 (3.08H, m, CH2COH, c, CH2Ph, o, c)4.72 (2H, s) 3.55 (0.75H, d, J = 12.6 Hz),

3.71 (0.75H, d, J = 12.3 Hz)4.75 (2H, s) 3.59 (0.18H, d, J = 12.6 Hz),

3.63 (0.18H, d, J = 12.9 Hz)4.82 (2H, s) 3.54 (0.75H, d, J = 12.3 Hz),

3.72 (0.75H, d, J = 12.3 Hz)4.82 (2H, s) 3.58 (0.20H, d, J = 12.3 Hz),

3.65 (0.20H, d, J = 12.3 Hz)4.93 (2H, s) 3.63 (0.93H, d, J = 12.6 Hz),

3.79 (0.93H, d, J = 12.6 Hz)4.96 (2H, s) 3.67 (0.19H, d, J = 12.9 Hz),

3.73 (0.19H, d, J = 12.9 Hz)


Heart Infusion (BHI) medium, containing 100 lg/ml ampicillin and34 lg/ml chloramphenicol and was grown at 37 �C and 220 rpmfor 16 h. Then the saturated culture was diluted (1:50) in freshBHI medium, containing 100 lg/ml ampicillin, 34 lg/ml chloram-phenicol, and 0.03 mM ZnSO4 and was grown to OD600 � 0.8. Theexpression of recombinant CA VI was induced with 1 mM isopropylb-D-thiogalactoside (IPTG) containing 0.3 mM ZnSO4. The culturewas grown for 20 h at 20 �C and 250 rpm. The cells were harvestedby centrifugation at 4000g for 20 min at 4 �C.

The pellet was suspended in lysis buffer (25 mM MES, 0.5% Tri-ton X-100, 0.1 M Na2SO4, pH 5.6, and 1 mM PMSF) containing theprotease inhibitor cocktail (Roche Applied Science, Indianapolis,IN). The cells were incubated at 4 �C for 60 min and then disruptedby sonication. The supernatant, containing soluble proteins, wasobtained after centrifugation at 20,000g for 25 min. Soluble proteinwas purified using a Sepharose–IDA–Ni+2 affinity column (GEHealthcare Bio-Sciences AB, Uppsala), followed by cation exchangechromatography on SP-Sepharose (GE Healthcare Bio-Sciences AB,Uppsala). Eluted protein was dialysed against the storage buffer(25 mM MES, 50 mM Na2SO4, pH 5.8) and stored at �80 �C.

The purity of CA VI was analysed by sodium dodecylsulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE). Protein concen-trations were determined by UV–VIS spectrophotometry using anextinction coefficient e280 = 52892.5 M�1 cm�1 and confirmed bythe standard Bradford method. Molecular weight of the proteinhas been confirmed by mass spectrometry. Theoretical MW is33180.9 Da and it was found to be 33050.0 Da. The difference of131.2 Da is attributed to the N-terminal Met.

4.3. Determination of compound binding and inhibition of CAs

4.3.1. Thermal shift assayThe thermal shift assay measurements were performed in a

Corbett Rotor-Gene 6000 (QIAGEN Rotor-Gene Q) instrument usingthe blue channel (excitation 365 ± 20, detection 460 ± 15 nm).Samples contained 5–10 lM protein, 0–200 lM compound,50 lM ANS (8-anilino-1-naphthalene sulfonate) in 50 mM phos-phate buffer (pH 7.0) containing 100 mM NaCl and the final DMSOconcentration 2%. The applied heating rate was 1 �C/min. Dataanalysis was performed as previously described.28

4.3.2. Isothermal titration calorimetryIsothermal titration calorimetry (ITC) experiments were per-

formed using ITC200 and/or VP-ITC instruments (Microcal, Inc.,Northampton, USA) with 5–20 lM protein solution in the celland 50–200 lM of the ligand solution in the syringe. A typicalexperiment consisted of 18 or 25 injections (2 or 10 ll each) addedat 2 or 3 min intervals, respectively for the two calorimeters.Experiments were performed at 37 �C in a 50 mM sodium phos-phate buffer containing 100 mM NaCl at pH 7.0, with a final DMSOconcentration of 2%, equal in the syringe and the cell.

4.3.3. CO2 hydration assayThe carbon dioxide hydration activity of the recombinant hu-

man CA II was measured using Applied Photophysics SX.18MV-Rstop-flow spectrometer according to Refs. 15,16.

4.4. Crystallography

4.4.1. CrystallizationCA II was concentrated for crystallization to the concentration

of 40–60 mg/ml, CA XII and CA XIII were concentrated to the con-centration of 20–30 mg/ml. Crystallization was started by mixingof equal volumes of the protein and reservoir buffer in a sittingdrop. Crystallization buffers for CA II consisted of 2.2–2.5 M so-dium malonate pH 7.5 with or without addition of 0.1 M sodium

bicine at pH 9.0. CA XIII was crystallized either in buffer containing0.1 M sodium citrate, pH 5.5, 0.1 M sodium acetate, pH 4.5, and30% (w/v) PEG4000 or in 0.1 M ammonium acetate, pH 7.0, 0.1 Msodium acetate, pH 4.5, and PEG3350 26% (w/v). The same reser-voir buffers were used in crystallization of CA XII. Crystals weresoaked with 0.5 mM solution of the ligand prepared by mixing of50 mM solution of ligand in DMSO with 50 ll of reservoir bufferfrom the crystallization plate. Crystals of CA XIII and XII were flashcryo-cooled after several minute soaking in corresponding reser-voir buffers supplemented with 15% (v/v) of ethylene glycol ascryoprotector.

4.4.2. Data collection and structure determinationDiffraction data from complexes of CA II with compounds 2j and

CAXII with 3j were collected at the EMBL beam line X11 at theDORIS storage ring (DESY, Hamburg). Data from CA XIII and CAXII complexes with 2j were collected at the EMBL beam line P14,the storage ring PETRAIII (DESY, Hamburg). Data from crystals ofCA II-2f and CA XIII-2f were collected using X-ray diffractometerMicroMax 007 HF (Rigaku, Japan) at the Institute of Biotechnology(Vilnius, Lithuania). Datasets were processed using MOSFLM29,30

and SCALA.31 Initial phases for molecular replacement for CA IIcrystal structures were calculated with 3HLJ PDB entry28 excludingheteroatoms and ligands. Initial phases for CA XII crystal structureswere obtained using the PDB entry 1JD0, and structures of CA XIIIwere solved using PDB entry 2NN0 as initial models for molecularreplacement, which was performed using MOLREP.32 REFMAC33

and COOT34 were used for structure refinement and model build-ing. Inhibitors were modeled using AVOGADRO,35 and correspond-ing topology and parameters for refinement were generated byLIBREFMAC.36 Statistics of data collection and refinement is pre-sented in Supplementary Table 1. Co-ordinates and structure fac-tors are deposited in RCSB Protein Databank, PDB IDs are givenin Supplementary Table 1. All graphic representations of crystalstructures were produced using PYMOL.37

Acknowledgments

This research was funded by a Grant (No. LIG-09/2012) from theResearch Council of Lithuania. Diffraction data were collected atthe EMBL/DESY, Hamburg, P14 beamline at PETRA III storage ringand X11 at DORIS storage ring. Access to the measurement facili-ties was funded by the FP7-REGPOT-2009-1 program (project245721 MoBiLi). M.K. and A.S. acknowledge support by project‘Promotion of Student Scientific Activities’ (VP1-3.1-ŠMM-01-V-02-003) from the Research Council of Lithuania. This project isfunded by the Republic of Lithuania and European Social Fund un-der the 2007–2013 Human Resources Development OperationalProgramme’s priority 3. Authors thank Zita Liutkevici�ute andVytautas Smirnovas for the help with mass spectrometry analysisof synthetic compounds and proteins and local contacts at theEMBL beamlines Dr. G. Bourenkov and Dr. M. Cianci for the helpwith beamline operation.

Supplementary data

Supplementary data associated with this article can be found, inthe online version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.bmc.2013.09.029.

References and notes

1. Capkauskaite, E.; Zubriene, A.; Baranauskiene, L.; Tamulaitiene, G.; Manakova,E.; Kairys, V.; Grazulis, S.; Tumkevicius, S.; Matulis, D. Eur. J. Med. Chem. 2012,51, 259.

2. Supuran, C. T. Nat. Rev. Drug Disc. 2008, 7, 168.3. Krishnamurthy, V. M.; Kaufman, G. K.; Urbach, A. R.; Gitlin, I.; Gudiksen, K. L.;

Weibel, D. B.; Whitesides, G. M. Chem. Rev. 2008, 108, 946.


http://refhub.elsevier.com/S0968-0896(13)00809-2/h0005







4. Sly, W. S.; Hu, P. Y. Annu. Rev. Biochem. 1995, 64, 375.5. Alterio, V.; Fiore, A. D.; D’Ambrosio, K.; Supuran, C. T.; Simone, G. D. Chem. Rev.

2012, 112, 4421.6. Pastorekova, S.; Kopacek, J.; Pastorek, J. Curr. Top. Med. Chem. 2007, 7, 865.7. Supuran, C. T.; Scozzafava, A.; Casini, A. Med. Res. Rev. 2003, 23, 146.8. Hassan, M. I.; Shajee, B.; Waheed, A.; Ahmad, F.; Sly, W. S. Bioorg. Med. Chem.

2013, 21, 1570.9. Scozzafava, A.; Mastrolorenzo, A.; Supuran, C. T. Expert Opin. Ther. Patents 2006,

16, 1627.10. Supuran, C. T.; Scozzafava, A.; Conway, J. Carbonic Anhydrase—Its Inhibitors and

Activators; CRC Press: Boca Raton, FL, USA, 2004. pp 1–363.11. Capkauskaite, E.; Baranauskiene, L.; Golovenko, D.; Manakova, E.; Grazulis, S.;

Tumkevicius, S.; Matulis, D. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 7357.12. Whittington, D. A.; Waheed, A.; Ulmasov, B.; Shah, G. N.; Grubb, J. H.; Sly, W. S.;

Christianson, D. W. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001, 98, 9545.13. Jogaite, V.; Zubriene, A.; Michailoviene, V.; Gylyte, J.; Morkunaite, V.; Matulis,

D. Bioorg. Med. Chem. 2013, 21, 1431.14. Wiseman, T.; Williston, S.; Brandts, J. F.; Lin, L. N. Anal. Biochem. 1989, 179, 131.15. Khalifah, R. G. J. Biol. Chem. 1971, 246, 2561.16. Dudutiene, V.; Zubriene, A.; Smirnov, A.; Gylyte, J.; Timm, D.; Manakova, E.;

Grazulis, S.; Matulis, D. Bioorg. Med. Chem. 2013, 21, 2093.17. Scott, A. D.; Phillips, C.; Alex, A.; Flocco, M.; Bent, A.; Randall, A.; O’Brien, R.;

Damian, L.; Jones, L. H. ChemMedChem 2009, 4, 1985.18. Fujikura, T.; Miigata, K.; Hashimoto, S.; Imai, K.; Takenaka, T. Chem. Pharm. Bull.

(Tokyo) 1982, 30, 4092.19. Zanka, A.; Kubota, A. Synlett 1999, 1984.20. Nickson, T. E.; Roche-Dolson, C. A. Synthesis 1985, 6, 669.21. Oelschlager, H. Justus Liebigs Ann. Chem. 1961, 641, 81.22. Baker, B. R.; Schaub, R. E.; Joseph, J. P.; McEvoy, F. J.; Williams, J. H. J. Org. Chem.

1953, 18, 133.

23. Anderson, G. W.; Halverstadt, I. F.; Miller, W. H.; Roblin, R. O. J. Am. Chem. Soc.1945, 67, 2197.

24. Kruse, V. R.; Breitmaier, E. Chem. Zeit. 1977, 101, 305.25. Cimmperman, P.; Baranauskiene, L.; Jachimoviciute, S.; Jachno, J.; Torresan, J.;

Michailoviene, V.; Matuliene, J.; Sereikaite, J.; Bumelis, V.; Matulis, D. Biophys. J.2008, 95, 3222.

26. Sudzius, J.; Baranauskiene, L.; Golovenko, D.; Matuliene, J.; Michailoviene, V.;Torresan, J.; Jachno, J.; Sukackaite, R.; Manakova, E.; Grazulis, S.; Tumkevicius,S.; Matulis, D. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 7413.

27. Marcisauskas, R.; Karalyte, D.; Sudziuviene, O.; Pesliakas, I.-G. Use of TriazineDyes in Purification of T4 Poly-Nucleotide Kinase. In Protein–Dye Interactions:Developments and Applications; Vijayalakshmi, M., Bertrand, O., Eds.; Springer:Netherlands, 1989; pp 331–336.

28. Baranauskiene, L.; Hilvo, M.; Matuliene, J.; Golovenko, D.; Manakova, E.;Dudutiene, V.; Michailoviene, V.; Torresan, J.; Jachno, J.; Parkkila, S.; Maresca,A.; Supuran, C. T.; Grazulis, S.; Matulis, D. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2010, 25,863.

29. Leslie, A. G. W. Joint CCP4+ ESF-EAMCB Newsletter on Protein Crystallography,1992, 26.

30. Leslie, A. G. W. Acta Crystallogr., Sect. D 2006, 62, 48.31. Evans, P. Acta Crystallogr., Sect. D 2006, 62, 72.32. Vagin, A.; Teplyakov, A. J. Appl. Crystallogr. 1997, 30, 1022.33. Murshudov, G. N.; Vagin, A. A.; Dodson, E. J. Acta Crystallogr., Sect. D 1997, 53,

240.34. Emsley, P.; Cowtan, K. Acta Crystallogr., Sect. D 2004, 60, 2126.35. Avogadro, Avogadro: An Open-Source Molecular Builder and Visualization Tool.

Version 1.0.0. http://avogadro.openmolecules.net/, 2009.36. Vagin, A. A.; Steiner, R. A.; Lebedev, A. A.; Potterton, L.; McNicholas, S.; Long, F.;

Murshudov, G. N. Acta Crystallogr., Sect. D 2004, 60, 2184.37. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.5.0.4 Schrodinger, LLC






















































http://avogadro.openmolecules.net/



2014

http://informahealthcare.com/enzISSN: 1475-6366 (print), 1475-6374 (electronic)

J Enzyme Inhib Med Chem, 2014; 29(1): 124–131! 2014 Informa UK Ltd. DOI: 10.3109/14756366.2012.757223

Benzenesulfonamides with benzimidazole moieties as inhibitorsof carbonic anhydrases I, II, VII, XII and XIII

Asta Zubrien _e1, Edita Capkauskait _e1,2, Joana Gylyt _e1, Migl _e Kisonait _e1, Sigitas Tumkevicius2, andDaumantas Matulis1

1Department of Biothermodynamics and Drug Design, Institute of Biotechnology, and 2Department of Organic Chemistry, Faculty of Chemistry,

Vilnius University, Vilnius, Lithuania

Abstract

A series of benzenesulfonamide derivatives, bearing benzimidazole moieties, were designedand synthesized as inhibitors of carbonic anhydrases (CAs). Their binding affinities torecombinant human CA isozymes I, II, VII, XII and XIII were determined by the thermal shiftassay. A group of compounds containing a benzimidazole substituent in the para position ofthe benzenesulfonamide ring was found to exhibit higher binding potency toward tested CAsthan meta-substituted benzenesulfonamides. Some of these compounds exhibited nanomolaraffinities and selectivity toward the CA isozymes tested.

Keywords

Benzenesulfonamide, carbonic anhydrase,N-alkylated benzimidazoles, thermal shiftassay, ThermoFluor�

History

Received 18 October 2012Revised 6 December 2012Accepted 6 December 2012Published online 28 January 2013

Introduction

Carbonic anhydrases (CAs) are widely investigated enzymes dueto their involvement in various physiological and pathologicalprocesses1–4. There are a total of 15 CA isoforms found inhumans. However, three of them have no catalytic activity (CAVIII, X and XI). The 12 active isozymes (CA I–IV, VA, VB, VI,VII, IX, XII and XIV) are metalloenzymes, which participate inthe regulation of acid–base balance and ion transport in manytissues and organs. The enhanced activity of CAs is often relatedto various diseases. The isoforms CA IX and CA XII wereintensively investigated enzymes during the last decade due totheir overexpression in various human cancers5–9. Much work hasbeen done to design selective CA IX and CA XII inhibitors. Somecompounds such as glycosyl coumarins, N-b-glycosyl sulfamidesand ureido-substituted sulfamates were found to be lownanomolar CA IX and XII inhibitors, while showing weakinhibition toward cytosolic isoforms CA I and CA II10–12.Numerous inhibitors of various CA isoforms were reviewed byAlterio et al.1. The design of CA inhibitors as drugs has beenimpeded by the large number of isoforms, their diffusion amongmany tissues/organs and the lack of isozyme-selective inhibitorsamong existing sulfonamides13. As the differences between theactive sites of the 12 catalytically active human CAs are verysubtle, CAs have proved to be a challenging drug target for thedevelopment of isozyme-specific inhibitors2,14.

Primary sulfonamides present an important class of com-pounds which have been studied as drugs and drug candidatesagainst diseases such as glaucoma, inflammation, edema,

epilepsy, dandruff, cancer and as antiviral compounds15,16.The majority of clinically used CA inhibitors are also primarysulfonamides1. To date, CA inhibitors such as acetazolamide(AZM), ethoxzolamide (EZA) and methazolamide are widelyused as systemic antiglaucoma drugs17; sultiame and zonisamideas antiepileptic drugs18; and chlorthalidone, indapamide andfurosemide as diuretics19 (Figure 1). The largest numbers of newCA inhibitors are benzenesulfonamides1,14.

Benzenesulfonamides bind to the active site of CAs in theirdeprotonated form, with the nitrogen atom of the sulfonamidemoiety coordinated to the Zn(II) ion. Depending on the nature ofthe substituent, additional interactions with hydrophobic andhydrophilic amino acids in the CA active center can be assigned.Therefore, a variety of substitutions on the benzenesulfonamidehead group can be used for the development of novel inhibitors.

Recently, we have investigated the interaction of severalCA isozymes with pyrimidine derivatives such as [(2-pyrimidi-nylthio)acetyl]benzenesulfonamides20, 4-[N-(substituted 4-pyrimi-dinyl)amino]benzenesulfonamides21 and thiadiazole derivatives22.We have also reported on the synthesis of 2-substitutedbenzimidazoles N-alkylated with 2-chloro-5-bromoacetylbenze-nesulfonamide (Figure 2, compounds 4(a–j)) and their binding tofour CA isozymes, namely CA I, CA II, CA VII and CA XIII23.We extended these earlier investigations to new sulfonamidescontaining a benzimidazole group (compounds of series 1–3).

Here we present the binding data of 4(a–j) to the catalyticdomain of CA XII, an anticancer drug target. The N-alkylatedbenzimidazoles 4(a–j) exhibited dissociation constants in therange of 0.3–10 mM against tested CAs. Furthermore, wecompared series 4 to compounds of series 1–3, which are 4-[(2-substituted-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfonamide1(a–j), 2-chloro-4-[(2-substituted-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]-benzenesulfonamide 2(a–j) and 3-[(2-substituted-1H-benzimida-zol-1-yl)acetyl]benzenesulfonamide 3(a–j). Their binding was

Address for correspondence: Asta Zubrien _e, Department of Biothermo-dynamics and Drug Design, Vilnius University Institute of Biotechnol-ogy, Graiciuno 8, Vilnius LT-02241, Lithuania. E-mail: [email protected],[email protected]

Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y O

ndok

uz M

ayis

Uni

v. o

n 04

/28/

14Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

then assayed with five CA isozymes CA I, CA II, CA VII, CA XIIand CA XII. The compounds 2(a–j) were found to be the mostpotent CA inhibitors exhibiting nanomolar affinities toward CA I,II, VII and XIII. Detailed structure–activity correlation could bedrawn by comparing the affinities and selectivity of thesecompounds.

Materials and methods

Syntheses

Synthesis of 4-(bromoacetyl)benzenesulfonamide (1) and3-(bromoacetyl)benzenesulfonamide (3) was achieved fromcommercially available 1-(4-aminophenyl)ethanone and 1-(3-aminophenyl)ethanone, respectively, as described by Fujikuraet al.24. Synthesis of 4-(bromoacetyl)-2-chlorobenzenesulfona-mide (2) was accomplished from 1-(4-amino-3-chloropheny-l)ethanone as described by Fujikura et al.24. 1-(4-Amino-3-chlorophenyl)ethanone was synthesized by the chlorination of 1-(3-aminophenyl)-N ethanone with N-chlorosuccinimide in acet-onitrile25,26. 2-Substituted benzimidazoles (b–i) were preparedfrom 1,2-benzenediamine and the appropriate carboxylic acidsaccording to Phillips’ procedure27. Benzimidazole (a) and2-methylthiobenzimidazole (j) are commercially available andwere used without further purification. All ingredients werepurchased from Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI) and Alfa AesarGmbH (Karlsruhe, Germany).

The melting points of the compounds were determined in opencapillaries on a Thermo Scientific 9100 Series apparatus(Rochford, UK) without further correction. IR spectra wereobtained on a Perkin-Elmer (Upplands Vasby, Sweden) FT-IRspectrophotometer Spectrum BX II in KBr. 1H and 13C NMRspectra were recorded on a Varian Unity Inova spectrometer (PaloAlto, CA) (300 and 75 MHz, respectively) in DMSO-d6 usingresidual DMSO signals (2.52 and 40.21 ppm for 1H and 13C NMR

spectra, respectively) as the internal standard. Thin-layerchromatography was performed with silica gel 60 F254 aluminumplates (Merck, Darmstadt, Germany) and visualized with UVlight. High-resolution mass spectra (HRMS) were recorded on aDual-ESI Q-TOF 6520 mass spectrometer (Agilent Technologies,Santa Clara, CA). The purities of target compounds were analyzedusing an HPLC system with UV detection.

General procedure for the synthesis of 1–3(a–j)

A mixture of the corresponding compounds 1–3 (0.360 mmol),appropriate 2-substituted benzimidazole (a–j) (0.540 mmol) andsodium acetate (33.9 mg, 0.414 mmol) in tetrahydrofuran (2 ml)were stirred at r.t. for 24 h. The reaction mixture was poured intowater. The precipitate was filtered out and then washed with waterand diethyl ether to yield 1–3(a–j).

4-(1H-benzimidazol-1-ylacetyl)benzenesulfonamide (1a).Yield 60%, m.p. 242–244 �C. IR (�, cm�1): 3358 (NH2), 1701(CO). 1H NMR � ppm: 6.11 (2H, s, CH2CO), 7.24–7.27 (2H, m,C50,60–H), 7.57–7.60 (1H, m, C70–H), 7.67 (2H, s, NH2), 7.70–7.73(1H, m, C40–H), 8.07 (2H, d, J¼ 8.4 Hz, C2,6–H), 8.24 (1H, s,C20–H), 8.31 (2H, d, J¼ 8.1 Hz, C3,5–H). 13C NMR � ppm: 51.82,111.38, 119.97, 122.32, 123.14, 126.80, 129.66, 135.31, 137.46,143.60, 145.57, 149.09, 193.67. HRMS Calcd for C15H13N3O3S([MþH]þ): 316.0750, Found: 316.0746.

4-(1H-benzimidazol-1-ylacetyl)-2-chlorobenzenesulfonamide(2a). Yield 72%, m.p. 234–236 �C. IR (�, cm�1): 3379 (NH2),1705 (CO). 1H NMR � ppm: 6.10 (2H, s, CH2CO), 7.23–7.26 (2H,m, C50,60–H), 7.57–7.60 (1H, m, C70–H), 7.70–7.72 (1H, m,C40–H), 7.93 (2H, s, NH2), 8.19–8.23 (3H, m, C20,5,6–H), 8.33 (1H,s, C3–H). 13C NMR � ppm: 51.88, 111.37, 120.05, 122.27, 123.09,127.72, 130.18, 131.75 (2C), 135.33, 138.83, 143.77, 145.50,145.67, 192.98. HRMS Calcd for C15H12ClN3O3S ([MþH]þ):350.0361, Found: 350.0363.

3-(1H-benzimidazol-1-ylacetyl)benzenesulfonamide (3a).Yield 83%, m.p. 247–249 �C. IR (�, cm�1): 3270 (NH2), 1698(CO). 1H NMR � ppm: 6.13 (2H, s, CH2CO), 7.22–7.28 (2H, m,C50,60–H), 7.57–7.61 (1H, m, C70–H), 7.64 (2H, s, NH2), 7.69–7.75(1H, m, C40–H), 7.88 (1H, t, J¼ 7.8 Hz, C5–H), 8.19 (1H, d,J¼ 7.8 Hz, C4–H), 8.22 (1H, s, C20–H), 8.40 (1H, d, J¼ 7.8 Hz,C6–H), 8.50 (1H, s, C2–H). 13C NMR � ppm: 15.71, 111.38,120.04, 122.23, 123.08, 125.63, 130.60, 131.18, 132.26, 135.41,135.74, 143.81, 145.60, 145.69, 193.48. HRMS Calcd forC15H13N3O3S ([MþH]þ): 316.0750, Found: 316.0752.

4-[(2-Methyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfona-mide (1b). Yield 63%, m.p. 146–148 �C. IR (�, cm�1): 3336(NH2), 1698 (CO). 1H NMR � ppm: 2.45 (3H, s, CH3), 6.06(2H, s, CH2CO), 7.14–7.21 (2H, m, C50,60–H), 7.46–7.49 (1H, m,C70–H), 7.57–7.60 (1H, m, C40–H), 7.66 (2H, s, NH2), 8.07 (2H, d,J¼ 8.4 Hz, C2,6–H), 8.32 (2H, d, J¼ 8.1 Hz, C3,5–H). 13C NMR� ppm: 14.00, 50.84, 110.60, 118.80, 122.06, 122.23, 126.74,129.79, 136.53, 137.47, 142.88, 149.21, 153.31, 193.81. HRMSCalcd for C16H15N3O3S ([MþH]þ): 330.0907, Found: 330.0909.

2-Chloro-4-[(2-methyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benze-nesulfonamide (2b). Yield 74%, m.p. 204–206 �C. IR (�, cm�1):3385, 3332 (NH2), 1707 (CO). 1H NMR � ppm: 2.45 (3H, s, CH3),6.09 (2H, s, CH2CO), 7.14–7.20 (2H, m, C50,60–H), 7.47–7.50(1H, m, C70–H), 7.57–7.61 (1H, m, C40–H), 7.94 (2H, s, NH2),8.20 (2H, s, C5,6–H), 8.37 (1H, s, C3–H). 13C NMR � ppm: 13.97,51.01, 110.75, 118.71, 122.19, 122.32, 127.80, 130.09, 131.71,132.06, 136.41, 138.72, 142.59, 145.78, 153.29, 193.02. HRMSCalcd for C16H14ClN3O3S ([MþH]þ): 364.0517, Found:364.0517.

3-[(2-Methyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfona-mide (3b). Yield 62%, m.p. 295–297 �C. IR (�, cm�1): 3280(NH2), 1699 (CO). 1H NMR � ppm: 2.46 (3H, s, CH3), 6.09

Figure 1. Chemical structures of some clinically used sulfonamides.

Figure 2. The structure of N-alkylated benzimidazole derivatives.

DOI: 10.3109/14756366.2012.757223 Benzenesulfonamides with benzimidazole moieties 125

Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y O

ndok

uz M

ayis

Uni

v. o

n 04

/28/

14Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

(2H, s, CH2CO), 7.14–7.21 (2H, m, C50,60–H), 7.47–7.51 (1H,m, C70–H), 7.57–7.60 (1H, m, C40–H), 7.63 (2H, s, NH2), 7.89(1H, t, J¼ 7.8 Hz, C5–H), 8.20 (1H, d, J¼ 8.1 Hz, C4–H), 8.44(1H, d, J¼ 7.8 Hz, C6–H), 8.51 (1H, s, C2–H). 13C NMR � ppm:14.03, 50.78, 110.62, 118.83, 122.03, 122.21, 125.70, 130.57,131.31, 132.51, 135.66, 136.58, 142.96, 145.66, 153.33, 193.59.HRMS Calcd for C16H15N3O3S ([MþH]þ): 330.0907, Found:330.0903.

4-{[2-(Hydroxymethyl)-1H-benzimidazol-1-yl]acetyl}ben-zenesulfonamide (1c). Yield 57%, m.p. 200–202 �C. IR(�, cm�1): 3375, 3314 (NH2, OH), 1702 (CO). 1H NMR � ppm:4.70 (2H, s, CH2OH), 5.64 (2H, br s, OH), 6.09 (2H, s, CH2CO),7.20–7.26 (2H, m, C50,60–H), 7.53–7.56 (1H, m, C70–H), 7.64–7.68(3H, m, C40–H, NH2), 8.06 (2H, d, J¼ 8.4 Hz, C2,6–H), 8.31(2H, d, J¼ 8.4 Hz, C3,5–H). 13C NMR � ppm: 51.04, 57.59,111.02, 119.59, 122.31, 123.01, 126.76, 129.72, 137.00, 137.54,142.33, 149.04, 154.76, 193.49. HRMS Calcd forC16H15N3O4S([MþH]þ): 346.0856, Found: 346.0859.

2-Chloro-4-{[2-(hydroxymethyl)-1H-benzimidazol-1-yl]ace-tyl}benzenesulfonamide (2c). Yield 52%, m.p. 195–197 �C. IR(�, cm�1): 3370, 3267 (NH2, OH), 1707 (CO). 1H NMR � ppm:4.69 (2H, d, J¼ 4.8 Hz, CH2OH), 5.60 (1H, br s, OH), 6.08 (2H, s,CH2CO), 7.20–7.25 (2H, m, C50,60–H), 7.50–7.57 (1H, m, C70–H),7.60–7.65 (1H, m, C40–H), 7.92 (2H, s, NH2), 8.19 (2H, s, C5,6–H), 8.33 (1H, s, C3–H). 13C NMR � ppm: 51.11, 57.54, 110.97,119.66, 122.27, 122.33, 127.74, 130.15, 131.05, 131.81, 137.01,138.88, 142.50, 145.63, 154.71, 192.80. HRMS Calcd forC16H14ClN3O4S ([MþH]þ): 380.0466, Found: 380.0463.

3-{[2-(Hydroxymethyl)-1H-benzimidazol-1-yl]acetyl}ben-zenesulfonamide (3c). Yield 60%, m.p. 220–222 �C. IR(�, cm�1): 3364, 3272 (NH2, OH), 1703 (CO). 1H NMR � ppm:4.69 (2H, d, J¼ 3.3 Hz, CH2OH), 5.63 (1H, br s, OH), 6.12 (2H, s,CH2CO), 7.21–7.24 (2H, m, C50,60–H), 7.54–7.57 (1H, m, C70–H),7.62–7.67 (3H, m, C40–H, NH2), 7.87 (1H, t, J¼ 7.8 Hz, C5–H),8.18 (1H, d, J¼ 7.5 Hz, C4–H), 8.40 (1H, d, J¼ 7.8 Hz, C6–H),8.49 (1H, s, C2–H). 13C NMR � ppm: 50.98, 57.64, 111.02,119.63, 122.26, 122.97, 125.65, 130.59, 131.16, 132.33, 135.74,137.07, 142.45, 145.63, 154.75, 193.20. HRMS Calcd forC16H15N3O4S ([MþH]þ): 346.0856, Found: 346.0857.

4-[(2-Benzyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfo-namide (1d). Yield 62%, m.p. 241–243 �C. IR (�, cm�1): 3284(NH2), 1703 (CO). 1H NMR � ppm: 4.26 (2H, s, CH2Ph), 6.06(2H, s, CH2CO), 7.15–7.28 (7H, m, C50,60–H, Ph–H), 7.44–7.47(1H, m, C70–H), 7.62–7.65 (1H, m, C40–H), 7.68 (2H, s, NH2),8.04 (2H, d, J¼ 8.4 Hz, C2,6–H), 8.22 (2H, d, J¼ 8.7 Hz, C3,5–H).13C NMR � ppm: 33.42, 50.83, 111.03, 119.17, 122.28, 122.59,126.63, 127.19, 129.06, 129.60 (2C), 129.70, 136.60, 137.36,142.80, 149.03, 154.83, 193.15. HRMS Calcd for C22H19N3O3S([MþH]þ): 406.1220, Found: 406.1217.

4-[(2-Benzyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]-2-chlorobenze-nesulfonamide (2d). Yield 71%, m.p. 210–212 �C. IR (�, cm�1):3382, 3294 (NH2), 1705 (CO). 1H NMR � ppm: 4.27 (2H, s,CH2Ph), 6.07 (2H, s, CH2CO), 7.19–7.26 (7H, m, C50,60–H, Ph–H), 7.45–7.49 (1H, m, C70–H), 7.61–7.64 (1H, m, C40–H), 7.93(2H, s, NH2), 8.07 (1H, d, J¼ 8.1 Hz, C5–H), 8.18 (1H, d,J¼ 8.1 Hz, C6–H), 8.25 (1H, s, C3–H). 13C NMR � ppm: 33.40,50.91, 111.01, 119.21, 122.25, 122.56, 127.15, 127.66, 129.03,129.62, 129.98, 131.59, 131.87, 136.61, 137.41, 138.67, 142.91,145.63, 154.77, 192.46. HRMS Calcd for C22H18ClN3O3S([MþH]þ): 440.0830, Found: 440.0836.

3-[(2-Benzyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfona-mide (3d). Yield 88%, m.p. 146–148 �C. IR (�, cm�1): 3340(NH2), 1702 (CO). 1H NMR � ppm: 4.27 (2H, s, CH2Ph), 6.08(2H, s, CH2CO), 7.17–7.36 (7H, m, C50,60–H, Ph–H), 7.45–7.52(1H, m, C70–H), 7.64–7.69 (1H, m, C40–H, NH2), 7.85 (1H, t,J¼ 7.8 Hz, C5–H), 8.18 (1H, d, J¼ 7.8 Hz, C4–H), 8.34 (1H, d,

J¼ 7.8 Hz, C6–H), 8.41 (1H, s, C2–H). 13C NMR � ppm: 33.45,50.76, 111.01, 119.22, 122.14, 122.22, 125.67, 127.18, 129.06,129.63, 130.43, 131.16, 132.37, 135.63, 136.67, 137.44, 142.98,145.55, 154.87, 193.01. HRMS Calcd for C22H19N3O3S([MþH]þ): 406.1220, Found: 406.1223.

4-[(2-Ethyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfona-mide (1e). Yield 71%, m.p. 236–238 �C. IR (�, cm�1): 3334(NH2), 1699 (CO). 1H NMR � ppm: 1.31 (3H, t, J¼ 7.5 Hz, CH3),2.79 (2H, q, J¼ 7.5 Hz, CH2), 6.07 (2H, s, CH2CO), 7.17–7.20(2H, m, C50,60–H), 7.47–7.50 (1H, m, C70–H), 7.61–7.64 (1H, m,C40–H), 7.67 (2H, s, NH2), 8.07 (2H, d, J¼ 8.1 Hz, C2,6–H), 8.33(2H, d, J¼ 8.1 Hz, C3,5–H). 13C NMR � ppm: 12.16, 20.50, 50.63,110.70, 118.91, 122.12, 122.37, 126.73, 129.82, 136.49, 137.44,142.62, 149.21, 157.44, 193.89. HRMS Calcd for C17H17N3O3S([MþH]þ): 344.1063, Found: 344.1062.

2-Chloro-4-[(2-ethyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzene-sulfonamide (2e). Yield 66%, m.p. 236–238 �C. IR (�, cm�1):3333 (NH2), 1706 (CO). 1H NMR � ppm: 1.30 (3H, t, J¼ 7.5 Hz,CH3), 2.78 (2H, q, J¼ 7.5 Hz, CH2), 6.09 (2H, s, CH2CO),7.14–7.21 (2H, m, C50,60–H), 7.47–7.50 (1H, m, C70–H), 7.60–7.63(1H, m, C40–H), 7.93 (2H, s, NH2), 8.17–8.23 (2H, m, C5,6–H),8.38 (1H, s, C3–H). 13C NMR � ppm: 12.19, 20.46, 50.76,110.76, 118.90, 122.14, 122.36, 127.79, 130.06, 131.71,132.10, 136.44, 138.70, 142.59, 145.78, 157.41, 193.16. HRMSCalcd for C17H16ClN3O3S ([MþH]þ): 378.0674, Found:378.0670.

3-[(2-Ethyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfona-mide (3e). Yield 66%, m.p. 292–294 �C. IR (�, cm�1): 3288(NH2), 1699 (CO). 1H NMR � ppm: 1.31 (3H, t, J¼ 7.5 Hz, CH3),2.79 (2H, q, J¼ 7.5 Hz, CH2), 6.09 (2H, s, CH2CO), 7.14–7.21(2H, m, C50,60–H), 7.47–7.50 (1H, m, C70–H), 7.62–7.69 (1H, m,NH2, C40–H), 7.89 (1H, t, J¼ 7.8 Hz, C5–H), 8.20 (1H, d,J¼ 8.1 Hz, C4–H), 8.45 (1H, d, J¼ 7.8 Hz, C6–H), 8.51 (1H, s,C2–H). 13C NMR � ppm: 12.20, 20.53, 50.53, 110.65, 119.01,121.99, 122.27, 125.71, 130.56, 131.31, 132.54, 135.66, 136.60,142.92, 145.66, 157.46, 193.72. HRMS Calcd for C17H17N3O3S([MþH]þ): 344.1063, Found: 344.1065.

4-[(2-Propyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfona-mide (1f). Yield 65%, m.p. 245–247 �C. IR (�, cm�1): 3300(NH2), 1700 (CO). 1H NMR � ppm: 0.97 (3H t, J¼ 7.5 Hz, CH3),1.78 (2H, sextet, J¼ 7,5 Hz, CH2), 2.75 (2H, t, J¼ 7.2 Hz, CH2),6.08 (2H, s, CH2CO), 7.14–7.22 (2H, m, C50,60–H), 7.45–7.48 (1H,m, C70–H), 7.60–7.63 (1H, m, C40–H), 7.69 (2H, s, NH2), 8.07(2H, d, J¼ 8.4 Hz, C2,6–H), 8.33 (2H, d, J¼ 8.7 Hz, C3,5–H). 13CNMR � ppm: 14.47, 20.95, 28.84, 50.66, 110.75, 118.88, 122.12,122.32, 126.71, 129.85, 136.38, 137.38, 142.66, 149.19, 156.32,193.85. HRMS Calcdfor C18H19N3O3S([MþH]þ): 358.1220,Found: 358.1222.

2-Chloro-4-[(2-propyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benze-nesulfonamide (2f). Yield 71%, m.p. 240–242 �C. IR (�, cm�1):3354 (NH2), 1702 (CO). 1H NMR � ppm: 0.97 (3H, t, J¼ 7.5 Hz,CH3), 1.78 (2H, sextet, J¼ 7.5 Hz, CH2), 2.74 (2H, t, J¼ 7.5 Hz,CH2), 6.09 (2H, s, CH2CO), 7.13–7.20 (2H, m, C50,60–H),7.45–7.48 (1H, m, C70–H), 7.59–7.62 (1H, m, C40–H), 7.93 (2H,s, NH2), 8.20 (2H, s, C5,6–H), 8.39 (1H, s, C3–H). 13C NMR� ppm: 14.49, 21.00, 28.87, 50.78, 110.74, 118.96, 122.05,122.24, 127.79, 130.05, 131.71, 132.13, 136.41, 138.69, 142.90,145.78, 156.31, 193.14. HRMS Calcd for C18H18ClN3O3S([MþH]þ): 392.0830, Found: 392.0827.

3-[(2-Propyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfona-mide (3f). Yield 87%, m.p. 275–277 �C. IR (�, cm�1): 3314(NH2), 1701 (CO). 1H NMR � ppm: 0.97 (3H, t, J¼ 7.5 Hz, CH3),1.79 (2H, sextet, J¼ 7.5 Hz, CH2), 2.75 (2H, t, J¼ 7.5 Hz, CH2),6.09 (2H, s, CH2CO), 7.13–7.21 (2H, m, C50,60–H), 7.46–7.49 (1H,m, C70–H), 7.60–7.62 (3H, m, C40–H, NH2), 7.89 (1H, t,J¼ 7.8 Hz, C5–H), 8.20 (1H, d, J¼ 8.1 Hz, C4–H), 8.45 (1H, d,

126 A. Zubrien _e et al. J Enzyme Inhib Med Chem, 2014; 29(1): 124–131

Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y O

ndok

uz M

ayis

Uni

v. o

n 04

/28/

14Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

J¼ 7.8 Hz, C6–H), 8.50 (1H, s, C2–H). 13C NMR � ppm: 14.50,20.98, 28.91, 50.58, 110.69, 118.99, 122.00, 122.22, 125.71,130.56, 131.30, 132.58, 135.64, 136.50, 142.97, 145.65, 156.35,193.66. HRMS Calcd for C18H19N3O3S ([MþH]þ): 358.1220,Found: 358.1219.

4-[(2-Butyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfona-mide (1 g). Yield 67%, m.p. 260–262 �C. IR (�, cm�1): 3299(NH2), 1699 (CO). 1H NMR � ppm: 0.90 (3H, t, J¼ 7.5 Hz, CH3),1.39 (2H, sextet, J¼ 7.5 Hz, CH2), 1.75 (2H, quintet, J¼ 7.5 Hz,CH2), 2.77 (2H, t, J¼ 7.5 Hz, CH2), 6.08 (2H, s, CH2CO),7.14–7.21 (2H, m, C50,60–H), 7.45–7.48 (1H, m, C70–H), 7.60–7.63(1H, m, C40–H), 7.69 (2H, s, NH2), 8.07 (2H, d, J¼ 8.4 Hz, C2,6–H), 8.34 (2H, d, J¼ 8.4 Hz, C3,3–H). 13C NMR � ppm: 14.48,22.50, 26.63, 29.65, 50.66, 110.70, 118.93, 122.06, 122.26,126.73, 129.84, 136.45, 137.42, 142.82, 149.20, 156.46, 193.89.HRMS Calcd for C19H21N3O3S ([MþH]þ): 372.1376, Found:372.1376.

4-[(2-Butyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]-2-chlorobenze-nesulfonamide (2 g). Yield 75%, m.p. 201–203 �C. IR (�, cm�1):3333 (NH2), 1708 (CO). 1H NMR � ppm: 0.90 (3H, t, J¼ 7.2 Hz,CH3), 1.38 (2H, sextet, J¼ 7.5 Hz, CH2), 1.74 (2H, quintet,J¼ 7.5 Hz, CH2), 2.76 (2H, t, J¼ 7.5 Hz, CH2), 6.09 (2H, s,CH2CO), 7.13–7.20 (2H, m, C50,60–H), 7.45–7.48 (1H, m, C70–H),7.59–7.61 (1H, m, C40–H), 7.94 (2H, s, NH2), 8.20 (2H, s,C5,6–H), 8.39 (1H, s, C3–H). 13C NMR � ppm: 14.47, 22.50,26.60, 29.66, 50.78, 110.74, 118.93, 122.06, 122.24, 127.77,130.06, 131.71, 132.12, 136.42, 138.69, 142.85, 145.78, 156.44,193.15. HRMS Calcd. for C19H20ClN3O3S ([MþH]þ): 406.0987,Found: 406.0981.

3-[(2-Butyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfona-mide (3 g). Yield 61%, m.p. 214–216 �C. IR (�, cm�1): 3322(NH2), 1702 (CO). 1H NMR � ppm: 0.90 (3H, t, J¼ 7.2 Hz, CH3),1.39 (2H, sextet, J¼ 7.2 Hz, CH2), 1.75 (2H, quintet, J¼ 7.5 Hz,CH2), 2.77 (2H, t, J¼ 7.5 Hz, CH2), 6.09 (2H, s, CH2CO),7.13–7.20 (2H, m, C50,60–H), 7.45–7.48 (1H, m, C70–H), 7.60–7.69(3H, m, C40–H, NH2), 7.89 (1H, t, J¼ 7.8 Hz, C5–H), 8.20 (1H, d,J¼ 7.8 Hz, C4–H), 8.45 (1H, d, J¼ 8.1 Hz, C6–H), 8.50 (1H, s,C2–H). 13C NMR � ppm: 14.47, 22.50, 26.64, 29.65, 50.57,110.67, 118.98, 121.99, 122.20, 125.70, 130.56, 131.30, 132.56,135.66, 136.52, 142.99, 145.65, 156.48, 193.67. HRMS Calcd forC19H21N3O3S ([MþH]þ): 372.1376, Found: 372.1377.

4-[(2-Isopropyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfo-namide (1 h). Yield 65%, m.p. 258–260 �C. IR (�, cm�1): 3341(NH2), 1706 (CO). 1H NMR � ppm: 1.30 (6H, d, J¼ 6.6 Hz,(CH3)2), 3.18 (1H, septet, J¼ 6.6 Hz, CH), 6.09 (2H, s, CH2CO),7.13–7.22 (2H, m, C50,60–H), 7.44–7.47 (1H, m, C40–H), 7.61–7.64(1H, m, C70–H), 7.66 (2H, s, NH2), 8.07 (2H, d, J¼ 8.4 Hz,C2,6–H), 8.34 (2H, d, J¼ 8.4 Hz, C3,5–H). 13C NMR � ppm: 22.41,26.20, 50.57, 110.82, 119.04, 122.12, 122.32, 126.72, 129.85,136.28, 137.44, 142.71, 149.23, 161.05, 194.03. HRMS Calcd forC18H19N3O3S ([MþH]þ): 358.1220, Found: 358.1218.

2-Chloro-4-[(2-isopropyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]ben-zenesulfonamide (2 h). Yield 57%, m.p. 149–151 �C. IR(�, cm�1): 3375, 3278 (NH2), 1708 (CO). 1H NMR � ppm: 1.29(6H, d, J¼ 6.3 Hz, (CH3)2), 3.16–3.24 (1H, m, CH), 6.13 (2H, s,CH2CO), 7.10–7.26 (2H, m, C50,60–H), 7.48–7.50 (1H, m, C70–H),7.61–7.63 (1H, m, C40–H), 7.93 (2H, s, NH2), 8.20 (2H, s,C5,6–H), 8.40 (1H, s, C3–H). 13C NMR � ppm: 22.39, 26.11,50.78, 111.00, 118.88, 122.33, 122.48, 127.81, 130.04, 131.71,132.19, 136.08, 138.64, 142.25, 145.81, 161.03, 193.22. HRMSCalcd for C18H18ClN3O3S ([MþH]þ): 392.0830, Found:392.0827.

3-[(2-Isopropyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfo-namide (3 h). Yield 51%, m.p. 267–269 �C. IR (�, cm�1): 3319(NH2), 1706 (CO). 1H NMR � ppm: 1.30 (6H, d, J¼ 6.6 Hz,(CH3)2), 3.19 (1H, septet, J¼ 6.9 Hz, CH), 6.12 (2H, s, CH2CO),

7.14–7.22 (2H, m, C50,60–H), 7.46–7.49 (1H, m, C70–H), 7.62–7.63(3H, m, C40–H, NH2), 7.89 (1H, t, J¼ 7.8 Hz, C5–H), 8.20 (1H, d,J¼ 7.8 Hz, C4–H), 8.47 (1H, d, J¼ 7.8 Hz, C6–H), 8.51 (1H, s,C2–H). 13C NMR � ppm: 22.44, 26.19, 50.53, 110.87, 119.02,122.13, 122.33, 125.72, 130.55, 131.32, 132.63, 135.61, 136.27,142.67, 145.64, 161.07, 193.80. HRMS Calcd for C18H19N3O3S([MþH]þ): 358.1220, Found: 358.1221.

4-[(2-Isobutyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfo-namide (1i). Yield 66%, m.p. 234–236 �C. IR (�, cm�1): 3333(NH2), 1703 (CO). 1H NMR � ppm: 0.96 (6H, d, J¼ 6.6 Hz,(CH3)2), 2.12–2.25 (1H, m, CH), 2.68 (2H, d, J¼ 6.9 Hz, CH2),6.07 (2H, s, CH2CO), 7.13–7.22 (2H, m, C50,60–H), 7.43–7.46 (1H,m, C40–H), 7.61–7.64 (1H, m, C70–H), 7.66 (2H, s, NH2), 8.07(2H, d, J¼ 8.4 Hz, C2,6–H), 8.33 (2H, d, J¼ 8.4 Hz, C3,5–H). 13CNMR � ppm: 23.08, 27.67, 35.76, 50.73, 110.82, 118.92, 122.12,122.29, 126.72, 129.84, 136.34, 137.44, 142.77, 149.22, 155.71,193.77. HRMS Calcd for C19H21N3O3S ([MþH]þ): 372.1376,Found: 372.1377.

2-Chloro-4-[(2-isobutyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]ben-zenesulfonamide (2i). Yield 74%, m.p. 234–236 �C. IR (�,cm�1): 3378 (NH2), 1706 (CO). 1H NMR � ppm: 0.95 (6H, d,J¼ 6.3 Hz, (CH3)2), 2.12–2.24 (1H, m, CH), 2.67 (2H, d,J¼ 6.9 Hz, CH2), 6.10 (2H, s, CH2CO), 7.13–7.24 (2H, m,C50,60–H), 7.45–7.47 (1H, m, C70–H), 7.60–7.62 (1H, m, C40–H),7.93 (2H, s, NH2), 8.20 (2H, s, C5,6–H), 8.39 (1H, s, C3–H). 13CNMR � ppm: 23.07, 27.67, 35.66, 50.87, 110.88, 118.86, 122.17,122.30, 127.79, 130.03, 131.69, 132.16, 136.24, 138.64, 142.67,145.78, 155.69, 193.00. HRMS Calcd for C19H20ClN3O3S([MþH]þ): 406.0987, Found: 406.0989.

3-[(2-Isobutyl-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfo-namide (3i). Yield 68%, m.p. 216–218 �C. IR (�, cm�1): 3312(NH2), 1703 (CO). 1H NMR � ppm: 0.96 (6H, d, J¼ 6.6 Hz,(CH3)2), 2.19 (1H, septet, J¼ 6.9 Hz, CH), 2.68 (2H, d,J¼ 7.2 Hz, CH2), 6.10 (2H, s, CH2CO), 7.13–7.21 (2H, m,C50,60–H), 7.45–7.47 (1H, m, C70–H), 7.63–7.69 (3H, m, C40–H,NH2), 7.89 (1H, t, J¼ 7.8 Hz, C5–H), 8.20 (1H, d, J¼ 7.5 Hz, C4–H), 8.46 (1H, d, J¼ 7.8 Hz, C6–H), 8.50 (1H, s, C2–H). 13C NMR� ppm: 23.11, 27.65, 35.77, 50.65, 110.79, 118.98, 122.06,122.23, 125.72, 130.56, 131.30, 132.62, 135.63, 136.40, 142.96,145.65, 155.75, 193.56. HRMS Calcd for C19H21N3O3S([MþH]þ): 372.1376, Found: 372.1375.

4-{[2-(Methylsulfanyl)-1H-benzimidazol-1-yl]acetyl}benze-nesulfonamide (1j). Yield 62%, m.p. 213–215 �C. IR (�, cm�1):3319 (NH2), 1702 (CO). 1H NMR � ppm: 2.72 (3H, s, CH3), 5.98(2H, s, CH2CO), 7.15–7.23 (2H, m, C50,60–H), 7.50–7.52 (1H, m,C40–H), 7.61–7.63 (1H, m, C70–H), 7.68 (2H, s, NH2), 8.07 (2H, d,J¼ 8.1 Hz, C2,6–H), 8.34 (2H, d, J¼ 8.1 Hz, C3,5–H). 13C NMR� ppm: 15.20, 50.96, 110.32, 118.26, 122.37(2C), 126.82, 129.82,137.18, 173.72, 143.58, 149.29, 153.70, 193.05. HRMS Calcd forC16H15N3O3S2 ([MþH]þ): 362.0628, Found: 362.0628.

2-Chloro-4-{[2-(methylthio)-1H-benzimidazol-1-yl]acetyl}-benzenesulfonamide (2j). Yield 53%, m.p. 195–197 �C. IR(�, cm�1): 3362, 3256 (NH2), 1707 (CO). 1H NMR � ppm: 2.72(3H, s, CH3), 6.01 (2H, s, CH2CO), 7.14–7.23 (2H, m, C50,60–H),7.48–7.51 (1H, m, C70–H), 7.60–7.63 (1H, m, C40–H), 7.92 (2H, s,NH2), 8.21 (2H, s, C5,6–H), 8.39 (1H, s, C3–H). 13C NMR � ppm:15.22, 51.09, 110.34, 118.26, 122.34, 122.38, 127.80, 130.17,131.86, 132.04, 137.64, 138.43, 143.56, 145.91, 153.72, 192.37.HRMS Calcd for C16H14ClN3O3S2 ([MþH]þ): 396.0238, Found:396.0241.

3-{[2-(Methylthio)-1H-benzimidazol-1-yl]acetyl}benzene-sulfonamide (3j). Yield 54%, m.p. 242–244 �C. IR (�, cm�1):3288 (NH2), 1706 (CO). 1H NMR � ppm: 2.72 (3H, s, CH3), 6.99(2H, s, CH2CO), 7.15–7.23 (2H, m, C50,60–H), 7.50–7.41(1H, m,C70–H), 7.60–7.63 (3H, m, C40–H, NH2), 7.88 (1H, t, J¼ 7.5 Hz,C5–H), 8.19 (1H, d, J¼ 7.5 Hz, C4–H), 8.45 (1H, d, J¼ 7.8 Hz,


Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y O

ndok

uz M

ayis

Uni

v. o

n 04

/28/

14Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

C6–H), 8.50 (1H, s, C2–H). 13C NMR � ppm: 15.24, 50.90,110.36, 118.28, 122.28, 122.37, 125.69, 130.69, 131.43, 132.47,135.45, 137.76, 143.62, 145.72, 153.65, 192.83. HRMS Calcd forC16H15N3O3S2 ([MþH]þ): 362.0628, Found: 362.0627.

Protein preparation

Expression and purification of CA I, II, VII, XII and XIII hasbeen previously described: CA I by Baranauskiene et al.28, CA IIby Cimmperman et al.29, CA VII and XIII by Sudzius et al.21 andCA XII by Jogaite et al.30.

Determination of compound binding to CAs by thermalshift assay

The thermal shift assay (TSA) measurements were performed in aCorbett Rotor-Gene 6000 (QIAGEN Rotor-Gene Q, Sydney,Australia) instrument using the blue channel (excitation 365� 20,detection 460� 15 nm). Samples contained 10 mM protein, 0–200mM compound, 50 mM solvatochromic dye ANS (8-anilino-1-naphthalene sulfonate) and 50 mM phosphate buffer containing100 mM NaCl at pH 7.0, with the final DMSO concentration at2%. The applied heating rate was 1 �C/min. Data analysis wasperformed as previously described31.

Results

A series of benzenesulfonamides with a benzimidazole moiety1–4(a–j) were designed as CA inhibitors (Figure 2). Theprocedures for N-alkylation of 2-substituted benzimidazoles(a–j) with 5-(bromoacetyl)-2-chlorobenzenesulfonamide (4)have been described previously23. N-substituted benzimidazolederivatives 1–3(a–j) were prepared by N-alkylation of benzimi-dazoles a–j with 4-(bromoacetyl)benzene-sulfonamide (1),4-(bromoacetyl)-2-chlorobenzenesulfonamide (2) and 3-(bromoa-cetyl)benzenesulfonamide (3) (Scheme 1).

The dissociation constants for compounds 1–4(a–j) binding tofive CA isozymes CA I, II, VII, XII and XIII are listed in Table 1.AZM and EZA were used as controls. The binding of thesecompounds was determined by the TSA. Figures 3 and 4 showrepresentative binding data obtained by TSA. The data in Table 1and Figure 5 show that the position of the sulfonamide group onthe benzene ring significantly influences the binding strength tothe various CA isoforms. In most cases, the para-substitutedbenzenesulfonamide (compounds 1–2(a–j)) had higher bindingaffinity than its meta-substituted benzenesulfonamide equivalent(compounds 3–4(a–j)) (Figure 3). All 1–2(a–j) derivatives werenanomolar inhibitors of CA I, II, VII and XIII (dissociationconstants (Kds) in the range of 1.6–286 nM). The binding of1–2(a–j) to CA XII was weaker (Kd ranged from 62.5 nM to8.3mM). Most compounds of the 3–4(a–j) series were micromolarinhibitors of all investigated CA isoforms (Kds in the range of0.1–100mM). Compounds bearing a chlorine atom in the ortho

position of the benzenesulfonamide ring were in most cases moreeffective CA inhibitors than compounds without a chlorinesubstitution in this position: (2(a–j) versus 1(a–j) and 4(a–j)versus 3(a–j)). For example, compound 2g exhibited 25 timesgreater affinity than 1g to CA XIII whereas compound 4h was 34

Table 1. Dissociation constants for compounds binding to five humanrecombinant CA isoforms, determined by TSA (37 �C, pH 7.0).

Dissociation constantsKd (nM) to CA isoforms

Inhibitors R3 CA I CA II CA VII CA XII CA XIII

1a 33.0 4.0 20.0 909.0 83.02a H 12.0 8.3 4.0 833.0 19.03a 4350 4340 6670 12 500 23804a 11 100 1560 1000 2080 670.01b 10.0 6.3 28.0 769.0 76.92b Me 5.88 10.5 11.0 200.0 23.23b 9090 7690 16 670 16 670 20004b 10 000 2000 2500 6250 400.01c 8.33 4.17 20.0 1050 62.52c CH2OH 10.0 14.3 5.0 1000 66.73c 5000 4000 5710 12 500 20004c 7140 1000 400.0 5560 333.01d 143.0 100.0 20.0 8 330 286.02d C6H5CH2 8.33 2.86 8.33 167.0 6.673d 2500 1667 12 500 5000 11104d 8330 1560 3330 769.0 10001e 8.33 5.0 20.0 556.0 50.02e Et 4.76 6.25 7.69 66.7 11.53e 4760 7690 25 000 14 300 33304e 7140 556.0 1670 1820 400.01f 7.14 5.56 17.2 667.0 28.62f Pr 2.86 3.57 4.17 62.5 5.563f 1000 6670 25 000 11 100 10004f 10 000 833.0 2500 1430 14301g 11.1 4.17 20.0 1000 50.02g Bu 3.33 2.70 3.33 112.0 2.503g 667.0 2860 25 000 11 100 667.04g 10 000 454.0 3 330 2860 400.01h 4.0 5.56 20.0 476.0 33.32h i-Pr 5.0 14.3 5.0 333.0 40.03h 2500 16 700 100 000 20 000 50004h 4540 667.0 2000 588.0 370.01i 8.33 5.56 5.56 833.0 33.32i i-Bu 6.67 14.3 5.0 500.0 40.03i 125.0 5 000 25 000 8330 14304i 3330 384.0 1000 2000 28601j 3.57 4.0 18.2 2000 38.42j SCH3 1.67 3.33 4.54 66.7 9.093j 1670 3450 25 000 5000 833.04j 5000 1000 1670 1430 1110Indapamide 10 000 300.0 300.0 1400 100.0EZA 14 0.71 0.71 36.0 13.0AZM 1400 17.0 17.0 133.0 50.0

Average standard deviation for TSA data was below 25%.

Scheme 1. Synthesis of compounds 1–3(a–j).


Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y O

ndok

uz M

ayis

Uni

v. o

n 04

/28/

14Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

times more potent than 3h for CA VII. In contrast, CA I bound4(a–j) weaker than 3(a–j). The highest difference was observedbetween compounds 4i and 3i, with the latter being 27 timesstronger CA I inhibitor than 4i.

The binding of most benzenesulfonamides of types 1–4(a–j) toCA I, II, VII, XII and XIII did not strongly depend on thesubstituent (R3) on the benzimidazole ring. By comparing theseries of compounds bearing methyl 1–4b, hydroxymethyl 1–4c,ethyl 1–4e, propyl 1–4f and butyl 1–4g substituents, we showedthat the tail length did not affect the binding affinity by more thantwo times to any of the tested CAs. For example, the Kds for 1b, c

and e–j for CA I varied only in the narrow nanomolar range (from3.5 to 11.1 nM). The Kds for CA I were higher for compounds 1aand 1d, 33 and 143 nM, respectively. CA II was best inhibited(Kd¼ 4–100 nM), while CA XII (Kd¼ 0.48–8.33 mM) leastinhibited. Compounds bearing iso-propyl 1 h and S-methyl 1jsubstitution on benzimidazole ring were good inhibitors of CA Iand CA II (Kds were about 4–5 nM), whereas iso-butyl-substitutedcompound 1i potently bound CA VII (Kd¼ 5.56 nM).Benzyl-substituted 1d had the weakest binding affinity, especiallyto CA XII (Kd¼ 8.33 mM), but it was selective for CA VII(Kd¼ 20 nM).

N-alkylated benzimidazoles (2(a–j)) were the best inhibitors ofCA I, II, VII and XIII exhibiting affinities in the nanomolar range.These compounds were weaker CA XII inhibitors by about oneorder of magnitude. Compounds with methyl, ethyl, propyl andbutyl substituents had a high affinity for CA I (Kd ranged from 2.9to 5.9 nM), CAII (Kd from 10.5 to 2.70 nM), CA VII (Kd from 11.1to 3.33 nM) and CA XIII (Kd from 23.3 to 2.50 nM).Benzimidazoles that contained a branched chain aliphatic tail(compounds 2 h, 2i) had four to eight times reduced affinity forCA II (Kds were 14.3 nM for both compounds), CA XII (Kds were333 and 500 nM, respectively) and CA XIII (Kds were 40 nM forboth compounds), as compared to compounds 2f and 2g whichcontained an unbranched tail. Benzimidazole with an S-methylsubstituent, 2j, bound to CA isoforms similarly as the propyl-substituted compound, 2f.

3(a–j) N-benzimidazoles were the weakest CA inhibitors (Kdsin the range of 0.67–100 mM). Only three of them (3g, i, j) had ahigher affinity for CA I and XIII, than for the other tested CAs.For example, 3i binds to CA I 40 times stronger than CA II, 200times stronger than CA VII, 66 times stronger than CA XII and 10times stronger than CA XIII.

4(a–j) N-substituted benzimidazoles (Kds in the range of0.33–11.1mM) were slightly better inhibitors than the 3(a–j)compounds. They behaved as weak inhibitors against CA I (Kdsare in the micromolar range 3.3–11mM). Six derivatives, namely4a–c, e, g and h, were better inhibitors of CA XIII, with Kds in therange of 0.33–0.67 mM. Compound 4b, which is structurally themost similar to the clinically used indapamide, was slightly lesspotent. The binding affinity of 4b and indapamide to CA I wassimilar, but 4b bound about seven times weaker to CA II and CAVII and four times weaker to CA XII and CA XIII thanindapamide.

Discussion

Indapamide, which is a clinically used diuretic, may act as aninhibitor of various CA isozymes present in the kidneys and bloodvessels, thus lowering the blood pressure in patients withhypertension and type-2 diabetes32. It has been reportedpreviously by Supuran’s group that the inhibition constants (Kis)of indapamide for several CAs were: 51 900 nM for hCA I,2520 nM for hCA II, 0.23 nM for hCA VII, 10 nM for CA XII and13 nM for murine CA XIII19. The TSA data confirmed thatindapamide was a weak inhibitor of the isoform CA I(Kd¼ 10 000 nM). However, the Kd values toward other CAsdiffered from Ki values (Kds for CA II and VII were 300 nM, CAXII¼ 1400 nM and CA XIII¼ 100 nM). These discrepanciescould be observed due to the different techniques utilized forcompound binding and inhibition measurements. Usually, theTSA and other biophysical binding techniques, such as isothermaltitration calorimetry, yield dissociation constants that are close tothe inhibition constants determined by the stop-flow carbondioxide hydration assay28,33.

Numerous indapamide analogues were designed in search ofnew, more potent and selective CA inhibitors. A diminished

2d

200

0

Flu

ores

cenc

e, a

rb.u

nits

50 60 70

10203040506070

0

20

40

60

80

100

4d

200

T, °C

Lt, M

Tm

, °C

0

0 10−5 10−4 10−3

60

70 1d

4d

3d

2d

Figure 3. TSA data of 1–4d binding to CA XIII. The top panels comparedenaturation curves observed by fluorescence at 0–200 mM addedcompound concentrations. The bottom panel shows the dependence ofthe protein melting temperatures Tm on compound concentrations.

50

52

54

56

58

60

62

64

2h

2d

CA XII Kd(2j) = 66.7 nM

Kd(2a) = 833 nM

Lt M

Tm

°C

010−510−6 10−4 10−3

Figure 4. TSA data of 2a, 2d, 2h and 2j binding to CA XII.


Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y O

ndok

uz M

ayis

Uni

v. o

n 04

/28/

14Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

affinity of derivatives of both series 3(a–j) and 4(a–j), which aremost structurally related to indapamide when compared with thecorresponding inhibitors 1(a–j) and 2(a–j), towards isozyme I, II,VII, XII and XIII was observed. This is thought to occur due tothe benzimidazole group in the meta position in relation to thebenzenesulfonamide moiety, which is present in the first series ofcompounds. This could lead to steric hindrance when binding tothe Zn ion within the enzyme active site.

It was interesting to notice that the chlorine atom in the orthoposition of the sulfonamide group of the compounds 2(a–j) and4(a–j) increased the affinity to all CAs, with the exception of CAI. All compounds of the series 4(a–j) with a chlorine substitutionin the ortho position possessed a lower binding potency with CA Ithan compounds 3(a–j) without a chlorine substitution.Compound 3i, bearing a bulky iso-butyl substituent in thebenzimidazole moiety, behaved as a selective CA I inhibitor,having more than 10 times higher affinity against CA I isozyme ascompared to other CAs.

Conclusions

Benzenesulfonamides bearing benzimidazole substituents weresynthesized and assayed as inhibitors of five CA isozymes, CA I,II, VII, XII and XIII. 4-[(2-Substituted-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfonamides 1(a–j) were more than twoorders of magnitude stronger CA inhibitors than 3-[(2-substi-tuted-1H-benzimidazol-1-yl)acetyl]benzenesulfonamides 3(a–j).Compounds of the series 1(a–j) and 2(a–j) were nanomolarinhibitors of CA I, II, VII and XIII (Kds in the range of1.6–286 nM).

Declaration of interest

The authors report no conflicts of interest.This research was funded by a grant (No. LIG-09/2012) from the

Research Council of Lithuania. The authors also acknowledge FP7-REGPOT-2009-1 grant ‘‘MoBiLi’’, agreement No.: 245721, and theCOST projects TD0905 and CM0804. This work was partly supported bythe Lithuanian Science Council Student Research Fellowship Award (No.SMT12P-079, student – MK).

References

1. Alterio V, Fiore AD, D’Ambrosio K, et al. Multiple binding modesof inhibitors to carbonic anhydrases: how to design specific drugstargeting 15 different isoforms? Chem Rev 2012;112:4421–68.

2. Aggarwal M, Kondeti B, McKenna R. Insights towards sulfonamidedrug specificity in a-carbonic anhydrases. Bioorg Med Chem 2012;doi: 10.1016/j.bmc.2012.08.019.

3. Supuran CT. Carbonic anhydrases as drug targets – an overview.Curr Top Med Chem 2007;7:825–33.

4. Supuran CT. Carbonic anhydrases – an overview. Curr Pharm Des2008;14:603–14.

5. Nordfors K, Haapasalo J, Korja M, et al. The tumour-associatedcarbonic anhydrases CA II, CA IX and CA XII in a group ofmedulloblastomas and supratentorial primitive neuroectodermaltumours: an association of CA IX with poor prognosis. BMCCancer 2010;10:148–58.

6. Chien MH, Ying TH, Hsieh YH, et al. Tumor-associatedcarbonic anhydrase XII is linked to the growth of primary oralsquamous cell carcinoma and its poor prognosis. Oral Oncol2012;48:417–23.

7. Swietach P, Hulikova A, Vaughan-Jones RD, Harris AL. Newinsights into the physiological role of carbonic anhydrase IX intumour pH regulation. Oncogene 2010;29:6509–21.

8. Said HM, Supuran CT, Hageman C, et al. Modulation of carbonicanhydrase 9 (CA9) in human brain cancer. Curr Pharm Des2010;16:3288–99.

9. Pastorekova S, Parkkila S, Zavada J. Tumor-associated carbonicanhydrases and their clinical significance. Adv Clin Chem2006;42:167–216.

10. Winum JY, Carta F, Ward C, et al. Ureido-substituted sulfamatesshow potent carbonic anhydrase IX inhibitory and antiproliferativeactivities against breast cancer cell lines. Bioorg Med Chem Lett2012;22:4681–85.

11. Rodriguez OM, Maresca A, Tempera CA, et al. N-b-glycosylsulfamides are selective inhibitors of the cancer associated carbonicanhydrase isoforms IX and XII. Bioorg Med Chem Lett2011;21:4447–50.

12. Touisni N, Maresca A, McDonald PC, et al. Glycosyl coumarincarbonic anhydrase IX and XII inhibitors strongly attenuate thegrowth of primary breast tumors. J Med Chem 2011;54:8271–7.

13. Supuran CT. Carbonic anhydrase inhibition with natural products:novel chemotypes and inhibition mechanisms. Mol Divers2011;15:305–16.

14. Supuran CT, Scozzafava A, Conway J. Carbonic anhydrase – itsinhibitors and activators. Boca Raton, FL: CRC Press; 2004:1–363.

15. Supuran CT, Innocenti A, Mastrolorenzo A, Scozzafava A. Antiviralsulfonamide derivatives. Mini Rev Med Chem 2004;4:189–200.

16. Carta F, Scozzafava A, Supuran CT. Sulfonamides: a patent review(2008–2012). Expert Opin Ther Pat 2012; 22:747–58.

17. Carta F, Supuran CT, Scozzafava A. Novel therapies for glaucoma: apatent review 2007–2011. Expert Opin Ther Pat 2012; 22:79–88.

18. Thiry A, Dogne JM, Supuran CT, Masereel B. Anticonvulsantsulfonamides/sulfamates/sulfamides with carbonic anhydrase inhi-bitory activity: drug design and mechanism of action. Curr PharmDes 2008;14:661–71.

19. Temperini C, Cecchi A, Scozzafava A, Supuran CT. Carbonicanhydrase inhibitors. interaction of indapamide and related diureticswith 12 mammalian isozymes and X-ray crystallographic studies forthe indapamide-isozyme II adduct. Bioorg Med Chem Lett2008;18:2567–73.

20. Capkauskaite E, Zubriene A, Baranauskiene L, et al. Design of [(2-pyrimidinylthio)acetyl]benzenesulfonamides as inhibitors of humancarbonic anhydrases. Eur J Med Chem 2012;51:259–70.

21. Sudzius J, Golovenko D, Matuliene J, et al. 4-[n-(substituted4-pyrimidinyl)amino]benzenesulfonamides as inhibitors of carbonic

Figure 5. The binding constants of 1i, 2i, 3iand 4i to CAI, II, VII, XII and XIII.

1.E+04

1.E+05

1.E+06

1.E+07

1.E+08

1.E+09

1i 2i 3i 4i

Kb, M

-1

CA I CA II CA VII CA XII CA XIII


Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y O

ndok

uz M

ayis

Uni

v. o

n 04

/28/

14Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

anhydrase isozymes I, II, VII and XIII. Bioorg Med Chem 2010;18:7413–21.

22. Dudutiene V, Baranauskiene L, Matulis D. Benzimidazo[1,2-c][1,2,3]thiadiazole-7-sulfonamides as inhibitors of carbonic anhy-drase. Bioorg Med Chem Lett 2007;17:3335–8.

23. Capkauskaite E, Baranauskiene L, Golovenko D, et al. Indapamide-like benzenesulfonamides as inhibitors of carbonic anhydrases I, II,VII, and XIII. Bioorg Med Chem 2010;18:7357–64.

24. Fujikura T, Miigata K, Hashimoto S, et al. Studies on benzene-sulfonamide derivatives with alpha- and beta-adrenergic antagonis-tic and antihypertensive activities. Chem Pharm Bull (Tokyo)1982;30:4092–101.

25. Zanka A, Kubota A. Practical and efficient chlorination ofdeactivated anilines and anilides with ncs in 2-propanol. Synlett1999;12:1984–6.

26. Nickson TE, Roche-Dolson CA. A convenient procedure for thechlorination of deactivated anilines. Synthesis 1985;6/7:669–70.

27. Phillips MA. The formation of 2-substituted benzimidazoles.J Chem Soc 1928;CCCXVII:2393–9.

28. Baranauskiene L, Hilvo M, Matuliene J, et al. Inhibition and bindingstudies of carbonic anhydrase isozymes I, II and IX withbenzimidazo[1,2-c][1,2,3]thiadiazole-7-sulphonamides. J EnzymeInhib Med Chem 2010;25:863–70.

29. Cimmperman P, Baranauskiene L, Jachimoviciute S, et al.A quantitative model of thermal stabilization and destabilizationof proteins by ligands. Biophys J 2008;95:3222–31.

30. Jogaite V, Zubriene A, Michailoviene V, et al. Characterization ofhuman carbonic anhydrase XII stability and inhibitor binding.Bioorg Med Chem 2012; doi: 10.1016/j.bmc.2012.10.016.

31. Kazlauskas E, Petrikaite V, Michailoviene V, et al. Thermodynamicsof aryl-dihydroxyphenyl-thiadiazole binding to human Hsp90. PLoSONE 2012;7:e36899.

32. Supuran CT. Diuretics: from classical carbonic anhydrase inhibitorsto novel applications of the sulfonamides. Curr Pharm Des2008;14:641–8.

33. Zubriene A, Kazlauskas E, Baranauskiene L, et al. Isothermaltitration calorimetry and thermal shift assay in drug design.European pharmaceutical review 2011;16:56–9.


Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y O

ndok

uz M

ayis

Uni

v. o

n 04

/28/

14Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

http://informahealthcare.com/enzISSN: 1475-6366 (print), 1475-6374 (electronic)

J Enzyme Inhib Med Chem, Early Online: 1–8! 2014 Informa UK Ltd. DOI: 10.3109/14756366.2014.908291

Intrinsic thermodynamics of sulfonamide inhibitor binding to humancarbonic anhydrases I and II

Vaida Morkunait _e1, Joana Gylyt _e1, Asta Zubrien _e1, Lina Baranauskien _e1, Migl _e Kisonait _e1, Vilma Michailovien _e1,Vaida Juozapaitien _e1, Matthew J. Todd2, and Daumantas Matulis1

1Department of Biothermodynamics and Drug Design, Institute of Biotechnology, Vilnius University, Vilnius, Lithuania and2Jenssen Pharmaceuticals, Johnson & Johnson, Inc., Welsh & Mc.Kean Rds., Springhouse, PA, USA

Abstract

Human carbonic anhydrase (CA) I and II are cytosolic proteins, where their expression disorderscan cause diseases such as glaucoma, edema, epilepsy or cancer. There are numerous inhibitorsthat target these isozymes, but it is difficult to design compounds that could bind to oneof these proteins specifically. The binding of sulfonamide inhibitor to a CA is linked to severalprotonation reactions, namely, deprotonation of the sulfonamide group, protonation of theactive site zinc hydroxide and the compensating protonation–deprotonation of buffer.By performing binding experiments at various pHs and buffers, all those contributions weredissected and the ‘‘intrinsic’’ binding parameters were calculated. Intrinsic thermodynamicbinding parameters to CA I and II were determined for such widely studied drugs asacetazolamide, ethoxzolamide, methazolamide, trifluoromethanesulfonamide and dichloro-phenamide. The assignment of all contributions should enhance our understanding of theunderlying energetics and increase our capability to design more potent and specific CAinhibitors.

Keywords

Carbonic anhydrase, enthalpy, fluorescentthermal shift assay, intrinsic parameters,isothermal titration calorimetry, ligandbinding, thermal shift assay, ThermoFluor

History

Received 29 January 2014Revised 21 March 2014Accepted 22 March 2014Published online 23 April 2014

Introduction

Carbonic anhydrases (CAs) are metalloenzymes that catalyzecarbon dioxide and water conversion to bicarbonate ion andproton. This reaction occurs slowly at physiological pH[kCO2¼ 0.037 (±0.002) s�1], but CAs make it faster about 106

times1. Carbon dioxide is an essential metabolite in all livingsystems, therefore, five different CA classes have been identifiedin different kingdoms of living organisms: a-, b-, c-, d- andz-CA2. They have little chain or structure similarities, but performthe same function3. a-CA is the most investigated of all fiveclasses, because it is most spread and is the only class that isfound in human. There are 15 different CA isoforms in humanbody, only 12 of them are catalytically active4–6.

CA I and II are cytosolic CA isoforms, as are CA III, VII andXIII. Three-dimensional structural analysis shows a high degreeof structural similarity between CA I and II isoforms7. Highconcentrations of CA I and II isozymes are found in erythrocytes.CA I is the most abundant non-hemoglobin protein in red bloodcells and it is important for bone ossification process. However,its overexpression can cause retina and brain edema. CA II is themost spread isoform that has the highest catalytic activity. It isfound in almost all organs and tissues but disorder of expressioncan be a reason of edema, epilepsy, glaucoma or several tumors,such as esophagus, kidney, pulmonary and others8. Therefore,

these CA isoforms are important targets for pharmaceuticalresearch.

Numerous compounds have been designed as CA inhibitors.Best known are ligands that have primary sulfonamide group.About 30 of them are used as drugs. However, the main problemis to find an inhibitor that would be selective for one isoform.Design of such inhibitors requires detailed investigation of thestructure–activity relationships (SARs) of the new compound.Most inhibitors are only characterized by determining theirbinding or inhibition constants. We think that it is important todetermine the full thermodynamic profile, including the enthal-pies and entropies of binding and estimate intrinsic parameters ofprotein–ligand binding. This would let us more deeply understandthe SAR and allow the design of isoform-specific inhibitors4,9.Sulfonamide inhibitors bind CAs as anions, whereas they exist insolution at pH 7.0 as electrostatically neutral molecules10,11,thus exhibiting linked protonation events upon binding that shouldbe subtracted.

Determination of intrinsic thermodynamic parameters ofbinding requires predetermination of Zn-bound hydroxy ionprotonation parameters by performing numerous experimentsby isothermal titration calorimetry (ITC) at various pHs in atleast two different buffers. However, it is enough to performthis analysis only once for each CA isoform by using onemodel inhibitor. Intrinsic parameters of binding of otherinhibitors can then be calculated by subtracting protonationcontributions12,13.

Here, we determine the intrinsic parameters of well-knowninhibitors, ethoxzolamide (EZA), trifluoromethanesulfonamide(TFS), acetazolamide (AZM), dichlorophenamide (DCP) andmethazolamide (MZM) binding to CA I and CA II isoforms.

Address for correspondence: Daumantas Matulis, Department ofBiothermodynamics and Drug Design, Institute of Biotechnology,Vilnius University, Graiciuno 8, Vilnius LT-02241, Lithuania. Tel:+370-5-269-1884. Fax: +370-5-260-2116. E-mail: [email protected],[email protected]

Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y D

anm

arks

Nat

ur-o

g on

04/

28/1

4Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

http://informahealthcare.com/enz




Experiments were performed by ITC and fluorescent thermal shiftassay (FTSA) methods.

ITC is the method that can determine the binding constant andbinding enthalpy in a single experiment. However, there is a limitof binding constants that can be determined by ITC (about 108 M�1

depending on protein concentration). As some inhibitors boundstronger6, the binding constants of all inhibitors were alsoconfirmed by FTSA (also called differential scanning fluorimetryand, in high-throughput format, ThermoFluor�). This methodmeasures the increase in protein melting temperature in thepresence of the inhibitor14–18. FTSA is a rapid screening method,that requires small amounts of proteins and can be applied to nearlyall soluble protein–ligand systems16,17,19–22. A good agreementbetween the ITC and ThermoFluor� data confirmed the accuracyof binding constant determination by ITC.

Materials and methods

Proteins

CA isozymes I and II were purified as described in previousstudies27,28. For comparison, we used CA isozyme I (from humanerythrocytes, cat. # C4396) and II (from human erythrocytes, cat.# C6165) purchased from Sigma Chemical Company, St. Louis,MO. Concentration was determined by dry weight and spectro-photometrically (discrepancy between the methods did not exceed15%). The observed thermodynamic parameters of inhibitorbinding to CA I and II purchased from Sigma and the CAspurified from Escherichia coli cells in our laboratory wereidentical within the error margin of the experiment.

Inhibitors

EZA was purchased from Aldrich, TFS was purchased from AlfaAesar and Lancaster Synthesis, AZM, DCP and MZM werepurchased from Sigma Chemical Co, St. Louis, MO. All inhibitorswere used without further purification. Inhibitors, purchased fromdifferent suppliers, bound to the same enzymes with identicalaffinity.

Isothermal titration calorimetry

ITC experiments were performed by using VP-ITC and ITC200

instruments (Microcal, Inc., GE-Healthcare, Northampton, MA).Measurements of protein–ligand binding reactions were per-formed using 4–20 mM protein solution in the cell and 40–200 mMligand solution in the syringe. A typical experiment consisted of25 injections, 10 mL each. Intervals between injections were 2 or3 min. Experiments were performed at 25�C in 50 mM sodiumphosphate and Tris-chloride buffers, containing 100 mM NaCland 2% DMSO, concentration equal in the syringe and the cell.For the determination of ligand binding at various pHs, thesolution pH was carefully checked in the syringe and cell solutionbefore and after the experiment. ITC data were integrated, fit andanalyzed as described previously29.

Fluorescent thermal shift assay

FTSA experiments were performed with Corbett Rotor-Gene 6000(QIAGEN Rotor-Gene Q, Hilden, Germany) instrument using theblue channel (excitation 365 ± 20, detection 460 ± 15 nm), apply-ing the heating rate of 1 �C/min. The samples contained 20mL of10mM protein, 0–400 mM ligand, 50 mM 8-anilino-1-naphthalenesulfonate (ANS), 50 mM sodium phosphate at pH 7.0, 50 mMNaCl and 2% DMSO. The pH dependence of the observed bindingconstant (Kb) was determined in the buffer containing 50 mMsodium phosphate, 50 mM sodium acetate and 25 mM sodiumborate. The fluorescence and ligand dosing curves were fit asdescribed previously17,27.

Results

Protonation reactions occurring upon binding

At least three protonation–deprotonation reactions (R2, R3 andR4) accompany the reaction of sulfonamide anion binding to CA(R1). First, the hydroxide ion that bound to zinc atom at theactive site, must be protonated (R2). Second, amino group of thesulfonamide must become negatively charged – deprotonated(R3). Third, there will be a compensating protonation ordeprotonation of the buffer (R4). Such reactions may besummarized as follows (R – inhibitor chemical groups otherthan sulfonamide):

RSO2NH�þCA� Zn�H2O$ CA� Zn� NH�SO2RþH2O

ðR1Þ

CA� Zn� OH�þHþ $ CA� Zn�H2O ðR2Þ

RSO2NH2 $ RSO2NH�þHþ ðR3Þ

BufferþHþ $ BufferHþ ðR4Þ

RSO2NH2þCA� Zn� OH�þBufferþHþ

$ CA� Zn� NH�SO2Rþ BufferHþþH2O ðR5Þ

Observed thermodynamic parameters represent the sum of alllinked events (R5), whereas (R1) is the intrinsic binding reaction,free of protonation–deprotonation contributions representing adisplacement of water molecule by a deprotonated inhibitormolecule.

Observed thermodynamics of inhibitor binding to CA

Chemical structures of sulfonamide inhibitors used in this studyare shown in Figure 1. These inhibitors exhibited the observedbinding affinities spanning the range from 106 to 108 M�1

(Table 1). Figure 2 shows several typical FTSA data for inhibitorbinding to CA. Figure 2(A) shows the CA II melting curves in thepresence of EZA, whereas Figure 2(B) – in the presence of TFS.Figure 2(C) shows the dosing curves obtained from the data inpanels A and B. Same concentration of EZA shifted the meltingtemperature of CA II more than TFS. Therefore, EZA is a strongerbinder than TFS at pH 7.0. However, these are only the observedbinding parameters.

Binding is highly dependent on buffer and pH. ITC experi-ments were carried out in buffers of different protonation enthalpyto determine the protonation reactions linked to the bindingreaction. ITC curves in Figure 3 illustrate the binding dependenceon buffer and its pH. If a net change in protonation occurs uponligand binding, a corresponding change in buffer protonationshould add to the observed enthalpy. We have performed thebinding experiments in the sodium phosphate and Tris-chloridebuffers at 25 �C. Deprotonation enthalpies of these buffers at thistemperature are 5.10 kJ/mol and 47.5 kJ/mol, respectively.

The observed binding constants (observed Gibbs free ener-gies), enthalpies and entropies are listed in Table 1 and inFigure 4. Both the observed binding constants and the observedenthalpies are dependent on pH and buffer. For example,EZA binding to CA I in phosphate buffer was about 10-foldweaker at pH 9.0 than at pH 7.0, but the enthalpy was muchmore exothermic at pH 9.0 (�75.60 kJ/mol) than at pH 7.0(�29.07 kJ/mol). In Tris buffer, however, the enthalpy wasmore exothermic at pH 7.0 (�63.39 kJ/mol) than at pH 9.0(�46.44 kJ/mol). The trend for CA II was generally similar buthad significant differences discussed below.

Furthermore, binding of a given sulfonamide ligand to CA willbe strongest at the pH when the ligand is deprotonated and thehydroxide ion bound to zinc is protonated. Therefore, optimal

2 V. Morkunait _e et al. J Enzyme Inhib Med Chem, Early Online: 1–8

Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y D

anm

arks

Nat

ur-o

g on

04/

28/1

4Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

binding is in the pH region between the respective pKas whenpKa-sulfonamide5pKa-Zn-water. When pH is below the pKa-sulfonamide

or above the pKa-Zn-water, then the binding is weaker. The observedbinding constant Kb-obs is equal to the intrinsic binding constantKb multiplied by the available fractions of deprotonated inhibitorand protonated zinc hydroxy anion:

Kb�obs ¼ KbfRSO2NH� fCAZnH2O ð1ÞThe Gibbs free energy in turn is:

Db�obsG ¼ �RT ln KbfRSO2NH� fCAZnH2Oð Þ ð2Þ

Fraction of deprotonated sulfonamide can be calculated when theprotonation pKa is known:

fRSO2NH� ¼10

pH�pKasulfonamide

1þ 10pH�pKasulfonamide

¼ 1� 10pKasulfonamide

�pH

1þ 10pKasulfonamide

�pHð3Þ

Similarly, the fraction of enzyme molecules with protonated watermolecules bound to the active site Zn atom can be calculated ifrespective protonation pKa is known:

fCAZnH2O¼ 1� 10pH�pKa Zn water

1þ 10pH�pKa Zn water¼ 10pKa Zn water�pH

1þ 10pKa Zn water

�pHð4Þ

Figure 5 shows the pH dependence of the observed bindingconstants obtained by using FTSA and ITC methods. Bothmethods yielded similar pH dependence as seen for TFS bindingto CA I. However, due to high EZA affinity to CA II at pH rangefrom 7.5 to 8.5, it was difficult to observe the binding constants byITC because the Wiseman (c¼Kb�C, where C is protein molarconcentration) factor falls out of the useful range of 5–500.

The binding constant does not depend on the chemical natureof the buffer provided that the buffer does not bind the ligand orthe protein. There was essentially no difference between thebinding Gibbs free energies obtained in phosphate and Trisbuffers.

The intrinsic enthalpy of binding has contributions from theobserved binding enthalpy (DbHobs), enthalpies of inhibitor(Db_proton_inhH), CA (Db_proton_CAH) and the buffer protonation(Db_proton_bufH):

DbH ¼ DbHobs � ninhDb proton inhH

� nCADb proton CAH þ nDb proton buf H

where:ninh ¼ fRSO2NH� � 1

nCA ¼ 1� fCAZnH2Oð6Þ

n ¼ ninh þ nCA

Energetics of inhibitor protonation

Equation (R3) represents the deprotonation of the sulfonamidegroup. Only the deprotonated sulfonamide form is thought to bindto the CA23. The ionization form of inhibitor depends on the pKa

and pH of the solution. Most sulfonamide inhibitors areprotonated at physiological pH and must undergo a linkeddeprotonation reaction upon binding to the protein.

Figure 1. Chemical structures and abbrevi-ations of the CA inhibitors used in this study.Every inhibitor bears a sulfonamide groupthat binds to the zinc atom of the CA activesite.

Dichlorophenamide (DCP)Trifluoromethane-sulfonamide (TFS)

Ethoxzolamide (EZA) Acetazolamide (AZM)

Methazolamide (MZM)

Cl

Cl

S

O

OS

O

O

S

O

O

N

O

NS

N

SNH2NH2

NH2

NH2 NH2H2N

O

O

O

HNS

N N

S

O

OS

N

O

FFF

SO O

Table 1. The observed thermodynamic parameters of EZA, TFS andAZM binding to CA I and II in phosphate and Tris buffers at various pH,25�C, determined by ITC.

Compound pHKb_obs,M�1

DbGobs,kJ/mol

DbHobs,kJ/mol

TDbSobs,kJ/mol

CA I, Phosphate bufferEZA 6.6 3.59� 107 �43.12 �27.42 15.70

7.0 2.55� 107 �42.28 �29.07 13.217.9 1.68� 107 �41.24 �44.10 �2.869.0 4.12� 106 �37.76 �75.60 �37.84

TFS 7.0 2.58� 107 �42.31 �53.10 �10.79AZM 7.0 1.19� 106 �34.68 �44.70 �10.02MZM 7.0 1.14� 107 �40.29 �44.43 �4.14DCP* 7.0 1.85� 106 �35.77 �32.34 3.43

CA I, Tris bufferEZA 6.6 2.98� 107 �42.66 �65.52 �22.86

7.0 5.31� 107 �44.09 �63.39 �19.307.9 2.22� 107 �41.93 �61.38 �19.459.0 1.74� 107 �41.33 �46.44 �5.11

CA II, Phosphate bufferEZA 6.0 2.59� 108 �48.02 �49.29 �1.27

7.0 7.00� 107 �44.76 �64.68 �19.927.5 1.94� 108 �47.30 �70.79 �23.497.9 1.99� 108 �47.37 �82.59 �35.22

TFS 7.0 4.84� 107 �43.86 �35.53 8.33AZM 7.0 5.91� 107 �44.36 �53.35 �8.99MZM 7.0 2.89� 107 �43.76 �52.05 �8.29DCP* 7.0 8.19� 107 �45.17 �27.20 17.97

CA II, Tris bufferEZA 6.0 1.45� 108 �46.58 �87.11 �40.53

6.9 2.91� 108 �48.31 �74.39 �26.087.4 5.30� 107 �44.09 �70.96 �26.877.9 2.48� 108 �47.92 �63.64 �15.72

*Thermodynamic parameters of DCP binding to CA I and II from Sigma.Uncertainty of the DbGobs is ± 4 kJ/mol, DbHobs is ± 4 kJ/mol andTDbSobs is ± 6 kJ/mol.

DOI: 10.3109/14756366.2014.908291 Inhibitor binding to CA I and II 3

Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y D

anm

arks

Nat

ur-o

g on

04/

28/1

4Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

The inhibitor protonation enthalpy is observed by titratingalkaline solution of the inhibitor (1.5 equivalent of base wasadded) with acid (Figure 6). The enthalpy of the secondtransition is equal to the enthalpy of inhibitor protonation. Thefirst transition is due to neutralization of 0.5 equivalentof NaOH.

The same solutions and volumes as in the calorimetricexperiments were used for potentiometric titration by using apH-meter. A function describing two transitions was derivedaccording to another study24 and curves were simulated to matchthe experimental datapoints. Two representative titration curvesare shown in Figure 6(C). The midpoint of the second transitionmatches the pKa of the inhibitor.

The heat capacities of sulfonamide protonation were alsodetermined by carrying out the ITC titration at differenttemperatures (Figure 6D). The slope of the enthalpy dependenceon temperature is equal to the heat capacity of inhibitorprotonation.

TFS has a pKa of 6.25; therefore, at pH 7.0, almost all of theinhibitor exists in a negatively charged form (fraction¼ 0.91) andthe affinity to CA is strong. The pKa values of other measuredinhibitors were 47. The enthalpies of inhibitor protonation(25 �C) were quite similar (�22.4 to �29.5 kJ/mol). Entropies ofprotonation were from 13.3 to 18.7 kJ/(mol�K).

Fluo

resc

ence

inte

nsity

(a.

u.)

0

10

20

30

40

50

60

[EZA] μM011.7126.34200

Fluo

resc

ence

inte

nsity

(a.

u.)

0

10

20

30

40

50

60

Tm (°C)

40 50 60 70 80 90

Tm (°C)

Lt (M)

Tm

(°C

)40 50 60 70 80 90

[TFS] μM011.7126.34200

56

58

60

62

64

66

68

(A) (B)

(C)

00 10−410−510−6

EZATFS

Figure 2. EZA and TFS binding to CA II observed by the FTSA at pH 7.0. (A) and (B) show the protein melting fluorescence curves at several addedconcentrations of EZA and TFS, respectively. (C) Shows the dependence of the protein melting temperatures Tm on the added compoundconcentrations. Datapoints are the experimental values obtained from the upper graphs and the solid lines are simulated according to the model asdescribed in the methods.

Pow

er (

µcal

/s)

−0.2

−0.15

−0.1

−0.05

0

Time (s)0 1000 2000 3000 4000 5000

δH (

kJ/m

ol)

−90

−80

−70

−60

−50

−40

−30

−20

−10

0

Molar ratio

0 0.5

Tris pH 7.0

Tris pH 9.0

Pi pH 7.0

1.51 2

Figure 3. ITC data shows EZA binding to CA II dependence on buffersolution and pH value at the same temperature (25 �C). Integrated curvesshow observed data in Tris-chloride buffer at pH 7.0 (filled triangle) andpH 9.0 (filled square) and sodium phosphate buffer at pH 7.0 (opencircle). The inset shows raw ITC curve in Tris-chloride buffer, pH 7.0,25 �C.


Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y D

anm

arks

Nat

ur-o

g on

04/

28/1

4Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

The thermodynamic parameters of EZA and TFS protonationhave been previously described12. Parameters for AZM, MZMhave been described in other studies23,25, DCP also25 and areconsistent with these results.

Energetics of zinc hydroxy anion protonation

The hydroxy anion bound to the active site Zn must be protonated(electrostatically neutral) in order for the sulfonamide inhibitorbinding reaction to occur. Equation (R2) shows this reaction.Table 2 lists the thermodynamic parameters of protonation of thehydroxide bound to Zn atom. The pKa of CA II was found to be7.1. However, the pKa of CA I was significantly higher,¼ 8.4.Therefore, the Gibbs free energies of reaction (R2) for CA I and IIdiffered by about 5 kJ/mol.

The enthalpies of (R2) for CA I and II were �41 kJ/mol and�26 kJ/mol, respectively. Thus, the enthalpy was slightly moreexothermic for CA I than for CA II. The entropies were alsocontributing favorably to the protonation reaction. Comparison ofobserved parameters shows that the entropy contribution to theCA I protonation was greater than to CA II.

Comparing the thermodynamics of (R2) for CA I and II withother CAs (Table 2), it is clear that the pKa of CA I is similar tothe pKa of CA XIII, whereas that of CA II to CA VII and XII.However, there is no clear pKa correlation with the enthalpy andentropy of hydroxy anion protonation. The enthalpies varied from

�26 to �41 kJ/mol, whereas the entropies varied from 5.3 to21.1 kJ/mol. The process of protonation is primarily enthalpy-driven but also has smaller favorable entropy contribution.

Intrinsic thermodynamics of binding parameters

Table 3 lists the intrinsic thermodynamic parameters of inhibitorbinding to CA I and II. These parameters are independent of pH,buffer and linked protonation events. Intrinsic binding constantsof CA II are greater than the observed Kb values by about oneorder of magnitude except for EZA. However, the difference ofintrinsic and observed binding constants for CA I is generallysmaller than for CA II. Inhibitors bound tighter to CA II than toCA I by about an order of magnitude. This difference may be dueto the different recognition of the surface of the binding pocket.The difference is not due to the linked protonation events and thusmay be correlated to structure. In terms of Gibbs free energy, it isclear that TFS, MZM and DCP bind to CA I with nearly identicalintrinsic affinity of �42.9 to �43.9 kJ/mol. The value for AZM isalso quite similar (�37.8 kJ/mol), but EZA bound significantlytighter (�51.4 kJ/mol). Similar tendency is also observed for CAII. All these values differed significantly from the observed Gibbsfree energies.

Inhibitor binding was enthalpy driven and had relativelynegligible entropic contribution to binding except intrinsicthermodynamic parameters of DCP binding to CA II.

Δ bH

obs

(kJ/

mol

)

Δ bH

obs

(kJ/

mol

)

Δ bH

obs

(kJ/

mol

)

−90

−80

−70

−60

−50

−40

−30

−20

pH

6 7 8 9

CA I-EZA

Pi

Tris

intrinsic

−80

−70

−60

−50

−40

−30

−20

pH

5 6 7 8 9 10

CA I-TFS

intrinsic

Pi

Tris

−100

−90

−80

−70

−60

−50

−40

(A) (B)

(C)

pH

5 6 7 8 9

CA II-EZA

Pi

Tris

intrinsic

Figure 4. The observed enthalpies of binding are shown as a function of buffer pH. Panel A: CA I-EZA, Panel B: CA I-TFS and Panel C: CA II-EZA.Filled circles show the observed binding enthalpies in sodium phosphate buffer, open circles show binding enthalpies observed in Tris-chloride buffer.Experiments were performed by ITC at 25�C. Dotted line represents the intrinsic binding enthalpy. Curves are fit according to Equation (5).


Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y D

anm

arks

Nat

ur-o

g on

04/

28/1

4Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

Discussion

Structure–activity relationships in drug design are usually limitedto the analysis of enzyme inhibition constants or inhibitor bindingconstants. However, other thermodynamic parameters describingprotein–inhibitor interaction, such as enthalpy, entropy, heatcapacity and volume add significant information for inhibitorimprovement and may lead to the design of drugs with betterproperties of target binding9,26.

Thermodynamic parameters of ligand–protein binding areoften thought to be determinable by a single titration calorimetryexperiment. Unfortunately, most such determinations cannot beunderstood in terms of structural features of protein–ligandinterface. Instead, a detailed study is needed to be able to correlatebinding parameters with structure. First, it is necessary to performexperiments in various buffers to show that there are no linkedprotonation–deprotonation reactions. Only if there are no linkedreactions one can relate such parameters to structure. In reality,even the simplest reactions of one inhibitor molecule binding to aspecific site on a protein is usually linked to a series ofcomplicated protonation–deprotonation and other reactions suchas conformational changes or other ion binding.

CA–sulfonamide inhibitor binding is linked to at least threeprotonation reactions. Their impact on observed thermodynamicparameters is very significant. Without the dissection of the linked

reactions, the structural reason for the observed parameters cannotbe understood. The enthalpy of hydroxide or amino groupprotonation (�40 to �50 kJ/mol) is comparable with the enthalpyof binding.

The contributing linked reactions of MZM binding to CA Iwere determined earlier23. Their obtained enthalpy of MZMbinding to CA I (�56.5 kJ/mol) is close to our intrinsic enthalpy(�56.9 kJ/mol) (Table 3). The pKa of zinc hydroxide protonationwas assumed to be the same as that of the CA I containing cobaltatom in the active site. The presence of cobalt enabled pKa

determination by spectral methods. The Co hydroxide protonationpKa was equal to 7.41 ± 0.04. Our determined zinc hydroxide pKa

in CA I was¼ 8.4. Therefore, an assumption that Co and Znenzymes will have the same pKa is not correct. Furthermore, ourresults show that CA I and CA II zinc hydroxide pKas differsignificantly (it is¼ 7.1 for CA II).

Interestingly, DCP-bound CA I with the negative entropy(TDbSintr¼�11.7 kJ/mol) while CA II with the positive entropy(16.2 kJ/mol). Furthermore, DCP bound stronger to CA II than toCA I, but the enthalpy was more exothermic for the binding toCA I. There is no clear reason for such behavior, but there isenthalpy–entropy compensation effect.

Thermodynamic dissection of contributing linked reactionsshould improve the design of CA inhibitors. The major contribu-tor to the binding weakness of some of the studied inhibitors is a

Δ bG

obs

(kJ/

mol

)

Δ bG

(kJ

/mol

)

Δ bG

obs

(kJ/

mol

)

(A) (B)

(C)

−55

−50

−45

−40

−35

−30

pH

5 6 7 8 9 10

pH

5 6 7 8 9 10

pH

5 6 7 8 9 10

CA I-EZA

intrinsic

−50

−45

−40

−35

−30

Method (buffer):ITC (Tris)ITC (Pi)FTSA

CA I-TFS

intrinsic

−60

−55

−50

−45

−40

−35

CA II-EZA

intrinsic

Figure 5. The observed Gibbs free energy (DbGobs) of EZA (Panel A) and TFS (Panel B) binding to CA I, and EZA binding to CA II (Panel C) atvarious pH. TFS binding to CA I was determined by ITC in Tris-chloride (open triangle, Panel B) and sodium phosphate (open diamond) buffers and byFTSA (filled square). EZA binding to CA I and CA II was performed by FTSA (Panels A and C). Solid line shows the fit according to Equation (2)using parameters listed in tables. Dashed and dotted lines show the contributions of deprotonated ligand and protonated CA, respectively. Straight lineshows the intrinsic Gibbs free energy of binding.


Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y D

anm

arks

Nat

ur-o

g on

04/

28/1

4Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

large pKa of inhibitor deprotonation. It should be advantageousto design inhibitors with pKas58. This may be achieved byintroducing electron withdrawing groups on the inhibitormolecule.

Specificity and selectivity of the studied inhibitors is limited.There is about 10� preference to bind CA II over CA I.Apparently, large differences in chemical structures of ligandssuch as TFS and MZM actually lead to very small differences inintrinsic binding constants. Instead, most of the difference lies inthe deprotonation of sulfonamide group necessary for the bindingto occur. In order to be more specific, inhibitors need to bearlarger structural differences.

Conclusions

Dissection of all contributing reactions to the observed thermo-dynamics of inhibitor binding to a protein is necessary in order to

(A) (B)

(C) (D)

Pow

er, μ

J/s

20

40

60

80

100

120

140

Time, s

δH (

kJ/m

ol)

−50

−40

−30

−20

−10

0

TFS 13 °C

MZM 37 °C

pH

2

4

6

8

10

12

Molar ratio

MZM

TFS

Δ pro

tona

tion

H (

kJ/m

ol)

−35

−30

−25

−20

−15

−10

Temperature (°C)

TFSAZMMZMDCP

0 1 2 3

Molar ratio

0

10 15 20 25 30 35 40

0 2000 4000 6000 8000 1 2 3

Figure 6. Panel A – representative raw ITC data of alkaline inhibitor (MZM) protonation with HCl at 25�C. About 1.5 equivalents of NaOH wereadded to the neutral inhibitor solution. Concentrations and volumes used for ITC experiments were identical to pH titration experiments shown inPanel C. First portion of the titration curve represents the reaction between H+ and excess OH�. The second portion of the titration curve having thestoichiometry of 1.0 represents the inhibitor protonation. Solid line is the baseline. Panel B – integrated ITC curves of TFS (open diamond) at 13 �C andMZM (filled diamond) at 37 �C titration with HCl. The enthalpy of the first portion of the titration (stoichiometry �0.5, DH � �54 kJ/mol) is a valueclose to the expected value for the reaction of H+ + OH�¼H2O. The enthalpy of the second portion of the titration curve (stoichiometry �1.0)represents the enthalpy of sulfonamide protonation. Panel C – the pH titration curves for MZM (filled diamond) and TFS (open diamond), determinedpotentiometrically at 24 �C. Concentrations and volumes were identical to ITC experiments (panels A and B). Two transitions are seen: 0.5 equivalentof H+ reaction with OH�, and one equivalent of sulfonamide protonation. The pKa is approximately equal to the pH at the midpoint of the second stageof the titration. Datapoints are experimental pH values and the line is fit according to another study24. Panel D – the temperature dependence ofinhibitor sulfonamide group protonation (reaction R3 in reverse) enthalpy as determined by ITC. Datapoints are experimentally determined integralenthalpies for, TFS (open square), AZM (filled circle), MZM (inverted open triangle), and DCP (filled diamond). Lines are linear fits of theexperimental data. Slopes of the lines are positive and equal to the heat capacities of about 190–290 J�mol�1 K�1.

Table 2. Thermodynamic parameters of inhibitor sulfonamide groups andalso CA I and CA II Zn-bound hydroxide anion protonation at 25�C.

Inhibitor/protein pKa DGprot, kJ/mol DHprot, kJ/mol TDS, kJ/mol

EZA* 8.0 �45.7 �29.5 16.2TFSy 6.25 �35.7 �22.4 13.3AZMy 7.3 �41.7 �23.0 18.7MZMy 7.1 �40.5 �25.1 15.4DCPy 8.2 �46.8 �29.3 17.5CA I-Zn-H2O 8.4 �46.3 �41.0 5.3CA II-Zn-H2O 7.1 �40.5 �26.0 14.5CA VII-Zn-H2Oz 7.0 �40.0 �33.0 7.0CA XII-Zn-H2O� 7.0 �40.0 �28.0 12.0CA XIII-Zn-H2O* 8.3 �47.1 �26.0 21.1

*Data taken from Reference12.yData taken from Reference25.zData taken from Reference30.�Data taken from Reference13.


Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y D

anm

arks

Nat

ur-o

g on

04/

28/1

4Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

correlate the thermodynamic parameters with the structure of theprotein–ligand complex. Sulfonamide inhibitors bound stronger toCA II isozyme than to CA I. An especially large difference ofabout two orders of magnitude was observed for AZM. Thesmallest difference among the two isozymes was observed forTFS binding. The major difference in affinities of the inhibitorslay within the differences of sulfonamide group pKas. For allligands, the binding was enthalpy driven.

Declaration of interest

The authors report no conflict of interest. This research was funded by theEuropean Social Fund under the Global Grant measure (no. VP1-3.1.-SMM-07-K-02-009). Authors thank FP7-REGPOT-2009-1 grant‘MoBiLi’ agreement No.: 245721 and the COST projects TD0905 andCM0804.

References

1. Khalifah RG. The carbon dioxide hydration activity of carbonicanhydrase. i. stop-flow kinetic studies on the native humanisoenzymes b and c. J Biol Chem 1976;246:2561–73.

2. Xu Y, Feng L, Jeffrey PD, et al. Structure and metal exchange in thecadmium carbonic anhydrase of marine diatoms. Nature 2008;452:56–61.

3. Supuran CT. Carbonic anhydrase inhibitors. Bioorg Med Chem Lett2010;20:3467–74.

4. Krishnamurthy VM, Kaufman GK, Urbach AR, et al. Carbonicanhydrase as a model for biophysical and physical-organic studies ofproteins and protein-ligand binding. Chem Rev 2008;108:946–1051.

5. Sly WS, Hu PY. Human carbonic anhydrases and carbonicanhydrase deficiencies. Annu Rev Biochem 1995;64:375–401.

6. Supuran CT. Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications forinhibitors and activators. Nat Rev Drug Discov 2008;7:168–81.

7. Hassan I, Shajee B, Waheed A, et al. Structure, function andapplications of carbonic anhydrase isozymes. Bioorg Med Chem2013;21:1570–82.

8. Alterio V, Di Fiore A, D’Ambrosio K, et al. Multiple binding modesof inhibitors to carbonic anhydrases: how to design specific drugstargeting 15 different isoforms? Chem Rev 2012;112:4421–68.

9. Ladbury JE, Klebe G, Freire E. Adding calorimetric data to decisionmaking in lead discovery: a hot tip. Nat Rev Drug Discov 2010;9:23–7.

10. King RW, Burgen AS. Kinetic aspects of structure-activity relations:the binding of sulphonamides by carbonic anhydrase. Proc R SocLond B Biol Sci 1976;193:107–25.

11. Kumar K, King RW, Carey PR. Carbonic anhydrase-aromaticsulfonamide complexes, a resonance raman study. FEBS Lett 1974;48:283–87.

12. Baranauskiene L, Matulis D. Intrinsic thermodynamics of ethoxzo-lamide inhibitor binding to human carbonic anhydrase XIII. BMCBiophys 2012;5:12.

13. Jogaite V, Zubriene A, Michailoviene V, et al. Characterization ofhuman carbonic anhydrase XII stability and inhibitor binding.Bioorg Med Chem 2013;21:1431–6.

14. Pantoliano MW, Petrella EC, Kwasnoski JD, et al. High-densityminiaturized thermal shift assays as a general strategy for drugdiscovery. J Biomol Screen 2001;6:429–40.

15. Todd MJ, Salemme FR. Direct binding assays for pharma screening.Genetic Eng News 2003;23:28–9.

16. Kranz JK, Schalk-Hihi C. Protein thermal shifts to identify lowmolecular weight fragments. Methods Enzymol 2011;493:277–98.

17. Cimmperman P, Matulis D. Protein thermal denaturation measure-ments via a fluorescent dye. Cambridge, UK: RSC Publishing; 2011,Ch. 8, pp. 247–74.

18. Niesen FH, Berglund H, Vedadi M. The use of differential scanningfluorimetry to detect ligand interactions that promote proteinstability. Nat Protoc 2007;2:2212–21.

19. Zubriene A, Matuliene J, Baranauskiene L, et al. Measurement ofnanomolar dissociation constants by titration calorimetry andthermal shift assay – radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamidebinding to CA II. Int J Mol Sci 2009;10:2662–80.

20. Matulis D, Kranz JK, Salemme FR, Todd MJ. Thermodynamicstability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinityand stoichiometry using thermofluor. Biochemistry 2005;44:5258–66.

21. Mezzasalma TM, Kranz JK, Chan W, et al. Enhancing recombinantprotein quality and yield by protein stability profiling. J BiomolScreen 2007;12:418–28.

22. Zubriene A, Kazlauskas E, Baranauskiene L, et al. Isothermaltitration calorimetry and thermal shift assay in drug design. EurPharmaceut Rev 2011;16:56–9.

23. Khalifah RG, Zhang F, Parr JS, Rowe E. Thermodynamics ofbinding of the CO2-competitive inhibitor imidazole and relatedcompounds to human carbonic anhydrase I: an isothermal titrationcalorimetry approach to studying weak binding by displacementwith strong inhibitors. Biochemistry 1993;32:3058–66.

24. Butler JN, Cogley DR. Ionic equilibrium. Solubility and pHcalculations. New-York: John Wiley and Sons Inc.; 1998.

25. Matulis D, Todd MJ. Thermodynamics-structure correlations ofsulfonamide inhibitor binding to carbonic anhydrase. Chichester,England: John Wiley & Sons; 2004, Ch. 6, pp. 107–32.

26. Ladbury JE. Calorimetry as a tool for understanding biomolecularinteractions and an aid to drug design. Biochem Soc Trans 2010;38:888–93.

27. Baranauskiene L, Hilvo M, Matuliene J, et al. Inhibition and bindingstudies of carbonic anhydrase isozymes I, II, and IX withbenzimidazo[1,2-c][1,2,3]thiadiazole-7-sulphonamides. J EnzymeInhib Med Chem 2010;25:863–70.

28. Cimmperman P, Baranauskiene L, Jachimoviciute S, et al. Aquantitative model of thermal stabilization and destabilization ofproteins by ligands. Biophys J 2008;95:3222–31.

29. Kazlauskas E, Petrikaite V, Michailoviene V, et al. Thermodynamicsof aryl-dihydroxyphenyl-thiadiazole binding to human Hsp90. PLoSOne 2012;7:e36899.

30. Pilipuityte V, Matulis D. Intrinsic thermodynamics of trifluoro-methanesulfonamide and ethoxzolamide binding to human carbonicanhydrase VII. Submitted.

Table 3. Intrinsic thermodynamic parameters of deprotonated inhibitorbinding to CA I and CA II containing the protonated Zn-bound watermolecule at 25� C.

InhibitorDbHintr,kJ/mol Kb_intr, M�1

DbGintr,kJ/mol

TDbSintr,kJ/mol

CA IEZA �50.0 1.0� 109 �51.4 1.4TFS �47.0 5.0� 107 �43.9 �3.1TFS* �49.0 4.0� 107 �43.4 �5.6AZM* �48.1 4.2� 106 �37.8 �10.3MZM* �56.9 3.3� 107 �42.9 �14.0DCP* �54.8 3.5�107 �43.1 �11.7

CA IIEZA �73.0 1.8� 1010 �58.5 �14.5TFS �36.7 1.0� 108 �45.7 9.0TFS* �36.8 2.0�108 �47.4 10.6AZM �56.0 3.5� 108 �48.8 �7.2AZM* �59.8 4.8�108 �49.5 �10.3MZM �47.8 1.3� 108 �46.4 �1.4MZM* �53.6 2.2�108 �47.6 �6.0DCP* �38.5 3.8�109 �54.7 16.2

*Thermodynamic parameters of inhibitor binding to CA purchased fromSigma.


Jour

nal o

f E

nzym

e In

hibi

tion

and

Med

icin

al C

hem

istr

y D

ownl

oade

d fr

om in

form

ahea

lthca

re.c

om b

y D

anm

arks

Nat

ur-o

g on

04/

28/1

4Fo

r pe

rson

al u

se o

nly.

Documents

Citozolinių karboanhidrazių slopiklių struktūros ir ......1.1.1. Biotermodinamika Pagrindinis parametras apibūdinantis molekulių sąveiką yra laisvoji Gibso energija ( G). Tiek