Clase 3 Analisis Seminal

8/18/2019 Clase 3 Analisis Seminal

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NIVERSIDAD

NACIONAL AGRARIA

DE LA SELVA

Facultad de

Zootecnia

Area de Reproducción yMejora Genética

valuación de la

Calidad Seminal

Ing. M.SC. Jorge Daniel Juárez


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IMPORTANCIA

Semen post colecta y antes de usarlo en la IA, debe

medirse cantidad y calidad sin afectar la viabilidad delos SPZ (Cueto et. al., 1993)

!a evaluaci"n debe ser reali#ada tan pronto como seaposible post colecta ($vans y %a&'ell, 19)

$valuaci"n elemento fundamental para detectarinfertilidad o subfertilidad de mac*os, producida pordiversos factores como+ deficiencias alimenticias,condiciones sanitarias, de maneo y ambientales

Aplicaci"n en IA+- .ran impacto del mac*o en la eficacia reproductiva

de la e&plotaci"n


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Podemos valorar la calidad de dosis tras ser

sometidas a diversos procedimientosSe puede valorar in vivo o in vitro

%/todos para valorar la calidad seminal, para IA o

investi0aci"n, en constante desarrollo para estimar conmayor precisi"n fertilidad de mac*os reproductores

aloraciones de laboratorio no predicen con e&actitudla fertilidad, debido en 0ran parte a la subetividad de

muc*as de dic*as valoraciones

%/todo ideal para anali#ar capacidad fecundante demac*o+ estudio del semen y la capacidad de producir0estaciones

IMPORTANCIA


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2epende de factores+ Intrnsecos+ propios de cada animal

4a#a

$dad

5actores 0en/ticos+ consan0uinidad,

anomalas cromos"micas

Patolo0as

$&trnsecos+ maneo

Calidad seminal


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Calidad seminIntrínsecos: RAZA


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Calidad seminIntrínsecos: EDAD


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Calidad seminIntrínsecos: CONSANGUINIDA

4eproducci"n en cautividad+ cuando poblaciones naturales enries0o de e&tin0uirse Consan0uinidad 1ras 0eneracionesinevitable, /&ito del pro0rama de cra+ evitar efectos delet/reossobre supervivencia y reproducci"n de individuos

Animales en cautividad y dom/sticos, efecto m6sfrecuentemente de consan0uinidad detectado+ aumento enmortandad uvenil (4alls et al., 1997 4alls y 8allou, 197%itton, 1993)

%ac*os Gazella cuvieri con : nivele de consan0uinidad tienenpeor calidad seminal ;ue de otras especies (Cassinello et al.,199)+ 2isminuci"n en proporci"n de sp# m"tiles, y de sp#morfol"0icamente normales, y de sp# con acrosoma intacto,importantes en la capacidad fecundante de sp# (4oldan et al ,199), : da


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A nivel testicular, barrera *emato>testicular mecanismopara evitar defensa y posibles tratamientos, reservoriopara virus y otros a0entes infecciosos

?erpes virus bovino (8?>1) causa 4inotra;ueitis bovinainfecciosa (I84) en semen de toros sub clnicamenteinfectados y serone0ativos

Calidad semin

2iarrea viral bovina (82 ) @ransmitido en semen (altaconcentraci"n), no alteraci"n en morfolo0a Sobrevive acriopreservaci"n, infecci"n en *embras, en novillas+ fallasen concepci"n y permite mayor difusi"n del virus

Intrínsecos: INFECCIOSASVirales:


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Calidad seminIntrínsecos: INFECCIOSAS

Mycobacterium avium subespecie paratuberculosiseliminado por semen y aislado de "r0anosreproductivos de toros infectados7 no est6 determinado

si semen puede o no transmitir la enfermedad vauterina

!eptospirosis importante causa de infertilidad enbovinos+ ! interrogans, borgpeterseneii y kirschneri

tros a0entes infecciosos+ PI3 (Parainfluen#a 3),Trichomona f , Campylobacter f , Brucella, entre otros,los cuales afectan de una u otra forma la calidadseminal,

Infecciosos no virales


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Calidad semin

Conteo total de unidades formadoras de colonias(B5C) por m! en semen fresco y con0elado

Intrínsecos: INFECCIOSASInfecciosos no virales


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Dependen del ambiente de la

explotación y del manejo del macho.

Factores: Ambiente 5recuencia de e&tracciones $str/s Aloamiento (confort) =ivel sanitario Alimentaci"n tros factores

FactoresExtrínsecos

Calidad semin


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Calidad seminFactoresExtrínsecos

Ambiente


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Calidad semin

Ambiente


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Calidad semin

Ambiente

lid d i


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Frecuencia de

extracciones

Calidad semin

Infuencia de la

recuencia derecolección en eln!"ero de dosisproducidas poreyaculado#

C lid d i


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Frecuencia de

extracciones

Calidad semin

!os promedios indican;ue al aumentar el =de recolecciones, el

volumen de eyaculadodisminuye DEF en lasfrecuencias de dos ytres veces por semana,

con reduccionesmayores si es e&tradotodos los das (PGE,E1)

C lid d i


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Estrés

Calidad semin

Principal mecanismo del estr/s da lu0ar a inadecuadacalidad seminal+ *ormona C4? Hfactor liberador de la*ormona corticotropa (AC@?)H+ desencadenacascada del estr/s con acciones de tipo in*ibitorio a

nivel testicular como central con in*ibici"n de la !?

C4? secretado a nivel *ipotal6mico, en estres

tambi/n por !eydi0 a nivel testicular (iniciado porSerotoninas), actuando en receptores en membranade las !eydi0 como potente re0ulador ne0ativo para!? As impide la producci"n de andr"0enos

C lid d i


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Alojamiento

Calidad semin

erracos no deben estar untos, por a0resiones fsicas

Area de mD mnimo, altura 1 m

Preferible en cuadras, prolon0a vida del mac*o y

disminuye problemas de aplomos

Preferible contacto visual y nasal entre verracos,meora lbido

Suelo enrreillado, cama de paa de buena calidad,efecto positivo en calidad seminal, aumenta motilidad ydisminuye formas anormales (Corcuera et. al., DEE1)

C lid d i


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Alojamiento

Calidad semin

Condiciones ambientales: @ optima+ 1 H DDC, conveniente ;ue nunca pase los

D9C da estr/s t/rmico, afecta libido y producci"nseminal

? recomendada+ J H JF con una velocidad del airede E,D H E, mKs

Fotoperiodo: $&posici"n de verracos a periodos de 1D *oras con

intensidad de 3EE lu&es

Preferible lu# fluorescente

C lid d i


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FactoresExtrínsecos Alimentación

Calidad semin

Animales con dietas balanceadas+ m6s precoces ;uesubalimentados

%ac*os subalimentados retraso en pubertad+ aldisminuir producci"n de I.5>1 y, retarda p&n de !? y

@ 2ietas balanceadas con pastos ricos en ener0a, y

adecuado F protena, ben/ficas en inicio depubertad+ desarrollo testicular m6s r6pido, meor

entre 1E y 1J m 2esnutrici"n atrasa inicio de pubertad, y dietas no

balanceadas por e&ceso (sobrecondicionamientos),llevan a alteraciones irreversibles, a nivel fsico como

de calidad esperm6tica

C lid d i


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Alimentación

Calidad semin

$fectos indirectos de sobrealimentaci"n comoobesidad y problemas de pe#u


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Nivel sanitario

Calidad semin

Personal ;ue trabaa con mac*os debe ser distinto alresto del laboratorio Si no es posible, debe tener deropa especfica, distinto material y previa duc*a

$nfermedades, trastornos o vacunaciones, ;ue danlu0ar a fiebres, efecto ne0ativo similar a los producidospor estr/s t/rmico+

2r6stico aumento del F de c/lulas anormales

Por eso no suele vacunarse a los mac*os el mismoda, eso si se piensa ;ue puede causar problemas defiebres


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Caractersticas ;ue debe reunir una buenaprueba laboratorial+

betividad4epetibilidad

Precisi"n

CS@$ AC$P@A8!$

Contrastación seminal


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%acrosc"pica+ Color+ opaco a lec*oso olumen+ por especie lor+ tpico & sp p?+ neutro

%icrosc"pica+

Concentraci"n %otilidad %orfoanomalas aloraci"n de los acrosomas

Valoración de la calidad seminal:

espermiograma clásico


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=Lmero de espermato#oidesKm!

$s importante por;ue permite rentabili#ar elnLmero de dosis obtenidasKeyaculado

Instrumentos de medida+c6maras de recuento celular,espectrofot"metros o colormetros,contadores celulares electr"nicos opro0ramas computori#ados de an6lisis

seminal (CASA)

Contrastaciónmicroscópica:

Concentraciónespermática


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Correlaci"n con la fertilidad poco clara

%edida+ subetiva,

sistemas computari#ados (CASA)

tros+ mi0raci"n en moco cervical

ontrastación microscópica:

!otilidad Espermática"

%otilidad subetiva+

%asal

Individual

t t ió i ó i


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Motilidad masal: se"en no diluido# $alora el

n!"ero% la densidad y la &elocidad de "o&i"ientode las ondas o re"olinos 'ue se or"an en lasuper(cie de la )ota de se"en# Poco usada#



t t ió i ó i


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%otilidad individual+ semen diluido alora la cantidady la calidad del movimiento @$%P$4A@B4AM



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Prue*a en porcino:

+yaculados aptos:,-./ "otilidadtotal% ,0./"ó&iles

pro)resi&os#

, -1/ para

e&itar pro*le"asde ertilidad yproli(cidad


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$stimaci"n del porcentae de motilidadde forma objetiva"

Informa acerca del F de sp# m"tiles dela muestra y de la calidad del movimiento

Sistemas de an6lisis de ima0en, dan

resultados acerca de las caractersticasdel movimiento

istemas CAA !Computer Assisted permAnalysis":

i CAA !C A i d


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i t CAA !C t A i t d


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istemas CAA !Computer Assisted permAnalysis":elocidades

• VCL: curvilineal pat* velocity elocidad mediadel espermato#oide medida sobre la trayectoriaverdadera punto por punto (NmKsec)

• VSL: Strai0*t line velocity 2istancia en lnearecta entre el inicio y el final de la trayectoria delespermato#oide (NmKsec)

• VAP: avera0e pat* velocity elocidad sobreuna trayectoria calculada y recta (NmKsec)@rayectoria 0eneral del espermato#oide

i t CAA !C t A i t d


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istemas CAA !Computer Assisted perm


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ilid d


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Penetración de moco cervical. Bsado sobre todo en *umana

O5unciones del moco cervical

OQu/ problemas puede presentar este test

%edios sint/ticos con poliacrilamida o

%etilcelulosa Bsado en vacuno tambi/n

Motilidad

M # R F # $ # G % A


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4elacionado con la forma de los sp#, el an6lisis permitedetectar problemas en espermato0/nesis y en maduraci"nepididimaria

!a fertilidad se reduce cuando las anormalidadessuperan el 1 al DEF $n especies politocas, tambi/n

desciende la prolificidad Anomalas causan alteraciones para la interacci"n entre0ametos o producci"n de embriones inviables

Sp# normales+ 3 re0iones principales (cabe#a, pie#aintermedia y cola), dimensiones determinadas

%orfoanomalias+ Cabe#a, Cola y Acrosomas

M # R F # $ # G % A

M # R F # $ # G % A


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M # R F # $ # G % A

abe#a+ Asim/tricaPiriforme

Afinada

Corta%icro.i0ante

ola: Aba&ial@irabu#"n5iliforme

$nrollado2oblePro&imal@ranslocada2istal

2oblada

Acrosomas+Incompleto

Anudado Arru0ado

M # R F # $ # G % A


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M # R F # $ # G % A

M # R F # $ # G % A


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@inciones+ 0ran cantidad+ eosina>ni0rosina, roo de ben0ala, A#ul de victoria, Rells, Rilliams,

.iemsa, tinta c*ina, 5uc*ina 5enicada, violeta de metilo,

anilina, coloraci"n de arras,

M # R F # $ # G % A

Por lo comLn se cuentanentre DEE H 3EE sp# en varios

campos

M # R F # $ # G % A : & i p o s


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M # R F # $ # G % A : & i p o s%alformaciones en eyaculado se clasifican en funci"n dellu0ar de ori0en+ primarias, secundarias y terciarias

Anomalías primarias: desarrolladas en testculo, defectoen la espermato0/nesis o espermio0/nesis =o debene&ceder del JF, determinantes de baa fertilidad

$specficas+ de ori0en 0en/tico, pueden afectar acual;uier estructura del sp#

=o especficas+ se dan alteraciones de+

la cabe#a+ macro o microc/falos, cabe#asalar0adas, piriformesT la pie#a intermedia+ pie#a intermedia doble,

en0rosadaT la cola+ cola corta, colas doblesT

normalidades 'rimarias:


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normalidades 'rimarias:DeCa*e2a:

normalidades 'rimarias:


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normalidades 'rimarias:De 3a Pie2aInter"edia:

De 3aCola:

M # R F # $ # G % A : & i p o s


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Anomalías secundarias: producidas durante maduraci"nde sp# en el epiddimo

$&tremo distal enrollado

Cola enrollada completamente o parcialmente

Cabe#a sin cola

Cola en l6ti0o (alteraci"n en la eliminaci"n de la 0otacitoplasm6tica o por secreci"n alterada de las 0l6ndulasaccesorias)

$stos defectos no est6n considerados como serios yno afectan la fertilidad a menos ;ue sea mayor del 1JF(%BUZ y PABCA4, DEEJ)

M # R F # $ # G % A : & i p o s

normalidades ecundarias:


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normalidades ecundarias:

M # R F # $ # G % A : & i p o s


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Anomalías terciarias: por mal maneo del semen enel laboratorio Pueden ser+

%ec6nicas

5sico>;umicas

Pueden confundir con alteraciones secundarias

2entro de ellas+

Colas en l6ti0o+ alteraciones de osmolaridad,cambios bruscos de temperatura

Cabe#as sin cola+ mala reali#aci"n dee&tensiones

M # R F # $ # G % A : & i p o s

M # R F # $ # G % A


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=iveles tolerables de morfoanomalas (8art* y Vo, 199)

Anomalas nucleares+ G 1J>DEF fallos de fecundaci"n odesarrollo embrionario Anomalas de acrosoma o fla0elo ;ue no interfieren conla capacidad de sp#s normales fecunden ovocitos+ W DJF Sp# normales+ X JF

Sp# con 0ota citoplasm6tica pro&imal+ G 3EF

Pron"stico de recuperaci"n de ori0en 0en/tico, presentes

de forma permanente

4p2 in"aduro "5s r5)il 'ue "aduro% se o*ser&aracturas ce5licas 6trans&ersales o lon)itudinales7 y decola#

Ori)en de "oroano"al8as: so*re todo las secundarias yalta de "aduración de 4p2% por reducción del fu9o de Ta ni&el testicular% se da por estr;s o rit"os de extraccióninadecuados% por exceso o por deecto# Ta"*i;n puedentener ori)en anató"ico : presencia de &aricocele#

M # R F # $ # G % A

An6lisis morfol"0icos


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- %orfometra

$stima variaciones en la forma de los sp# (cabe#a),podra indicar defectos en la condensaci"n de lacromatina

Caballos y verracos subf/rtiles+ cabe#a de mayoresdimensiones

Cambios en dimensiones de la cabe#a trascon0elaci"n

%edidas de la cabe#a de sp# de toros o moruecosf/rtiles es poco variable

$stablecer las condiciones "ptimas para el an6lisis

An6lisis morfol"0icos

A(lutinación


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Consiste en la uni"n de varios sp# formando acLmulos

Se valora observando diversos campos en mo conobetivo 1E& y E&, considerando el porcentae de campo;ue ocupa7 normal entre E y 1EF, con valor lmite del DJF

(

$&isten varios tipos de a0lutinaci"n se0Ln el ori0en y el

estado de los espermato#oides+

$" Aglutinación verdadera: !os sp# est6n vivos

a" Aglutinación bio%u&mica: Producida por

alteraciones en la composici"n de protenas yminerales del plasma seminal (relacionado coninflamaciones yKo infecciones de 0l6ndulas aneas) op/rdida de al0unas protenas ;ue recubren la

superficie del sp#

A(lutinación


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As se consideran varios 0rados+

' .4A2 $+ Bn 0rupo de menos de DE sp#' .4A2 (+ 2os 0rupos de menos de DE sp#' .4A2 )+ arios 0rupos de m6s de DE sp#

D Aglutinación falsa: !os sp# est6n muertos !a m6sfrecuente denomin6ndose as a la simple acumulaci"n desp# muertos $sta puede aparecer relacionada con

cual;uier alteraci"n ;ue afecte a la dosis esperm6tica,como puede ser la presencia de t"&icos o contaminantes

b Aglutinación inmunomediada: 2ebida a un fen"meno deautoinmunidad en el ;ue el propio verraco elaborara anticuerpos

contra sus espermato#oides, atrap6ndolos y a0lutin6ndolos

(

A(lutinación


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(

.4A2 )+arios 0ruposde m6s de DE

sp#

Grado de a(lutinación:

Puede ser valorado cualitativamente (YKYYKYYY), "

cuantitativamente (1KDK3) @odos los verracos presentanal0Ln tipo de a0lutinaci"n

.4A2 $+Bn 0rupo demenos de DE

sp#

.4A2 (+2os 0ruposde menos de

DE sp#

A(lutinación


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(

Acrosomas


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Se evalLan+ % de contraste de fases, m con contraste

interferencial, me 6lida para especies con acrosoma 0rande

@inciones+

campo claro (.iemsa, eosina 8>5ast 0reen 5C57naftol amarillo y eritrosina 8) Problemas en sp#con0elados

o fluorescencia (5I@C>PSA, 5I@C>P=A, P$>P=A,

!ysotracVer, anticuerpos marcadosT) !as tincionesfluorescentes se pueden evaluar tambi/n mediantecitometra de fluo)

Acrosomas

Acrosomas


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Acrosomasbservaremos cuantos sp# poseen su acrosoma intactoy cuantos lo tienen da


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Acrosomas


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Sp# te


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&riple&inción

Inte0ridad de las mbs plasm6tica y acrosomal e&terna

5lourocromo 8P Bso

*+,-.$/ JDJ %bP nte0ra (vivos), se li0a al A2=

I0 DE P/rdida de inte0ridad %bP (muertos), se li0a al A2=

0E.0NA JJ Con p/rdida de inte0ridad de %bA e&terna

A <

CD

A: 0oblación con

pérdida de integridad

de la !b0"

,: 0oblación con

pérdida de integridad

de la !b0 1 !bA

da2ada"

: 0oblación con !b0

integra 1 !bA da2ada"

3: 0oblación con !b0

integra"

IP YS84 >P$>P=A >

IP YS84 >P$>P=A Y

IP >S84 YP$>P=A >

IP >S84 YP$>P=A Y

Prue*as uncionales


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- $valuaci"n de la inte0ridad de la %bP @inciones vitales+ inte0ridad estructural ?S@ (test de end"smosis)+ funcionalidad de

la %bP

- @est de resistencia osm"tica (4@)

- @est de resistencia t/rmica

- $valuaci"n del funcionamiento de lasmitocondrias

- $studio de los procesos de capacitaci"n yreacci"n acros"mica

- Inte0ridad y estructura de la cromatina

Prue*as uncionales


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Tinciones de ca"po claro:

- +osina=ni)rosina- +osina


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Integridad de la membrana plasmática

Funcionalidad espermática.


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+sta*ilidad de la "e"*rana plas"5tica o desordenlip8dico#

5lourocromo 8P Permeabilidad

M54 DE Identifica el desorden lipdico en la %P +0$ JDJ Identifica la p/rdida de inte0ridad %P

AA

CC


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$valLa la inte0ridad y funcionalidad de %P del sp#(del fla0elo), asociada a capacidad de penetraci"n al

"vulo

Permite medir la *abilidad de la %P para transportarfluidos selectivamente (%BUZ y PABCA4, DEEJ)

- @est de end"smosis celular (?S@)- @est de resistencia osm"tica (4@)

g p

Por comportamiento de sp# frente a variacionesosm"ticas, se determina el estado de la %bP, mediantedos t/cnicas+

Test de endósmosis celular (!ST".

Integridad de la membrana plasmáticaPrue*as uncionales


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g p


Capacidad de enroscamiento de cola, indica+ transportea trav/s de %P es normal, indicador de inte0ridad yfuncionalidad de la %P (CA%AC?, DEEE) aloresnormales DF de sp# *inc*ados, inferiories a EF sonpatol"0icos (%BUZ y PABCA4, DEEE)



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g p


@ras diluci"n del semen en medio *ipoosm"tico, seincuba & 3E[ a @\ ambiente, lue0o se fia la muestra yse contabili#a el F de sp# con end"smosis positiva

A : F de /stos, : calidad de la muestra



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g p



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Test de resistencia osmótica (!#T"

Permite anali#ar, con alta fiabilidad, potencialreproductivo de mac*os

Se basa en inte0ridad de la %b del acrosoma sometidaa c*o;ue osm"tico

Se diluye E,D ml de semen en 3 ml de diluyente a 3EEmsmK0, incubado en ba


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$l resultado de dic*a f"rmula clasifica las dosis seminales encinco cate0oras en funci"n de su calidad+

%uy buenos+ 4@ :EF 8uenos+ 4@ y EF 4e0ulares+ 4@ J y 3F Pobres+ 4@ y J3F %uy pobres+ 4@ GF

Test de resistencia osmótica (!#T"

Integridad de la membrana plasmática

O.R.T. = ( % A + % B ) / 2

Prue*as uncionales


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8asada en evoluci"n de la motilidad cuandose somete a los espermato#oides a incubaci"n(3> 39C)

In vivo, los espermato#oides tendr6n ;ueresistir durante un tiempo en el tracto

reproductor femenino antes de fecundar

%uestras ;ue presenten escasa resistencia,pueden tener problemas de fertilidad in vivo

Se evalLa, por lo 0eneral, a los 3E[ y 1JE[post calentados

&est de resistencia térmica:

Prue*as uncionales


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%itocondrias son las encar0adas de producir $\necesaria para las funciones del sp# (motilidad)

Se usan tinciones fluorescentes (las mitocondriasfuncionales son capaces de producir un compuesto ;ue

forma a0re0ados de color distinto a las no funcionales)

2entro de ellas,- 4odamina 1D3+ verde en mitocondrias con alto

potencial de membrana interna (mitocondriasfuncionales)

- ]C>1+ color verde en mitocondrias sin respiraci"no&idativa, narana en mitocondrias funcionales

Funcionamiento de lasmitocondrias

Prue*as uncionales


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'rocesos de capacitación y reacciónacrosómica Capacitaci"n+ conunto de cambios ;ue sufre el sp# en eltracto reproductor femenino, necesario para ;ue sea capa#de fecundar

A mayor F de espermato#oides capacitados, menor

lon0evidad de los espermato#oides in vivo

Se puede tambi/n estudiar el comportamiento de los sp#cuando se les somete a tratamientos capacitantes (siresponden bien o no)

!os espermato#oides de animales f/rtiles, presentanmayor respuesta al ser tratados con sustanciascapacitantes

Prue*as uncionales


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$studio de estadio de capacitaci"n+ iones de Ca- @inci"n con clortetraciclina (C@C)- 5luo>3+ evaluaci"n de niveles de Ca intracelulares

$studio de estadio de capacitaci"n+ or0ani#aci"n

lipdica- %erocianina JE+ detecta cambios en fluide# de mb- 5I@C>Ane&ina + detecta alteraci"n en la asimetra

de la mb (e&posici"n de fosfatidilserina>PS)- 4o>E9>E19 marcado+ detecta alteraci"n en la

asimetra de la membrana (e&posici"n defosfatidiletanolamina>P$)

'rocesos de capacitación y reacciónacrosómica

rado de apoptosis5ti


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esper"5tica#5lourocromo 8P Permeabilidad !" # $I%C!F$."

JDJ Indica inicio de apoptosis, identificando c/lulas cone&teriori#aci"n de PS, li06ndose a esta

I& !F$/" DE C/lulas con p/rdida de inte0ridad %P (muertos), se li0a al A2=AV binding buffer %edio con calcio, permite la uni"n del A con la PS

&u)o .

&u)o 0

&u)o /

I' 1

A23

I' 1

A21

I' 3A23

I' 3A21

&u)o .:Muestra

&u)o 0:Muestra 1 I'

&u)o /:Muestra 1 I'1 A2

Viables 4I0 .5 1 sinapoptosis 4AV .5" Viables 4I0 .5 1 conapoptosis 4AV 65"

4o +ia)les !I' 1" ycon apoptosis !A2 1"*

No viables 4I0 65 1

sin apoptosis 4AV .5


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Prue*as uncionales


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Integridad y estructura de la cromatina

*3: *perm 7romatin 3ispersion 8est

#tros análisis


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2etecci"n de pero&idaci"n lipdica+

4adicales de o&0eno libres da

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Clase 3 Analisis Seminal