Clase de Deteccion de Deleciones Mariana

8/17/2019 Clase de Deteccion de Deleciones Mariana

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TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICOMOLECULAR

Dra. Mariana L. FerramolaCurso de Técnicas molecularesaplicadas a bioquímica clínica.

Área de Qca. BiológicaFQByF !"#L

$%&'


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(T-C(

Muestra de partida:ARN.

Pasos de reacción:!"ranscripción

re#ersa paraobtención de ADNc.

$!Ampli%cación de lasecuencia deseadamediante P&R.


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(T-C(/ De0ección de 1irus de+n2uen3a *.

Pachucki y col., JOURNAL OF CLINICAL MICROIOLOG!, Ju"# $%%&, '. $()*+$().Muestra: 'isopado nasal y (ar)ngeo.Transcripción Reversa: RNA total, usando -a"o/

'-i/#- h#0a/#-1.

+den0i4cación del1irus de +n2uen3a *

median0eampli4cación por-C( del gen dema0ri3 de dic5o1irus 6$&$bp7.


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(FL--C(

)s0a 0écnica apro1ec5a la aparición oeliminación de un si0io de cor0e para en3ima

de res0ricción debido a una mu0ación

pun0ual.

*a t+cnica consta de dos pasos sucesi#os:!Ampli%cación de la secuencia de inter+s

mediante P&R.

$!Restricción de la secuencia ampli%cada conuna enima espec)%ca.


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(FL--C(


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(FL--C(/ De0ección de aleloDuar0e 6mu0ación "

'&8

D7.

*a #ariante Duarte, es un alelo polimor%co delgen -A*", ue da como resultado ue la enimapresente acti#idad disminu)da.*a #ariante se debe a la mutación N314D, en la

cual /ay una sustitución 0c.123 A4-!, uegenera un cambio del aminoácido asparagina0Asn, N! por un ácido aspártico 0Asp, D!.Este polimor%smo genera un cambio de basesue determina un sitio de corte para la enimade restricción A#a55.


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(FL--C(/ De0ección de aleloDuar0e 6mu0ación "'&8D7.


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(FL--C(/ De0ección de alelo

Duar0e 6mu0ación "'&8D7.

*n9lisis de la mu0ación "'&8D en el e:ón &% del gen;*LT 5umano. Línea 8/ 5omocigo0a para el alelomu0ado< líneas & $ = y >/ 5e0erocigo0as y líneas ' y? al &%/ 5omocigo0as para el alelo normal


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(FL--C(/ De0ección de 1irusde +n2uen3a * resis0en0es a

*man0adina.Pachucki y col., JOURNAL OF CLINICAL MICROIOLOG!, Ju"# $%%&,

'. $()*+$().

Primeramente se

realia unaampli%cación del gende la prote)na M$.*uego se detectan

mutaciones puntualesue dan resistencia aamantadina, medianteel uso de enimas derestricción.


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;*--C(.

Puede usarse un único par de primers ue6anueen la ona deleccionada, de modo tal ueesta sea ampli%cada en la reacción de P&R.Para delecciones peue7as 0menores de 8b! el

par de primers utiliados generará dos productosde ampli%cación, el (ragmento de menor tama7ose producirá a partir del alelo ue presenta ladelección.&uando la delección es mayor, la distancia entrelos primers en el alelo normal es demasiadogrande como para ser ampli%cada, y sólo seobtendrá producto a partir del alelo ue presentala delección 0alelo mutado!. En estos casos, el

alelo normal es detectado usando un tercer

#e u0ili3a para de0ec0ar delecciones en

el *D".


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;*--C(/ De0ección dedelecciones que causan @

0alasemia..


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Long range -C(.

Esta técnica ha sido utilizada para detectardelecciones e inserciones.

Pueden obtenerseamplicones de /asta938b.El protocolo de P&Res modi%cado por laintroducción de una

polimerasa conacti#idad correctorade pruebas 09;


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Long range -C(/ De0ección deinserciones


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M*-A 6ml0iple 5ibridi3aciónde sondas ampli4cables7 y

ML-* 6ml0iple ampli4caciónde sondas dependien0e de

ligación7Ambas son t+cnicas basadas en una ampli%cación

cuantitati#a por P&R.Presentan la #enta>a de permitir el análisis de /asta23 secuencia blanco simultáneamente.?on t+cnicas muy usadas para detección dedelecciones y duplicaciones del genoma.Debido a la rapide con ue estas t+cnicas permitenescanear /asta 23 blancos, es muy probable uesean ampliamente usadas tanto para in#estigacióncomo para diagnóstico. Por e>emplo para la

caracteriación@di(erenciación de tumores.


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M*-A/ #ín0esis de sondas&ada secuencia blanco es detectada por una

sonda espec)%ca. "odas las sondas están 6anueadas por lasmismas secuencias 0en sus e=tremos


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M*-A/ -ro0ocolo de ensayo..

no de losprimersusados paralaampli%cación

con P&R estámarcado conun6uorocromo.*os productosdeampli%caciónsonseparados

porelectro(oresis


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ML-*.

Principales dierencias con el M!P":

tilia dos sondas para reconocer cada secuenciablanco.

*a /ibridación de las sondas con el ADN blanco serealia en solución.

*uego de la /ibridación de las sondas, se lle#a a cabouna reacción de ligación.


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ML-*/ -ro0ocolo de ensayo..

*as sondas/ibridiande manerainmediatamente

adyacente,de estamanera soloauellospares de

sondas ueencuentransussecuenciasblanco

pueden ser


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ML-*/ -ro0ocolo de ensayo..

*as sondas uereconocieron susecuencia blanco ypudieron ser ligadas sonampli%cadas por P&R,

usando un único par deprimers.

"odos los ampliconesgenerados deben tenerdi(erente tama7o.*os productos obtenidosson separados porelectro(oresis capilar ydetectados debido a su

marcación 6uorescente0usualmente en uno de


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M*-AML-*/ (esul0ados..


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M*-AML-*/ (esmen..


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##C- 6-olimor4smos deconormación de cadena

nica7..*a t+cnica de ??&P detecta #ariaciones en lasecuencia del ADN 0mutaciones puntuales y otroscambios peue7os! debido a la generación dedi(erencias en la mo#ilidad electro(or+tica.

Ba>o condiciones no desnaturaliantes, lasmol+culas de ssADN asumen con(ormacionesúnicas ue dependen de su secuencia denucleótidos.

*os cambios con(ormacionales producidos por#ariaciones en la secuencia de ADN puedenresultar en di(erencia de mo#ilidad detectables.*a mayor)a de los e=perimentos de ??&P sondise7ados para e#aluar polimor%smos en un únicolocus, y comparar los resultados entre indi#iduos


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##C-

. n par de primersespec)%co es utiliado paraampli%car el AND blanco.

$. *a muestra se enriuece enssADN por medio de unaP&R asim+trica, debido a lapresencia de uno de losprimers en mayor cantidadue el otro.

9. *as mo#ilidades de los(ragmentos simple cadenase comparan medianteelectro(oresis en un gelneutro de poliacrilamida.

2. *as bandas son detectadas.


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##C-/ esquema de 0rabao.


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##C-/ eemplo.

El a"3li1i1 #l ADN 'o- SSCP /u#14-a ha'lo4i'o1/5l4i'l#1 , o 1#41 # al#lo1 u1ual/#"4# h#-#ao1

co/o u"a u"ia. La1 call#1 6 y & /o14-a-o"ha'lo4i'o1 i7"4ico1 # o1 i"i8iuo1 i9#-#"4#1.La1 i9#-#"cia1 # /i:-aci;" # 6 ?$@

call#1 6>& ?%@ call#1 &>B ?6@ call#1 B>* ?@ call#1 *>(


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Transerencia #ou05ern

#e utiliza paraanalizar

ra$%entos deDN! $enerados

por di$estión con

enzi%as derestricción.


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Principales

usos:

Detección de secuencias

relacionadas & e'. a%iliasde $enes(.

Detección de deleciones einserciones $randes

causantes deener%edades &e'.Distro)a %uscular deDuchenne(.

*denti)cación deindividuos %ediante +NTR

#e utilizan sondas de $ran ta%ao/ con$rados de actividad varia0le/

dependiendo del uso.


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