Clase Transcripción y procesamiento del RNA Dr. Alejandro Tapia

5/16/2018 Clase Transcripción y procesamiento del RNA Dr. Alejandro Tapia - slidepdf.com

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Curso biología Celular y molecular

1era Unidad: Flujo de Información

Transcripción y procesamiento

Alejandro Tapia P.

IDIMIFacultad de Medicina

Area centro

DNA ProteínasRNA

Dogma central de la Biología Molecular



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Regulación de laexpresión génica

1. Transcripción

2. Procesamiento del RNA

3. Transporte del mRNA

4. Traducción

5. Degradación del mRNA

6. Degradación de proteínas

Control de requerimientos de la célula



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• No todos los genes son útiles en el mismo lugar o al mismotiempo, lo cual implica que su expresión debe ser regulada(espacial y temporalmente)

• Los genes pueden ser tanto activados como reprimidos

• El control de la expresión procede mediante la interacción

de proteínas al DNA

• Un porcentaje de lo genes deben permanecer en constanteactividad transcripcional para mantener la integridad celular

Solución a problemas comunes

Introducción

• Transcripción es el primer paso en la expresióngénica

• Involucra dos conceptos fundamentales

– 1. La secuencia del DNA proveen la información• Indica qué áreas del DNA son genes y que deberían expresarse

– Sólo el 10% del DNA humano

• Indica donde debe comenzar y terminar la transcripción – Señaliza el principio y el término de un gen

– 2. Proteínas específicas reconocen estas secuencias yllevan a cabo el proceso

• Ocurre en el núcleo de las células eucariontes



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• Transcripción literalmente significa el acto o proceso dehacer una copia – Una hebra de un gen en el DNA (de doble hebra) se copia a una

molécula de RNA de una sola hebra.

– Un ácido nucleico (DNA) se copia en forma de otro ácido nucleico(RNA)

– Muy pocos cambios en el ‘lenguaje químico’

• La estructura del DNA no se altera como resultado de esteproceso – Permanece almacenando la información

– Un gen puede ser copiado muchas veces

Generalidades de la transcripción



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• Muchos de los aspectos básicos de la transcripcióngénica son similares entre bacterias y eucariontes

• La transcripción génica en eucariontes es más compleja – Organismos más grandes

– Complejidad celular (más genes)

• E. coli tiene 4.377 genes

• H. sapiens tiene cerca de 25.000 genes – Multicelularidad (diferentes tipos celulares con diferentesfunciones).

Transcripción en Eucariontes



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Un gen puede ser definido como una región discreta delDNA que es copiada (transcrita) a RNA Por lo tanto un gen también puede llamarse unidad transcripcional

La molécula de RNA fabricada a partir del gen se llama transcrito (transcript)

Durante la expresión génica, la secuencia del DNA en el geno cerca de él permite definir:

Cuanto debe expresarse este gen Cuando debe expresarse este gen

Donde (en qué tejidos o células) debe expresarse este gen

Estructura del gen

La transcripción es llevada a cabo por un gran complejoproteico llamado RNA polimerasa

La mayoría de las veces, la RNA polimerasa se une a unasecuencia específica en el DNA que está antes del genllamada promotor El promotor recluta la RNA polimerasa hacia el gen, señalizando la

proximidad a este.



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En genes estructurales, podemos identificar al menos treselementos presentes en la mayoría de los promotores

Sitio de inicio de la transcripción

Caja TATA

Elementos reguladores

Promotores de genes eucariontes

• El promotor más importante es relativamente corto:

– Consiste en una caja TATA• Importante en la determinación del punto preciso para el

inicio de la transcripción

• Este promotor por sí mismo produce un bajo nivel detranscripción – Esto se denomina transcripción basal



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• Elementos reguladores pueden afectar la unión de la RNApolimerasa al promotor

– Existen dos tipos:

• Enhancers (o potenciadores) – Estimulan la transcripción

• Silenciadores (o represores) – Inhiben la transcripción

– Tienen ubicación variable pero generalmente seencuentran en posiciones –50 a –100 (ej. cajas GC yCAAT)

La expresión génica puede ser controlada por secuenciasde DNA o proteínas

Elementos de acción cis Son secuencias de DNA que afectan sólo a genes cercanos

ejemplo: caja TATA, enhancers y silenciadores

Elementos de acción trans

Son proteínas que se unen a secuencias de DNA (factores detranscripción)

Control estructural de la expresióngénica en eucariontes



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RNA Polimerasa• La enzima responsable de la síntesis de RNA es la RNA

polimerasa DNA-dependiente

• En eucariontes existen tres tipos de RNA polimerasas,cada una de las cuales es una proteína con múltiplessubunidades y se encargan de transcribir diferentestipos de RNAs

El DNA nuclear se transcribe por tres RNApolimerasas distintas: RNA pol I

Transcribe todos los genes rRNA (excepto para el rRNA 5S)

RNA pol II Transcribe todos los genes estructurales

Por lo tanto, sintetiza todos los mRNAs

Transcribe algunos genes snRNA

RNA pol III Transcribe todos los genes de tRNA

y el gen del rRNA de 5S

RNA polimerasas de eucariontes



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RNA-pol I II III

productos 45S rRNA Pre-mRNA

5S rRNA

tRNA

snRNA

Sensibilidada Amanitina

No alta moderada

RNA-polimerasas de eucariontes

La Amanitina es un inhibidorespecífico de RNA-pol.

Nomenclatura



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Estados de la Transcripción

• Los factores de transcripciónreconocen al promotor. Estospermiten que la RNApolimerasa se una alpromotor formando uncomplejo y el DNA esdenaturado.

Iniciación

Elongación La RNA polimerasa se

desplaza por el DNAsintetizando del transcritode RNA.

Terminación

Una señal de términohace que la RNApolimerasa se disocie delDNA.



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RNA mensajero

Se requieren 3 tipos de proteínas o complejos deproteínas transactivadoras para que ocurra latranscripción basal en el promotor (caja TATA)

RNA polimerasa II

Factores generales de transcripción (cinco)

Un complejo de proteínas llamado mediador

La RNA polimerasa II y sus factores detranscripción



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Factores generales de transcripción:

•TFIID: 2 subunidades (TBP (factorde transcripción universal) y 1complejo de 10 TAFs)•TFIIB: (1 proteína) media lainteracción entre TFIID y laPolimerasa•TFIIF: (4 proteínas) estabiliza elcomplejo DNA-TBP-TFIIB.

•TFIIE: (4 proteínas) regula TFIIH yen conjunto promueven la adición delprimer nucleótido del RNA.•TFIIH: es el complejo de mayortamaño (9 subunidades) actividadhelicasa y de reparación del DNA.•RNA polimerasa: (12 subunidades)requiere de estos factores para:-Posicionar correctamentela enzima-Para regular su actividad



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Unión de TATA-binding protein (TBP) acaja TATA

Regulación del complejo a través de factoresde transcripción



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Estructura de algunos factores de transcripción

Cremallera deLeucina

Hélice-bucle-hélice

Dedos de Zn2+ Hélice-vuelta-hélice

Activación de la transcripción vía mediador



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• El análisis de los genes de bacterias mostró que: – La secuencia del DNA en la hebra codificante

corresponde a la secuencia de nucleótidos del mRNA

– Esta última corresponde a la secuencia de aminoácidosdel polipéptido

• Esto se denomió colinearidad de la expresióngénica

• El análisis estructural de los genes eucariontesmostró que estos no siempre tenian colinearidadcon sus respectivos mRNAs

Modificaciones del RNA



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• Las secuencias codificantes, llamadas exones,son interrumpidas por secuencias llamadasintrones

• Durante la transcripción se copia el gencompleto – Los intrones deben se removidos posteriormente

– Los exones deben ser empalmados• Este proceso se denomina splicing (o

maduración) del RNA – Es un proceso genético común en eucariontes




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• Aparte del splicing, los transcritos de RNApueden experimentar otras modificaciones

– Por ejemplo:• Trimming de los transcritos de rRNA y tRNA

• 5’ Capping y la adición en 3’ de una cola de poli Aen los transcritos de mRNA


La mayoría de los mRNAs maduros poseen una 7-metil guanosina (caperuza) covalentemente unidaen su extremo 5’

Este proceso se llama capping

El capping ocurre a medida que el pre-mRNA essintetizado por la RNA pol II Normalmente cuando los transcritos tienes entre 20-25

bases

Capping



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• La caperuza en 5′ se forma agregando una G a la basedel extremo a través de un enlace 5′–5′

• La estructura de la caperuza es reconocida por proteínas(cap-binding proteins) que influencian la estabilidad delmRNA, splicing, exportación al citoplasma y traducción

Capping

Capping



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La mayoría de los mRNAs maduros poseen unacola de poli-A en sus extremos 3’

La cola de poli-A no está codificada en la secuenciadel gen Se agrega enzimáticamente despues de que el gen es

transcrito

Poli-adenilación (tailing )



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Poli-adenilación (tailing )

El extremo 3′ de los mRNAs songenerados por clivaje y poliadenilación

• La secuencia AAUAAA es unaseñal para clivaje, lo cualgenera el extremo 3’ del mRNAque es posteriormente

poliadenilado

• La reacción requiere uncomplejo proteico que contieneuna endonucleasa y una poli(A)polimerasa



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Involucra: La remoción de

intrones del RNA

El empalme de losexones en el RNApor un enlacefosfodiéster

Catalizado por elsplicesosoma

Splicing



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• pre-mRNA –El transcrito nuclear es procesado poruna modifiación y maduración (splicing) para originarun mRNA

• Maduración del RNA (splicing) – Proceso por elcual se remueven intrones del RNA y se conectanenxones para originar un mRNA contínuo



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• RNA nuclear heterogeneo (hnRNA) – RNA quecomprende a los genes nucleares transcritos por laRNA polimerasa II (pre-mRNAs); posee una grandiversidad de tamaños y baja estabilidad

• hnRNP – corresponde a la forma deribonucleoproteína de hnRNA, en que el hnRNAforma complejo con proteínas

– Pre-mRNAs no son exportados hasta que elprocesamiento se haya completado; por lo quesólo se encuentran en el núcleo.



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• Los sitios de splicing son las secuencias inmediatamente allado de la unión exón-intrón. Su denominación se realizaen relación a su posición respecto del intrón

• El sitio de splicing 5’ en el extremo 5’ (izquierda) del intróncontiene una secuencia de consenso GU

• El sitio de splicing 3’ en el extremo 3’ (derecha) del intróncontiene una secuencia de consenso AG

Los sitios de corte y empalme (splicing)

son secuencias cortas

• La regla GU-AG(originalmentellamada la reglaGT-AG en relación a

la secuencia delDNA) se refiere alrequerimiento de lapresencia de estosdinucleótidos en lasprimeras y últimas2 posiciones en losintrones de pre-mRNAs.

Los sitios de corte y empalme (splicing)son secuencias cortas



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• Existen intrones menores en relación a los intronesmayores que siguen la regla GU-AG.

• Los intrones menores siguen la regla general AU-AC,usando un set de secuencias de consenso diferentesen las uniones exon-intron.

Los sitios de corte y empalme (splicing)

son secuencias cortas

Los sitios de corte y empalme se leen enforma de pares

• El splicing depende sólo del reconocimiento de paresen los sitios de corte y empalme

• Todos los sitios del corte y empalme 5′ sonfuncionalmente equivalentes, y todos los sitios en 3’ son funcionalmente equivalentes

• Otras secuencias conservadas en sitios de splicing en5’ y 3’ pueden definir otros sitios de splicing entremuchos otros sitios potenciales en el pre-mRNA



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El splicing de pre-mRNAs ocurre a travésde un lazo

• El splicing necesita los sitios de splicing en 5′ 3′ y unsitio de ramificación justo rio arriba del sitio de cortey empalme en 3’.

• La secuencia de ramificación es conservada enlevaduras pero no tanto en eucariontes multicelulares

• Se forma un lazo cuando el intrón se cliva en 5’, y elextremo 5’ se une a en 2’ en una A en el sitio deramificación del intrón.



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• El intrón sale como un lazolazo cuando se cliva en elsitio 3’ y después los exonesde izquierda y derecha seempalman

El splicing de pre-mRNAs ocurre a través

de un lazo

Los snRNAs son requeridos para el splicing

• small nuclear RNA (snRNA) – Uno de los snRNAque se encuentra confinado en el núcleo; varios deellos están involucrados en el splicing u otrasreacciones de procesamiento de RNA.



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• Cinco tipos de snRNPsestán involucrados en elsplicing y son U1, U2, U5,

U4, and U6.

• Juntos con otrasproteínas, los snRNPsforman el spliceosoma.


• Factor de splicing – Componente proteico delspliceosoma que no es parte de los snRNPs.

• Trans-esterificación – Reacción de rompe y

establece enlaces químicos en forma coordinada por loque no requiere energía




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Un spliceosoma alternativo usa snRNPs

diferentes para procesar los intrones declase menor

• La vía alternativa de splicing usa otro set de snRNPscon sólo U5 snRNP en común con el spliceosomamayor.

• Los intrones blanco son definidos por secuencias deconsenso más largas en los sitios de corte yempalme, a diferencia de las secuencias de regla GU-

AG o AU-AC



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La snRNP U1 se aparea en el sito de splicing en5’ y las proteínas BBP (branch-point bindingprotein) y U2AF (U2 auxilliary factor) reconocenel sitio puntual de ramificación.

La snRNP U2 desplaza a BBP y U2AF,apareándose con la secuencia de ramificación.

El trío U4/U6•U5 snRNP s ingresan a la reacción.En esta snRNP triple, las snRNAs U4 y U6 semantienen apareadas. Luego algunos rearregloscrean un sitio activo para el spliceosoma yubican los sitios del pre-mRNA para la primerareacción fosforil-transferasa.

Otros rearreglos RNA–RNA rompen elapareamiento entre U4/U6 y permite que la

snRNP U6 desplace a U1 en el sitio de splicingen 5’ para formar un sitio activo para la segundareacción fosforil-transferasa que completa elsplicing.



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Tipos de splicing

El splicing de pre-mRNA comparte elmismo mecanismo que los intrones

autocatalíticos

• Estos intrones se remueven a sí mismos por unevento de splicing autocatalítico (autosplicing oself-splicing).

• Los sitios de corte y empalme; y el mecanismo desplicing de estos intrones son similares al del splicingde intrones nucleares.

• Se pliegan en una estructura secundaria que generaun sitio catalítico que se parece a la estructura U6-U2-intron nuclear.



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El splicing es temporal y funcionalmente

acoplado a múltiples pasos en laexpresión génica

• El splicing puede ocurrir durante o después de latranscripción

• Las maquinarias de transcripción y splicing están física yfuncionalmente integradas

• El splicing está asociado a la exportación del mRNA y elcontrol de la estabilidad

• Complejo de unión de exones (EJC) – Es un complejode proteínas que se ensambla en las uniones exón-exóndurante el splicing y asiste en el transporte de RNA,localización y degradación

El splicing se requiere para la exportación de mRNA



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• El splicing en el núcleo puedeinfluenciar la traducción delmRNA en el citoplasma.

• nonsense-mediatedmRNA decay (NMD) – es

una vía que degrada el mRNAque posee una mutaciónnonsense antes del últimoexón.

El splicing es temporal y funcionalmente

acoplado a múltiples pasos en laexpresión génica

Una ventaja de los genes con intrones es que permiten elsplicing alternativo

Un pre-mRNA con múltiples intrones puede ser maduradoen diferentes puntos de su secuencia

Esto genera mRNAs maduros con diferentescombinaciones de exones

Esta variación en el splicing puede ocurrir en diferentestipos celulares o durante diferentes etapas del desarrollo

¿Ventajas de poseer intrones?



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La ventaja biológica del splicing alternativo es que de unmismo gen se pueden originar dos (o más) polipéptidos

Esto permite que un organismo posea pocos genes en sugenoma pero igualmente es capaz de producir muchasproteínas diferentes

¿Ventajas de poseer intrones?

• Secuencias específicas de exones pueden serexcluidas o incluidas en los productos de mRNA

usando sitios alternativos de splicing.

• El splicing alternativo contribuye a la diversidadestructural y funcional de los productos génicos.

El splicing alternativo es una regla en vezque la excepción en los eucariontes

multicelulares



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Diferentes modos de splicing alternativo

El splicing alternativo es una regla en vezque la excepción en los eucariontes

multicelulares

• La determinación del sexo en la Drosophila involucrauna serie de eventos de splicing alternativo en genes

que codifican para sucesivos productos de una vía.



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Secuencias en intrones o exones puedenmodular la selección del sitio de splicing



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