Class 70 Sequence Alignment

5/17/2018 Class 70 Sequence Alignment - slidepdf.com

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ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS

INTRODUCCION A TECNICAS DE MINERIADE DATOS

Mg. Samuel Oporto Díaz



Mapa Conceptual – Minería de Datos

DataObjetivo

DataPre-procesada

Data Transformada Patrones

Fuentes de datos Pre-procesamientoExploración y

transformaciónReconocimiento de

PatronesEvaluación eInterpretación

DatacrudaDHW

DBMS

Texto

Evaluación yEntendimien

to

Muestreo ySelección

• Muestreo• Selección

Limpieza deDatos

• Limpieza dedatos

• Datos que noexisten

• Datos no

clasificados• Identificación de

Transformaciónde Datos

• Reducción deDimensionalidad

• Creación deCaracterísticas

• Normalización de

Datos• Variables

Correlacionadas

Reportes yVisualización

Modelado• Descripción• Clasificación• Regresión• Agrupamient

o• Asociación

• Secuenciación

•


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Tabla de Contenido

• Introducción 4

• Pre-procesamiento 9• Reducción de Datos 26

• Selección de Instancias 36

• Selección de Características 40

• Ejemplo

– Planteamiento del Problema 49

– Procedimiento de solución 53

– Algoritmos 58 – Fuentes de Datos 64

– Diseño de Experimentos 66

– Resultados Experimentales 68

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INTRODUCCION



PREGUNTAS



Alineamiento de secuencias

Fernán Agüero

Instituto de Investigaciones BiotecnológicasUniversidad Nacional de General San Martín

<fernan at iib.unsam.edu.ar>



Análisis comparativo

Finches of the Galápagos Islands observed byCharles Darwin on the voyage of HMS Beagle

El alineamiento de

secuencias es similar aotros tipos de análisiscomparativo.

En ambos es necesariocuantificar las similitudesy diferencias (scoring)entre un gruporelacionado de entidades.



Para qué alinear?• Para poder comparar dos secuencias

– Dos proteínas o genes con función similar pero provenientes de distintosorganismos

• Analizar variación, conservación de residuos importantes para la función

• Detectar patrones que sirvan para detección diferencial (diagnóstico)

– Dos proteínas distintas pero con una región o dominio similar

• Proteína X de función conocida contiene un dominio Y

• Proteína Z de función desconocida también tiene un dominio Y. Puedo decir algoacerca de su probable función?

– Un mRNA y el gen correspondiente: detección de la organización génica

• El mRNA contiene secuencias derivadas de los exones solamente

• El gen contiene tanto intrones como exones



Homología vs similitud• Homología entre dos entes biológicos implica una herencia

compartida

• Homología es un término cualitativo

• Se es homólogo o no se es

• Similitud implica una apreciación cuantitativa o una cuantificacióndirecta de algún caracter

• Podemos usar una medida de similitud para inferir homología




Los algoritmos que

alinean secuenciasmodelan procesosevolutivos

GATTACCA

GATG ACCA GATTACCA

inserción

GATTG ATCA

GATTACCA GATTATCA GATTACCA

GATC ATCA

sustitución deleción

GAT _ ACCA

Deriva de un ancestro comúna través de cambiosincrementales debido aerrores en la replicación delDNA, mutaciones, daño ocrossing-over desigual.




Algoritmos de alineamiento

modelan procesos evolutivos

GATTACCA

GATGACCA GATTACCA

Deriva a partir de un ancestrocomún a través de cambioincremental. GATCATCA GATTGATCA


GATACCA

Sólo las secuencias actuales son conocidas, lassecuencias ancestrales se postulan.

GATCATCA GATTGATCA

GATTACCA

GATACCA



1212 /39/39


La palabra homología implica una herencia común(un ancestro común), el cual puede ser inferido apartir de observaciones de similitud de secuencia.

Algoritmos de alineamiento

modelan procesos evolutivos

GATTACCA

GATGACCA GATTACCA

Deriva a partir de unancestro común a través decambio incremental.Mutaciones que no matan alindividuo pueden pasar a lapoblación.

GATCATCA GATTGATCA


GATACCA



1313 /39/39

Alineamientos

• Qué es un alineamiento?

– El procedimiento de comparación de dos (o más) secuencias demanera de lograr que una serie de caracteres individuales opatrones de caracteres que se encuentren en el mismo orden enambas secuencias queden “alineados” verticalmente.

– AATTGGCCGTACGT – AATTGGCCGTACGT

• Cómo alineamos dos secuencias?

– a mano o con la ayuda de un programa – usando un método/algoritmo



1414 /39/39

Definición de alineamiento: tipos

Alineamientos locales:

Alineamiento global:

Alineamiento:

Todas las bases se alinean con otra base o con ungap (“-”)

Cada base se usa a lo sumo una vez

No hay necesidad de alinear todas las bases

Align BILLGATESLIKESCHEESE and GRATEDCHEESE

G-ATESLIKESCHEESE or G-ATES & CHEESE

GRATED-----CHEESE GRATED & CHEESE



1515 /39/39

Alineamientos buenos y malos?Cuál es el ‘mejor’ alineamiento?

GCTACTAGTT------CGCTTAGC

GCTACTAGCTCTAGCGCGTA TAGC

GCTACTAG-T-T--CGC-T-TAGCGCTACTAGCTCTAGCGCGTATAGC

0 mismatches, 5 gaps

3 mismatches, 1 gap



1616 /39/39

Cómo decidir cuál es el mejor?• Respuesta: el más significativo desde el punto de vista

biológico• Pero: necesitamos una medida objetiva

• sistemas de puntaje (scoring)

– reglas para asignar puntos – el más simple: match, mismatch, gap



1717 /39/39

Un primer ejemplo de scores

G- ATESLIKESCHEESE

GRATED-----CHEESE

Score

(10 * 1) + (1 * 0) + (6 * (-1)) = +4

Ejemplo de sistema de score

match = +1 mismatch = 0 gap = -1

Usando otro sistema de score

Score

(10 * 2) + (1 * 0) + (6 * (-1)) = +14



1818 /39/39

Puedo comparar scores?

• Primera conclusión importante:

– no tiene sentido comparar scores de distintos alineamientos

– a menos que el sistema de scoring utilizado sea el mismo en los

distintos alineamientos

– Es importante especificar el sistema de puntaje!



1919 /39/39

Gap penalties

1- Abrir un gap es costoso

GCTACTAGTT------CGCTTAGCGCTACTAGCTCTAGCGCGTATAGC

GCTACTAG-T-T--CGC-T-TAGCGCTACTAGCTCTAGCGCGTATAGC

Penalty = 5 * (-5) + 6 * (-1) = -31

Penalty = 1 * (-5) + 6 * (-1) = -11

2 - Extender un gap es menos costoso

gap opening penalty = -5gap extension penalty = -1



2020 /39/39

Dot plots: introducciónDot-plot: Fitch, Biochem. Genet. (1969) 3, 99-108.

A

C

G

T

C G T A C C G T

0 0 0 1 0 0 0 0

1

0

0

0 0 0 1 1 0 0

1 0 0 0 0 1 0

0 1 0 0 0 0 1

Eje horizontal: secuencia 1

E j e

v e r t i c a l :

s e c u e n c i a

2



2121 /39/39



2222 /39/39

Dot Matrix Plot



2323 /39/39

Dot Matrix Plot



2424 /39/39

Dot Matrix Plot



2525 /39/39

Similitud local

FXII F2 E F1 E K Catalytic

PLAT F1 E K CatalyticK

Dominios mezclados confunden alos algoritmos de alineamiento.

Módulos en el factor XII de coagulación y en el activadorde plasminógneos – tissue plasminogen activator (PLAT)

F1,F2 Fibronectin repeatsE EGF similarity domainK Kringle domainCatalytic Serine protease activitiy

Módulos en ordenreverso

Módulosrepetidos



2626 /39/39

Dot plots: ejemplo

T i s

s u e P l a s m i n o g e n A c

t i v a t o r ( P L A T )

Coagulation Factor XII (F12)

K

K

Catalytic

C a t a l y t i c

K

EF1EF2

E

F 1



2727 /39/39

Dot plots: ejemplo (cont.)

T i s

s u e P l a s m i n o g e n A c

t i v a t o r ( P L A T )

Coagulation Factor XII (F12)

K

K

Catalytic

C a t a l y t i c

K

EF1EF2

E

F 1

Dominios repetidosmuestran un patróncaracterístico.



2828 /39/39

Dot plots: path graphs

90 137

7 2

2 3

90 137

7 2

2 3

PLAU 90 EPKKVKDHCSKHSPCQKGGTCVNMP--SGPH-CLCPQHLTGNHCQKEK---CFE 137

PLAT 23 ELHQVPSNCD----CLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYE 72

Dominios EGF conservados en la urokinse plasminogenactivator (PLAU) y el tissue plasminogen activator(PLAT)

Dot plots sugierencaminos (paths) através del espacio dealineamientos posibles.

Path graphs sonrepresentacionesmás explícitas deun alineamiento.

Cada path es unalineamiento único.

P th h t l j i



2929 /39/39

Path graphs: encontrar el mejor camino

Rutear una llamada telefónica desdeNY a San FranciscoLos problemas queinvolucran encontrar lamejor ruta o camino(Best-path problems)son comunes encomputación científica.

El algoritmo paraencontrar el mejorcamino entre dosextremos y pasando porvarios puntos se llama

‘dynamic programming’

D i i i t d ió



3030 /39/39

Dynamic programming: introducción

G A T A C T A

G A T T A C C A

Construir unalineamiento óptimoentre estas dossecuencias

Utilizando lassiguientes reglas descoring:

Match:

Mismatch:Gap:

+1

-1-1

Un ejemplo:



3131 /39/39

Dynamic programming: ejemplo

G A T A C T A G A

TT A

CC A

Ordenar las dossecuencias en una

matriz bidimensional

Los vértices de cadacelda se encuentranentre letras (bases).

Needleman & Wunsch(1970)



3232 /39/39

(cont.)

G A T A C T A G A

TT A

CC A

El objetivo esencontrar la ruta(path) óptimo

Desde aquí

Hasta acá

Dynamic programming: paths posibles



3333 /39/39

Dynamic programming: paths posibles

G A T A C T A G A

TT A

CC A

Cada path corresponde aun alineamiento único

Cuál es el óptimo?

Dynamic programming: scores: match



3434 /39/39

Dynamic programming: scores: match

G A T A C T A G A

TT A

CC A

El score para unaruta (path) es lasuma incremental de

los scores de suspasos (diagonales olados).

A alineada con A Match = +1



3535 /39/39

mismatch

G A T A C T A G A

TT A

CC A

A alineada conT

Mismatch = -1



Dynamic programming: scores: gaps



3636 /39/39

Dynamic programming: scores: gaps

G A T A C T A G A

TT A

CC A

T alineada con NADA

Gap = -1

T alineada con NADA



Dynamic programming: paso a paso (1)



3737 /39/39


G A T A C T A G A

TT A

CC A

Extender el path paso por paso

0 -1

+1-1

G

G

–

G

G

–

+1 -1 -1




3838 /39/39


G A T A C T A G A

TT A

CC A

0

+1-1

-2

-2

-1

Recordar el mejorsubpath que lleva acada punto en lamatriz.

Incrementar el path paso a paso




3939 /39/39

G A T A C T A G A

TT A

CC A

0

-1

-2

0 +2

+1

-1

-20







4040 /39/39

G A T A C T A G A

TT A

CC A

0 -2

0 +2

+1

-1

-20

-2

-1







4141 /39/39

G A T A C T A G A

TT A

CC A

0

+1

-1

-2-1

-3-2

-3

-2

+3

-1

-1

0

0

+1

+1

+2







4242 /39/39

G A T A C T A G A

TT A

CC A

0

+1

-1

-1

-2

-2 0

0

+1+2

-5-4

-5

-4

-3

-3

-1 -3-2

-10

+1

+2

0

+1-1

+2

-3 -1

-2

+1 +3

+2 +1

+2+3










4545 /39/39

obtenido

G A T A C T A G A

TT A

CC A

Imprimir el alineamiento

A

A

-

T

T

T

A

A

C

C

T

C

A

A

G

G

Dynamic programming: Smith-Waterman



4646 /39/39

Dynamic programming: Smith-Waterman

• El método fue modificado (Smith-Waterman) para obtener

alineamientos locales

• El método garantiza la obtención de un alineamiento óptimo(cuyo score no puede ser mejorado)

• La complejidad es proporcional al producto de las longitudesde las secuencias a alinear

G



4747 /39/39

Gracias aHugues Sicotte (NCBI)

(slides DP, HMS Beagle)

Marcelo Viegas(slides Dot Matrix)



4848 /39/39



4949 /39/39

Algoritmos de alineamiento optimo

para pares de secuencias

Ali i t ó ti



5050 /39/39

Alineamientos óptimos

• Una vez fijado un sistema de puntuación

– Matriz de substitución (Identidad, PAMxx, BLOSUM…) – Coste de la apertura y de la extensión de “gaps”

• Se define el alineamiento óptimo entre dos secuencias comoaquel cuya puntuación és máxima entre todos los posiblesalineamientos.



5151 /39/39

Un algoritmo exhaustivo para obtener



5252 /39/39

Un algoritmo exhaustivo para obtener alineamientos óptimos

• Una posible aproximación para encontrar el alineamientoóptimo es la búsqueda exhaustiva: – Construir todos los posibles alineamientos

– Calcular la puntuación de cada uno

– El alineamiento óptimo es el que obtenga el valor más grande(puede haber más de uno!)

• El número de alineamientos posibles es muy alto: Si S, T constan de unos 20 caracteres pueden hacer falta más de240 operaciones!!!

U lt ti l bú d h ti





5353 /39/39

Una alternativa a la búsqueda exhaustiva:La programación dinámica (PD)

• La programación dinámica es una técnica de diseño de

algoritmos consistente en – Considerar, en primer lugar, los casos más sencillos de unproblema

– Resolverlos

– Combinarlos par a obtener la solución de casos más

complicados – Hasta resolver el caso completo original

Veamos un ejemplo

Có tili ió di á i





















5454 /39/39

Cómo utilizar programación dinámica paraobtener el alineamiento óptimo?

• Se obtiene un alineamiento óptimo para una subsecuencia, – P.ej. el primer carácter de cada secuencia por la izquierda.

• El alineamiento óptimo de la subsecuencia inicial se mantendráen el alineamiento óptimo final

– cualquier otro puntuaría menos que éste disminuiría la puntuación

total• Tras alinear la primera subsecuencia ya no hace falta trabajar conella Se pasa a la subsecuencia siguiente y así se va iterandohasta el final

– el coste de cada paso es bajo

– el resultado final se obtiene de acumular los resultados de cada paso

El algoritmo de Needleman y Wünsch:



5555 /39/39

g y Alineamiento basado en programación

dinámica

Un alineamiento puede representarse como



5656 /39/39

p pun camino en una matriz (de puntuaciones)

T C G C A

T

C

C A

T C G C A

T

C

C

A

TCGCA TC-CA

TCGCA T-CCA

Un alineamiento puede representarse como



5757 /39/39

T C G C A

T

C

C A

s22

El significado de cada punto enla matriz es el siguiente: Todos

los caracteres hasta el punto se

han alineado,

Puede ser, sin embargo quehaya muchos caminos que

llevan al punto

La posición etiquetada “s22” representa TC alineado con TC

--TC -TC TCTC-- T-C TC

p pun camino en una matriz (de puntuaciones)

Calculo de la matriz de puntuaciones



5858 /39/39

Calculo de la matriz de puntuaciones• Cualquier posición de la matriz sólo

puede alcanzarse de tres maneras

posibles: – En diagonal lo que significa

emparejando el carácter de fila y decolumna

– En vertical que significa insertando

uno o más gaps en la secuenciahorizontal (S1)

– En horizontal que representainsertar uno o más gaps en lasecuencia vertical (S2)

T C G C A

T

C

C

A s43

S2

S1

Calculo de la matriz de puntuaciones



5959 /39/39

Calculo de la matriz de puntuaciones• Para llenar la matriz de

puntuaciones

– Consideramos todas las manerasde llegar hasta cada celda de lamatriz

– Nos quedamos con la(s) queconsiguen la puntuación más alta:

Puede haber más de una

T C G C A

T

C

C

A s43

S2

S1

Cálculo de la matriz de puntuaciones



6060 /39/39

Cálculo de la matriz de puntuaciones

• La matriz de puntuaciones (Score Matrix ), P, se llena de arribaabajo y de izquierda a derecha mediante el siguiente

procedimiento1. Se llena la fila 0 y la columna cero con el coste de abrir un gap y

extenderlo tantos caracteres como posición en la fila (columna) seencuentre la celda

2. Se va llenando la matriz de izquierda a derecha y de arriba abajo. Encada celda se coloca la puntuación máxima resultante de considerar

todas las posibles maneras de acceder a aquella celda3. La direccion (o direcciones) que han dado lugar a la máxima

puntuación se anota por separado en la matriz de reconstrucción quese utilizará para reconstruir el alineamiento

Fórmulas de cálculo



6161 /39/39

Fórmulas de cálculo• Utilizamos la notación siguiente:

– S(i,j): Puntuación para coincidencia o no

– W k = a+b·k : Penalización afín para un “gap” de longitud k

• Con esta notación la puntuación de la fila y la columna 0:

– P(0,0)=0; P(0,k)=-W k, P(k,0)=-W k,

• Y la puntuación de cada celda de la tabla:

{ }{ }

−−−−

+−−

=−

≥

≥

columnaladeanterioresceldas,),(max

filaladeanterioresceldas,),(max

diagonalenanterior celda,),()1,1(

max),(

1

1

y y

x x

W y ji P

W j xi P

jiS ji P

ji P



6262 /39/39

Matriz de reconstrucción (Traceback)• Para reconstruir el alineamiento, al mismo tiempo que se llena la matriz

de puntuaciones, se llena la matriz de reconstrucción, T de la siguiente

forma: – T(i,j)=0 , si el máximo viene de la diagonal

– T(i,j)=+y , si el máximo viene de un desplazamiento vertical de y celdas. A

veces tan sólo se indica que viene de arriba (“↑”)

– T(i,j)=-x , si el máximo viene de un desplazamiento horizontal de x celdas. A

veces tan sólo se indica que viene de la izquierda (“←”)

• Si hay empate anotamos todos los valores iguales

R t ió d l li i t



6363 /39/39

Reconstrucción del alineamiento

• Para reconstruir el alineamiento se busca, en la matriz de

puntuaciones, la celda de la última fila o columna con la puntuaciónmás grande

• Se escoge la misma celda en la matriz de reconstrucción y se varetrocediendo según los valores indicados en ésta

• Este procedimiento puede dar más de un alineamiento óptimo

Ejemplo



6464 /39/39

Ejemplo

Smith-Waterman



6565 /39/39

Algoritmo de alineamiento local

0

0

0

0 0 0 0 0

..

..

P[i,0]= 0 ; per i= 0…m

a[0,j]= 0 ; per j= 0…n

Si el mejor alineamiento hasta un ciertopunto tiene un valor negativo esmejor empezar uno nuevo en lugar deextender el viejo

Matriz de puntuaciones:No se penalizan los gaps de

las bandas derecha y izquierda{ }

{ }

−−

−−

+−−

=−≥

≥

0

,),(max

,),(max

,),()1,1(

max),(

1

1

y y

x x

W y ji P

W j xi P

jiS ji P

ji P



6666 /39/39

Complementos

Nomenclatura para el estudio de



6767 /39/39

psecuencias de caracteres

• Cadena: Lista ordenada de caracteres de un alfabeto: GATTACA

• Prefijo: Caracteres consecutivos cogidos desde el inicio: G,GAT, GATTA,

• Sufijo: Caracteres consecutivos cogidos desde el final:

A,CA,TACA,...• Subcadena: Caracteres consecutivos desde los extremos o el

medio: GAT,TACA,ATTA...

• Subsecuencia: Caracteres ordenados no necesariamenteconsecutivos: GAAA,TTC,...

Ejemplo de programación dinámica



6868 /39/39

Ejemplo de programación dinámicaNúmeros de Fibonacci

Sub Fib(n, tab())

Dim j as integer

Redim tab(n)

tab[1] = 1tab[2] = 1;

for j = 3 to n

tab[j]=tab[j-1] + tab[j-2]

next jEnd Sub

Empecemos resolviendo los

problemas más sencillos

Utilicemos las soluciones parcialespara resolver problemas más

grandes

1

1

2

35

8

13

21

34

55

89

….

tab

Tornar

Gaps en el inicio del alineamiento



6969 /39/39

Gaps en el inicio del alineamiento

Si el dot-plot tiene este aspecto El alineamiento es:

A T C G A A T C G A

* * │ │ │C X ▬ ▬ C G A

G XA X

Si el dot-plot tiene este aspecto El alineamiento es:

G T C ▬ ▬ G C T

│ │ │

T * T A G C TA *G XT XC X



7070 /39/39



7171 /39/39


Contenido



7272 /39/39

Contenido

1. Conceptos básicos

2. Métodos gráficos de alineamiento3. Puntuación de los alineamientos









7373 /39/39

1. Conceptos básicos

Introducción









7474 /39/39

Introducción

• El alineamiento de secuencias es probablemente la

herramienta más utilizada en bioinformática• Su objetivo es alinear dos o más secuencias (de DNA oproteínas) de forma que puedan destacarse las regionessimilares entre las moléculas

• Al determinar si una secuencia desconocida es similar, enalgún sentido, a secuencias conocidas (e idealmente deestructura y función conocidas) podremos identificarla ypredecir su estructura y función

Aplicaciones





















7575 /39/39

Aplicaciones

• Mediante un alineamiento global entre genomas se puede

–identificar repeticiones internas (G1 vs G1) o – encontrar secuencias conservadas entre especies (G1 vsG2)

• Para predecir la función de una proteína desconocida suelebuscarse dominios funcionales comunes,

– mediante alineamientos locales entre dos secuencias – mediante alineamientos múltiples entre conjuntos de

secuencias

• Para buscar una secuencia en una base de datos para lo

que alinea por separado distintos fragmentos y se cuantificael grado de similitud alcanzado

• …

Métodos de alineamiento




































7676 /39/39

Métodos de alineamiento

• Existen muchos programas disponibles en WWW para

alinear secuencias y buscarlas en las BD• Si se pretende que el resultado de dichos programas sea útilno deben ser “cajas negras”

• La correcta elección del programa ( método) y de sus

parámetros es muy importante – Una elección inadecuada puede conllevar la no detección desimilitudes relevantes

Visión global de los métodos























7777 /39/39

Visión global de los métodos

• Alineamiento de dos secuencias

– Métodos gráficos: Dotplot . Es intuitivo, pero difícil decuantificar

– Algoritmos óptimos de alineamiento global (NW) o local(SW)

Obtienen el mejor alineamiento posible con programacióndinámica

Son demasiado exigentes para ser prácticos en búsquedasextensivas

• Alineamientos múltiples

• Algoritmos heurísticos para búsqueda en bases dedatos FASTA, BLAST

– Dan soluciones buenas, no necesariamente óptimas

– Pueden ser mucho más rápidos



































7878 /39/39


• Es el procedimiento consistente en comparar dos (“ pairwise”)

o más (“multiple” ) secuencias buscando los caracteres opatrones que aparezcan en el mismo orden en lassecuencias

• Podemos distinguir entre alineamientos

– Globales: Alineamiento de secuencias completas – Locales : Alineamiento de subsecuencias

Ejemplos de alineamientos























7979 /39/39

Ejemplos de alineamientos

2 Secuencias no alineadas

L G P S S K Q T G K G S S R I W D NL N I T K S A G K G A I M R L G D A

Alineam iento globalL G P S S K Q T G K G S ▬ S R I W D N

│ │ │ │ │ │ │L N ▬ I T K S A G K G A I M R L G D A

Alineam iento local▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ T G K G ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬

│ │ │

▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ A G K G ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬

Ejemplo de alineamiento múltiple




























8080 /39/39

Ejemplo de alineamiento múltiple

I M A G I N A B L E

I M P R A C T I C A B LE

I L E G I B L E

I M▬ ▬

A G▬

I N A BL

EI M P R A C T I C A B L E

I N F ▬ A L ▬ I ▬ ▬ B L E






























8181 /39/39

2. Métodos gráficos de alineamiento

Los Dotplots









8282 /39/39

Los Dotplots

• Se obtienen disponiendo dos secuencias S y T en losmárgenes horizontal y vertical de una tabla

• y marcando con una cruz (un punto) todas las posiciones enque coinciden los caracteres de S y T

– Si son idénticas se observa una diagonal definida

– Cuanto más diferentes sean, más difusa será – La aparición de patrones permite revelar estructuras en

las secuencias

Umbral de severidad (“Stringencyth h ld”)































8383 /39/39

threshold”)• Para facilitar la visualización, se opta a menudo por mostrar

únicamente las diagonales formadas por un número mínimo

de puntos (umbral de severidad)

• Si el umbral de severidad es alto

– Eliminamos el ruido de fondo (“filtrado alto”)

– Solo detecta similitudes muy altas

• Si es bajo

– Hay ruido de fondo

– Detecta relaciones distantes

Ejemplo de dotplot 1: Una secuencia conll i




























8484 /39/39

ella misma

Ejemplo de dotplot 2: Secuencias que handi id










8585 /39/39

divergido

Ejemplo de dotplot 3:I i “d l i ”










8686 /39/39

Inserciones y “deleciones”








8787 /39/39

3. Puntuación de los alineamientos

Sistemas de puntuación









8888 /39/39

p

• Para cuantificar la similitud entre dos cadenas, S y T, definimos sistemas de puntuaciones de forma que para cadaalineamiento se pueda calcular un número tal que, a mayor valor, mayor sea su significación (biológica)

• Pueden ser esquemas sencillos como por ej

– Coincidencia , S[i]=T[i] 1,

– No coincidencia, S[i]#T[i] 0,

– Inserción de espacios (gaps) -1,

• o bien sistemas más complejos basados en afinidades

químicas o en frecuencias de emparejamiento observadas

Puntuación de un alineamento









































8989 /39/39

• Una vez establecido un sistema de puntuación la puntuación de una pareja de caracteres s,t alineados se define como p(s,t)

• La puntuación (score) de un alineamiento entre S i T :

• Un alineamiento es óptimo si su puntuación es la más

grande posible

( )∑∀ iiT iS p ][],[

Ejemplo











































9090 /39/39

j p

S= A T G C A G T

T= A T A A G Tp(s,t) 1 1 0 0 0 0 Σ = 2

S= A T G C A G TT= A T A A ▬ G Tp(s,t) 1 1 0 0 -1 1 1 Σ = 3

S= A T G C A G TT= A T ▬ A A G Tp(s,t) 1 1 -1 0 1 1 1 Σ = 4

Ejemplo




























9191 /39/39

j p

P untuac ión con esquem a s imple

S = T T Y G A P P W C S

T= − T G Y A P P P W S

p(s ,t) -1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 Σ = 4

S = T T Y G A P P W C S

T= T G Y A P P P W S −p(s ,t) 1 0 1 0 0 1 1 1 0 -1 Σ = 4

El sentido de las puntuaciones























9292 /39/39

p

• Los dos alineamientos del ejemplo anterior puntúan igual.Sin embargo

– a) conserva residuos comunes (A, P, S, T)

– b) conserva residuos menos habituales (W, Y)

• El sistema de puntuar los emparejamientos entre AA debería

reflejar su relación química y biológica – Residuos similares/distintos deberían puntuar alto/bajo

pues el cambiar uno por otro afectará poco/mucho lafunción de la proteína

Matrices de puntuación (scoring) o desubstitución (substitution)
























9393 /39/39

substitución (substitution)

• Una forma usual de definir el sistema de puntuación esutilizando una matriz de substitución

• Es una tabla que contiene las puntuaciones que asignamosa cada pareja posible de caracteres,

(sirve para las coincidencias y las no-coincidencias)

• El término “substitución” refleja que lo que se pretende alpuntuar un emparejamiento es valorar el coste evolutivo decambiar un residuo por otro

Matrices para alinear ADN






















9494 /39/39

p

• Suele utilizarse una matriz identidad – P(i,i)=1, p (i,j)=0

o alguna variante de ésta – P(i,i)=0.9, p (i,j)=-0.1

Matrices para proteínas
















9595 /39/39

• No hay una matriz única que se pueda usar siempre

• Según la familia de proteínas y el grado de similitudesperado se usará una u otra

• Las más utilizadas PAM y BLOSUM

– PAM: Percent Accepted Mutation Matrix

• Derivadas de alineamientos globales de secuenciaspróximas

• PAM40 PAM250. A mayor nº mayor distanciaevolutiva

– BLOSUM• Derivadas de alineamientos locales de secuencias

distantes

• BLOSUM90 BLOSUM45 El nº representa porcentaje

de identifdad




































9696 /39/39

Penalización por “gaps”








9797 /39/39

• En un sistema de puntuación es importante definir el costede insertar o eliminar un residuo, lo que en el alineamientoaparece como un hueco (“gap”)

• Suele penalizarse distinto – el primer hueco (“gap opening”)

– que los restantes (“gap extension”) que parten de él

• La variación de estos parámetros puede tener efectosimportantes en el alineamiento final

Efecto del valor de la penalización





















9898 /39/39

Coste deapertura de

gap

Coste deextensión del

gapComentario

Grande Grande Pocas inserciones o eliminaciones

Bueno para proteínas muy relacionadas

Grande Pequeño Algunas inserciones grandes

Bueno si puede que se hayan insertadodominios completos

Pequeño Grande Muchas inserciones pequeñasBueno si se trata de proteínas distantes
























9999 /39/39

4. Algoritmos de alineamiento óptimo

para pares de secuencias

Un algoritmo exhaustivo para obtener alineamientos óptimos











100100 /39/39

alineamientos óptimos• Un algoritmo para obtener el alineamiento óptimo es:

– Construir todos los posibles alineamientos – Calcular la puntuación de cada uno

– El alineamiento óptimo es el que obtenga el valor másgrande (puede haber más de uno!)

• El número de alineamientos posibles es muy alto: Si S, T constan de unos 20 caracteres pueden hacer falta más de240 operaciones!!!

Una alternativa a la búsqueda exhaustiva:La programación dinámica (PD)



























101101 /39/39

La programación dinámica (PD)• La programación dinámica es una técnica de diseño de

algoritmos consistente en

– Considerar, en primer lugar, los casos más sencillos deun problema

– Resolverlos

– Combinarlos para obtener la solución de casos más

complicados – Hasta resolver el caso completo original

Veamos un ejemplo

Algoritmos de alineamiento óptimo























102102 /39/39

• Los dos más conocidos son

– Needleman y Wunsch (1970) para alineamientos globales – Smith y Waterman (1981), una variante para

alineamientos locales

• Sirven para alinear tanto DNA como proteínas

• Cada algoritmo retorna los alineamientos con la máximapuntuación posible para una matriz de substitución y un

coste de “gaps” dados

• El alineamiento obtenido no tiene necesariamente un

significado biológico



103103 /39/39



104104 /39/39

2004

Bioinformática y Genómica

Fernán Agüero

Instituto de Investigaciones Biotecnológicas

Universidad Nacional de General San Martín

Un breve repaso histórico



105105 /39/39

• La aparición de las secuencias completas del genoma humano y cientos deotros genomas es el producto de un siglo de investigación dirigido acomprender la información genética.

• Comienzos del siglo XX: redescubrimiento de las leyes de Mendel

• Durante el primer cuarto de siglo, la biología descubrió que la base celular de lainformación eran los cromosomas

• Durante el segundo cuarto de siglo, se descubrió que la base molecular de la

información era el DNA• Durante el tercer cuarto de siglo, se definieron los mecanismos que utilizan las

células para leer esta información y se desarrollaron las herramientas de DNArecombinante

• Durante el ultimo cuarto de siglo, los biólogos se volcaron a colectar información genética - primero de genes, luego de genomas completos.

Información biológica



106106 /39/39

En que estamos hoy …



107107 /39/39

En que estamos hoy …



108108 /39/39

• El resultado: de ser una ciencia puramente experimental (con base en ellaboratorio) la biología está siendo transformada en una ciencia de lainformación

• La información acumulada no sólo es información genética (secuencias deDNA) – expresión de RNAs

– interacción entre proteínas

– estructuras tridimensionales

– Anulación sistemática de genes (knockouts, RNAi) que produce información defenotipos

– …

• Cada vez más diversos estudios comienzan con el análisis de bases de datospara luego formular hipótesis o diseñar experimentos

• Cada vez más el trabajo de laboratorio termina en la acumulación decolecciones masivas de datos que deben ser luego analizados



109109 /39/39

Paradigma central de la bioinformática



110110 /39/39

GeneticInformation

MolecularStructure

BiochemicalFunction

Symptoms(phenotype)

Genómica, Bioinformática y Medicina



111111 /39/39

Molecular Epidemiology

Molecular Diagnostics

Genomics

Bioinformatics

Identify Targets

Drug Design

Genetic Therapy



112112 /39/39

Información biológica en formatoelectrónico

Bases de datosFernán Agüero


UNSAM

conceptos básicos



113113 /39/39

Qué es una base de datos? Una colección de datos

Cómo colecciono los datos? Decisión del usuario. Diseño dela base de datos.

Procesador de texto? (Word) Si. Permite sólo búsqueda yordenamiento simples.

Planilla de Cálculo? (Excel) También. Como los datos estánen columnas independientes, sepuede ordenar en formas máscomplejas. Las búsquedassiguen siendo simples.

Puedo usar:

Introducción: conceptos básicos: registros

U l ió d i t ( d )



114114 /39/39

• Una colección de registros (records).• Cada registro tiene varios campos.

• Cada campo contiene información específica.• Cada campo contiene datos de un tipo

determinado. – Ej: dinero,texto, números enteros, fechas, direcciones

• Cada registro tiene una clave primaria. Unidentificador único que define al registro sinambigüedad.

gi Accession version date Genbank Division taxid organims Number of Chromosomes

6226959 NM_000014 3 01/06/2000 PRI 9606 homo sapiens 22 diploid + X+Y



41 X63129 1 06/06/1996 MAM 9913 bos taurus 29+X+Y

Planilla

Versión simple deuna base de datos

Tipos de datos



115115 /39/39

• Cada campo de una base de datos contiene un tipo particular de datos – 021204

• Es un numero?• Es texto?

• Es una fecha?

• Ejemplo de una busqueda: buscar todos los registros en donde el valor almacenado sea mayor que 021204 – Es obvio que para poder comparar los valores almacenados tenemos que

saber qe tipo de valores estamos comparando. – Si es una fecha: 021204 (2.Dic.2004) > 211203 (21.Dic.2003)

– Si es un numero: 021203 < 211203

– Si es texto: 021203 ≠ 211203, las comparaciones < y > pueden dar distintos resultados (evaluan orden o longitud)

Tipos de datos



116116 /39/39

• Numericos (enteros, decimales)

•Texto• Fechas (DD/MM/YYYY, HH:MM:SS)

• Logicos (boolean) = verdadero / falso

• Geometricos (punto, linea, circulo, poligonos, etc.)

primariagi Accession version date Genbank Division taxid organims Number of Chromosomes



117117 /39/39





gi = Genbank Identifier: Clave única : Clave primaria

Cambia con cada actualización del registro correspondiente a la secuencia

Accession Number: Clave secundaria

Refiere al mismo locus y secuencia, a pesar de los cambios en la secuencia.

Accession + Version es equivalente al gi (representa un identificador único)

Ejemplo: AF405321.2 Accession: AF405321 Version: 2

relacionalesgi Accession version date Genbank Division taxid organims Number of Chromosomes



118118 /39/39





gi Accession version date Genbank Division taxid

6226959 NM_000014 3 01/06/2000 PRI 9606

6226762 NM_000014 2 12/10/1999 PRI 9606

4557224 NM_000014 1 04/02/1999 PRI 9606

41 X63129 1 06/06/1996MAM 9913

taxid organims Number of Chromosomes

9606 homo sapiens 22 diploid + X+Y

9913 bos taurus 29+X+Y

Base de datos relacional:

Normalizar una base de datos para sub-elementos repetidos,repartiendola en bases de datos menores, relacionadas a través de unidentificador único (clave primaria).

informacion



119119 /39/39

Lutzomyia cruzi cytochrome b; best similarity to gi|12345685696

Sarcocystis cruzi 16SRNA gene5695

Candida albicans hypothetical protein in region 21922..245685694

Trypanosoma cruzi chromosome 3, ORF 1234, similar to gi|12345|

AF934567 caseine kinase (Candida albicans)

5693

annotationgi

1234568Cytochrome bLutzomyia cruzi5696

78651216S RNA geneSarcocystis cruzi5695

Hypothetical protein in region 21922..24568Candida albicans5694

12345Chromosome 3, ORF 1234Trypanosoma cruzi5693

similar to AnnotationOrganismgi

índices



120120 /39/39

• Para facilitar las búsquedas en una base de datos, seconstruyen índices.

• Un índice es una lista de claves primarias asociadas a undeterminado campo (o grupo de campos)

Genbank divPRI 6226959;6226762;4557224;É

MAM 41;É AccessionNM_000014 6226959;6226762;4557224;X63129 41;

gi Accession version date Genbank Division taxid organims Number of Chromosomes





Indices (cont)



121121 /39/39

• Un ejemplo más complejo: buscar todos los records quecontengan la palabra ‘kinase’ en la descripción de la

secuencia

gi acc def

214734 L07770 Xenopus laevis rhodopsin mRNA, complete cds.

123456 AF43567 Mus musculus casein kinase mRNA, partial cds.

•Indexar la columna ‘def’

word list of GIs

casein 1234,3245,43678,123456 ...

kinase 432,5678,32456,123456 ...

laevis 36314,214734, ...

mus 23467,98732,123456,312456,567983 ...musculus 23467,98732,123456,567983 ...

rhodopsin 214734,223466,873212,23587,2942,12932 ...

xenopus 28462,36314,98476,214734 ...

Indexar es costoso



122122 /39/39

• El proceso de indexación es costoso en términos computacionales,pero se realiza una única vez (en realidad cada vez que se actualizan

los datos)

• Desde el punto de vista de la base de datos, los índices no son otracosa que nuevas tablas relacionadas con la tabla que contiene elcampo indexado

• Ejemplo más obvio: buscadores de páginas de internet (Google, Altavista). Visitan páginas e indexan los términos que encuentran

– kewyword: url1, url2, url3, url4, etc.

indexadas



123123 /39/39

• Buscadores de páginas en internet

• PubMed / Entrez / SRS

• BLAST

Importante: no se busca en el total de los datos disponibles, sino sobreun subset pre-computado.

Schemas



124124 /39/39

• La distribución de los datos en campos dentro de una tabla y de lasrelaciones entre tablas y sus campos es lo que se llama el diseño o

schema

Schemas (cont)



125125 /39/39

RDBMS



126126 /39/39

• Relational Database Management Systems – Comerciales

• Oracle, Sybase

– Open source, gratuitos

• PostgreSQL, MySQL

• Todos usan SQL (standard query language) para – crear tablas, índices, etc.

– ingresar datos

– consultar

Búsquedas simples



127127 /39/39

• Los motores de búsqueda ofrecen búsquedas simples

• No imponen restricciones

• El usuario tipea palabras libremente

• Usan estrategias para intentar “adivinar” la intención delusuario (sobre qué campo de la base de datos buscar)

Ejemplo: term mapping - Entrez (PubMed)



128128 /39/39

• Entrez busca en una serie de listas para ver si la palabra queingresaron se encuentra en alguna

• MeSH (Medical Subject Headings): vocabulario controlado utilizado para

indexar artículos en PubMed.

• Journals: nombre completo del journal, abreviaturas usadas en MEDLINE y

números ISSN.

• Lista de frases: cientos de miles de frases generadas a partir de MeSH y otros

vocabularios controlados similares.

• Indice de autores: apellido e iniciales.

• Stopwords: palabras comunes, presentes en casi todos los registros de la base

de datos (a, an, by, of, the … )

Búsquedas simples: pros / cons



129129 /39/39

• Ventajas

– rápidas de formular

– no hay que leer el manual

– ni hacer un curso

• Desventajas

– poco selectivas

Búsquedas avanzadasP i t i i t b l i ió



130130 /39/39

• Presuponen un cierto conocimiento sobre la organizaciónsubyacente de los datos

• Hay que especificar sobre qué campos buscar:

⇒hay que conocer los campos

• Entrez: se especifican entre corchetes

• Tags predefinidos (hay que conocerlos)– Escherichia coli[organism]

–review[publication type]

– attenuator[feature key]

• SRS: formulario avanzado (no hay que conocer términos otags)

Búsquedas avanzadas: Entrez



131131 /39/39

• Entrez provee además

– Límites: especie de formulario avanzado que les

permite limitar la búsqueda a un campo determinado,

sin tener que conocer los tags)

– History: una historia de las búsquedas que van

realizando. En cualquier momento pueden combinar

búsquedas o volver sobre alguna de ellas

– Preview/Index: les permite probar una búsqueda

(preview) y ver el número de registros que selecciona

o ver los índices y el número de registros asociados a

cada uno de ellos – Details: permite analizar la traducción que realizó

Entrez de la búsqueda que realizamos (uso de

sinónimos, límites, etc)

Operadores lógicos

E bú d i l d i i



132132 /39/39

• En búsquedas simples o avanzadas siempre tienen adisposición operadores lógicos para encadenar términos

• AND (unión) – human AND genome

– +human +genome

– human && genome

• OR (intersección) – human OR genome

– human || genome

• NOT (subconjunto)

– human NOT genome

Orden de los términos en un query

El d d l té i i t t



133133 /39/39

• El orden de los términos es importante

• Un query se evalúa de izquierda a derecha – human NOT genome no es lo mismo que genome NOT human

• Si el query tiene muchos términos pueden forzar el orden deevaluación usando paréntesis – human AND cancer AND (cell OR science OR nature)

– casein kinase NOT (human OR mouse)



134134 /39/39

Bases de datos biológicas: DNA• Nucleotide databases:



135135 /39/39

Nucleotide databases:

– Genbank: International Collaboration• NCBI (USA), EMBL (Europe), DDBJ (Japan and Asia)

– Organism specific databases

• FlyBase

• ChickBASE

• pigbase

• SGD (Saccharomyces Genome Database)

Bases de datos biológicas: proteínas• Protein Databases:



136136 /39/39

– NCBI:• Genpept: Translated Proteins from Genbank Submissions

– EMBL

• TrEMBL: Translated Proteins from EMBL Database

– SwissProt:

• recibe secuencias peptídicas

• cura y anota secuencias provenientes de TrEMBL

(Gratuita para uso académico. Restricciones sobre los

descubrimientos hechos utilizando la base de datos. La

versión de 1998 es gratuita y libre de todas las restricciones.)

• http://www.expasy.ch (última versión no-gratuita)

• NCBI tiene la última versión gratuita.

Bases de datos biológicas: estructura• Structure databases:

http://www.expasy.ch/

http://www.expasy.ch/



137137 /39/39

– PDB: Protein structure database.• http://www.rscb.org/pdb/

– MMDB: NCBI’s version of PDB with entrez links.• http://www.ncbi.nlm.nih.gov

– SCOP: structural classification of proteins• family, superfamily, fold

– CATH: structural classification of proteins• class, architecture, topology, homology

– FSSP: fold classification based on structure-structure alignment

• Genome Mapping Information: – http://www.il-st-acad-sci.org/health/genebase.html

–NCBI(Human) – Genome Centers:

• Stanford, Washington University, UCSC

– Research Centers and Universities

Bases de datos biológicas: literatura• Literature databases:



138138

/39/39

Literature databases:

– NCBI: Pubmed: All biomedical literature.• www.ncbi.nlm.nih.gov

• Abstracts and links to publisher sites for – full text retrieval/ordering

– journal browsing.

– Publisher web sites.

• Pathways Database: – KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes:

www.genome.ad.jp/kegg/kegg/html

Bases de datos biológicas: GenBank• Es un Banco: no se intenta unificar datos



139139

/39/39

Es un Banco: no se intenta unificar datos. – No se pueden modificar las secuencias sin el consentimiento del

autor (submitter). – No se intenta unificar (puede haber más de una secuencia para

un locus/gen).

– Puede haber registros de diversas calidades de secuencia ydiferentes fuentes ==> Se separan en varias divisiones de

acuerdo a:• Secuencias de alta calidad en divisiones taxonómicas.

– PRI -> Primates

– MAM -> Mamíferos

– INV -> Invertebrados

• Secuencias de baja calidad en divisiones uso-específicas. – GSS -> Genome Sequence Survey

– EST -> Expressed Sequence Tags

– HTG -> High Troughput Sequencing (unfinished contigs, BACs,cosmids, chromosomes).

GenBank

• Redundante



140140

/39/39

• Redundante

• Con errores

• Dificil de actualizar

• Para poder corregir, mejorar y mantener actualizada la

anotación de los registros, el NCBI creó RefSeq (coleccióncurada de registros de GenBank) – toma records de GenBank y los actualiza/corrije

– unifica para reducir redundancia

– Accession numbers del tipo XX_123456

Bases de datos primarias• Una base de datos primaria es un repositorio de datos



141141

/39/39

p pderivados de un experimento o de conocimiento

científico.

– Genbank (Repositorio de secuencias nucleotídicas)

– Protein DB, Swissprot

– PDB – Pubmed (literatura)

– Genome Mapping

– Kegg (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, base

de datos de vías metabólicas)

Bases de datos secundarias• Una base de datos secundaria contiene información



142142 /39/39

Una base de datos secundaria contiene informaciónderivada de otras fuentes (primarias, entre otras).

– Refseq (Colección curada de GenBank en NCBI) – Unigene (Clustering de ESTs en NCBI)

• Las bases de datos organismo específicas son en

general una mezcla entre primaria y secundaria.



143143 /39/39

Análisis y anotación de genomas

Fernán Agüero

Historia• Primer proyecto de secuenciación de un genoma:



144144 /39/39

Primer proyecto de secuenciación de un genoma:Escherichia coli (US + Japón). Comenzó en 1992 y

terminó en 1997. 4.6 MB• Primer genoma (eubacteria): Haemophilus influenzae

(1995). 1.83 MB

• Primer genoma (archaea): Metanococcus jannaschii

(1996). 1.6 MB

Qué es un genoma?

• Una colección de



145145 /39/39

• Una colección de – genes

• que codifican productos proteicos

• que codifican RNAs

– pseudogenes

– regiones no codificantes

• regulatorias (expresión)

• estructurales

– attachment a matriz nuclear

– mitosis / meiosis

– elementos repetitivos

Qué es anotar?

• Agregar información de la manera más



146146 /39/39

• Agregar información, de la manera más

confiable y actualizada que se pueda paradescribir una secuencia

• Información asociada a coordenadas

genómicas (comienzo..fin), a distintosniveles

• Interpretar la información cruda de secuencia

en un marco biológico

Anotación genómica

D i l d t ió



147147 /39/39

• Dos niveles de anotación

– Estructural: encontrar genes y otros sitios conrelevancia biológica. Armar un modelo del genoma:

cada gen/sitio es un objecto asociado a una posición

en el genoma

– Funcional: los objetos son utilizados en búsquedas (y

experimentos). El objetivo es atribuir información

biológica relevante a los objetos.

Más niveles de anotación

• Organismo: fenotipo: morfología fisiología



148148 /39/39

• Organismo: fenotipo: morfología, fisiología,

comportamiento, respuestas ambientales

• Celula: vías metabólicas, cascadas de señalización,

localización subcelular.

• Molecula: sitios de binding, actividad catalítica,

estructura tridimensional

• Dominio

• Motif

• Residuo

De donde proviene la anotación?

• Fuentes utilizadas en la anotación:



149149 /39/39

• Fuentes utilizadas en la anotación:

– publicaciones que reportan nuevas secuencias

– reviews que actualizan periódicamente la anotación de familias o

grupos de proteínas

– expertos externos

– análisis de secuencia

Anotación genómica



150150 /39/39

transcription

RNA processing

translation

AAAAAAA

Genomic DNA

Unprocessed RNA

Mature mRNA

Nascent polypeptide

folding

Reactant A Product BFunction

Active enzyme

ab initio gene

prediction

Functionalidentification

Gm3

Comparative gene

prediction

Annotation & functional genomicsLa anotación del genoma es esencial en el desarrollo deestrategias funcionales (functional genomics)



151151 /39/39

GeneKnockout

Expression Microarray

RNAi phenotypes

proteome based functional genomics

estrategias funcionales (functional genomics)

Anotación: busqueda de genes• Buscar genes en el genoma

– RNA



152152 /39/39

RNA

• ribosomal RNAs ⇒BLASTN

• tRNAs ⇒tRNAscan – protein coding

• ab initio gene prediction⇒ORFs, codon usage, frecuencia dehexámeros, modelos, etc.)

• similarity ⇒BLASTX, otros

• Buscar regiones no codificantes

– regulatorias

• ab initio ⇒Gibbs sampling

• similarity ⇒patterns, profiles

– repetitivas

• similarity

• ab initio

• En todos los casos ⇒ literatura!

Integrar resultados

BLASTX



153153 /39/39

Secuenciagenoma

BLASTX

BLASTN

RepeatMasker

tRNASCan

gene prediction

DB

flatfiles

Visualización

Genome annotation: C. elegans



154154 /39/39

Resumir resultados de análisis• Guardar el reporte crudo de un BLAST (lista de hits,



155155 /39/39

p (alineamientos) es demasiado

• Prácticamente cualquiera de los análisis que se realizansobre DNA o proteínas para anotar un genoma puedenresumirse en:– secuencia start end

– cromosoma1 1723 3456

• Este formato básico es la base del formato GFF (Sanger)

secuencia metodo programa start end frame score extra

Contig1 similarity blastx 100 1000 +1 132 gi|12345|AF34093 casein kinase ...

Contig1 cds glimmer 85 1201 +1 1321 ORF0001; overlap with ORF0002

Contig1 similarity blastn 80 1300 . 136 gi|54321|AF09990 complete genome

Anotación: herramientas

• Artemis



156156 /39/39

Artemis – http://www.sanger.ac.uk/Software/Artemis

– Permite visualizar

• secuencia, con sus traducciones virtuales (6)

• tracks de anotación (entries)

• plots (built-ins y creados por el usuario)

– Lee secuencias en formato FASTA, EMBL, GenBank

– Lee features en formato EMBL, GenBank, GFF, MSPcrunch,BLAST

Artemis: main window



157157 /39/39

Feature list

Sequence view

Sequence view

Artemis: plots



158158 /39/39

%GC plot

AA propertiesplot para unCDS

Artemis: display de análisis



159159 /39/39

Frameplot

BLASTX

BLASTN

Artemis:



160160 /39/39

Artemis: zoom



161161 /39/39

Artemis: spliced genes



162162 /39/39

Artemis: comparar análisis



163163 /39/39

ACT: Artemis Comparison Tool



164164 /39/39

Nature Genetics 35 (2003)

Comparative analysis of the genome

sequences of Bordetella pertussis,

Bordetella parapertussis and

Bordetella bronchiseptica.

ACT: Artemis Comparison Tool



165165 /39/39

Otras estrategias

• Artemis se usa para anotar genomas bacterianos o para



166166 /39/39

pequeños proyectos (cósmidos, BACs, etc.)

• En genomas más grandes, la tendencia es a distribuir laanotación

• Los tracks de anotación son generados en distintos centros

• Ejemplo: UCSC Genome Browser (genoma humano, ratón).

Anotación automática: TrEMBL

• La anotación de TrEMBL (translated EMBL) se hace por



167167 /39/39

( ) p

métodos automáticos.

– Requerimientos para anotar automáticamente

• Una base de datos de referencia bien anotada (ej. Swissprot)

• Una base de datos que sea altamente confiable (en el sentido

diagnóstico) en la asignación de proteínas a grupos o familias (ej CDD,

InterPro)

• Una serie de reglas de anotación

Transferencia directa de anotación



168168 /39/39

• Realizar una búsqueda en la

base de datos de referencia ytransferir la anotación

• Ejemplo: FASTA contra una

base de datos desecuencias y transferencia

de la línea DE del mejor hitTargetTarget

XDBXDB

Anotación a partir de múltiples fuentes

G l t



169169 /39/39

• Generalmente se usa

más de una base dedatos externa

• Hay que combinar los

resultados

TargetTarget

XDBXDB

Conflictos

• Contradicción



170170 /39/39

• Inconsistencia• Sinónimos

• Redundancia

Traducción de anotaciones



171171 /39/39

• Es necesario utilizar un traductor para

mapear el lenguaje utilizado en labase de datos externa (XDB) allenguaje utilizado en la base de datostarget que queremos anotar

TargetTarget

XDBXDB

Traducciones: algunos ejemplos

ENZYME→ TrEMBL

CA L ALANINE D ALANINE



172172 /39/39

CA L-ALANINE=D-ALANINE

CC -!- CATALYTIC ACTIVITY: L-ALANINE=CC D-ALANINE.

PROSITE→ TrEMBL

/SITE=3,heme_iron

FT METAL IRON

Pfam→ TrEMBL

FT DOMAIN zf_C3HC4FT ZN_FING C3HC4-TYPE

equer m en os e un s s ema e ano ac nautomática

• Corrección



173173 /39/39

• Escalable

• Actualizable

• Poco redundante

• Completo

• Vocabulario controlado

Cómo funciona?

• Una proteína en TrEMBL es reconocida como un miembro



174174 /39/39

de cierto grupo o familia de proteínas

• Este grupo de proteínas en Swissprot comparten entre sí

partes de la anotación

• La anotación común es transferida automáticamente a la

proteína en TrEMBL y marcada como ‘annotated by

similarity’

Anotación: evidencias• Las anotaciones suelen estar acompañadas de TAGS que indican la

evidencia en la que se basa la anotación



175175 /39/39

q

• Ejemplos de algunos TAGS utilizados en TrEMBL:

– EMBL: la información fue copiada del original(EMBL/GenBank/DDBJ)

– TrEMBL: anotación modificada para corregir errores o paraadecuarse a la sintaxis propia de Swissprot

– Curator: juicio del curador– Similarity: por similitud con otra secuencia, a juicio del

curador

– Experimental: evidencia experimental de acuerdo a unareferencia, que usualmente es un paper.

– Opinion: opinión emitida por el autor de una referencia,usualmente con poca o ninguna evidencia experimental

– Rulebase: información derivada del uso de una regla deanotación automática

– SignalP: programa de predicción

Anotación: manual vs automática

• La anotación de un genoma ocurre en etapas



176176 /39/39

– anotación automática

• correr todos los análisis sobre el genoma• generar un primer borrador con todos los datos organizados. Por

ejemplo en páginas web o integrando todos los datos en un displayunificado (Artemis)

– anotación manual: cura de los datos

• una persona (curador) revisa la anotación, gen por gen, verificando laanotación automática, agregando anotaciones manuales, corriendoeventualmente algún programa particular

Qué herramientas se usan?

• Oakridge Genome Annotation Channel



177177 /39/39

– http://compbio.ornl.gov/channel

• ENSEMBL – http://ensembl.ebi.ac.uk

• Artemis – http://www.sanger.ac.uk/Software/Artemis

• GeneQuiz – http://www.sander.ebi.ac.uk/genequiz

• Genome browsers: varios – cada consorcio/proyecto desarrolló el suyo: Apollo (FlyBase,

Drosophila), AceDB (C. elegans),

Anotación: fuentes de error

• Transferencia transitiva de anotaciones



178178 /39/39

– gen1 mal anotado como ‘casein kinase’ presente en los bancos de

datos – gen2 con alta similitud con gen1, resulta anotado como casein

kinase

• Solución: – usar bases de datos curadas: por ejemplo Swissprot

– revisar la anotación de más de un hit

– verificar que las anotaciones de todos los hits concuerden

Anotación confiable: proyecto HAMAP



179179 /39/39

• High-quality Automated Microbial Annotation ofProteomes– Swissprot (Swiss Bioinformatics Institute-European

Bioinformatics Institute)

– CNRS Lyon

– INRIA Grenoble– INRA Toulouse

– CNRS Marseille

– Pasteur Institute

HAMAP

• Hay muchos genomas bacterianos terminados, pero va a haber



180180 /39/39

muchos más en los próximos años

• El número de proteínas bacterianas proveniente de estosgenomas llegará al millón muy rápidamente

•Pero el análisis funcional y una caracterización detallada van aexsitir sólo en unos pocos casos:

– todas las proteínas de organismos modelo (E. coli, B.

subtilis)

– proteínas involucradas en patogénesis (interés médico e

industrial)– proteínas involucradas en vías metabólicas específicas

(interés biotecnológico)

Prioridades del proyecto HAMAP

• Anotación de proteínas huérfanas

ó í



181181 /39/39

• Pre-anotación de proteínas pertenecientes a familias

grandes/complejas (transportadores ABC, HTH, sistemasde dos componentes, SDH)

• Anotación de alta calidad de proteínas pertenecientes afamilias bien caracterizadas

• Anotación manual de proteínas caracterizadasexperimentalmente en ese organismo

• Anotación manual de proteínas no caracterizadas quemuestren similitud con otras proteínas

Estrategia HAMAP



182182 /39/39

ORFans

HAMAP: ORFans

• No tienen similitud con otras proteínas (excepto tal vezotras proteínas de organismos muy cercanos)



183183 /39/39

otras proteínas de organismos muy cercanos)

• No tienen hits contra InterPro (Prosite, PRINTS, Pfam,ProDom, SMART)

• Qué se hace:– Predicción de señales

– Predicción de regiones trans-membrana

– Predicción de coiled-coils

– Anotación de repeticiones

HAMAP: ORFan antes



184184 /39/39

HAMAP: ORFan después



185185 /39/39

HAMAP: large/complex families



186186 /39/39

HAMAP: anotación automática

• Transferencia automática de anotaciónUsando reglas específicas para cada famila de proteínas



187187 /39/39

– Usando reglas específicas para cada famila de proteínas

– Usando reglas específicas para un organismo particular

• La transferencia de anotación puede ir acompañada deadvertencias para el curador

– Por ejemplo:• WARNING: this genome contains MF_00031 (ruvA) but not MF_00016

(ruvB)

HAMAP: ejemplo reglas



188188 /39/39

HAMAP: Escherichia coli

• De acuerdo al análisis original: 4286 proteínas



189189 /39/39

– 60 proteínas no detectadas (casi todas < 100 aa)

– 120 muy probablemente no existan

– 50 pares o tripletes de ORFs tuvieron que ser fusionados

– 719 con errores en la asignación del codón de inicio

– ~1800 todavía sin caracterización bioquímica (aproximadamenteuna asignación funcional por semana)

Chromosome browsers• UCSC Genome Browser

– provee un display rápido de cualquier región genómica



190190 /39/39

provee un display rápido de cualquier región genómica

– con varios “tracks” de anotación alineados al genoma – Por el momento sólo: Human & Mouse

• Annotation tracks – genes conocidos (RefSeq, GenBank)

– predicted genes (Genscan, FGENESH, GeneID, Acembly) – spliced ESTs

– CpG islands

– assembly gaps

– cobertura

– bandas cromosómicas

– elementos repetitivos

– etc



191191 /39/39

UCSC Genome browser • UCSC sólo genera la mitad de los tracks

• El resto proviene de la comunidad biomédica



192192 /39/39

El resto proviene de la comunidad biomédica

• El Genome Browser es una herramienta de visualización

• No saca conclusiones! Simplemente integra en formagráfica toda la información que posee sobre una región,

dejando la exploración y la interpretación al usuario.

UCSC Genome Browser: gene expression



193193 /39/39

splicing



194194 /39/39

transcription



195195 /39/39

UCSC Genoma browser: user tracks• Ustedes pueden agregar sus propios tracks

• Pueden ser públicos o privados



196196 /39/39

Pueden ser públicos o privados

• No necesitan saber programar • Tienen que proveer información en formato GFF (u otros

similares: GTF, BED)

chrom start end [name strand score]

chr1 1302347 1302357 SP1 + 800

chr1 1504778 1504787 SP2 – 980

Acknowledgements• Nicola Mulder, EBI

• Daniel Lawson Sanger Centre



197197 /39/39

• Daniel Lawson, Sanger Centre



198198 /39/39

2004

BioinformáticaHerramientas y aplicaciones

Fernán Agüero


Universidad Nacional de General San Martín

Entender la información genética• La información genética es redundante

• La información estructural es redundante



199199 /39/39

La información estructural es redundante

• Un gen, muchas funciones

• La información genética es unidimensional, pero la funcióndepende de la estructura tridimensional

• El reemplazo de 40% de los residuos de una proteína no

afectan la función

u erram en as provee a compu ac ncientífica

• Machine Learning (inteligencia artificial, aprendizajeautomático)



200200 /39/39

)

– Distintos métodos ‘entrenables’ para reconocer o aprender disintascosas:

• Neural Networks

• Markov Models and Hidden Markov Models

• Nearest neighbor • Otros

– Predicción en proteínas

• SignalP, Net-O-Glyc, TMHMM, TmPred, PSORT

– Gene finding, Gene prediction

• Genscan, Glimmer, GeneMark, FGENESH

– Predicción de estructura secundaria

• nnpredict, PHDSec,

Qué herramientas provee la computación• Bases de datos

– Organizar datos de manera eficiente

– Posibilidad de realizar consultas complejas integrando y cruzando datos



201201 /39/39

Posibilidad de realizar consultas complejas, integrando y cruzando datos.

• Entrez, SRS, FlyBase• Oracle, Sybase, MySQL, PostgreSQL

• Teoría de la información – Medir la cantidad de información (en bits)

– Incertidumbre

• Sequence Logos

• Algoritmos – Métodos para tratar con distintos tipos de problemas

– Una vez que se aprende como solucionar un problema particular, la solución segeneraliza a toda una clase de problemas similares

• Dynamic programming Qué problema resuelve este algoritmo? El problema de encontrar elmejor camino entre muchos posibles.

• utilizado en métodos de alineamiento de secuencias (Smith-Waterman, Needleman-Wunsch,BLAST, FASTA), en métodos de predicción de genes, en ruteo de llamadas telefónicas através de distintas centrales, etc.

Bases de datos: conceptos básicosQué es una base de datos? Una colección de datos

Có l i l d t ? D i ió d l i Di ñ d l



202202 /39/39

Cómo colecciono los datos? Decisión del usuario. Diseño de la

base de datos.

Procesador de texto? (Word) Si. Permite sólo búsqueda y

ordenamiento simples.

Planilla de Cálculo? (Excel) También. Como los datos están encolumnas independientes, se puedeordenar en formas más complejas.Las búsquedas siguen siendo

simples.

Puedo usar:

Un sistema de manejo de base de datos

(Database Management System, DMS)

Ideal. Permite representar los datosen formas complejas. Flexible parareordenar y buscar con distintoscriterios

Un experimento bioinformático• Un experimento en la computadora no es distinto de cualquier

experimento en la mesada: – los resultados deben contestar una pregunta concreta

– deben ser reproducibles por otra persona que utilice el mismo método



203203 /39/39

• Identificar el problema – cuál es el mecanismo catalítico de la enzima X?

• Identificar las herramientas necesarias para resolver el problema – búsquedas de secuencias similares, alineamientos múltiples, detección de

profiles y motivos, modelado de la estructura tridimensional, evaluación delmodelo

• Definir criterios de satisfacción (éxito del experimento) – Prácticamente todos los métodos computacionales producen resultados. Una

búsqueda utilizando BLAST casi siempre produce algún hit

– Es necesario distinguir resultados significativos del ruido para no terminar comparando superoxido dismutasas con alcohol dehidrogenasas.

– Hay que entender cómo funcionan los programas, en qué algoritmos estánbasados, que puntos débiles tienen, etc.

Un experimento bioinformático …• Seleccionar el set de datos apropiados

– En el laboratorio, los materiales y reactivos son objetos físicos necesariosli i t G l t b d f



204204 /39/39

para realizar un experimento. Generalmente uno sabe cuando fueron

preparados, quien los preparo, como fueron preparados, etc.

– En bioinformática el mismo tipo de información es esencial. Las fuentes deinformación (bases de datos, por ej), fecha de ultima actualizacion, elcrtiterio y el metodo utilizado para extraer los datos que van a ser utilizadosen el experimento

El costo de un proyecto bioinformático es bajo

una vez que cubierto el gasto inicial en computadoras(y eventualmente software)

Un ejemplo concreto• Un investigador interesado en estudiar genes en involucrados en la interacción

hospedador-parásito, con especial interés en identificar aquellos productos que seansecretados



205205 /39/39

• Un sitio web reporta los resultados de un análisis sistemático de expresión (usandomicroarrays) de todos los genes del genoma en todos los estadíos del ciclo de vida delparásito

• El investigador puede bajar un archivo con un resumen de estos experimentos

• Las secuencias de todas las proteínas codificadas por el genoma se encuentrandisponibles en una base de datos.

• Lo que se necesita es contar con la capacidad de identificar genes que se expresen enlos estadíos del ciclo de vida que ocurren en el hospedador y extraer las secuencias deestos genes de la base de datos

• En ultima instancia el objetivo es analizar las secuencias de interés usando SignalP parapredecir la posible presencia de un péptido señal

Cuestiones a tener en cuenta:• Podemos hacer el trabajo ‘a mano’

– Abrimos el resumen con los datos de los experimentos con microarrays en unprocesador de texto



206206 /39/39

– buscamos los genes que muestran expresión en el estadio de interés – Construimos una lista de genes (accession numbers)

– Luego vamos a nuestra base de datos con secuencias genómicas y sus traduccionesy buscamos una por una las secuencias

– El ultimo paso es pasar todas las secuencias a un formato que entienda SignalP yingresarlas una por una en el formulario correspondiente.

• Hay tres problemas evidentes: – Si el número de genes que se expresan en nuestro estadio de interes es más que

‘unos cuantos’ el trabajo se vuelve tedioso y más que nada lento por el tiempo queinsume

– Peor aun, cada vez que aparezcan nuevos resultados de microarrays o seactualicen, hay que repetir todo el procedimiento

– El proceso de abrir el resumen con datos de microarrays (o la base de datos degenes) en un procesador de textos puede no ser factible si el tamaño de los archivosexcede los 5 o 10 MB

Programación en biología• Cualquier persona que tenga experiencia en el diseño y llevado a cabo de

experimentos para responder una pregunta puede programar una computadora



207207 /39/39

• Un experimento en el laboratorio comienza con una pregunta que evolucionahacia una hipótesis testeable

• Finalmente el experimento sirve para afirmar o descartar una afirmación

• En la computadora el programa que uno escriba debe estar diseñado demanera de producir resultados que respondan a este tipo de afirmaciones

• Aprender un lenguaje de programación puede resultar un desafío no trivial,pero es similar a aprender a utilizar una nueva herramienta, tecnología u otrolenguaje (inglés, francés)

Programación en biología• Ejemplos simples:

– automatizar tareas



208208 /39/39

– identificar una o más tareas que uno quiere realizar

– escribir un programa que las realice en forma automática

• Analizar todas las proteínas de un genoma y seleccionar aquellas quesean (o parezcan) proteinasas

– Un archivo con todas las secuencias – Una base de datos de proteinas (Swissprot, GenPept)

– Un programa para buscar secuencias similares en bases de datos (BLAST)

– Una serie de instrucciones a seguir (un protocolo)

Automatizar búsquedas con BLAST

Secuencias



209209 /39/39

BLAST

Significativo?

Es una proteinasa? Guardar

NO

NO

SI

SI

Automatizar BLAST• Muy lindo el diagrama, pero: cómo se hace?



210210 /39/39

• Por cada secuencia de una lista de secuencias hay que: – correr la comparación (BLAST) contra una base de datos

– analizar el reporte que genera el programa y extraer dos tipos dedatos:

• score, expect, identidad, similitud (algún criterio cuantitativo que mesirva para tomar una decisión)

• descripción de la secuencia obtenida de la base de datos

>gi|32172429|sp|P25807|CYS1_CAEEL Gut-specific cysteine proteinase precursor>gi|32172419|sp|P07268|PRZN_SERSP Serralysin precursor (Extracellular metallo proteinase) (Zinc proteinase)

Programación• Todo lenguaje de programación provee construcciones para

tomar decisiones: – if A then do B, else do C



211211 /39/39

– if A > 100 then continue else exit

• Algunos lenguajes de programación proveen métodos paraejecutar otros programas

– salir al sistema operativo, ejecutar el programa X y tomar el output – blast secuencia vs swissprot

– system( “blast -i secuencia -d swissprot” )

• Lo más dificil: analizar el output y tomar los datos de interés

– para poder tomar decisiones (hacer comparaciones) tenemos quetener los datos en variables

Reportes de BLAST• Un reporte de BLAST tal como aparece en un navegador o al

ejecutar el programa en la línea de comando (Unix) esbasicamente un archivo de texto (un archivo plano o flatfile)



212212 /39/39

basicamente un archivo de texto (un archivo plano o flatfile)

• Ningun reporte es igual a otro. Sin embargo hay patronessimilares (la apariencia de hecho es similar). Tenemos queentrenar a nuestro programa para reconocer patrones:

– la primer linea contiene información sobre el programa

– la quinta línea contiene información sobre la secuencia utilizadapara la búsqueda

– la décima línea contiene información sobre la base de datos

– la línea que comienza con ‘>’ indica el comienzo de la descripciónde un hit

– etc.

Anatomía de un reporte de BLASTHeader



213213 /39/39

Programa$programa = “TBLASTN” $version = “2.2.6”

Query$id = “GROU_DROME”

$accession = “P16371” $descripcion = “Groucho protein …” $longitud = “719”

Base de datos$database = “GenBank non-mouse …” $secuencias = “8104717”

Anatomía de un reporte de BLASTHit List



214214 /39/39

Anatomía de un reporte de BLAST

Subject

High scoring pairs (HSPs)



215215 /39/39

j$gi = “132150256” $gb = “CB923560” $version = “1” $desc = “TcAmaPl03Run01_C08 …” Longitud = “653”

HSP info$score = “58.9” $expect = “7e-10” $identity = “24%” $similarity = “43%” $frame = “+1’

Anatomía de un reporte de BLASTFooter



216216 /39/39

Estadísticas para esta corrida

Base de datosParámetros estadísticosMatrizPenaltiesDetalles sobre lo que hizo el algoritmo

Nuevos formatos• Los reportes estaban diseñados con un usuario (humano) en mente

– Formato no estructurado

– Ideal para lectura



217217 /39/39

Ideal para lectura

• Cada vez más los reportes que producen distintos programas seencuentran en formatos estructurados más fáciles de analizar desde elpunto de vista de la computadora – XML

– ASN.1 – Tabulado

• Estos formatos no son amigables para un humano (no son fáciles deleer)

Representación de la información

flatfiles



218218 /39/39

procesamiento

resultados

Ayer

Representación de la información

flatfiles



219219 /39/39

procesamiento

resultados

DB

Hoy

Analizando un reporte de BLAST• Nuestro programa ya leyó el reporte

• Y almacenó los valores que le pedimos en distintas variables

• Ahora podemos hacerle hacer lo que querramos:



220220 /39/39

Ahora podemos hacerle hacer lo que querramos:

– (en pseudocódigo):

• if $score < 100 { read next report }

else { print $accession }

• if $description =~ “proteinase” { print $accession} else { read nextreport }

• if $score < 100 AND $description =~ “proteinase”

{ print $accession }

else { read next report }

Módulos de software reusables• Resumiendo:

– nuestro programa tiene que poder leer el reporte (FACIL)

– identificar dentro del reporte distintos elementos y almacenarlos en



221221 /39/39

p y

variables (MAS COMPLICADO) – tomar decisiones en base a los valores contenidos en las variables y

realizar acciones (imprimir algo en pantalla, almacenar datos en un archivo,base de datos, etc.) (Criterio del usuario)

• El criterio del usuario es lo que va a hacer que el programa sirva paraun fin u otro

• Es evidente que los pasos 1 y 2 van a ser necesarios para cualquier programas que intenten procesar reportes de BLAST – solo hay que programarlos una vez

– modulos reusables (subrutinas)

Bibliotecas de modulos reusables• Perl, Python, Java, C

– en general todos los lenguajes proveen bibliotecas de módulos reusables

– el módulo contiene código que realiza ciertas operaciones



222222 /39/39

g q p

– no es necesario saber como funciona internamente el módulo para poder usarlo

– solo necesitamos saber que datos necesita (por ejemplo: una secuencia) yque resultados produce (un valor: 135, una respuesta: SI/NO)

•En el caso de aplicaciones biológicas – BioPerl

– BioPython

– BioJava

– Otros

Pipelines• Qué es un pipeline?

– Una línea automatizada de análisis



223223 /39/39

Seq

BLAST Pfam TMHMM SignalP etc

Base de datos

CGI

Web Page

IntegraciónY

Visualización

Almacenamiento

Fábrica de resultados

Pipelines: ejemplos• Sistemas de anotación automática de genomas

– Ensembl - http://www.ensembl.org

http://www.ensembl.org/

http://www.ensembl.org/



224224 /39/39

– UCSC Genome Browser - http://genome.ucsc.edu

– ORNL Genome Channel - http://compbio.ornl.gov/channel

– HAMAP - http://us.expasy.org/sprot/hamap

Estrategia HAMAP

http://genome.ucsc.edu/

http://compbio.ornl.gov/channel

http://us.expasy.org/sprot/hamap


http://compbio.ornl.gov/channel

http://genome.ucsc.edu/




225225 /39/39

ORFans









226226 /39/39







227227 /39/39







228228 /39/39

Consideraciones prácticas• La bioinformática es más barata que el trabajo en el laboratorio

• El equipamiento es significativamente más barato que el de un laboratorio debiología molecular













229229 /39/39

• Los materiales (programas) y reactivos (datos) son en general gratuitos ylibremente accesibles

• Almacenamiento – La cantidad y tipos de bases de datos que se planean instalar (ejemplo: GenBank actualmente

requiere 120 GB)

– La cantidad y tipo de datos que se planean generar

• Memoria y Procesador – Los requerimientos de los distintos métodos

– BLAST es principalmente memoria-intensivo

– HMMER es principalmente procesador-intensivo

Consideraciones prácticas• Backup

– CD

– Cinta

– Un segundo disco


































230230 /39/39

• Software – Sistema operativo: unix

– Paquetes: BLAST, FASTA, etc

– Software de manejo de bases de datos: MySQL, PostgreSQL

– Lenguajes de proramación: Perl, Java, Python, C, C++

• Para un laboratorio chico una PC con un disco un poco más grande yun poco más de memoria que lo común pueden ser suficientes

Con respecto a la protozoología• Los genomas de varios protozoarios están terminados o cerca de

estarlo – Plasmodium falciparum, berghei, chabaudi, knowlesi


























231231 /39/39

– Toxoplasma gondii – Trypanosomatidos (T. cruzi , T. brucei , L. major )

• Algunos otros se encuentran en distintos estados – Entamoeba hystolytica

– Theileria annulata

– Babesia bovis – Eimeria tenella

• En algunos casos hay proyectos post-genómicos en curso o reciéncomenzando – Proteomics

– Microarrays

– RNAi

Bibliografía sugerida• Developing Bionformatics Computer Skills

– O’Reilly & Associates









































232232 /39/39

• Bioinformatics. Sequence and genome analysis.

– CSHL Press

• Bioinformatics, a practical guide to the analysis of genes and proteins

– Wiley InterScience















233233 /39/39







234234 /39/39

Búsqueda en bases de datos

Similitud, homología.

Métodos heurísticos.










235235 /39/39

Búsqueda en bases de datos

Perspectiva general

Búsqueda en BD frente al alineamiento desecuencias• Una de las aplicaciones más conocidas es buscar [nuevas] secuencias

en una BD.

• Esto suele hacerse alineando la secuencia contra todas las de la BD.
















236236 /39/39

– Proceso parecido al alineamiento por parejas. – Objetivos distintos: interesa más la puntuación que el alineamiento en si.

– Los parámetros que mejor distingan entre secuencias relacionadas y lasque no lo están no son necesariamente los mismos que proporcionan elmejor alineamiento.

Búsqueda en BD y predicción de la función deuna proteína o un gen• La búsqueda de secuencias en bases de datos puede verse como un

proceso de descubrimiento científico en el que.

– Se utiliza la información acumulada.
























237237 /39/39

– Para descubrir propiedades de nuevas secuencias.

• Obviamente como en toda investigación.

– Es preciso proceder con meticulosidad y racionalidad.

– Un proceso incorrecto o descuidado puede llevar a conclusiones erróneas oa omitir hallazgos.

¿Puede predecirse la función de una proteínao un gen?• La evolución es un proceso conservativo

– Cambian los residuos en una secuencia

– Pero se conservan las propiedades bioquímicas y los procesos
























238238 /39/39

fisiológicos

• Si somos capaces de encontrar en la BD secuenciashomólogas a la secuencia problema concluimos que lanueva secuencia “debe de tener” propiedades similares a la

secuencia conocida

Homología y similitud• Para inferir las propiedades de una nueva secuencia

precisamos de secuencias homólogas a ésta.

•




















239239 /39/39

Sin embargo la homología no es observable, solo la similitud.• Debemos pues determinar… – Cual es la mejor forma de medir la similitud.

– Como determinar si de la similitud observada puede inferirse lahomología.
















240240 /39/39

Fuentes de información para la búsquedaen bases de datos

Fuentes de información• La búsqueda en BD se fundamenta en tres tipos distintos de

fuentes de información [conocimiento previo].













241241 /39/39

– El sistema de puntuación con el que se cuantifica el grado desimilitud.

– El algoritmo utilizado para realizar las comparaciones.

– La base de datos en donde se realiza la búsqueda.

El sistema de puntuación• La similitud se cuantifica con matrices de sustitución (PAM,

BLOSUM, etc…).

•



















242242 /39/39

Se han obtenido analizando sustituciones conocidas de unos AA por otros entre secuencias con grados distintos dedivergencia y conservación de función. – Siempre es mejor usar una matriz adecuada que suponer

sustituciones equiprobables.

–Distintos grados de divergencia requieren distintas matrices depuntuación.

El algoritmo de búsqueda• Cada algoritmo (S-W, FASTA, Blast).

– Aprovecha de forma distinta la información.

– Imponiendo restricciones distintas sobre el modelo evolutivo.
























243243 /39/39

• SW: pocas restricciones. – Muy sensitivo pero poco selectivo.

– Lento.

• FASTA/Blast: restricciones heurísticas. – Pueden resultar en menor sensibilidad.

– Más selectivos y mucho más veloces.

La base de datos• Es la fuente más evidente de conocimiento preexistente.

• Una búsqueda adecuada en BD puede ahorrar muchas
























244244 /39/39

horas de trabajo en el laboratorio.

Suposiciones en que se basala búsqueda en las BD• La búsqueda en BD presupone que…

– Las secuencias buscadas tienen ancestros comunes con lasecuencia problema.















245245 /39/39

– El camino evolutivo más adecuado es el que presupone un menor número de cambios.

• No todas las sustituciones son igualmente probables: Debemos usar matrices de sustitución que las ponderen adecuadamente.

• Las inserciones y eliminaciones son menos probables que lassustituciones

En la práctica …• La elección del algoritmo de búsqueda influye en

– La sensibilidad y

– La especificidad























246246 /39/39

de la búsqueda.

• La elección de la matriz de similitud determina el patrón y lacantidad supuesta de sustituciones en las secuencias que seespera descubrir en la búsqueda.












247247 /39/39

Sensibilidad y especificidad

Exitos y fracasos en la búsqueda

• Supongamos que conociéramos TODAS las coincidencias entre una

i bl b d d t












248248 /39/39

secuencia problema y una base de datos.• En este caso podríamos distinguir si, dada una coincidencia, ésta es

cierta o falsa.

• Esto nos lleva a distinguir entre.

– Positivos verdaderos (True positives TP).

– Positivos Falsos . (False Positives, FP). – Negativos Verdaderos (True Negatives, TN).

– Negativos Falsos (False Negatives, FN).

Verdaderos/Falsos Positivos/Negativos

Realidad Coincidencia

Ci t

Coincidencia

F l



































249249 /39/39

DetecciónCierta Falsa

Positivo:Se detecta coincidencia

Positivo verdadero Falso positivo

Negativo:

No se detecta lacoincidencia

Falso Negativo Negativo verdadero

Sensibilidad frente aEspecificidad (“Selectividad”)

S ibilid d TP /(TP FN)





















250250 /39/39

• Sensibilidad= TP /(TP+FN)

% de coincidencias bien identificadas

(% positivos entre las coincidencias)

• Especificidad = TP / (TP+FP)

% de positivos correctos

(% de correctos entre los positivos)

El compromiso entresensibilidad y especificidad• Si en una búsqueda colocamos el umbral alto

– Cuesta localizar los positivos Pocos FP – Pero tendremos más falsos negativos

Es decir un umbral alto suele conllevar una baja sensibilidad y una alta

ifi id d





























251251 /39/39

especificidad• AL reves si colocamos un umbral bajo

– Tendremos muchos positivos Tambien más FP – Pero habran menos falsos negativos

Es decir un umbral bajo conlleva una alta sensibilidad y una baja especificidad

• Idealmente:mirar de lograr un equilibrio,

• O en todo caso decidir que error nos interesa más controlar en cadasituación






















252252 /39/39

< 0.05

< 1.00

Low sensitivity,many false

negatives

High selectivity,

few false positives

Highsensitivity,

few false

negatives

L



















253253 /39/39

< 1.00

Lowselectivity,

many false

positives












254254 /39/39

Algoritmos de búsqueda

De la programación dinámica a los métodosheurísticos

Busqueda basada en PD• Una forma razonable de buscar una secuencia en una base

de datos es realizando alineamientos locales de ésta contra

t d l d l b d d t















255255 /39/39

todas las de la base de datos• Algoritmo: Smith-Waterman – Encuentra una solución óptima

– Sólo impone una restricción: Puntuación > 0

– Proporciona la mejor sensibilidad

Inconvenientes de labúsqueda basada en SW• La busqueda basada en PD proporciona una gran

sensibilidad pero – Es poco específica Pocos falsos negativos: Fàcil perder las

“homologías remotas”


























256256 /39/39

homologías remotas – Es necesariamente lenta.

• Alternativa: Métodos heurísticos – Aproximaciones a SW con restricciones que:

• Aumentan la especificidad (aunque baja la sensibilidad)

• Són mucho más rápidas

FASTA• Aproximación a S-W que utiliza dos heurísticas para ir más

rápido a costa de perder sensibilidad

Heurísticas : Restricciones al modelo evolutivo implicito en la
























257257 /39/39

• Heurísticas : Restricciones al modelo evolutivo implicito en lacomparación de secuencias – Tamaño de palabra (Word size)

– Tamaño de ventana (Window size)

Tamaño de palabra en FASTA• La comparación entre secuencias no se realiza residuo a residuo sino

por grupos de residuos,

– 2 residuos en AA.

6 bases en DNA






















258258 /39/39

– 6 bases en DNA.

• A mayor tamaño de palabra menor es la sensibilidad y mayor laespecificidad.

• El efecto de variar el tamaño de palabra se muestra en los dot-plots: Amayor tamaño menor numero de coincidencias.

Tamaño de palabra=1• Ruidoso

• Es dificillocalizatr las

zonas de






















259259 /39/39

zonas desimilitud

Tamaño de palabra=2

• Se ven las

regiones













260260 /39/39

regionescandidatas

• Aunque se pierdenalgunascoincidencias

Tamaño de palabra=3• Sin ruído pero

• Apenas sincoincidencias



















261261 /39/39

BLAST

• Aproximación similar a la anterior basada en aparear fragmentos

cortos que irá extendiendo para buscar alineamientos locales











262262 /39/39

cortos que irá extendiendo para buscar alineamientos locales• Utiliza un modelo estadístico para encontrar los mejores

alineamientos entre la secuencia desconocida y la BD

• HSP: High-scoring Segment Pair

– La unidad fundamental de trabajo con BLAST

– Corresponde a una región de máxima similitud entre dossubsecuencias (palabras, W ) con una puntuación más grande o igual auna puntuación umbral, T

BLAST: Algoritmo

1. Compilar todas las palabras de medida n que den una puntuación

superior al umbral (HSP)




























263263 /39/39

superior al umbral (HSP)2. Comparar estas palabras con las de la BD para identificar las

identidades exactas (“hits”)

3. Extender las palabras que han superado el umbral, en las dosdirecciones mirando de mejorar la puntuación

– La extensión acabará si baja la puntuación por debajo de otro umbral,si llega a cero o si se acaba la secuencia

1. Listar los segmentos extendidos de puntuación más alta

Algoritmo de BLAST (1)

















264264 /39/39









265265 /39/39









266266 /39/39







267267 /39/39

5. Significación de los resultados

E-values, p-values y bit-scores• Dado que los programas de búsqueda heurística tan sólo

encuentran coincidencias aproximadas conviene poder cuantificar cuan aproximadas son

E t h di t di ti t t dí ti















268268 /39/39

• Esto se hace mediante distintos estadísticos – E-value

– P-value

– Bit-scores

E-values

• Dado un High Scoring Pair el E-value es el número esperado de

puntuaciones iguales o superiores a las del HSP dado

• Un E-value de 10 para una coincidencia significa, que, en una base de datos






















269269 /39/39

Un E value de 10 para una coincidencia significa, que, en una base de datosdel mismo tamaño en la que se ha realizado la búsqueda, se podría esperar encontrar hasta 10 coincidencias con la misma puntuación o similar,simplemente por azar

• El E- value es la medida de corte más utilizada en las búsquedas en basesde datos. Sólo se informa de las coincidencias que superan un nivel mínimo

• El E-value oscila entre 0 y cualquier valor

P-values• Refleja la probabilidad de obtener por azar una puntuación superior o

igual a la observada

• Se relaciona con el E-value en que: P=1-e-E

• Un P-valor de 0 03 significa que hay una probabilidad (>=) 3% det t ió i l b d i l t



























270270 /39/39

Un P valor de 0.03 significa que hay una probabilidad ( ) 3% deencontrar una puntuación superior a la observada simplemente por azar

• Si E<0,01 Los P-valores y los E-valores son similares

• Los p-valores oscilan entre 0 y 1

Bit scores• El valor de la puntuaciones obtenidas por un emparejamiento

carecen de sentido si no se tiene en cuenta el tamaño de labase de datos y el sistema de puntuación

L Bit li l t i
























271271 /39/39

• Los Bit-scores normalizan las puntuaciones paraindependizarlas de ambos factores de forma que podamoscompararlas













272272 /39/39

Score E-Value

< 0.05









273273 /39/39

< 1.00









274274 /39/39







275275 /39/39

Bases de datos

Tipos de bases de datos• Primarias

– Principales depósitos de información. Datos de secuencia oestructura. Pueden contener datos adicionales.














276276 /39/39

• Derivadas – Preparadas a partir de primarias. Información adicional procesada

manual o automáticamente

Bases de datos biológicas

• Primarias

– Información suministrada por trabajo experimentalL i tit ió t i l i f ió ñ d d










http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/34/suppl_1/D3/DC1











277277 /39/39

– La institución receptora organiza la información per o no añade nada

• Ejemplo EMBL/GenBank

• Derivadas

– Anotadas a posteriori

• Los datos son revisados, corregidos y se añade información bibliográfica• Ejemplo SWISS-PROT

– Derivadas computacionalmente

• Ejemplo PFAM

– Combinaciones específicas

Molecular Database Collection 2006 update

Principales Tipos de Búsqueda• Acceso directo a la base de datos

– Normalmente se obtiene una información más elaborada

•Sistemas de búsqueda global – SRS, NCBI Entrez


































278278 /39/39

q gSRS, NCBI Entrez – Automatizado, uniforme. Permite una visión global de la información (varias

BD simultáneamente)

• Acceso programático (bioXXX, servicios Web, taverna)

Bases de datos de secuencia

• Contienen todas las secuencias obtenidasexperimentalmente



279279 /39/39

Contienen todas las secuencias obtenidasexperimentalmente – DNA genómico

– cDNA, RNA

– EST

– Proyectos genoma (HTS) – Proteína

– ...

Origen de la información• Trabajo individual de investigación

– Produce información de gran calidad en cantidades muy limitadas

• Secuenciaciones masivas: EST HTS proyectos genoma



280280 /39/39

• Secuenciaciones masivas: EST, HTS, proyectos genoma. – Producen mucha información de una calidad inferior, en algunos

casos dudosa.

Principales repositorios• DNA/RNA

– (EMBL, Genbank, DDBJ), RefSeq

• Proteína



281281 /39/39

• Proteína – Uniprot (Swissprot/TrEMBL), PIR



282282 /39/39



283283 /39/39



284284 /39/39



285285 /39/39

TEXT

http://var/www/apps/conversion/current/tmp/scratch27403/TKGenBank.txt




286286 /39/39







287287 /39/39







288288 /39/39

Anotaciones








289289 /39/39

Traducción

http://www.expasy.org






http://www.expasy.org/






290290 /39/39

Información cruzada

• La mayoría de archivos de bases de datos incluyenenlaces a otras bases de datos











291291 /39/39

– Secuencia DNA Secuencia proteína

– Secuencia Estructura 3D

– Secuencia Datos bibliográficos

– ....















292292 /39/39







293293 /39/39







294294 /39/39







295295 /39/39

Busqueda integrada. SRS








296296 /39/39







297297 /39/39

Búsqueda integrada. Entrez








298298 /39/39http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/datamodel/index.html

Uniprot ID PDB ID getHeadersfromPDBId PDBTextString

Acceso prog. Web Services





http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/datamodel/index.html

















299299 /39/39

Output

ServiceInput/output

AAS: AminoAcidSeq

getAASfromUniprot getAASfromPDBId

getAASfromPDBText

getPDBFilefromPDBId

AAS PDBText

BLASTText

PMUTTextPHDText

StringtoAAS

runPSIBlastfromAAS

runPHDfromBlastText runPMUTHSfromBlastText

FSOLVText

runFSOLVfromPDBText

Notas de prudencia• Las bases de datos pueden contener errores

• Distintas versiones (“releases”) pueden contener diferencias

significativas





























• Todos los grupos bioinformáticos publican bases de datos, no existecontrol




Documents

Class 70 Sequence Alignment