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Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha Phoneutria nigriventer Orientador: Prof. Dr. Evanguedes Kalapothakis Dep to de Farmacologia - ICB - UFMG Daniel C. Carvalho(IC), Marco A. Romano-Silva, Marco A. M.Prado, Marcus V. Gomez, Vania F. Prado e Evanguedes Kalapothakis

Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha Phoneutria nigriventer

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Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha Phoneutria nigriventer. Daniel C. Carvalho(IC), Marco A. Romano-Silva, Marco A. M.Prado, Marcus V. Gomez, Vania F. Prado e Evanguedes Kalapothakis. Orientador: Prof. Dr. Evanguedes Kalapothakis - PowerPoint PPT Presentation

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Page 1: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha Phoneutria nigriventer

Orientador: Prof. Dr. Evanguedes Kalapothakis

Depto de Farmacologia - ICB - UFMG

Daniel C. Carvalho(IC), Marco A. Romano-Silva, Marco A. M.Prado, Marcus V. Gomez, Vania F. Prado e

Evanguedes Kalapothakis

Page 2: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

Aranha armadeira Phoneutria nigriventer

Page 3: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

Efeitos decorrentes da inoculação subcutânea do veneno de P. nigriventer:

• Dor forte;• Cãibras dolorosas;• Tremores;• Sudorese; • Hipersecreção salivar;• Priaprismo;• Convulsões tônica;• Morte.• Efeitos semelhantes observados em seres humanos decorrente da picada da aranha.

Page 4: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

Canal de sódio onde estão indicados sítos de ligação para Toxinas

Page 5: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

(Rezende et al., 1991)

Veneno

PhTx1 PhTx2 PhTx3

Tx1 Tx2-1 Tx2-2 Tx2-3 Tx3-1 Tx3-2 Tx3-3

Tx2-4 Tx2-5 Tx2-6 Tx3-4 Tx3-5

Tx3-5

Tx2-7 Tx2-8 Tx2-9

(Diniz et al., 1990)

(Cordeiro et al., 1992)

(Cordeiro et al., 1992)

Page 6: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

Tx1 AELTSCFPVGHE-CDGDASNCNCCGDDVY----CGCGWGRWN----CKCKVADQSYAYGICKDKVNC

Tx2-1 ATCAGQDKP-CKET---CDCCGERGE----CVCALSYEGKYR-CICRQGNFLIAWHKLASCKTx2-5 ATCAGQDQT-CKVT---CDCCGERGE----CVCGGP-------CICRQGNFLIAAYKLASCKCKTx2-6 ATCAGQDQP-CKET---CDCCGERGE----CVCGGP-------CICRQGYFWIAWYKLANCKKTx2-9 SFCIP-FKP-CKSDEN---CCKKFK-----CK-TTGIVK-----LCRW

Tx3-1 AECAA-VYERCGKGYKR--CC-EERP----CKCNIVMDN----CTCKKFISETx3-2 ACAG-LYKKCGKGASP--CC-EDRP----CKCDLAMGN----CICKTx3-3 GCAN-AYKSC-NGPHT--CCWGYNGYKKACICSG?NWKTx3-4 SCIN-VGDFC-DGKKD--CCQCDRDNAF-CSCSVIFGYKTN-CRCETx3-5 GCIG-RNESCKFDRHG--CCWPW-----CCSCCKCGQPESDVGTx3-6 ACIP-RGEICTDD---CECCGCDNQ----CYCPPGSSLGIFKCSCAHANKYFCNRKKECKKA

Sequência de aminoácidos das toxinas da aranha Phoneutria nigriventer:

Page 7: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

Objetivo

•Identificar e clonar neurotoxinas da glândula de veneno da aranha Phoneutria nigriventer relacionadas a fração PHTx2.• Subclonar as toxinas em vetores de expressão procariotos e eucariotos (pMAL).•Estudar o efeito de cada toxina recombinate.

Page 8: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

Pn2-5A aggagagaactaattctctctctctcctcgtgccgaattcggaagtgcaat aggagagaactaatt ttgggaa

t t c g c t c a c g

Sonda Radiotiva

t t c g c t c g c g

DNA polimerase

Page 9: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

Pré-hibrização Hibridização

Dot Blot - Biblioteca de cDNA

Pré-hibrização Hibridização

Sonda radioativa Pn2-5A cDNA

Page 10: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

Dot Blot controle

Controle Positivo

Controle positivo

Page 11: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

Dot Blot da Biblioteca de cDNA

sonda Pn2-5A

Page 12: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

B11-1 bcacgagtgtggacatatctcgatacaactcagaPn2-5A aggagagaactaattctctctctctcctcgtgccgaattcggaagtgcaat

B11-1 ATG AAA GTT GCA ATC CTC TTC CTC TCT ATT TTG GTG CTT GCT GTT GCA AGT GAA TCC ATT Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

B11-1 GAA GAA TCC CGT GAT GAT TTT GCT GTA GAA GAA CTG GAG AGA GCC ACA TGC GCT GGC CAA Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..T ... ... ... ..T ...

B11-1 GAC CAG CCC TGC AAA GAA ACT TGC GAC TGC TGT GGA GAG AAA GGA GAA TGT GTT TGC GGA Pn2-5A ... ... A.. ... ..G .T. ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ..T ..A

B11-1 GGA CCT TGC ATT TGC AGG CAA GGC TAC TTT TGG ATA GCA TGG TAT AAA CTT GCT AGC TGT Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ...

B11-1 AAG AAA tga-atggatttatgtattccacgatataataaatattgttgcatttgaaaaaaaaaaaaaaaaaa

Pn2-5A/Pn2-5B

Pn2-5a ... ... ... t..............a...g...............a..........................

Page 13: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

10 20 30 40 50 60* * * * * * * * * * * * *

AM 848 ATG AAA GTC GCA ATC CTC ATC CTC TCT ATT TTG GTG CTT GCT GTT GCA AGT GAA ACC ATT GAA GAA TAC CGT GAC GAT TTT GTT GTA GAA GAA TTGB11-1 ... ... ..T ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... .C. ... ..T ... ... .C. ... ... ... C..B11-128 ... ... ..T ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... .C. ... ..T ... ... N.. ... ... ... C..AM 871 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ...B9-171 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .C. ... ... ... ...

B3-197 ... ... ... ... ... ... ... ... ... N.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .C. ..N T.. ... ... B9-09 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .C. ... ... N.. ...B9-80 ... ... ... S.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .C ... ... ... ...B9-34 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... T.N T.. ... ...

70 80 90 100 110 120 130* * * * * * * * * * * * *

AM 848 GAG AGA GCC ACA TGC GCT GGC CAA GAC CAG CCC TGC AAA GAA ACT TGC GAC TGC TGT GGA GAG AGA GGA GAA TGT GTT TGC GGA GGA CCT TGC ATTB11-1 ... ... ... ... ... XB. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...B11-128 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...AM871 ..N ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... N.. ... ... ... .N. ... .N. A.A .N. ... N.. ... ... ... ... ... ... ... ...B9-171 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...B3-197 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...B9-09 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... N.. ... ... ... ... ... ... N.N .N. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...B9-80 ... ... ... ... ... STN ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...B9-34 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... N.. ... ... ... ... ...

140 150 160 170 180 190 * * * * * * * * * * * * *

AM848 TGC AGG CAA GGC TAC TTT TGG ATA GCA TGG TAT AAA CTT GCT AAC TGT AAA AAA TGA TAT GGA TTT ATG TAT B11-1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. .G. ..G ... ... ... ... ... ... ... B11-128... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... AM871 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .N. ... ... ... ... ... B9-171 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..G .H. ... ... ... ... ... ... B3-197 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..G ... ... ... ... ... ... ... B9-09 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .N. ... ..N ... ... ... ... ... ... ... B9-80 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..G ... ... .CC ACG ATA TAA TAA B9-34 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..G ... ... ... ... ... ... N..

200 210 220 230 * * * * * * * * AM848 ACC ACG ATA TAA TAA ATA TTA TTG CAT TTG AAA AAA AAA AAA AAA B11-1 ... T.. ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... B11-128 T.. ... ... ... ... ... ..G N.. ... ... AM871 ... ... ... ... ... ... ... ... .N. ... ..G GGG GGG GGG GGG B9-171 T.. ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... B3-197 T.. ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... B9-09 T.. N.. ... ... ... ... ..G ... .N. ... ... .GN NGG ... ... B9-80 ATA TTG TTG C.T .TG .A. AA. AAA A.A AAA ... ... ... ... B9-34 T.. ... ... ... ..N .N. N.G

Page 14: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

PEPTÍDEO SINAL PRÓ-PEPTÍDEO TOXINA MADURA

Tx2-5 ATCAGQDQTCKVTCDCCGERGECVCGGPCICRQGNFLIAAYKLASCKCK*Pn2-5A MKVAILFLSILVLAVA SESIEESRDDFAVEELGR ATCAGQDQTCKVTCDCCGERGECVCGGPCICRQGNFLIAWYKLASCKK*B9-80 MKVXILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEELER ATCXGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK*B9-171 MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKX*B11-1 MKVAILFLSILVLAVA SESIEESRDDFAVEELER ATCXGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK*AM847 MKVAILILSXLVLAVA SETIEEYRDDFAV*ELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK*AM895 MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFVX*ELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVXGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK*

AM896 MKVAILFLSILVLAVA SESIEESRDDFXVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKK* AM848 MKVAILILSXLVLAVA SETIEEYRDDFVVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKK*AM871 MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEXLXR ATCAGQDQPCKXTCDXCXKXGXCVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKKXAM848 MKVAILILSXLVLAVA SETIEEYRDDFVVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKK*

AM872 MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEXLER ATCAGQDQPCKXTCDCCGXXGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLAXCXK*AM1062 MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRGXFAVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWI

Pn4A MKVAIVFLSLLVLAFA SESIEENREEFPVEESAR CADINGACKSDCD---CCGDSVTCDCYWSDSCKCRESNFKIGMAIRKKFCAM1072 MKVAIVFLSLXVLAFA SESIEENREEFPXF*SAR CXDINGACKSDCD---CCGDSVTCDCYWSXSCKCXESNFKIGMAIXKKFX*AM1054 MKVAIVFLSLLVLAFX XESIEENREEFPVEESAR CGDINAACKEEAAIV

Page 15: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

PERSPECTIVAS

Expressão das toxinas recombinantes;

Ensaios farmacológicos e eletrofisiológicos com astoxinas recombinanates.

Clonagem e sequenciamento de novas toxinas

Page 16: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

PCR de colônia bactériana com pMALc2 + B11-1

Page 17: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

Divisão Biologia Celular

Profs.: Dr. Evanguedes Kalapothakis Dr. Luiz A. C. DeMarco

Dr. Marcus V. Gomez Dr. Marco A. M. Prado Dr. Marco A. Romano-Silva

Neurobiologia Molecular

Profa.: Dra. Vania F. Prado

Page 18: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

PCR de colônia bactériana pMAL+ pMALp2

Primers Pn2-5F e Pn2-5R

Page 19: Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha  Phoneutria nigriventer

Pn2-5B bcacgagtgtggacatatctcgatacaactcagaPn2-5A aggagagaactaattctctctctctcctcgtgccgaattcggaagtgcaat

Pn2-5B ATG AAA GTT GCA ATC CTC TTC CTC TCT ATT TTG GTG CTT GCT GTT GCA AGT GAA TCC ATT Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

Pn2-5B GAA GAA TCC CGT GAT GAT TTT GCT GTA GAA GAA CTG GAG AGA GCC ACA TGC GCT GGC CAA Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..T ... ... ... ..T ...

Pn2-5B GAC CAG CCC TGC AAA GAA ACT TGC GAC TGC TGT GGA GAG AAA GGA GAA TGT GTT TGC GGA Pn2-5A ... ... A.. ... ..G .T. ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ..T ..A

Pn2-5B GGA CCT TGC ATT TGC AGG CAA GGC TAC TTT TGG ATA GCA TGG TAT AAA CTT GCT AGC TGT Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ...

Pn2-5b AAG AAA tga-atggatttatgtattccacgatataataaatattgttgcatttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

Pn2-5A/Pn2-5B

Pn2-5a ... ... ... t..............a...g...............a..........................

Sequência de nucleotídeos do cDNA das isoformas Pn2-5a e Pn2-5b. As regiões não trasncritas estãoem azul, a toxina esta destacada em verde e ainda o codon de iniciação, terminação e a região de poliadenilação em vermelho.