Upload
faunus
View
20
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha Phoneutria nigriventer. Daniel C. Carvalho(IC), Marco A. Romano-Silva, Marco A. M.Prado, Marcus V. Gomez, Vania F. Prado e Evanguedes Kalapothakis. Orientador: Prof. Dr. Evanguedes Kalapothakis - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha Phoneutria nigriventer
Orientador: Prof. Dr. Evanguedes Kalapothakis
Depto de Farmacologia - ICB - UFMG
Daniel C. Carvalho(IC), Marco A. Romano-Silva, Marco A. M.Prado, Marcus V. Gomez, Vania F. Prado e
Evanguedes Kalapothakis
Aranha armadeira Phoneutria nigriventer
Efeitos decorrentes da inoculação subcutânea do veneno de P. nigriventer:
• Dor forte;• Cãibras dolorosas;• Tremores;• Sudorese; • Hipersecreção salivar;• Priaprismo;• Convulsões tônica;• Morte.• Efeitos semelhantes observados em seres humanos decorrente da picada da aranha.
Canal de sódio onde estão indicados sítos de ligação para Toxinas
(Rezende et al., 1991)
Veneno
PhTx1 PhTx2 PhTx3
Tx1 Tx2-1 Tx2-2 Tx2-3 Tx3-1 Tx3-2 Tx3-3
Tx2-4 Tx2-5 Tx2-6 Tx3-4 Tx3-5
Tx3-5
Tx2-7 Tx2-8 Tx2-9
(Diniz et al., 1990)
(Cordeiro et al., 1992)
(Cordeiro et al., 1992)
Tx1 AELTSCFPVGHE-CDGDASNCNCCGDDVY----CGCGWGRWN----CKCKVADQSYAYGICKDKVNC
Tx2-1 ATCAGQDKP-CKET---CDCCGERGE----CVCALSYEGKYR-CICRQGNFLIAWHKLASCKTx2-5 ATCAGQDQT-CKVT---CDCCGERGE----CVCGGP-------CICRQGNFLIAAYKLASCKCKTx2-6 ATCAGQDQP-CKET---CDCCGERGE----CVCGGP-------CICRQGYFWIAWYKLANCKKTx2-9 SFCIP-FKP-CKSDEN---CCKKFK-----CK-TTGIVK-----LCRW
Tx3-1 AECAA-VYERCGKGYKR--CC-EERP----CKCNIVMDN----CTCKKFISETx3-2 ACAG-LYKKCGKGASP--CC-EDRP----CKCDLAMGN----CICKTx3-3 GCAN-AYKSC-NGPHT--CCWGYNGYKKACICSG?NWKTx3-4 SCIN-VGDFC-DGKKD--CCQCDRDNAF-CSCSVIFGYKTN-CRCETx3-5 GCIG-RNESCKFDRHG--CCWPW-----CCSCCKCGQPESDVGTx3-6 ACIP-RGEICTDD---CECCGCDNQ----CYCPPGSSLGIFKCSCAHANKYFCNRKKECKKA
Sequência de aminoácidos das toxinas da aranha Phoneutria nigriventer:
Objetivo
•Identificar e clonar neurotoxinas da glândula de veneno da aranha Phoneutria nigriventer relacionadas a fração PHTx2.• Subclonar as toxinas em vetores de expressão procariotos e eucariotos (pMAL).•Estudar o efeito de cada toxina recombinate.
Pn2-5A aggagagaactaattctctctctctcctcgtgccgaattcggaagtgcaat aggagagaactaatt ttgggaa
t t c g c t c a c g
Sonda Radiotiva
t t c g c t c g c g
DNA polimerase
Pré-hibrização Hibridização
Dot Blot - Biblioteca de cDNA
Pré-hibrização Hibridização
Sonda radioativa Pn2-5A cDNA
Dot Blot controle
Controle Positivo
Controle positivo
Dot Blot da Biblioteca de cDNA
sonda Pn2-5A
B11-1 bcacgagtgtggacatatctcgatacaactcagaPn2-5A aggagagaactaattctctctctctcctcgtgccgaattcggaagtgcaat
B11-1 ATG AAA GTT GCA ATC CTC TTC CTC TCT ATT TTG GTG CTT GCT GTT GCA AGT GAA TCC ATT Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
B11-1 GAA GAA TCC CGT GAT GAT TTT GCT GTA GAA GAA CTG GAG AGA GCC ACA TGC GCT GGC CAA Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..T ... ... ... ..T ...
B11-1 GAC CAG CCC TGC AAA GAA ACT TGC GAC TGC TGT GGA GAG AAA GGA GAA TGT GTT TGC GGA Pn2-5A ... ... A.. ... ..G .T. ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ..T ..A
B11-1 GGA CCT TGC ATT TGC AGG CAA GGC TAC TTT TGG ATA GCA TGG TAT AAA CTT GCT AGC TGT Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ...
B11-1 AAG AAA tga-atggatttatgtattccacgatataataaatattgttgcatttgaaaaaaaaaaaaaaaaaa
Pn2-5A/Pn2-5B
Pn2-5a ... ... ... t..............a...g...............a..........................
10 20 30 40 50 60* * * * * * * * * * * * *
AM 848 ATG AAA GTC GCA ATC CTC ATC CTC TCT ATT TTG GTG CTT GCT GTT GCA AGT GAA ACC ATT GAA GAA TAC CGT GAC GAT TTT GTT GTA GAA GAA TTGB11-1 ... ... ..T ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... .C. ... ..T ... ... .C. ... ... ... C..B11-128 ... ... ..T ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... .C. ... ..T ... ... N.. ... ... ... C..AM 871 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ...B9-171 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .C. ... ... ... ...
B3-197 ... ... ... ... ... ... ... ... ... N.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .C. ..N T.. ... ... B9-09 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .C. ... ... N.. ...B9-80 ... ... ... S.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .C ... ... ... ...B9-34 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... T.N T.. ... ...
70 80 90 100 110 120 130* * * * * * * * * * * * *
AM 848 GAG AGA GCC ACA TGC GCT GGC CAA GAC CAG CCC TGC AAA GAA ACT TGC GAC TGC TGT GGA GAG AGA GGA GAA TGT GTT TGC GGA GGA CCT TGC ATTB11-1 ... ... ... ... ... XB. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...B11-128 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...AM871 ..N ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... N.. ... ... ... .N. ... .N. A.A .N. ... N.. ... ... ... ... ... ... ... ...B9-171 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...B3-197 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...B9-09 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... N.. ... ... ... ... ... ... N.N .N. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...B9-80 ... ... ... ... ... STN ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...B9-34 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... N.. ... ... ... ... ...
140 150 160 170 180 190 * * * * * * * * * * * * *
AM848 TGC AGG CAA GGC TAC TTT TGG ATA GCA TGG TAT AAA CTT GCT AAC TGT AAA AAA TGA TAT GGA TTT ATG TAT B11-1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. .G. ..G ... ... ... ... ... ... ... B11-128... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... AM871 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .N. ... ... ... ... ... B9-171 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..G .H. ... ... ... ... ... ... B3-197 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..G ... ... ... ... ... ... ... B9-09 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .N. ... ..N ... ... ... ... ... ... ... B9-80 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..G ... ... .CC ACG ATA TAA TAA B9-34 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..G ... ... ... ... ... ... N..
200 210 220 230 * * * * * * * * AM848 ACC ACG ATA TAA TAA ATA TTA TTG CAT TTG AAA AAA AAA AAA AAA B11-1 ... T.. ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... B11-128 T.. ... ... ... ... ... ..G N.. ... ... AM871 ... ... ... ... ... ... ... ... .N. ... ..G GGG GGG GGG GGG B9-171 T.. ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... B3-197 T.. ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... B9-09 T.. N.. ... ... ... ... ..G ... .N. ... ... .GN NGG ... ... B9-80 ATA TTG TTG C.T .TG .A. AA. AAA A.A AAA ... ... ... ... B9-34 T.. ... ... ... ..N .N. N.G
PEPTÍDEO SINAL PRÓ-PEPTÍDEO TOXINA MADURA
Tx2-5 ATCAGQDQTCKVTCDCCGERGECVCGGPCICRQGNFLIAAYKLASCKCK*Pn2-5A MKVAILFLSILVLAVA SESIEESRDDFAVEELGR ATCAGQDQTCKVTCDCCGERGECVCGGPCICRQGNFLIAWYKLASCKK*B9-80 MKVXILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEELER ATCXGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK*B9-171 MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKX*B11-1 MKVAILFLSILVLAVA SESIEESRDDFAVEELER ATCXGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK*AM847 MKVAILILSXLVLAVA SETIEEYRDDFAV*ELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK*AM895 MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFVX*ELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVXGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK*
AM896 MKVAILFLSILVLAVA SESIEESRDDFXVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKK* AM848 MKVAILILSXLVLAVA SETIEEYRDDFVVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKK*AM871 MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEXLXR ATCAGQDQPCKXTCDXCXKXGXCVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKKXAM848 MKVAILILSXLVLAVA SETIEEYRDDFVVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKK*
AM872 MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEXLER ATCAGQDQPCKXTCDCCGXXGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLAXCXK*AM1062 MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRGXFAVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWI
Pn4A MKVAIVFLSLLVLAFA SESIEENREEFPVEESAR CADINGACKSDCD---CCGDSVTCDCYWSDSCKCRESNFKIGMAIRKKFCAM1072 MKVAIVFLSLXVLAFA SESIEENREEFPXF*SAR CXDINGACKSDCD---CCGDSVTCDCYWSXSCKCXESNFKIGMAIXKKFX*AM1054 MKVAIVFLSLLVLAFX XESIEENREEFPVEESAR CGDINAACKEEAAIV
PERSPECTIVAS
Expressão das toxinas recombinantes;
Ensaios farmacológicos e eletrofisiológicos com astoxinas recombinanates.
Clonagem e sequenciamento de novas toxinas
PCR de colônia bactériana com pMALc2 + B11-1
Divisão Biologia Celular
Profs.: Dr. Evanguedes Kalapothakis Dr. Luiz A. C. DeMarco
Dr. Marcus V. Gomez Dr. Marco A. M. Prado Dr. Marco A. Romano-Silva
Neurobiologia Molecular
Profa.: Dra. Vania F. Prado
PCR de colônia bactériana pMAL+ pMALp2
Primers Pn2-5F e Pn2-5R
Pn2-5B bcacgagtgtggacatatctcgatacaactcagaPn2-5A aggagagaactaattctctctctctcctcgtgccgaattcggaagtgcaat
Pn2-5B ATG AAA GTT GCA ATC CTC TTC CTC TCT ATT TTG GTG CTT GCT GTT GCA AGT GAA TCC ATT Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Pn2-5B GAA GAA TCC CGT GAT GAT TTT GCT GTA GAA GAA CTG GAG AGA GCC ACA TGC GCT GGC CAA Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..T ... ... ... ..T ...
Pn2-5B GAC CAG CCC TGC AAA GAA ACT TGC GAC TGC TGT GGA GAG AAA GGA GAA TGT GTT TGC GGA Pn2-5A ... ... A.. ... ..G .T. ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ..T ..A
Pn2-5B GGA CCT TGC ATT TGC AGG CAA GGC TAC TTT TGG ATA GCA TGG TAT AAA CTT GCT AGC TGT Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Pn2-5b AAG AAA tga-atggatttatgtattccacgatataataaatattgttgcatttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
Pn2-5A/Pn2-5B
Pn2-5a ... ... ... t..............a...g...............a..........................
Sequência de nucleotídeos do cDNA das isoformas Pn2-5a e Pn2-5b. As regiões não trasncritas estãoem azul, a toxina esta destacada em verde e ainda o codon de iniciação, terminação e a região de poliadenilação em vermelho.