CM: LES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES HUMAINES

Année 2018/2019

Bernard CARCYLaboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, Faculté de Pharmacie, Université

Montpellier

CM: LES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES

HUMAINES: APPARITION, DIAGNOSTIC ET

APPROCHES THERAPEUTIQUES

- CHAPITRE IV -

APPROCHES THERAPEUTIQUES DES MALADIES HEREDITAIRES

MONOGENIQUES (TRANSFERT DE GENE)

A- LE CLONAGE MOLECULAIRE D’UN ADN D’INTERET SUR UN VECTEUR

DFGSP2

Module SB2

UE11 : Biologie Moléculaire et Cellulaire

I- POLYMORPHISMES DU GENOME HUMAIN ET PATHOLOGIE MOLECULAIRE (MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES)

II- MECANISMES ET CONSEQUENCES DES MUTATIONS DELETERES A L’ORIGINE DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES

III- METHODES D’IDENTIFICATION DES MUTATIONS DELETERES A L’ORIGINE DES MALADIES GENETIQUES HEREDITAIRES

MONOGENIQUES (DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE)

IV- APPROCHES THERAPEUTIQUES DES MALADIES HEREDITAIRES



- Extraction des acides nucléiques (ADN, ARNm, synthèse d’ADNc)

- Séparations électrophorétiques (classique ou PFGE) de l’ADN et visualisation

- Ligature de 2 ADN (dans une stratégie de clonage d’un ADN d’intérêt sur un vecteur)

- Vecteurs de clonage (plasmides, BAC, rétrovirus)

- Transformation bactérienne

- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant (-complémentation)

- Banque d’ADN

B- APPLICATIONS THERAPEUTIQUES LIEES AU TRANSFERT DE GENE

1/ Production de protéines thérapeutiques recombinantes

- par des bactéries en fermenteur (tag (His)6 ou GST)

- par des animaux ou végétaux transgéniques

2/ Production de protéines thérapeutiques in situ

les différentes stratégies (in vivo ou ex vivo)

- les vecteurs viraux

- les vecteurs non viraux

3/ Le clonage reproductif et thérapeutique

4/ Modifications du génome via approche CRISPR-Cas9

2.1/ Thérapie génique (ADN médicament)

2.2/ Injection ADN nu

ADN

pUC

AmpR

Vecteur

Sélection

Ligature

Transformation

1- Clonage d’un seul fragment d’ADN (gène) 2- Clonage de n fragments d’ADN

(banque d’ADN d’un génome)

2- Fragmentation du

génome entier (n

fragments d’ADN)1- Sélection d’un

gène d’intérêt (1

fragment d’ADN)

Cellule hôte

Amplification d’un

gène (ou de n

gènes) après

fragmentation du

génome

Sous-clonage(changement de vecteur)

TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE II (Appliquées à l’extraction, la manipulation et le clonage moléculaire

d’un gène ou d’un génome; transfert de gène ou transgénèse)

• Extraction des Acides nucléiques (ADN, ARNm, synthèse d’ADNc)

• Séparation électrophorétique (classique ou PFGE) des acides nucléiques

et visualisation

• Fragmentation de l’ADN (enzymatique par ER ou mécanique par

shotgun)

• Ligature de 2 ADN (dans une stratégie de clonage d’un ADN sur un

vecteur)

• Vecteurs de clonage (plasmide, BAC, rétrovirus)

• Transformation bactérienne

• Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant

(-complémentation)

• Banques d’ADN

TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE II (Appliquées à l’extraction, la manipulation et le clonage moléculaire

d’un gène ou d’un génome; transfert de gène ou transgénèse)

1- Extraction des Acides nucléiques

Poly(A)CAP

5’

5’

5’

3’

3’

3’

AUG Stop

Brin codant

Brin non codant

exon1 exon2 exon3

exon1 exon2 exon3

exon1 exon2 exon3

ADNg (gène dans un génome eucaryote: intron + exon +5’ NC et 3’NC)

ARNm mature :

-1 seul cadre de

lecture ouvert

(Open Reading

Frame=ORF)exon1 exon2 exon3

exon1 exon2 exon3

ATG Stop

ADNc (ADN complémentaire)

copie ADN double brin issue

d’un ARNm mature)

introns

Traduction

Transcription/maturation

Rétrotranscription

Nter CterTraduction

protéine

*Quelques généralités (ADNg ou ADNc, ARNm)

N

Cellule nucléée

Tampon de dissociation des protéines

(détergents)1

ADN (µg)ARN totaux (µg)

+ Inhibiteurs RNases

endogènes

Extraction des AN (Ex: phénol) 2

Précipitation des AN (Ex: Alcool + sel) 3

Dosage/Pureté/intégrité des AN (spectro.) 41 DO260nm

= 50µg/ml

ADNdb

1 DO260nm

= 40µg/ml

ARNsb

DO260nm

DO280nm1,8 < < 2 Pureté

* Principe général d'extraction des acides nucléiques (ADN et ARN)


Purification des ARNm sur colonne d’affinité (via une séquence oligodT)

*Extraction/Purification des ARNm

ARN totaux purifiés

ARNt

ARNr

(A)n3’

ARNm5’

2

Colonne de billes

couplées à

séquences

polydT = (dT)n

(dT)n

(A)n

(dT)n

(dT)n

(A)n

(dT)n

(A)n

(A)n3’

ARNm5’

3Hybridation des ARNm

Par séquences poly(A)n

Elution des ARNm

1

ARNm purifiés

Tampon de

force ionique

ELEVEE

Tampon de

force ionique

FAIBLE


(A)n3’5’

ADNc

copie entière

ARNm purifié

ARNm/ADNc

5’ AAAA-3’

polyT(18)

5’ AAAA-3’

5’ AAAA-3’

5’ AAAA-3’

dNTP

dNTP

TTTT-5’

3’ TTTT-5’

3’ TTTT-5’

5’ AAAA-3’

3’ TTTT-5’

Hybridation

Ex: Synthèse d’ADN par la technique de cassure à la Rnase H

Rétrotranscription

Cassure ARNm

Polymérisation ADN

Transcriptase

reverse

RNase H

ADN

Polymerase

1

2

3

4

*Synthèse d'ADNc


2- Séparation électrophorétique des Acides nucléiques (AN) et visualisation

-- Migration dans un champ électrique du pôle – vers le pôle +(l’ADN est chargé – en raison des groupements phosphates)

- dans un seul champ électrique si fragments < 20kpb (migration dans une seule

direction)

- dans plusieurs champs électriques d’orientation variable (champs pulsé)

si fragments >20kbp (ex: migration bidirectionnelle en zig-zag)

- Séparation des fragments en fonction de leur taille:

- le plus souvent dans un gel d’agarose (gel horizontal de 0,6 à 2%) selon la taille des

fragments à séparer ou à visualiser (Ex: Southern blot, analyse de fragments PCR)

- dans l’acrylamide si petits fragments (<100pb) ou si besoin d’être très résolutif

dans la séparation de fragments (Ex: séquençage de l’ADN; détection de mutation par méthodes

dérivées de la PCR)

- La coloration des AN s’effectue par ajout d’un intercalant de l’ADN

(ATTENTION: si bromure d’éthidium (BET) comme intercalant de l’ADN; toxique) et leur

visualisation sous les U.V.

*Quelques généralités:

Gel 1% d’agarose

Electrophorèse en Champ pulsé

Electrophorèse classique

puits de dépôt de

l’échantillon d’ADN

à analyser

Fragment d’ADN

2 orientations

de migration

1 orientation

de migration

*Electrophorèses classique (ADN ou ARN) ou en champ pulsé (ADN)


*Séparation électrophorétique d’ARN totaux

Contrôle de la

qualité de

l’extraction des

ARN totaux d’un

tissu (en vue

d’une purification

des ARNm) par

visualisation de

l’intégrité des

ARN 28S et 18S.

ARNm


-

+Fragmentation d’un génome

par des enzymes de restriction

(Ex: Southern blot)

Génome digéré par

différentes ERÉtalons de

PM

E E

E E

EE

E

EADN

génomique

purifié

Digestion par une ER

*Séparation électrophorétique de fragments d'ADN issus d'une

fragmentation du génome par une enzyme de restriction (ER)


Le gel d’agarose permet d’analyser la

fragmentation de génomes entiers

par des enzymes de restriction (ER)

dans la perspective:

-d’identifier un gène dans un génome

et d’étudier son organisation

génomique (simple copie, multicopie)

par hybridation moléculaire

(Southern blot)

3- Fragmentation de l’ADN

ADN génomique purifié

COUPURE MECANIQUE

(coupure aléatoire = shotgun)

COUPURE ENZYMATIQUE PAR LES

ENZYMES DE RESTRICTION

(coupure à des sites définis)

E E

E E

EE

E

E

La plupart des génomes sont beaucoup trop grands (>109pb)

pour être analysés en un seul morceau. Il faut les fragmenter

*Méthodes de fragmentation de l'ADN

=> Quelques généralités sur les ER:

définition : Endonucléases d’origine procaryotique coupant de manière définie

et reproductible l’ADN double brin quelle que soit son origine.

Action: Réduisent de manière reproductible un génome entier à une série de

fragments caractéristiques d’un ADN donné.

ER de type II : une fois la séquence reconnue, l’enzyme coupe l’ADN double brin au niveau

du site de reconnaissance. Il en existe des centaines (commercialisées).

nomenclature des ER de type II:

Escherichia coli Ry13

Genre

Espèce

Souche EcoRI (première découverte)

EcoRV (cinquième)


*Les enzymes de restriction de type II

=> les sites de reconnaissance des ER de type II:

EcoRI

- séquences palindromiques:

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

- les flèches indiquent le site de coupure sur les 2 brins

NspIV5’-GGNCC-3’

3’-CCNGG-5’

N signifie A,C,G ou T

- séquences courtes (entre 4 et 8 pb)

- la spécificité de reconnaissance des séquences est le plus souvent absolue

mais pas toujours:

5’-GGCC-3’

3’-CCGG-5’HaeIII



=> Analyse de la méthylation de l'ADN par des isoschizomères :

HpaII

quand une base peut être méthylée par une méthylase bactérienne,

elle est repérée par une astérisque:

5’-CC GG-3’

3’-GG CC-5’

-des isoschizomères sont 2 enzymes de restrictions qui reconnaissent

une même séquence mais une des enzyme est sensible à la méthylation

(ne coupe pas si méthylée). L’autre enzyme coupe l’ADN qu’il soit méthylé ou pas.

HpaII et MspI5’-CCGG-3’

3’-GGCC-5’



=> Les différents types de coupure des ER de type II:

HaeIII

- Libération d’extrémités franches (blunt or flush ends):

5’-GGCC-3’

3’-CCGG-5’

- Libération d’extrémités cohésives (décalées ou protrusives):

EcoRI5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

5’-GG CC-3’

3’-CC GG-5’+

- 3’ cohésives: - 5’ cohésives:

5’-G AATTC-3’

3’-CTTAA G-5’+

5’-CGATCG-3’

3’-GCTAGC-5’

5’-CGAT CG-3’

3’-GC TAGC-5’

PvuII

+



4- Ligature de 2 ADNs différents (dans une stratégie de clonage

d’un ADN sur un vecteur)

*les 2 ADN sont coupés par une même ER

1

2

ADN LIGASE: enzyme qui

assure la formation d’une

liaison phosphodiester entre

une extrémité 3’OH et 5’P

de 2 désoxyribonucléotides

=> Après ligature, l’ADN1

se retrouve entre 2 sites

de restriction reconstitués

par complémentarité des

extrémités



*les 2 ADN sont coupés par une même ER

SCM= Site de clonage de l’ADNc

-Digestion du plasmide par ER

- Déphosphorylation des extrémités (phosphatase alcaline)

-ligature de l’ADNc au vecteur par ADN ligase

ETVecteur

recombinant

(R)

Vecteur non

recombinant

(NR)



*L’efficacité de ligature d’un ADN sur un vecteur n’est jamais de 100%

=> tout clonage nécessitera un système de discrimination (= sélection)

pUC

AmpR

ori

pUC

AmpR

ori

pUC

AmpR

ori

ER

ER

- Ligature de 2 ADNs différents (dans une stratégie de

clonage d’un ADN sur un vecteur)

1- ligature de 2 ADN coupés par

la même ER :

- que les extémités libérées soient

franches ou cohésives, on pourra

toujours ligaturer ces 2 ADN

(avantage).

- on reconstitue le site de restriction

initial sur la molécule chimère

(avantage) :

=> donc possibilité de le ressortir du

vecteur1 pour le ligaturer sur un autre

vecteur (sous-clonage)

- L’ADN cloné sur le vecteur se

retrouve entre 2 sites de restriction

identiques :

=> l'ADN peut être cloné dans 2

orientations (inconvénient si objectif

est de produire une protéine

recombinante)

2- ligature de 2 ADN coupés

par des ER différentes:

=> si coupures franches:- on pourra toujours ligaturer les 2

ADN

- Cependant on ne reconstitue pas

les sites de restriction initiaux sur la

molécule chimère (inconvénient).



=> Si coupures cohésives :- on ne pourra ligaturer ces 2 ADN que si 1

des 2 sites est contenu dans l’autre, par

complémentarité des

désoxyribonucléotides

dans la région simple brin.

(inconvénient).

5- Vecteurs de clonage

Définition : c’est un système qui permet le transfert, l’expression et la réplication d’un ADN

étranger dans des cellules-hôtes (en vue d’un clonage d’ADN, d’une transgénèse, d’une

thérapie génique, d’un séquençage, etc…).

Choix du vecteur de clonage: Le choix d’un vecteur pour une opération de clonage dépendra

de l’ADN étranger à insérer (compatibilité de taille et d’extrémités) et de l’application

(cartograghie et séquençage de génome, expression de protéine thérapeutique dans une

bactérie, thérapie génique,…)

*Généralités

Quelques

vecteurs de

clonage:

(*) Les vecteurs dont on parlera en DFGSP2, notamment les plasmides

Propriétés générales des vecteurs de clonage

-Réplication autonome (ori), le plus stable possible et sa présence ne doit pas perturber la

cellule hôte

-présence de marqueurs de sélection (gène de résistance aux antibiotique, gène lacZ,…)

qui permettront de différencier des bactéries porteuses d’un vecteur recombinant ou non

recombinant (par colorimétrie ou sur antibiotique).

-doit posséder un SCM (site de clonage multiple) constitué d’une succession de site unique

de coupure par des enzymes de restriction. Ce SCM est l’endroit où l’ADN à cloner sera

inséré. Le SCM est localisé dans un marqueur de sélection.

-doit être facilement isolable sous forme pure et en quantité illimitée

- le plus petit possible (favorise insertion d’ADN plus grands, manipulation plus facile,

augmente le nombre de copie par cellule car plus facile à répliquer)

*Généralités


- ADN double brin extrachromosomique

-d’origine procaryotique

- existe naturellement dans les bactéries (=

1ère génération)

- il en existe maintenant de nombreux artifiels

(2ème et 3ème génération)

Couramment utilisés dans les stratégies de

clonage simple (en vue de production de

protéine recombinantes, pour le séquençage

d'un gène , pour la sélection d'un gène dans

une banque d'ADN, etc)Cliché D. Dressier

*Les plasmides

Caracéristiques générales


Exemple d’un plasmide artificiel

de 3ème génération

Caractéristiques

majeuresdu plasmide

pBluescript:

-1- Présence d’un site de

clonage multiple (SCM =

MCS ou polylinker)

-2- Présence de

promoteurs (T3 ou T7

ou SP6,…) de part et

d’autre du SCM

- Présence de marqueurs

de sélection:

-Présence d’un gène

de résistance à un

antibiotique

-Présence du gène

lacZa (peptide de

lagalactosidase)

1

2

3

431

2

4

lacZa

*Les plasmides

2

=> couramment utilisé pour la sélection colorimétrique

de vecteurs recombinants (Cf TP BioMol1)


- Succession de site de

restriction unique

- nombre et séquence des

sites de restriction variable

d’un plasmide à l’autre

- plus il contient de site de

restriction et plus il sera

facile de cloner n’importe

quel ADN

-Le SMC est inséré dans

un marqueur de sélection

SCM1

lacZa

C’est l’endroit où on ouvre le vecteur par une enzyme de restriction

pour y cloner 1 ADN étranger (d’extrémités et de taille compatibles)

1*Les plasmides

Le SCM:


=> localisation des séquences

promotrices de part et d’autre du SCM

(donc de l'insert)

=> serviront de régions d'hybridation

d'amorces (PCR, séquençage, production

d'ARNm à grande échelle)

Les séquences promotrices 2

2

2

2

2

*Les plasmides

Faciliteront l’analyse des vecteurs

recombinants et de l'ADN cloné

(insert)


Serviront à la sélection des bactéries recombinantes d’intérêt (avec vecteur recombinant

portant le gène d’intérêt cloné)

Les marqueurs de sélection:

(Ex: pBluescript ; Cf TP1 BioMol)

-gène lacZa (peptide

de la -galactosidase)3

4

Elimination des

bactéries non

transformées

3

Discrimination colorimétrique des

bactéries transformées (via

mécanisme d’-complémentation)

contenant soit :

- un plasmide recombinant (blanche)

- Un plasmide non recombinant (bleue)

4

gène de résistance

à un antibiotique

*Les plasmides


6- La transformation bactérienne

Objectif : Consiste à faire entrer le plasmide recombinant (porteur du gène

d’intérêt) dans une cellule hôte (bactérie le plus souvent car simple d'utilisation) où

il pourra se répliquer (en grande quantité et sera clonal)

=> Ce n'est pas un phénomène naturel donc :

- on devra fragiliser la paroi bactérienne pour faciliter l'entrée du plasmide (=

bactéries compétentes)

- on utilisera des méthodes physico-chimiques (choc thermique de 0->42°C, choc

électrique=électroporation) pour faire entrer l'ADN plasmidique

=> L' efficacité de la ligature ADN/plasmide n'étant pas de 100 %, on n'aura

également pas d'efficacité de transformation de vecteur recombinant de 100 % (des

bactéries ne seront pas transformées et parmi les bactéries transformées on aura

des bactéries transformées par un vecteur non recombinant et d'autres par un

vecteur recombinant).

=> Il faudra donc un système de sélection double capable de discriminer à la fois :

- les bactéries transformées des bactéries non transformées (via gène de résistance à

un antibiotique)

- les bactéries transformées par un vecteur recombinant ou non recombinant (via

du gène lacZa)

*Généralités


Bactéries

(Escherichia coli)

Bactéries compétentes

ADN bactérien

Paroi bactérienne

intacte

Paroi bactérienne

fragilisée

* Préparation de Bactéries compétentes

paroi fragilisée

(par CaCl2 par exemple)

pour faciliter l’entrée du

vecteur

=> Bactéries aptes à recevoir de

l’ADN étranger


Bactéries compétentes

(Escherichia coli)

* Transformation des bactéries compétentesRésultat de la ligature

ADN/vecteur

Bactéries transformées

(L’efficacité de ligature d’un ADN

sur un vecteur n’est jamais de

100%)

Méthodes physico-chimiques:

Choc thermique (0=>42°C) ou

électrique (électroporation)

=> L’efficacité de la transformation n’est jamais de 100%

Bactéries non

transformées

Bactéries

transformées

Recombinantes

à sélectionner

Biologie et Multimédia -

Université

Pierre et Marie Curie

7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur

recombinant (-complémentation)

* L'opéron lactose bactérien (Cf Cours Bactériologie)



* L'opéron lactose bactérien (Cf Cours Bactériologie)



-galactosidase

Peptide

- dans OPERON LACTOSE BACTERIEN :

-Gène lacZ présent

sur un vecteur

- LORS OPERATION CLONAGE MOLECULAIRE:

Enzy-

Enzy+ (substrat: X-gal)-complémentation

gène lacZ

Peptide Enzy-

On restaure l’activité enzymatique lors d’une association

Enzy+(substrat: lactose)

*Le mécanisme d' -complémentation

-Gène lacZ présent

sur le génome

bactérien lac- des bactéries

à transformer:

(-> par contre l’activité enzymatique ne sera pas restaurée si modifié par

insertion d’un gène dans lacZ (=> plus d’association

=> par contre l’activité enzymatique n’est pas restaurée si modifié par

insertion d’un gène (plus d’association



*Le mécanisme d' -complémentation

PAS de -galactosidase

(Enzy-)

=> PAS de -galactosidase donc

=> PAS d'activité

enzymatique (Enzy-)

=>-galactosidase

AVEC activité

enzymatique (Enzy+)

association

PAS d'association RecA sélectionner

Transformation

bactérienne

(en présence

X-gal/IPTG/Ampicilline)



Blanche (Enzy-), AmpS

Bleue (Enzy+), AmpR

Blanche (Enzy-), AmpR

3 phénotypes

distincts

DONC REC

différentiable

des deux

autres types

A sélectionner

*Phénotypes bactériens en présence d'X-gal/IPTG/Ampicilline

X-gal (5-Bromo 4-chloro 3-indolyl bD galactopyranoside)

(SUBSTRAT incolore)

Bromo-chloro-indol

(BLEU)

-galactosidase

NORMALE

Protéine codée

par l’ADNc

Peptide Rec Peptide

Colonies bactériennes

BLANCHES

(PAS d’-complémentation)Colonies bactériennes

BLEUES

(-complémentation)



*Rôle de l'X-gal (en présence d'IPTG)

Association PAS d'association Rec

=> C'est le SUBSTRAT (incolore) de la -galactosidase dans ce système de sélection



*Rôle de l'IPTG (Isopropyl D thyogalactopyranoside)

=> analogue non métabolisable du lactose qui induiera la synthèse du peptide ou Rec

TRANSCRIPTION/TRADUCTION

BLOQUEE

Cas 1: Absence d’IPTG Cas 2: présence d’IPTG

TRANSCRIPTION/TRADUCTION

OUVERTE

23

4

6

5

1

7

Culture sur boite de

pétri LB+Ampicilline

+ IPTG et X-galColonie bactérienne

blanche : n bactéries

transformées par le même

vecteur recombinant

Prélèvement et

Multiplication en

culture liquide + Ampi

Extraction du plasmide

(miniprep)

Analyse de l’insert

*Sélection d’un clone à analyser:



1- Clonage d’un fragment d’ADN unique 2- Banque (clonage de n fragments d’ADN)

*Succès du clonage (nombre de clones à obtenir):

23

4

6

5

1

7

23

4

6

5

1

7

Tous les clones blancs

contiennent le même insertLes clones blancs 1, 2, 4, 6 et 7

peuvent contenir des inserts différents

1 CLONE BLANC SUFFIT > 95% BLANCS



8- Banques d’ADN

Une banque d’ADN (library) : correspond à un ensemble

de clones cellulaires (bactéries, levures,…) où chaque

cellule renferme un exemplaire différent d’ADN

recombiné à un vecteur.

La construction d’une banque : dépendra de ce que l’on recherche

- ADN génomique

- exons, introns, séquences régulatrices des gènes

- tout type cellulaire (exception : cellules de l’immunité)

- ADNc (complémentaire)

- exons des gènes

- il existe une spécificité tissulaire

=> Une banque d’ADN contiendra donc, sous forme morcelée,

l’ensemble de l’information génétique (ADNg ou ARNm matures via

ADNc) d’un individu telle qu’elle existe dans son génome.

*Généralités

Ex:

n BACTERIES RECOMBINANTES CONTENANT

UN SEUL PLASMIDE RECOMBINANT

ADNc1 ADNc2 ADNc5ADNc4ADNc3 ADNcn

pUC pUC pUC pUC pUC pUC

AmpR

Clonage dans vecteur plasmidique au niveau de lacZ

Transformation bactérienne

8- Banques d’ADN

*Exemple de construction d'une banque d'expression plasmidique

8- Banques d’ADN

*Stockage des clones d'une banque

Exemple : Stockage des

1536 ADN plasmidiques

extraits des 1536 clones

bactériens d'une banque

sur un filtre de Nylon

(chaque clone est déposé

en duplica)

Clones bactériens

Sur plaques 96puits

(ou 384 puits)

Clones bactériens

Sur boite de pétri

ADN plasmidiques

extraits des Clones

bactériens

sur plaques 96puits

(ou 384 puits)

Exemple : Banque de 1536

clones bactériens (16

plaques de 96 puits

(ou 4 plaques de 384 puits)

8- Banques d’ADN

*Criblage des clones d'une banque

=> Consiste en la sélection

d'un clone parmi un ensemble

de clones que constitue la banque

Criblage par PCR à l'aide d'un couple

D'amorces spécifiques d'un gène:

20

réactions

PCR

permettent

l’analyse

de

96 clones

8 Réactions

PCR sur

des mélanges

de lignes (12

clones/ligne)

12 Réactions

PCR sur des

mélanges de

colonnes (8

clones/colonne)

AB

CD

EF

GH

=> Clone positif en position F4 sur la plaque 96 puits

8- Banques d’ADN


Criblage par PCR:

8- Banques d’ADN


Criblage par PCR (localisation de 2 gènes dans la banque):

8- Banques d’ADN


Criblage par hybridation moléculaire

À l'aide d'une sonde

hybridation avec une

sonde

Résultat : donne la

localisation du gène étudié

dans la banque d'ADN

Exemple : Banque de






en duplica)

8- Banques d’ADN


Criblage par hybridation moléculaire

À l'aide de plusieurs sondes distinctes

Exemple : Banque de






en duplica)

Sonde 2

Sonde 1

Résultats : Les gènes 1 et 2 sont localisés dans les

mêmes régions génomiques (organisation génomique en

tandem)

8- Banques d’ADN

* Déchiffrage d'un génome entier par séquençage

=> les fragments d'ADN séquencés constituent des banques d'ADN (de grands (vecteur de type BAC) ou petits (vecteur de type Plasmide) fragments)

8- Banques d’ADN


=> les fragments d'ADN séquencés constituent des banques d'ADN (de grands (vecteur de type BAC) ou petits (vecteur de type Plasmide) fragments)

8- Banques d’ADN


Quelques objectifs d'analyse de Diversité chez les individus d'une même espèce

- mise au point de kits génétiques pour le grand public

(« médecine » prédictive ou personnalisée)

- étudier la relation facteurs

environnementaux, gènes

et maladies

- identifier les mutations

impliquées dans maladies

(entre autre)














- Banque d’ADN


1/ Production de protéines thérapeutiques recombinantes



2/ Production de protéines thérapeutiques in situ

les différentes stratégies (in vivo ou ex vivo)



3/ Le clonage reproductif et thérapeutique

4/ Modifications du génome via approche CRISPR-Cas9

2.1/ Thérapie génique (ADN médicament)

2.2/ Injection ADN nu














- Banque d’ADN


- Production de protéines thérapeutiques recombinantes



- Thérapie génique (ADN médicament)

- les différentes stratégies (in vivo ou ex vivo)



-Clonage reproductif et thérapeutique

- Modifications du génome via approche CRISPR-Cas9

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CM: LES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES HUMAINES