3/3/2015

1

Công ngh ệ DNA tái t ổ hợp

Nguyễn Vũ Phong

Lịch sử hình thành

• 1972 – 1973: DNA tái tổ hợp in vitro từ 3 nguồn vật liệu di truyềnkhác nhau. (Berg, Boyer và Cohen)

• 1973 – 1974: DNA tái tổ hợp có hoạt tính sinh học (Cohen,Henlinski, Boyer).

Tên gọi:

• Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology)

• Kỹ thuật gene (Gene engineering) hay công nghệ gene (Genetictechnology)

• Thao tác gene (Gene manipulation)

• Tạo dòng phân tử (Molecular cloning)

• Kỹ thuật di truyền (Genetic engineering): thao tác với những phầnlớn hơn của bộ gene.

QUY TRÌNH TIẾN HÀNH

• Bước 1: Nuôi tế bào chủ và tế bào cho

• Bước 2: Tách DNA plasmid và DNA tếbào cho

• Bước 3: Cắt DNA plasmid và DNA mụctiêu bằng 1 loại enzyme cắt giới hạn

• Bước 4: Trộn và nối 2 loại DNA bằngenzyme nối tạo DNA tái tổ hợp hoànchỉnh

• Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tếbào nhận (E. coli, nấm men)

• Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng tế bàomang gene tái tổ hợp

• Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để genebiểu hiện ra sản phẩm

1. Enzyme

1.1. Enzyme c ắt giới hạn (Restriction endonuclease enzyme, RE)

- 1962: hạn chế sự sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn

- Hệ thống hạn chế - biến đổi (restriction – modification system) giúp bảo vệtế bào khỏi sự xâm nhập của DNA lạ.

Restriction enzyme.swf

1. Enzyme

1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE)

- Trình tự nhận biết: gồm 4-6 cặp nu đối xứng đảo ngược (palindrom)

- Cắt tạo thành đầu so le (sticky end) hay đầu bằng (cohesive end) .

- Khoảng 3000 RE với 230 trình tự nhận biết khác nhau.

- EcoRI: Escherichia coli R: dòng vi khuẩn I: thứ tự tìm ra (I: đầu tiên)

1. Enzyme1.2. Enzyme nối (Ligase)

Hình thành cầu phosphodiester gắn các nucleotid kề cận hay chụm cầu với nhau

3/3/2015

2

1. Enzyme1.3. Enzyme phiên mã ngược

(reverse transcriptase)

• Tổng hợp sợi DNA bổ sungc-DNA (complementaryDNA) từ một sợi mRNAhoặc từ polyribonucleotidetổng hợp

• c-DNA có thể tổng hợpthành c-DNA kép (c-DNAduplex) nhờ DNApolymerase. c-DNA képđược dùng trong việc tạodòng c-DNA

cDNA.swf

1.4. Các enzyme khác

Enzyme Chức năng

DNaseI Phân hủy DNA mạch kép bằng phản ứng thủyphân nội liên kết phosphodiester (Endonuclease)

Nuclase BAL31 Phân hủy 2 đầu mút 3’ và 5’ của DNA (Exonnuclease)

S1 nuclease Cắt DNA mạch đơn

Đoạn Klenow DNA polymerase chỉ còn hoạt tính exonuclease 3’-5’

Taq polymerase DNA polymerase chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus

1. Enzyme

2. Các vector chuy ển gene

Plasmid:

- DNA vòng tròn

- Sao chép độc lập trong tế bào

- Có khả năng mang một số gene có khả năng biểu hiện thành protein

Vector:

- Phân tử DNA có khả năng tự tái bản

- Tồn tại độc lập trong tế bào

- Mang được gene mong muốn

Yêu cầu tối thiểu đối với vectorchuyển gene.

- Có trình tự khởi đầu sao chép (ori)để tự sao chép mà tồn tại độc lập

- Trình tự nhận biết cho RE tạo vếtcắt để chèn gene lạ

- Trình tự điều hòa (promoter) tạođiều kiện thuận lợi phiên mã genelạ

- Đảm bảo sự di truyền bền vữngcủa DNA tái tổ hợp

- Có gene đánh dấu (marker) để dễdàng nhận biết các gene lạ.

2. Các vector chuy ển gene

2. Các vector chuy ển gene

Các loại vector chuyển gene

Vector Đặc điểm Khả năngchèn

Ứng dụng

Plasmid Dạng vòng 0,1 – 10kb Procaryote

Phage λ Tự động xâm nhiễm và sinhsản trong TB vi khuẩn

15 – 23 Kb Lập ngân hàng gene

Cosmid Plasmid + đoạn cos củaphage λ

45kb Lập thư viện gene

Phage M13

DNA mạch đơn Xác định trình tự nuSản xuất mẫu dòGây đột biến điểmđịnh hướng

BAC NST nhân tạo vi khuẩn 50 – 300kb

YAC Vòng tròn 2 micrometre cảitiến

100-2000kb

MAC NST nhân tạo động vật có vú >2000kb

2. Các vector chuy ển gene

Ứng dụng của vector chuyển gene

- Tạo dòng và khuyếch đại trình tự DNA (nhiều bản sao)

- Nghiên cứu sự biểu hiện của đoạn DNA

- Chuyển gene

- Sản xuất RNA

- Sản xuất protein từ gene được tạo dòng.

Hệ thống vector chuyển gen được hoàn thiện không ngừng.

3/3/2015

3

Plasmid Ti

- 200Kb

- Agrobacterium tumefaciens

- Chuyển gen ở thực vật

- Chuyển và gắn ngẫu nhiên vào bộ gene của tế bào

2. Các vector chuy ển gene 3. Hệ thống t ế bào ch ủ (Host)

Mục đích:- Nhân nuôi tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng.- Biểu hiện gene, đặc biệt ở Eukaryote

- Sản xuất protein tái tổ hợp.

3.1. Escherichia coli (E.coli)

- Dễ nuôi cấy và nhân dòng

- Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau.

- Vi khuẩn Gram-, hình que,

- Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base

3. Hệ thống t ế bào ch ủ (Host)

3.2. Saccharomyces cerevisiae

- Eukaryote đơn bào

- Dễ dàng nuôi cấy và thu sinh khối

- Phân lập được nhiều promotor hoạt động mạnh

- Thực hiện biến đổi sau dịch mã tạo protein cóđủ hoạt tính sinh học.

- Sản xuất protein tái tổ hợp dễ dàng

- Sinh vật an toàn

3.3. Hệ thống tế bào thực vật

3.4. Hệ thống tế bào động vật

- Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney)

- Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney)

- Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney

- Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary)

- Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều hiện protein người

- Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans

3. Hệ thống t ế bào ch ủ (Host)

1. Lai nucleic acid

Đặc tính biến tính và hồi tính có thể lai giữa DNA-DNA, DNA-RNA,RNA-RNA

Kỹ thuật và ph ương pháp c ăn bản

Southern Blot.swf

2. Thu nhận gene- Thu nhận DNA từ bộ

gene

* Shotgun: toàn bộDNA của sinh vậtđược cắt đoạn nhỏbằng cơ học hay REvà gắn vào vector tạodòng

* Ngân hàng/thư việnDNA bộ gene(Bank/Library ofgenomic DNA)

Kỹ thuật và ph ương pháp c ăn bản

3/3/2015

4

2. Thu nhận gene- Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học

Kỹ thuật và ph ương pháp c ăn bản

2. Thu nhận gene- Lập ngân hàng c-DNA

* Tạo gene từ các mRNAthông tin nhờ enzyme phiênmã ngược

Ưu điểm

- Chứa trình tự mã hóa liêntục của một gene (khôngchứa đoạn intron)

Kỹ thuật và ph ương pháp c ăn bản

3. Tạo plasmid tái tổ hợpa) Dùng đầu so le

Kỹ thuật và ph ương pháp c ăn bản

3. Tạo plasmid tái tổ hợpa) Dùng đầu so le

b) Dùng các đoạn nối (linkers)

Kỹ thuật và ph ương pháp c ăn bản

3. Tạo plasmid tái tổ hợpa) Dùng đầu so le

b) Dùng các đoạn nối (linkers)c) Dùng enzyme terminal transferase

Kỹ thuật và ph ương pháp c ăn bản

4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bàoa) Hóa bi ến nạp

Kỹ thuật và ph ương pháp c ăn bản

3/3/2015

5

4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bàob) Điện bi ến nạp

Kỹ thuật và ph ương pháp c ăn bản

4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bàoc) Vi tiêm

Kỹ thuật và ph ương pháp c ăn bản

4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bàod) Bắn gene

Kỹ thuật và ph ương pháp c ăn bản

DNA coated golden particles

Gene gun

Cell division

A plant cell withthe new gene

Transgenic plant

Plant cell

Cell’s DNA

Tạo cây chuy ển gene

5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện genea) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp

Kỹ thuật và ph ương pháp c ăn bản

Screening.swf

5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện geneb) Sự biểu hiện của gene thành protein

Kỹ thuật và ph ương pháp c ăn bản

3/3/2015

6

Phản ứng t ạo chu ỗi nucleotide(Polymerase Chain Reaction, PCR)

1985, Kary Mullis1. Nguyên tắc

PCR.swf

PCR dựa trên 3 bước ở nhiệt độ khác nhau.

1. Biến tính: tạo dây đơn DNA với nhiệt độ 94 oC2. Bắt cặp: lai giữa primers và DNA đơn. Nhiệt độ khoảng 50 oC3. Kéo dài : tạo dây DNA bổ sung với tác động của polymerase và

dNTPs: 72 oC.

Lặp lại chu kỳ khoảng 30-40 lần sẽ tạo ra số lượng DNA cầnkhuếch đại đủ quan sát trên gel qua quá trình điện di

Polymerase Chain Reaction, PCR

2. Thành phần phản ứng- Primer - Polymerase chịu nhiệt- dNTP- Dung dịch đệm- Mẫu- Dung dịch đệm

Sequencing

1. Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert

Sequencing

1. Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert2. Phương pháp didesoxy của F. Sanger

Ứng dụng công ngh ệ gene

1. Khai thác DNA các bộ gene1.1. Genomics: - Xác định trình tự nucleotide của bộ gene và chức năng của chúng

- Phát hiện, bảo tồn sự đa dạng sinh học, sử dụng chúng.1.2. Proteomics

- Nghiên cứu cấu hình (conformation), vị trí (localization), các biến đổi (modification), sự tương tác (interactions), chức năng (function)

- Tạo hormone, vaccin tái tổ hợp dùng chữa trị bệnh.

1.3. Human Genome Projet1.4. Các ngành học khác

- Cellomics- Metabolomics- Ionomics

Ứng dụng công ngh ệ gene2. Công nghệ protein tái tổ hợp- Sản xuất r-protein

STT Sản ph ẩm Các b ệnh điều tr ị Năm hết patent

1 Insulin Ti ểu đường 2001

2 Interferon alpha Viêm gan siêu vi B, ung thư, ..

2002

3 Interferon beta X ơ cứng 2003

4 Hormon t ăng tưởng ng ười Thi ểu năng tăng trưởng 2003

5 Erythropoetin Thi ếu máu 2004

6 T-PA (tissu plasminogen activator)

Nhồi máu c ơ tim 2005

7 G-CSF (granulocyte –COLONY Stimulating Factor

Chemotherapy-induced neutropenia

2006

3/3/2015

7

Ứng dụng công ngh ệ gene

3. Chẩn đoán phân tử

- Dựa trên phương pháp lai DNA: đặc hiệu, nhạy, chính xác, đơn giản

- DNA marker: chuỗi DNA dùng để phân biệt giữa 2 cá thể, 2 dòng hoặc 2 giống khác nhau.

- Biomarker: dấu chuẩn sinh học

- DNA fingerprinting: dấu vân tay di truyền

- Microarray và Biochips:

Ứng dụng công ngh ệ gene4. Vi sinh vật chuyển gene

- Genomics vi sinh vật: giải trình tự hơn 200 loài vsv.

- Sản xuất các hợp chất sơ cấp và thứ cấp.

- Công nghệ bề mặt tế bào nấm men.

Ứng dụng công ngh ệ gene5. Thực vật chuyển gene

- Cải thiện giống cây trồng: kháng thuốc diệt cỏ, kháng bệnh,

- Tạo giống chống chịu điều kiện khí hậu bất lợi, già hóa

- Tạo sắc tố ở các thực vật chuyển gene

- Biến đổi chất lượng thực phẩm cây trồng

- Thực vật sản xuất vaccine, protein trị liệu

- Sản xuất dầu nhờn công nghiệp

- Sản xuất plastid

Ứng dụng công ngh ệ gene6. Động vật chuyển gene

- Động vật mang gene người làm mô hình thí nghiệm (bệnh di truyền, ung thư,, thoái hóa cơ, viêm khớp,…)

- Sản xuất protein tái tổ hợp

- Chăn nuôi gene (gene farming)

7. Công nghệ gene đối với sức khỏe con người

Xét nghiệm SNP (Single Nucleotide Polymorphism)* Thiết kế thuốc cho từng bệnh nhân* Nhận dạng từng nhóm bệnh, xác định phương thức điều trị

Pharmacogenomics: (Dược học bộ gene)Cung cấp cách chữa bệnh an toàn và hiệu quả cho từng cá nhân

Gene therapy: * Chuyển gen lành thay thế gene sai hỏng* Thay thế gene

Ứng dụng công ngh ệ gene