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1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTECENTRO DE BIOCINCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUMICAMESTRADO EM BIOQUMICA
MAGDA FABIANA DANTAS DA COSTA
CO-INFECO PELO VRUS DA HEPATITE G EM
PACIENTES INFECTADOS POR LEISHMANIA CHAGASI
NATAL/ RN2005
2
MAGDA FABIANA DANTAS DA COSTA
CO-INFECO PELO VRUS DA HEPATITE G EMPACIENTES INFECTADOS POR LEISHMANIA CHAGASI.
Dissertao de Mestrado apresentada ao Departamentode Bioqumica da Universidade Federal do Rio Grandedo Norte como requisito parcial para a obteno dottulo de Mestre em Bioqumica.
Orientadora: Selma Maria Bezerra Jernimo
NATAL2005
3
Diviso de Servios Tcnicos .
Catalogao da Publicao na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede
Costa, Magda Fabiana Dantas da.Co-infeco pelo vrus da Hepatite G em pacientes infectados por
Leishmania Chagasi / Magda Fabiana Dantas da Costa. - Natal, RN, 2005. 72 f.
Orientadora: Selma Maria Bezerra Jernimo
Dissertao (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte.Centro de Biocincias. Departamento de Bioqumica
1. Hepatite - Tese. 2. Hepatite G Vrus Tese. 3. Leishmaniose Infeco Tese. 4. Imunologia Tese. I. Jernimo, Selma Maria Bezerra.II.Ttulo.
RN/UF/BCZM CDU 616.36-002(043.2)
4
CO-INFECO PELO VRUS DA HEPATITE G EM PACIENTES INFECTADOSPOR LEISHMANIA CHAGASI
Dissertao apresentada aodepartamento de Bioqumica da UniversidadeFederal do Rio Grande do Norte, como requisitoparcial para obteno do ttulo de mestre emBioqumica.
................................................................................Prof. Selma Maria Bezerra Jernimo Depto de Bioqumica-UFRN
Orientadora
..................................................................................... 1 Examinador
......................................................................................2 Examinador
NATAL 2005
5
HOMENAGENS E AGRADECIEMTOS ESPECIAIS
A Deus Pai, A Deus Filho e Deus Esprito Santo, por mais uma etapa, na minha vida em queconseguimos provar e sentir que Deus trs em um, a voc Santssima Trindade onde por muitasnoites, nos encontramos nos momentos de orao e de estudo, o meu muito obrigado.
A Nossa Senhora Rainha da Paz, ao qual sou muito grata, Maria Mulher do Gnese ao apocalipsesempre esteve presente em minha vida, o meu eterno amor.
Aos Meus Pais: Flvio e Francisca que me deram o mais precioso Dom: o Dom da vida: Amo muitovocs dois.
Ao Meu Marido Andersom Abreu, pelas noites, dias meses em que precisei troc-lo pelos livros, pelasua pacincia meu Amor, o meu muito obrigado, vencemos juntos mais uma etapa de nossasvidas. Amo Voc.
A minha querida Helosa Nadir (Lindinha, meu beb de 83 aninhos). Lindinha voc um exemplo de vidana minha vida, tambm, muito forte, fiel a Deus e me ensinou a amar muito Maria, nossa meRainha. Amo Voc.
As minhas irms: Claudia Katarine, Ana Flvia, Silvia Nicole e Sarah Viviane, vocs so as obrasprimas de Deus na minha vida. Amo Vocs. Aos meus cunhados: Joari Alves (compadre), Constantino,Marcio Moreira e Emerson.
A Comunidade Catlica Maria Mater, onde a cada dia encontro Deus, amo muito todos vocs.
Aos meus Sobrinhos: Leonardo (Leozinho), Maria Beatriz (Bia), Samuel,Gabriel, Felipe e Vitor.
E a todos os familiares: que de uma forma ou de outra contriburam de algum modo neste trabalho.
6
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Prof. SELMA JERNIMO, gostaria de escrever nesta pgina tudo o que voc merece, entretanto,tentarei expressar com algumas palavras o que senti durante estes trs anos de convivncia. Voc um exemplo de vida para muitas pessoas, para a minha vida em especial, mostrou-me que, acincia muito mais que os livros e papeis, e que se lutarmos pelos nossos ideais, com certezairemos conseguir, no tenho como agradecer, por tudo o que aprendi com voc. Deus o Pai detodos ns, criou todas as criaturas visveis e invisveis, voc uma destas criaturas visveis, emque Deus se fez, atravs da cincia, nunca deixe de acolher seus alunos e ensin-los a amar a Deusatravs da cincia. Um de seus dons que mais agrada a Deus a simplicidade, Maria a Me deDeus foi me e foi simples, voc professora Selma simples e Me de muitos Filhos: seusAlunos.
A cincia uma ddiva de Deus ao homem, e que se completa com a ao deste mesmo homem, para que ahumanidade, possa provar que, Deus muito mais forte que nossas fraquezas (Magda Fabiana).
7
AGRADECIMENTOS
A uma Pessoa muito especial que me apresentou ao mundo cientifico Viviane Emerenciano Luz,obrigada VIVI por tudo.
A minha amiga que sempre esteve ao meu lado, dando muita fora e passando os valores que umser humano pode ter, dentre eles, perseverana, determinao, solidariedade, sinceridade eamizade. Que bom Renata ter lhe conhecido!
Ao colega de turma Carlos Maia Carlinhos voc muito, muito especial, obrigada pela suaindispensvel colaborao.
A colega de trabalho Josane. Obrigada Josane pelas manhs, tardes, feriados, em que ficamosjuntas.
Ao meu Amigo Daniel Leung que me fez conhecer e descobrir que a cincia vai alm dasfronteiras, vai alm mar. Obrigada Daniel.
Ao Hospital do Corao de Natal, nas pessoas de Dr. Nelson Solano Vale e Dr. Marcos Dias Leo, que nosajudaram cedendo os parelhos de dosagens, para desenvolvermos alguns experimentos destetrabalho.
A equipe do laboratrio do Hospital do Corao de Natal: Dra. Dulce Souza, Dra. Nadja Nascimento,Dra. Danielle Follador, Dr. Raimundo, Dra. Sandra, Dra. Andreia, Dra. Anny, Dr. Roberto, Dra. VivianneLuz, Dr.Vicente, Dr. Jesaias, Joanise, Clecia, Lecia , Alexandra, Keyte, Aninha, Suerda, Gorete, Auxiliadora,Fernandinho, Soraia, Janeide, Fbia, Pricila, Da Luz.
As famlias residentes nas reas endmicas que permitiram a realizao deste estudo.
Aos pacientes do banco de sangue Hemovida que contriburam com a realizao deste estudo.
Aos professores do Departamento de Bioqumica do Centro de Biocincias.
Em especial ao professor do Departamento de Biologia Celular e Gentica: Paulo Marinho pela suaespecial colaborao O sequenciamento foi chave do nosso experimento, muito obrigadaprofessor Paulo..
A Professora Edda Lisboa Leite pela sua especial colaborao no aprendizado que vivi neste tempo.
Ao professor Mauricio Pereira de Sales pela sua colaborao.
8
Aos colegas da turma 2002.1 de Mestrado. Anna Viviane, Anne, Carlos Maia, glria, Selton, Luana, Sales eJanice.
A todos os colegas do laboratrio de Imunogentica, pela colaborao e muitas vezes, pacinciacompanheirismo: Glria, Nbia, Wogel, Paula, Jacira, Regina, Henio, Eliana, Eliene, Olvia, Josane, ngela,Leonardo, Cacau, Ney, Carlos, Flvio e James.
Ao casal ngela (Engel) e Eduardo pela indispensvel colaborao que Deus pai de todos ns ilumineos seus passos.
A coordenao de apoio pesquisa e ensino superior (CAPES), a Pr Reitoria de Pesquisa e Ps-graduao da UFRN (PPPG) e ao National Institute of Health (NIH) pelo Apoio financeiro.
9
A Cincia tambm como muitas outras coisas No mundo obra prima da criao de Deus!
10
RESUMO
No Brasil, a Leishmania chagasi a espcie que causa a leishmaniose visceral (LV). A Leishmaniatem a capacidade de causar um estado de parasitismo intracelular nos macrfagos. A destruiodos parasitas, tanto no incio da infeco, como na fase tardia, depende da ativao de macrfagospor citocinas. Leishmania evade da resposta imunolgica do hospedeiro e sobrevive sem omacrfago durante a doena. A infeco por Leishmania chagasi pode induzir hepatites,independente da co-infeco com vrus de hepatites (A-E). A infeco por GBV-C est sendoassociada com proteo progresso da doena, e aumento da sobrevivncia em indivduos HIV-1soro positivos. Neste estudo, objetivou-se avaliar se a infeco subclnica por Leishmania Chagasidepende da modulao de outros patgenos dentre eles o vrus da hepatite G. Um total de 322indivduos, residentes em reas endmicas para LV e um total de 82 pacientes de banco de sangueparticiparam deste estudo. Usando a tcnica de RT-PCR seguida do sequenciamento do fragmentoda PCR da regio 5 NTR e submetendo-se os dados obtidos a um banco de genes (BLAST) parauma anlise comparativa de seqncias do Genebank obteve-se uma identidade de 98% do cloneGBV1 com o isolado 34,5 da hepatite G vrus, 5-UTR, parcial seqncia (AF489995. 1). Dentreos fentipos avaliados, DTH+, DTH-, e LV constatou-se uma maior prevalncia do fentipoDTH+ nos indivduos GBV-C positivos se comparados com DTH- e LV( DTH+ 57%, DTH-10%,LV 33%).Um subgrupo de 4 indivduos de fentipo LV e positivos para GBV-C no ano de1996 foi submetido a novas coletas em 2004. Anlises bioqumicas de enzimas,AST,ALT ,YGT,LDH, Fosfatasse Alcalina e bilirrubinas foram realizadas, bem como, dosagens demarcadores de outras hepatites.Constatou-se que as dosagens bioqumicas no sofreram alteraessignificativas e que os pacientes positivos no ano de 1996 para GBV-C; no ano de 2004apresentaram HVAG positivo, com marcadores negativos, para hepatite B e C. Sugerimos umapossvel interao do vrus da hepatite G com pacientes do fentipo LV e DTH+, com possvelativao da resposta imune celular.
Palavras chaves: Leishmaniose visceral, GBV-C, HIV e co-infeco.
12
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Ciclo biolgico da Leishmania chagasi................................................21
FIGURA 2: Distribuio mundial da leishmaniose................................................. 22
FIGURA 3: Distribuio mundial da leishmaniose visceral....................................23
FIGURA 4:Representao esquemtica da resposta Th1/.Th2................................27
FIGURA 5: Representao esquemtica do vrus GBV-C......................................30
FIGURA 6: Estrutura genmica do vrus GBV-C...................................................33
FIGURA 7: Representao da incidncia mundial co-infeco Leishmaniose e HIV
...............................................................................................................35
FIGURA 8: Interao molecular entre o HIV e o GBV-C.......................................38
FIGURA 9: Eletroforese em gel de agarose mostrando o fragmento da regio 5-NTR do vrus GBV-C......................................................................46
FIGURA10: Seqncia dos pares de base do vrus GBV-C e cDNA.......................51
FIGURA11: Eletroferograma do cDNA do vrus GBV-C......................................52
13
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Freqncia da infeco por GBV-C em doadores de sangue da cidade de Natal
-------------------------------------------------------------------------------------------47
TABELA 2: Populao residente em reas endmicas para LV distribuda de acordo com
Sexo e idade mdia frente aos fentipos--------------------------------------------49
TABELA 3: Populao residente em rea endmica para L.chagasi de acordo
Com fentipos-------------------------------------------------------------------------50
TABELA 4: Resultado de dosagens bioqumicas dos pacientes GBV-C positivos
(ano 1996) amostragem nova (ano 2004)------------------------------------------53
TABELA 5: Resultado de dosagens imunolgicas dos pacientes GBV-C positivos
(ano 1996) amostragem nova (ano 2004) ------------------------------------------54
14
LISTA DE ANEXOS
ANEXO------------------------------------------------------------------------------------------A
15
LISTA DE ABREVIATURAS /SIGLAS
ABTS - 2,2 azino-di (cido sulfnico 3- etilbenzotiazolino)
APCs Clulas Apresentadoras de antgenos (Antigen Presenting cells)
BSA Albumina soro bovina
BT - Bilirrubina total
BD - Bilirrubina direta
BI Bilirrubina indireta
cDNA- DNA complementar
CD28 - Receptor de superfcie de clula TCD4+
C3H/HeN - Linhagem de camundongos
CD4 - Molcula de superfcie de clula T
DTH - Teste de Hipersensibilidade Tardia
DNA - cido Desoxirribonuclico.
Dntp - Desoxirribonocleosdios Trifosfatados (ATP,TTP,CTP,GTP)
E2 - Protena do vrus do GBV-C
ELISA - Ensaio Imunoenzimtico
EDTA - cido Etilenodiamina Tetractico
F.ALC- Fosfatase Alcalina
GMCSF - Fator estimulador de colnia de granulcitos e macrfagos.
GBV-A - Hepatite de vrus G (A)
GBV-B - Hepatite de vrus G (B)
GBV-C - Hepatite de vrus G (C)
HIV - Vrus da Imunodeficincia Humana
H202 - Perxido de hidrognio
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HCV - Vrus da Hepatite C
HBSAg - Vrus da Hepatite B
HVAG - Anticorpo da Hepatite A IgG
HVAM - Anticorpo da Hepatite A IgM
IgG - Imunoglobulina G
IgA - Imunoglobulina A
IgE - Imunoglobulina E
INOS - Gene Indutor da xido Ntrico Sintetase
IFN- Interferon gama
IL2 Interleucina 2
IL3 Interleucina 3
IL4 Interleucina 4
IL5 Interleucina 5
IL6 Interleucina 6
IL9 Interleucina 9
IL10 Interleucina 10
IL13 Interleucina 13
IgG20 Isotipos de Imunoglobulinas G
IgG1 Isotipos de Imunoglobulinas G
IgG3 Isotipos de Imunoglobulinas G
IgA Imunoglobulina A
IL12R 1 Subunidade 1 receptora de IL12
IL12R 2 Subunidade 2 receptora de IL12
kDNA DNA de cinetoplasto
17
KMP11 Protena da membrana cinetoplasto (kinetoplastid membrane protein 11)
LCA Leishmaniose cutnea Americana
LV Leishmaniose Visceral
nM Milimolar
ng nanograma
MgCl2 Cloreto de Magnsio
M MLV Transcriptase Reversa
MHCII Complexo Principal de Histocompatibilidade Classe II
NK Clulas matadoras naturais (Natural Killer)
NTR Regio no traduzida
Na2CO2 Bicarbonato de Sdio
NaHCO3 Hidrocarbonato de Sdio
L Mililitro
ng nanograma
pb Pares de bases
PBM Cs Clulas mononucleares do sangue perifrico
PCR Reao da polimerase em cadeia
pH Potencial Hidrogenionico
PHOX Enzima oxidase fagoctica
PBS Tampo Salina Fosfatada
ROI Reativos Intermedirios de Oxignio
RNI - Reativos Intermedirios de Nitrognio
RDA Representao diferencial de amplificao
RT PCR Reao em cadeia da polimerase transcriptase reversa
18
RNA Acido Ribonuclico
rK39 Antgeno recombinante K39
SIDA Sndrome da Imunodeficincia adquirida
RPMI Meio de cultura
Regio 5 NTR Regio no traduzida
SMF Sistema monocitico fagocitrio
SISPA Seqncia independente de amplificao simples de primer
SDS 5% - Dodecil sulfato de sdio
TCD4+ - Clula CD4 auxiliar
Th1 clula T auxiliar 1 (T helper 1)
Th2 clula T auxiliar 2 (T helper 2)
TGF- Fator de transformao do crescimento beta
TNF - - fator de necrose tumoral alfa
TNF - - fator de necrose tumoral beta
Tris Hidrximetil aminometano
TBE Tampo de corrida contendo Tris base, cido brico, cido etilenodiamina, tetractico
TAE Tampo de corrida
TGO Transaminase glutmica oxalactica
TGP Transaminase glutmica pirvica
GT Gama glutamil transferase VHG Hepatite G vrus
19
SUMRIO
1 - INTRODUO--------------------------------------------------------------- 21
1.1. Aspectos Gerais---------------------------------------------------------------21
1.2. Urbanizao da Leishmaniose no Brasil---------------------------------- 24
1.3. Resposta imune a leishmania----------------------------------------------- 25
1.4. A infeco por leishmania em reas endmicas--------------------------28
1.5.Vrus da Hepatite G-----------------------------------------------------------29
1.6. Co-infeco--------------------------------------------------------------------34
2.0.OBJETIVOS-------------------------------------------------------------------39
2.1.1. Objetivos especficos------------------------------------------------------39
3.0. MATERIAIS E MTODOS------------------------------------------------40
3.1. Pacientes com LV e indivduos com infeco sub clnica--------------40
3.2 Avaliao fsico-laboratorial------------------------------------------------40
3.3.Controles e primers-----------------------------------------------------------41
3.4 Determinao da infeco por Leishmania Chagasi---------------------41
3.4.1Diagnstico clnico- Epidemiolgico-------------------------------------41
3.4.2 Pesquisa direta do parasita-------------------------------------------------41
3.4.3 Determinao de anticorpo anti-Leishmania no soro-------------------42
3.4.4 Teste cutneo de hipersensibilidade tardia DTH------------------------42
3.4.5 Isolamento de DNA no sangue perifrico--------------------------------42
3.4.6 Ensaio de proliferao celular---------------------------------------------42
3.4.7 Determinao de citocinas--------------------------------------------------43
20
3.5 Determinao da infeco por Leishmania Chagasi e pacientes portadores
do vrus GBV-C---------------------------------------------------------------------44
3.5.1 Definio de fentipos-------------------------------------------------------44
3.5.2 Extrao de RNA (GBV-C) e RT-PCR------------------------------------45
3.5.3 Sequenciamento---------------------------------------------------------------45
4.0 RESULTADOS-----------------------------------------------------------------46
4.1 Incidncia da infeco pelo vrus da hepatite G em Natal RN
em doadores de sangue-------------------------------------------------------------46
4.2 Dados demogrficos de indivduos doadores de sangue da cidade de
Natal RN-----------------------------------------------------------------------------47
4.3 Avaliao da infeco pelo vrus da hepatite G em populao
Exposta L. Chagasi-----------------------------------------------------------------48
4.4 Sequenciamento do produto amplificado por PCR------------------------51
4.5.Avaliao da funo heptica-------------------------------------------------53
5.0.DISCUSSO--------------------------------------------------------------------55
6.0 CONCLUSES-----------------------------------------------------------------58
7.0 REFERNCIAS-----------------------------------------------------------------59
8.0 ANEXOS-------------------------------------------------------------------------74
21
1. INTRODUO
1.1. Aspectos Gerais
A leishmaniose pertence a um grupo de doenas causadas pelo protozorio Leishmania
ssp, pertencente ordem cinetoplastidae e a famlia tripanosomatidae (LAINSON e SHAW, 1987).
As Leishmania spp so espcies dimrficas, sendo parasitas intracelulares obrigatrios do Sistema
Monocitico Fagocitrio (SMF) em mamferos. A forma intracelular presente em mamferos a
amastigota, enquanto no mosquito (Lutzomyia longipalpis), a forma a promastigota, de
localizao extracelular.Na figura 1 est representado o ciclo biolgico da Leishmania chagasi.
FIGURA 1. Ciclo biolgico da Leishmania chagasi.
Multiplicaodas
amastigotas
Transformaoda promastigotaem amastigota
Inoculao das promastigotasna pele
Ingesto dosmacrfagosinfectados comamastigotas
Multiplicao daspromastigotas
Estgio no mosquito
Ingestodas clulas
Amastigota transf.
Estgio no homem
Promastigotas fagocitadas por macrfagos
22
A Organizao Mundial da Sade estima que 350 milhes de pessoas esto sob risco de
Infeco por Leishmania e que 12 milhes so infectadas anualmente (PEARSON et al., 2001;
DESJEUX, 2001). A leishmaniose uma endemia que atinge os 5 continentes do mundo dentre
eles o continente americano.( NATALINO et al., 2003 ; LYNDEN et al.,2000)
FIGURA.2 .Distribuio mundial da Leishmaniose.Fonte:IDEP.
O parasita leishmania considerado um agente oportunista (BADAR et al.,1990).
Indivduos infectados e imunosuprimidos geralmente desenvolvem a doena com curso clnico
distinto e difcil teraputica. A leishmaniose continua em expanso em pases subdesenvolvidos e
mais recentemente, na Europa em funo da epidemia da infeco por HIV. A figura 2 mostra a
distribuio mundial da leishmaniose.
23
O parasita que causa a leishmaniose visceral (LV) teve o seu primeiro achado em 1885,
na ndia. Entretanto s em 1903 foi identificado, simultaneamente, por William Leishmam e
Charles Donovan. No mesmo ano, Laveram e Mesnil, denominaram o microorganismo como
Piroplasma donovani e Ross, em 1959 denominou-o de Leishmania donovani, em homenagem a
Leishmam e Donovan. No Nordeste do Brasil, o primeiro relato do parasito foi feito por Penna em
1934, ao encontrar formas amastigotas em indivduos com suspeita de febre amarela. Em 1937,
Cunha e Chagas supondo ter encontrado uma nova espcie responsvel pelo calazar, no novo
mundo, diferente da Leishmania donovani, propuseram a denominao da espcie Leishmania
chagasi. Em 1956, Deane e Alencar elucidaram os aspectos epidemiolgicos da doena no Cear.
FIGURA 3. Distribuio mundial da leishmaniose visceral (http://www.reise-
tropenmedizin.de/leish2.htm.)
A leishmaniose visceral ocorre em mais de 80 pases. Nos continentes Asiticos e
Africanos o agente etiolgico causal a Leishmania donovani. Nos continentes da rea
mediterrnea esta doena causada pela Leishmania infantum, na Amrica do sul por Leishmania
24
chagasi com 90% dos casos oriundos no Brasil ( PEARSON, SOUSA & JERONIMO, 2000). A
Leishmania chagasi reconhecida atualmente como originria da Leishmania infantum, tendo sido
trazida para as Amricas pelos povos ibricos no perodo de colonizao.
A Leishmaniose Cutnea Americana (LCA) uma doena granulomatosa crnica com
aspecto de manifestao clnica que incluem ulceraes cutneas simples, infeco difusa e doena
mucosa. Os agentes etiolgicos so L. mexicana, L. brazilienses, L. panamemsis. A L. chagasi
pode causar tambm envolvimento cutneo, localizado, com leses bem definidas na pele (BLUM
et al.,2004 ) enquanto a Leishmaniose cutnea difusa caracterizada por anergia seletiva,
resultando no envolvimento extensivo da pele e mucosa da nasofaringe e alguns ndulos linfticos
com parasitas em abundncia (CONVIT et al.,1972; CONVIT et al.,1994; CASTES et al.,1983;
CASTES et al.,1988;CONVIT et al.,1974).
1.2. Urbanizao da Leishmaniose no Brasil
No Brasil, a distribuio da leishmaniose mudou, consideravelmente, nos ltimos 20
anos (COSTA et al.,1990; JERNIMO et al.,1994). A doena era encontrada, principalmente, em
reas rurais, na regio do semi-rido nordestino, nos boqueires de serra (ALENCAR et al., 1978).
Epidemias de LV foram descritas em centros urbanos, como Teresina, no Piau (COSTA et al.,
1990) em Natal, Rio Grande do Norte (JERNIMO et al., 1994), entre outras localizaes.
25
1.3. Resposta imune a Leishmania
A resposta imune a Leishmania e a evoluo frente infeco deste patgeno resultam
da complexa interao entre fatores de virulncia do parasita e a resposta imune mediada por
clulas, geneticamente determinada, de seus hospedeiros (PEARSON et al.,1990). A imunidade
celular exerce um papel central, no entanto, outros segmentos do sistema imune so importantes.
A imunidade humoral no protetora no curso da evoluo da infeco. H ativao
policlonal de linfcitos B com produo de anticorpos da classe IgG, IgA e IgE no especficos
(GHOSE et al.,1980) e anti-leishmania, porm, ineficientes em controlar a parasitose (REZAI et
al.,1978). H indcios que a presena de anticorpos pode funcionar como um aspecto agravante na
patogenia, facilitando a entrada da leishmania e levando a uma produo de IL 10 (MILES et al.
2004). A formao de complexo antgeno-anticorpo pode contribuir para a plaquetopenia, um
achado freqente na forma clssica (MATTOS, 1998) e para a nefropatia, uma manifestao
descrita ocasionalmente na doena (MANSON-BAHR e MANMOUD, 1973). A imunidade inata
nos eventos iniciais da infeco influencia de modo decisivo no padro da resposta imune celular
(FEARON e LOCKSLEY, 1996).
Macrfagos so os stios preferenciais de multiplicao da leishmania. Estas clulas
tm um proeminente papel na defesa do hospedeiro por produzirem dano celular em agentes
infecciosos e tumorais (ZHUANG e WOGAN, 1997). A ao microbicida do macrfago
conseqncia da produo, geneticamente determinada, de intermedirios reativos de oxignio
(ROI), pela enzima oxidase fagoctica (Phox) e de intermedirios reativos de nitrognio (RNI),
pela enzima xido ntrico sintase induzida (INOS) (GANTT et al., 1995; GANTT et al., 2003).
As clulas matadoras naturais (NK) tm marcante atuao na fase inicial da infeco
por leishmania, por serem clulas citotxicas pr-ativadas capazes de mediar sua funo efetora,
sem sensibilizao prvia. Estas clulas so reconhecidamente, produtoras de IFN- e TNF- ,
26
algumas das citocinas envolvidas na ativao do macrfago e na diferenciao de clulas TCD4
(TRINCHIERI et al., 1996.; TRINCHIERI et al. ,1994).
Clulas dendrticas tambm podem albergar leishmania. Suas representantes na pele, as
clulas de Langherans tm a habilidade nica de transportar parasitas do stio de infeco na pele
para reas de clulas T do linfonodo de drenagem ( MOLL, 1993 ). O complexo peptdeo-MHC
classe II mais estvel nas clulas dendrticas do que nos macrfagos, tornando-as assim, clulas
apresentadoras de antgenos (APCs) mais potentes ( FLOHE et al.,1997 ). H, portanto, evidncias
de que o parasita estimula a maturao de clulas dendrticas, as quais produzem IL-12 criando
assim, um micro-ambiente favorvel para produo de INF pelas clulas NK com conseqente
desenvolvimento de uma resposta imune protetora na leishmaniose (MOLL et al., 2000). Existem
ainda evidncias de que somente clulas dendrticas, e no macrfagos, so capazes de apresentar,
persistentemente, o antgeno s clulas T e assim manter uma resposta imune sustentada contra
leishmania (MOLL et al.,1995).
No tocante imunidade celular, as disfunes envolvendo a clula TCD4+ so cruciais
no estabelecimento de uma resposta protetora, ou no, na LV. O modelo murino experimental
revelou duas sub-populaes destas clulas com habilidades funcionais distintas e reconhecidas
pelo perfil de citocinas produzido quais sejam, o subtipo Th1 capaz de produzir IL-2, TNF- e
INF e o sub-tipo Th2 produtor de IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13. Algumas citocinas,
entretanto, so produzidas pelos dois sub-tipos de clulas como IL-3, GM-CSF e TNF-
(MOSMAN et al.,1986). Estudos posteriores, no mesmo modelo animal, revelaram que as clulas
Th1 e Th2 tambm diferem na resposta a estas citocinas. Enquanto IL-4, produzida pela clula
Th2, induz a proliferao da prpria Th2, mas no de Th1 (KUPPER et al.,1987); IL-2, produto da
clula Th1, induz a proliferao dos dois subtipos da clula T (BARRAL et al.,1991). Por outro
lado, foi demonstrado que INF- (Th1) bloqueia a proliferao de clulas Th2 (GAJEWISK et al.,
27
1989), enquanto, IL-10 (Th2) suprime a secreo de citocinas por clulas Th1 (FIORENTINO et
al., 1991). Portanto, parece haver um mecanismo de contra-regulao entre Th1 e Th2. A figura 4
representa esquematicamente os dois tipos de respostas (Th1/Th2).
FIGURA 4: Representao esquemtica da Resposta Th1/Th2.
Com relao s diferenas funcionais, verificou-se que os linfcitos Th1 estimulam a
proliferao celular, levando a reao de hipersensibilidade tipo retardado (DTH), e induzem a
produo de isotipos de imunoglobulinas (IgG2a), fixadores de complemento, favorecendo assim,
a fagocitose. Enquanto que, os linfcitos Th2 induzem a produo de IgG1, IgG3 e IgA, pouco
28
fixadoras de complemento, alm de IgE, a qual se liga a superfcie do mastcito provocando a
resposta do tipo imediato, tpica dos processos alrgicos (LOHOFF et al.,1998).
A diferenciao da clula TCD4+ tambm influenciada pela apresentao do
antgeno, a qual se apropriada, capaz de expandir clulas Th1 estabelecendo, assim, uma resposta
protetora anti-leishmania. Admite-se que um dos mecanismos de escape do sistema imune
utilizado pela leishmania a interferncia nesse processo. Kima et al. (1996) observaram que
macrfagos infectados com amastigotas tm uma menor capacidade de apresentar antgenos do
que aqueles infectados com promastigotas; provavelmente, durante a transformao para a forma
intracelular, antgenos do parasita so liberados do MHC classe II prejudicando a ativao da
clula T.
1.4. A infeco por leishmania em reas endmicas
Estudos realizados em reas endmicas para L. chagasi mostraram que a maioria das
pessoas infectadas por este protozorio tem resoluo prpria da infeco, e somente um subgrupo
desenvolve doena. Indivduos com doena apresentam supresso celular leishmania especfico,
com inibio de proliferao de clulas T especficas do parasita, deficincia na produo de IL-2
e INF PEARSON et al., 1996; PEARSON et al., 2001). Esses indivduos apresentam um teste de
hipersensibilidade cutnea a antgenos de Leishmania negativo (teste de Montenegro). Uma vez
curados, ocorre reverso da imunossupresso, com proliferao celular a antgenos de leishmania e
produo de citocinas do tipo 1. Em reas endmicas para Leishmania, a infeco assintomtica
por Leishmania tem sido classicamente detectada pela avaliao da hipersensibilidade cutnea ao
antgeno da Leishmania (teste Montenegro) em um indivduo sem histria de LV. Estudos
realizados no Cear mostraram que 76% dos indivduos infectados tornaram-se Montenegro
positivo aps 3 anos e 86% das pessoas que foram confirmadas como portadoras da leishmaniose
29
visceral tornaram-se DTH+ aps tratamento, com aproximadamente um ano aps tratamento. Em
Jacobina 89% desses com LV confirmada desenvolveram um Montenegro positivo quando
testadas de 1 a 6 anos aps tratamento. Em Natal, uma rea recente endmica para L. chagasi, ns
temos observado desenvolvimento de Montenegro positivo de 8 meses a 3 anos aps tratamento
com sucesso. No Cear, a porcentagem de positividade de teste cutneo variou de 8% a 26%
dependendo da localidade dentro da rea de estudo (ROBERTS et al., 2000).
A imunidade contra o patgeno mediada por clulas. Infeco da Leishmania major
em camundongos tem demonstrado ser uma representao prototpica Th1/Th2, dicotomia em
clulas T ativadas. A expanso de clones Th1 CD4+ prottica, em contraste com uma
predominncia na resposta Th2 em disseminao (PEARSON, 2001).
1.5. Vrus da Hepatite G.
Os primeiros achados do vrus da hepatite G foi h aproximadamente 30 anos atrs em
um estudo de transmisso seriada de hepatites em sagis a partir de soros de pacientes com
sintomatologia de hepatite (DEIHARDT et al., 1967). Em 1995, atravs da tcnica de amplificao
de acido nuclico chamada RDA (Representation Differential Amplification), (LISITSYN et al.,
1993) dois diferentes vrus GB-A (GBV-A) e GB-B (GBV-B) foram identificados em sagis
(SIMONS et al., 1995). Posteriormente, um outro vrus semelhante ao GBV-A, GBV-B foi
identificado em humanos pelo mesmo grupo, usando-se iniciadores (primers) degenerados capazes
de detectar diferentes vrus da famlia Flaviviridae, este vrus foi designado como GBV-C
(SIMONS et al.,1995). Em 1996, um outro grupo utilizando uma tcnica de amplificao de cido
nuclico denominada como SISPA (Sequence Independent Single Primer Amplification),
amplificou o RNA do mesmo vrus a partir do soro de um paciente (PNF 2161) com hepatite
30
crnica no A, noB, e o designou como vrus da Hepatite G (GBV-C) (LINNEN et al., 1996).
Comparaes entre as seqncias do GBV-C/VHG mostram uma identidade de 95% na seqncia
de aminocidos e de 86% na de nucleotdeos, constituindo, portanto, diferentes isolados do mesmo
vrus. A identidade do GBV-C com GBV-A, GBV-B e VHG no maior do que 32%, levando
cada um deles a pertencer a grupos distintos dentro da famlia Flaviviridae. Ento, estes vrus eram
distintos entre si, e possuam homologia restrita entre si e o vrus da hepatite C. (LEARY et al.,
1996; MUERHOFF et al., 1995). Na figura 5 temos uma representao esquemtica do Vrus da
hepatite G.
FIGURA 5: Representao esquemtica do vrus GBV-C . (www.iladiba.com.co/
revista/1997/04/avhepat.asp).
31
A organizao do genoma dos vrus GBV-A, GBV-B e GBV-C foi analisada
detalhadamente. Estes vrus possuem genoma de polaridade positiva, RNA fita simples, com mais
de 9000 nucleotdeos (~ 9,4 k bases), contendo uma nica regio aberta de leitura que codifica
uma poliprotena precursora (LEARY et al., 1996) (MUERHOFF et al., 1995). A caracterstica
mais marcante do GBV-C, que compartilhada pelo GBV-A a ausncia da protena do core
viral. (SIMONS et al., 1996). Embora algumas regies antignicas j tenham sido identificadas
(PILOT-MATIAS et al., 1996), os resultados obtidos ainda esto longe da padronizao de testes
imunolgicos com sensibilidade e especificidade adequada para a deteco da infeco ativa
(IGM) pelo GBV-C. Posteriormente, foram padronizados testes para a deteco de anticorpos
contra o envelope viral, utilizando antgeno recombinante expresso em clulas de ovrio de
hamster chins. Estes testes funcionam como marcador para infeco passada pelo vrus, devendo
ser negativos durante a fase virmica. A presena deste anticorpo est associado com o
desaparecimento do vrus da circulao (clearence viral) na maioria dos casos, sendo sugestivo da
resoluo da infeco. (DILLE et al., 1997) (TACKE et al., 1997). A deteco da infeco recente
pelo GBV-C s pode ser realizada pela amplificao do cido nuclico (RT-PCR) do soro ou de
outros lquidos biolgicos, utilizando iniciadores (primers) especficos de diferentes regies do
genoma do vrus.(SIMONS et al.,1995; PINHO et al.,1999; KINOSHITA et al., 1997; KONOMI
et al.,1999).
O Vrus da Hepatite GBV-C, um flavivrus inicialmente isolado de pacientes com
hepatite, mas que no tinham relatos de hepatite devido aos vrus A-E (STAPLETON et al., 2003;
XIANG et al., 2001; WILLIANS et al., 2004; LISITYN & WIGLER, 1993). Como uma alta
prevalncia tem sido observada em indivduos saudveis, o nvel de patogenicidade
desconhecido. A forma de transmisso do GBV-C melhor documentada por via parenteral,
especialmente por transfuso sanguneas (ALTER et al., 1997; LINNEN et al., 1996; ALTER et
32
al., 1995; FEUCHT et al., 1999; JARVIS et al., 1996; NUBLING et al., 1996; SCHMIDT et al.,
1996).
A associao da transmisso sangunea com o aparecimento da hepatite foi
especialmente bem relatada, pois o vrus se tornou detectvel somente aps a recepo da
transfuso (LINNEN et al., 1996). A anlise da seqncia dos vrus encontrados tanto no doador
quanto no receptor confirmou esta associao. Desta forma, o vrus possui alta prevalncia entre
usurios de drogas endovenosas (AIKAWAT et al., 1996; STARK et al., 1996), politransfundidos
( CASTELING et al., 1998 ), hemoflicos ( LINNEN et al., 1996; GALLIAN et al., 1998 ) e
hemodialisados ( CASTELING et al., 1998; DE LAMBALLERIE et al., 1996; EGAWA et al.,
1996; MASUKO et al., 1996; FEUCHT et al., 1999). As transmisses sexual e vertical tm sido
tambm demonstradas. Contudo, ainda no existe uma relao estabelecida entre infeco por
GBV-C e outras infeces relacionadas com comportamento sexual de risco. A infeco por GBV-
C est sendo associada proteo, progresso da doena e aumento da sobrevivncia em
indivduos HIV-1 soropositivos ( WILLIAMS et al., 2004 ). Alm disso, a infeco por GBV-C
est associada a um prognstico ruim de indivduos infectados por HIV ( ALTER et al., 1997 ).
A epidemiologia do GBV-C varia entre os diversos pases, com baixa prevalncia em
pases desenvolvidos 0,9% no Japo ( LINNEN et al., 1996 ) 1,4% nos USA ( LEARY, 1996 ) e
alta prevalncia na frica (11% na frica do Sul) ( OLIVEIRA, 2002 ) e Amrica do Sul (14,6%
na Bolvia) ( WATANABE et al., 2003 ). A soroprevalncia de GBV-C RNA parece ser
relacionada com idade, raa e nmeros de parceiros sexuais.
No Brasil, estudos sobre hepatite G em banco de sangue tm revelado que 5-12% so
GBV-C RNA positivos. ( RIBEIRO et al., 2002; LEVI et al., 2003; GALLIAN et al., 1998;
DESJEUX, 1998; PINHO et al., 1999 ). A soroprevalncia parece ser dependente da regio. Um
estudo epidemiolgico de GBV-C no Brasil, incluindo 1039 indivduos recrutados de (
DESEJEUX, 1998) uma populao urbana em So Paulo, foram detectados 5,2% GBV-C RNA
33
positivos (GALLIAN, et al., 1998). Por outro lado, um estudo individual em uma rea rural do
Nordeste do Brasil com alta taxa de infeco por esquistossomose relata prevalncias de RNA
positivo para GBV-C de 16,4%. (CUNNINGHAM, 2002). As variaes encontradas nestas regies
podem ser atribudas s diferenas na composio tnica, com maior prevalncia em mulatos
(32,5%) e negros (17,8%) que em Caucasianos (7,4%)e Orientais (0%). Na figura 6 temos uma
representao da estrutura genmica do vrus da hepatite G(GBV-C).
FIGURA 6: Estrutura genmica do vrus GBV-C. Fonte: European Renal Assoc.-Euro. Dialysis
and Transplant assoc. 1997.
Recentemente foi descrito dois agentes da Hepatite G, um deles o vrus (HGV) e outro
o vrus (HGBV-C). A seqncia de nucleotdeos bem como de aminocidos revelam uma
homologia entre HGV e HGBV-C de 86% e 95% respectivamente. Estudos adicionais sobre o
HGV e HGBV-C foram feitos em pacientes com Hepatites criptognica e indivduos com fatores
34
de risco de exposio a vrus de transmisso parenteral. A anlise da seqncia sugere uma
composio genmica de 2900 aminocidos, incluindo motivos altamente conservados: um motivo
helicase, dois motivos proteases e um motivo RNA polimerase RNA dependente.( FABRIZI et al.,
1997).
O GBV-C est incluso na famlia Flaviviridae devido posse de um quadro de leitura
contnuo codificando uma grande poliprotena nica, alm de duas regies no traduzidas extensas
nos terminais 5 e 3. Entretanto, o GBV-C diverge amplamente do vrus do HCV (homologia de
26% na seqncia de aminocidos), para ser classificado como tal (FABRIZI et al., 1997).
1.6. CO-INFECO
Com base nos estudos feitos por Xiang et al.(2001), foi sugerido que pessoas
infectadas com o Vrus da Imunodeficincia Humana (HIV) e co-infectados com GBV-C vrus
tinham um retardo na progresso da AIDS. O GBV-C aparentemente no causa injria ao fgado.
Com base nesse estudo foram utilizados 362 pacientes positivos para HIV dos quais 144 (39,8%)
foram positivos para GBV-C. Quarenta e um dos GBV-C positivos (28,5%) morreram durante o
seguimento do estudo, comparado com 123 dos 218 pacientes que foram negativos para GBV-C
RNA (56,4%). Estudos recentes tem revelado um aumento da co-infeco HIV/LV no Brasil ,onde
no departamento de gastroenterologia da Universidade de So Paulo detectou-se um nmero total
de 850 casos deste tipo de co-infeco.(CHEHTER et al., 2001). Na figura 7 temos a representao
da incidncia mundial da co-infeco da Leishmaniose / HIV.
35
FIGURA 7: Representao da incidncia mundial co-infeco Leishmaniose e HIV.(The new England Journal of Medicine, December 1999).
A replicao do HIV diminuda in vitro pela co-infeco co GBV-C. A replicao do
GBV-C em clulas mononucleares do sangue perifrico aparentaria ser no citoptica e no
inibiria a sntese celular de protenas. Assim, o efeito sobre a replicao do HIV no parece ser
resultado de citotoxicidade celular. O efeito inibitrio do crescimento do HIV, pela replicao de
GBV-C, em culturas de clulas de medula evidente quando a infeco por HIV precede a de
GBV-C, e a infeco de GBV-C no altera a expresso de CD4, CXCR4 e CCR5. O mecanismo de
36
inibio, portanto parece operar durante um estgio da infeco do HIV, aps o acoplamento e
entrada. (XIANG, et al., 2001).
Gallian et al (1998), num estudo realizado em uma populao rural do Nordeste do
Brasil, com prevalncia de 80-90% de esquistossomose, observaram a presena de co-infeco
com GBV-C/HGV. Apesar da ausncia de risco de exposio parenteral, a prevalncia de
marcadores de infeco para GBV-C, foi aumentada de forma inusual (viremia 16,4% e anticorpos
especficos 18,3%). Suspeitando-se, portanto, que a infeco por helmintos influenciava a resposta
imune infeco por GBV-C, tendo-se alterado o padro de resposta de citocinas de Th1 para Th2,
resultando em uma depurao viral mais demorada.
Um estudo foi feito com 80 indivduos HIV-1 soropositivos acompanhados por oito
anos, onde os pacientes sofreram significativa diminuio nos nveis de IL2 e IL12, e um
significativo aumento de IL4 e IL10, em um grupo GBV-C negativo, enquanto indivduos GBV-C
positivo no sofreram estas mudanas ( NUNNARI et al.,2003).
Outro estudo feito recentemente por Willians et al. (2004), onde os autores avaliaram
271 homens que participaram do estudo multicntrico de coorte da AIDS atravs da viremia do
GBV-C por RT-PCR ou anticorpo E2 por ELISA entre 12 e 18 meses aps a soroconverso
positiva do HIV (consulta inicial). Um subgrupo de 138 pacientes tambm foi avaliado neste
estudo entre 5 e 6 anos aps a soroconverso do HIV (ultima consulta). Os resultados deste estudo
revelaram que a Infeco pelo GBV-C foi detectada em 85% dos homens com soro converso do
HIV com base na presena de anticorpo E2 (46%) ou RNA de GBV-C (39%). Apenas um homem
adquiriu viremia do GBV-C entre a consulta inicial e final, porm 9% dos homens tiveram
depurao de RNA GBV-C entre estas consultas. O nvel de GBV-C entre 12-18 meses aps a soro
converso do HIV no esteve significativamente associado sobrevida; entretanto, homens sem
RNA GBV-C entre 5-6 anos aps a soro converso para o HIV apresentaram 2,78 vezes mais a
propenso de morte do que os homens com viremia persistente do GBV-C (95% de intervalo de
37
confiana, 1,34 para 5,76; P = 0.006). O pior prognstico esteve associado perda de RNA de
GBV-C (dano relativo para morte quando comparado com RNA GBV-C persistente, 5,87; P =
0.003). Os autores concluram que a viremia pelo GBV-C esteve significativamente associada
sobrevida prolongada entre homens HIV positivos entre 5-6 anos aps a soro converso do HIV,
porm no entre 12-18 meses, e a perda de RNA do GBV-C entre 5-6 anos aps a soro converso
do HIV esteve associada a piores prognsticos. De acordo com os autores, o entendimento dos
mecanismos de interao entre o GBV-C e o HIV pode fornecer esclarecimento sobre a progresso
da doena causada pelo HIV. (WILLIAMS et al., 2004).
Uma nova investigao feita por Stepleton et al. (2004) e sua equipe na universidade
de Iowa, nos Estados Unidos conseguiu descrever o mecanismo pelo qual o vrus da hepatite G
(GBV-C) retarda progresso do HIV e aumenta a sobrevivncia dos infectados. Os pesquisadores
infectaram leuccitos com GBV-C e HIV e fizeram uma comparao com clulas que s haviam
sido infectadas com HIV. As clulas com GBV-C registraram um aumento de certas quimiocinas,
ou seja, protenas protetoras do sistema Imune, que se uniriam aos receptores moleculares das
clulas que utilizam o HIV como porta de entrada; quando estes receptores desapareciam, o vrus
do HIV seria incapaz de infectar as clulas. Ao neutralizar as quimiocinas com anticorpos, o GBV-
C no atuaria e no causaria nenhum efeito protetor e o HIV poderia continuar sua expanso.(
STEPLETON et al., 2004).
Na figura 8 temos um modelo estrutural dos possveis mecanismos protetores que
acometem a infeco causada pelo GBV-C e os pacientes infectados com o vrus do HIV , que
inclui um mecanismo de manuteno de perfil de citocinas Th1 dominante mais que o perfil Th2
dominante a inter-regulao do CCR5 ,a inibio da entrada e da propagao do HIV e o aumento
dos mecanismos imunes intracelulares inatos e a diminuio da eficcia da transcrio do HIV do
pro-vrus integrado ( WILLIAMS et al., 2004).
38
FIGURA 8: Interao molecular entre o HIV e o GBV-C.
(http://www.diariomedico.com/ficheros/diariomedico/fotos/graficomedicina040304.jpg)
39
2.0. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar a influncia da co-infeco pelo vrus da hepatite G na evoluo frente
infeco por L. chagasi.
2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS
1. Determinar a prevalncia da infeco pelo vrus da hepatite G em Natal.
2. Determinar a infeco pelo vrus da hepatite G em uma populao exposta
infeco por Leishmania chagasi;
3. Avaliar a funo heptica de indivduos infectados pelo vrus da hepatite G.
4. Determinar a resposta imune a antgenos de Leishmania em indivduos
infectados pelo vrus da hepatite G e com histria de infeco por Leishmania.
40
3.0. MATERIAIS E METDOS.
3.1. Pacientes com LV e indivduos com infeco subclnica
Os participantes deste trabalho foram pacientes com LV, recrutados no Hospital Giselda
Trigueiro, e indivduos residentes em rea endmica para L. chagasi. Para indivduos com suspeita
de LV foi realizado aspirado de medula ssea para a identificao deste parasita, Foram recrutados
tambm, indivduos em fase ps-tratamento, que responderam a terapia por antimonial, alm de
indivduos com infeco subclnica, demonstrado pela presena de uma resposta positiva ao teste
de Montenegro ou anticorpo anti-leishmania positivo.
Todos os indivduos arrolados concordaram em participar do estudo, e esta concordncia
foi expressa pela assinatura do termo de consentimento (TCLE, Anexo). O protocolo foi aprovado
pelo Comit de tica em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Registro
CEP-UFRN 86/04) e Comisso Nacional de tica em Pesquisa (CONEP REGISTRO 10875)
Foi estudada adicionalmente uma populao do banco de sangue para investigar a
prevalncia do vrus da hepatite G (GBV-C).
3.2. Avaliao fsica e laboratorial
Os indivduos participantes deste estudo responderam o questionrio (ver anexo A) e
foram submetidos a exames laboratoriais e fsicos, foram coletados aproximadamente 10 ml de
sangue para realizar, hemograma, extrao de DNA, extrao de RNA e obteno de soro. Para
cada indivduo arrolado foi realizado o teste cutneo de hipersensibilidade tardia (DTH)
41
utilizando-se os antgenos de Leishmania chagasi (Teste de Montenegro) e Mycobacterium
tuberculose (teste tuberculinico). Os dados registrados em fichas individuais foram armazenados
em banco de dados (Programa Excel), sendo os dados posteriormente exportados para o software
Statistica (Estados Unidos).
3.3. Controles e Primers
Os controles positivos e negativos e os primers sense e anti-sense foram
sintetizados pela Invitrogen.
3.4. Determinao da infeco por Leishmania chagasi
3.4.1. Diagnstico clnico-epidemiolgico
Pacientes internados nos hospitais de referncia, com suspeita de LV foram avaliados
clinicamente, de acordo com a presena de sinais e sintomas como hepato e/ou esplenomegalia,
perda de peso, febre entre outras infeces, e posteriormente submetidos aos exames
laboratoriais de rotina para esclarecimento diagnstico, incluindo puno medular (BADARO et
al., 1990).
3.4.2. Pesquisa direta do parasita
O aspirado de medula ssea foi coletado de pacientes com suspeita de LV, com
realizao de esfregao em lmina e colorao pelo mtodo de Giemsa. Atravs de microscopia
ptica pesquisou-se a presena de formas amastigotas dentro de macrfagos ou no meio
extracelular. Esse procedimento foi realizado nos hospitais de referncia por hematologista do
servio. Amostras de DNA isoladas desses pacientes foram tambm amplificadas por PCR para
42
determinar a existncia de L. chagasi em sangue perifrico, seguindo protocolo j descrito
(SMYTH et al., 1992).
3.4.3. Determinao de anticorpos anti-leishmania no soro
A presena de anticorpos anti-leishmania foi verificada pelo ensaio imunoenzimtico
(ELISA), utilizando-se o antgeno total e o recombinante K39 (rK39) de L. chagasi (EVANS et
al., 1992; BURNS et al., 1993) e padronizado para essa populao (BRAZ et al., 2002).
3.4.4. Teste cutneo de hipersensibilidade tardia (DTH)
O teste de Montenegro foi realizado utilizando-se o antgeno de L. chagasi
gentilmente cedido pelo Dr. Steven Reed (Infectious Disease Research Institute, Seattle, WA,
EUA), inoculando-se, intradermicamente, 0,1 ml (25 g) do antgeno no antebrao. A leitura da
reao foi feita 48-72 horas aps a inoculao, medindo-se a rea de endurao. O teste foi
considerado positivo (DTH+) quando a endurao foi igual ou maior do que 5 mm conforme
citado por Braz et al., (2002).
3.4.5. Isolamento de DNA do sangue perifrico
O isolamento do DNA foi realizado conforme descrito por Grimberg et al. 1989,
usando aproximadamente 10 ml de sangue perifrico.
3.4.6. Ensaio de proliferao celular.
Clulas mononucleares do sangue perifrico (PBMCs) foram isoladas do sangue
venoso heparinizado, utilizando-se um gradiente de ficoll-hypaque (LSM;Organ Teknika
Corporation Durham, NC, USA). Aps a terceira lavagem com soluo salina (NaCl a 0,9%), as
clulas foram re-suspensas em meio de cultura RPMI 1640 (GIBCO BRL, Grand Island, NY,
43
USA) suplementado com penicilina/estreptomicina L-glutamina e 10% soro AB humano. Para
ensaio de proliferao as PBMCs foram ajustadas para 2x105cluas/mL, e cultivadas em triplicata
em placas de 96 poos com lisado de antgeno solvel L. chagasi (10 g/mL). Essas clulas foram
pulsadas com 1 Ci de [H3]-Timidina (ICN immunochemicals, Costa Mesa, CA, USA) por poo
no final de 18 h de cultura e incorporao do radioistopo foi quantificado em contador de
cintilao. Os dados foram representados como ndice de estimulao e calculados pela diviso da
mdia expressa em CPM de poos estimulados com antgenos (CPM Ag) subtraindo-se a mdia de
estimulao de clulas sem a presena de antgeno (proliferao basal COM sem Ag). Divide-se
em seguida este resultado pela mdia da estimulao de clulas sem a presena de antgeno (
COM sem Ag), conforme indicado abaixo. Um ndice de estimulao maior que 2 considerado
significativo, isto , indicativo de resposta proliferativa positiva (CARVALHO LP et al., 2003).
IE= CPM Ag- CPM sem Ag
CPM sem Ag
3.4.7. Determinao de citocinas
Para ensaio de citocinas, as PBMCs (3x106) foram cultivadas em meio completo e os
ensaios foram realizados controles sem a presena de antgenos de L.chagasi. Para assegurar o
papel das citocinas e do anticorpo monoclonal anti-citocina em resposta linfoproliferativa, as
clulas mononucleares de pacientes tratados para leishmaniose visceral foram cultivadas em
presena de IL-10 (10 ng/mL), IL-4 (10 ng/mL; DNAX Research Institute, Palo Alto, CA, USA),
TGF-b (10ng/mL) (R&Dsystems Minneapolis, MN, USA) e anticorpo monoclonal anti-IL-12 (10
ng/mL) (R&D Systems) em presena ou ausncia de parasitas lisados. Os sobrenadantes foram
44
coletados e estocados a 20 oC para anlise de INF- , o qual foi quantificado pela tcnica de
ELISA sanduche (Genzyme, Cambridge, MA, USA). A curva padro foi utilizada para expressar
o resultado em pg/ml (CARVALHO LP, et al. 2003).
3.5. Determinao da infeco por Leishmania chagasi e pacientes portadores do
vrus GBV-C.
3.5.1. Definio dos fentipos
Os fentipos foram definidos de acordo com a combinao dos resultados do teste
Montenegro, presena de anticorpo anti- leishmania e histria anterior de LV, como se segue:
a) Indivduos com histria prvia ou atual de LV, confirmada pela presena de
amastigotas, na medula ssea, e ou critrios clnicos e epidemiolgicos incluindo a presena
de anticorpo anti-leishmania, anticorpo anti L.chagasi (extrato bruto) ou anti-proteina
recombinante K39.
b) Pacientes com L. chagasi sem histria de doena, mas apresentando teste
Montenegro positivo e/ou sorologia positiva.
c) Pacientes com L.chagasi sem histria de LV teste de Montenegro negativo e
sorologia positiva.
d) Indivduos expostos residentes em reas endmicas, mas sem histria de
infeco por L. chagasi ou histria de LV, com teste de Montenegro negativo e sorologia
positiva.
e) Pacientes expostos residentes em reas endmicas, mas sem evidncias de
infeco por Leishmania chagasi ou histria de LV com teste de Montenegro e sorologia
negativa.
45
f) Indivduos de Banco de sangue para pesquisa de GBV-C por RT-PCR
(Regio 5NTR).
3.5.2 Extrao de RNA (GBV-C) e RT-PCR
O RNA foi extrado de 50 L de soro dos pacientes atravs de RT-PCR da regio 5`-
NTR do vrus e a tcnica foi executada segundo descrito por Xiang et al., (2001). Soros controles
positivos e negativos foram processados simultaneamente. O produto da RT-PCR foi visualizado
numa eletroforese de gel de agarose a 1,2 % utilizando brometo de etdio.
3.5.3 Sequenciamento
Os PCR foram realizados dobrando-se o volume unitrio das amostras seguindo a
tcnica de Xiang et al., (2001). Do produto da PCR acima foi precipitado o DNA para posterior
sequenciamento. Para isto, utilizou-se o procedimento seguinte: 1 volume do produto de PCR para
1: 20 volumes de Acetato de Sdio 5M. Adicionou-se 2,5 volume de etanol a 100% seguido de
agitao em vortex por 10 minutos. Subsequentemente, o material foi colocado 1 hora a -80 C e
centrifugado por 30 minutos a 14.500 rpm. O sobrenadante foi descartado, secado ao ar e
resuspendido em 10 L de H2O. Para obter-se uma maior concentrao do produto final e
conseqentemente um melhor rendimento da amostra no seqenciador, realizou-se outra PCR, o
fragmento da PCR foi diretamente seqenciado com Big Dye usando-se Dye Terminador ZV.3.1 .
A leitura das bases terminais foi realizada no seqenciador de DNA automtico ABI PRISM 3100-
Avant Applied Biosystems Automated Selvencer. Os dados obtidos foram submetidos a um banco
de genes (BLAST) para anlise comparativa de seqncias do Genebank
46
4. RESULTADOS
4.1. Incidncia da infeco pelo vrus da hepatite G em Natal RN em doadores de
sangue.
O RNA total foi extrado de soro de doadores de banco de sangue (n=82) e,
subseqentemente, avaliado para se determinar a presena de RNA de GBV-C. A figura 8 mostra o
produto amplificado cDNA por RT-PCR utilizando-se oligonucleotdeos especficos para o vrus
GBV-C, indicando um produto de 200 pb.
1 2 3 4 5 6
FIGURA 9: Eletroforese em gel de agarose do fragmento da regio 5-UTR do vrusGBV-C: 1. GBV-C negativo, 2. GBV-C positivo, 3. controle positivo, 4. controle negativoe 5. branco.6.marcador.
200 pb
47
4.2. Dados demogrficos de indivduos doadores de sangue da cidade de Natal RN.
A tabela 1 apresenta os dados demogrficos dos indivduos estudados. A infeco por
GBV-C na populao de doadores no ano de 2004 foi de 19.5%. Analisando-se esta tabela,
observou-se que a infeco por GBV-C mais freqente em doadores do sexo masculino.
TABELA 1: Freqncia da infeco por GBV-C em doadores de sangue da cidade de Natal
GBV-C Masculino
n (%)
Feminino
n (%)
Total
n (%)
Positivo 14 (23,7) 2 (8,7) 16 (19,5)
Negativo 45 (76,3) 21 (91,3) 66 (80,5)
Total 59 (100) 23 (100) 82 (100)
48
4.3. Avaliao da infeco pelo vrus da hepatite G em populao exposta a L.
chagasi.
A avaliao da infeco pelo vrus da hepatite G foi realizada em uma populao
residente na rea perimetropolitana de Natal, a qual j havia sido previamente estudada quanto
exposio a L. chagasi. Neste estudo esta populao foi avaliada quanto co-infeco pelo vrus
GBV-C.
A tabela 2 apresenta os dados demogrficos da populao estudada, sendo esta
distribuda atravs dos fentipos determinados pelos resultados da avaliao clnica, teste
intradrmicos e sorolgicos, conforme descritos em materiais e mtodos. Observa-se nesta mesma
tabela, a caracterizao fenotpica da populao. A populao estudada era constituda de 322
indivduos residentes em reas endmicas para LV com idade mdia compreendida entre 10- 15
em anos.
49
TABELA 2: Populao residente em reas endmicas para LV distribuda de acordo com
sexo frente aos fentipos.
SexoFentipo
Masculino
n ( %)
Feminino
n ( %)
Total
n ( %)
DTH- 14 (7,6) 7 (5) 21 (6,5)
DTH+ 66 (36,1) 86 (62) 152 (47,2)
LV 103 (56,3) 46 (33) 149 (46,3)
Total 183 (100) 139 (100) 322 (100)
Na tabela 3 pode-se avaliar a freqncia da infeco por GBV-C(+) na populao
exposta a L. chagasi. Observa-se nesta tabela, uma freqncia de 9,3% (n=30) de positividade nos
sujeitos avaliados. Nesta mesma tabela observa-se uma associao do vrus do GBV-C em
indivduos infectados por. L. chagasi possibilitando-se analisar que a prevalncia do GBV-C
maior em indivduos DTH+. Com este dado podemos sugerir uma ao conjunta do GBV-C no
sistema imunolgico dos pacientes concomitantemente infectados com L. chagasi. Tais
indivduos teriam suas clulas infectadas pelo vrus GBV-C, e possivelmente, seriam protegidos
50
da ao do parasita, uma vez que, o vrus do GBV-C tambm atua nos receptores de clulas T
(TCD4+) assim como as Leishmanias. A idade mdia dos pacientes infectados utilizados neste
estudo foi de 19,6 anos, constatando-se que a populao predominante de indivduos jovens
TABELA 3. Populao residente em rea endmica para L. chagasi mostrada de acordo
com os Fentipos.
GBV-C
Fentipo Positivo
n (%)
Negativo
n (%)
Total
n (%)
DTH - 3 (10) 18 (6,2) 21 (6,5)
DTH + 17 (56,7) 136 (46,6) 153 (47,5)
LV 10 (33,3) 138 (47,2) 148 (46)
Total 30 (100) 292 (100) 322 (100)
51
4.4. Sequenciamento do produto amplificado por PCR.
O cDNA obtido de um dos casos positivos para o vrus GBV-C foi seqenciado e
submetido a uma anlise no GenBank obtendo-se uma homologia de 98% com 100 tipos de
seqncia do vrus GBV-C. A seqncia do cDNA obtido mostrada na figura 10
GBV-Caggttaagattcctcttgtgcctgtggcgagacagcgcacggtccacaggtgttggccct 123
cDNAaggttaagattcctcttgtgcctgtggcgagacagcgcacggtccacaggtgttggccct 95
GBV-Caccggtgtgaataaggccccgacgtcaggntcgtcgttaaaccgagccc 172
cDNAaccggtgtgaataagggcccgacgtcaggctcgtcgttaaaccgagccc 144
FIGURA 10: Seqncia dos pares de base do vrus GBV-C e cDNA.
52
Na figura 11 temos demonstrado o resultado do eletroferograma do cDNA do vrus
GBV-C de uma das amostras pesquisadas podendo-se observar a indicao grfica dos pares de
base
FIGURA 11: Eletroferograma do cDNA do vrus GBV-C.
53
4.5. Avaliao da funo heptica.
Uma sub populao de indivduos infectados por GBV-C foi avaliada com relao
funo heptica. A verificao das atividades de algumas enzimas e meablitos nos fornecem
indicaes sobre o comprometimento do fgado. Tomando como base os valores de referencias
das dosagens AST, ALT, YGT, Fosfatase Alcalina, LDH, BT, BD, BI, observamos que as
dosagens bioqumicas dos pacientes que foram positivos para GBV-C em 1996, no sofreram
alteraes significativas em seus valores no ano de 2004. Pode-se ento sugerir que nestes
indivduos no ocorreram comprometimentos hepticos considerveis.
TABELA 4: Resultado de dosagens bioqumicas dos pacientes GBV-C positivos (ano 1996)amostragem nova (ano 2004).
PACIENTESAST(UI/l)
ALT(UI/l)
YGT(UI/l)
F.ALC(UI/l)
LDH(UI/l)
BT(mg/dL)
BD(mg/dL)
BI(mg/dL)
01 25 22 17 153 234 0.2 0.1 0.1
02 21 22 20 220 285 1.2 0.4 0.8
03 14 20 30 165 168 0.4 0.2 0.2
04 26 33 36 233 283 0.2 0.1 0.1
54
A tabela 5 mostra outros tipos de marcadores sorolgicos para as hepatites A, B e C.
Observou-se que os pacientes no foram infectados pelo vrus C e B, entretanto, todos tiveram
contato com o vrus da hepatite A ou provavelmente, desenvolveram a doena. Sugerimos assim
que o vrus GBV-C no to hepatotrfico quanto o vrus da hepatite c. Todos os sujeitos
avaliados apresentavam anticorpo antivrus A.
TABELA 5. Resultado de dosagens imunolgicas dos pacientes GBV-C positivos (ano 1996)Amostragem nova (ano 2004)
PACIENTES GBV-C HCV HBSAg AntiHBS HVAG HVAM
01 (+) (-) (-) (-) (+) (-)
02 (+) (-) (-) (-) (+) (-)
03 (+) (-) (-) (-) (+) (-)
04 (+) (-) (-) (-) (+) (-)
55
5.0. DISCUSSO.
A Leishmaniose visceral uma doena potencialmente fatal cujo controle da
multiplicao do parasita, tanto em humanos quanto em animais, depende do desenvolvimento de
uma resposta imune celular tipo Th1 (PANAGIOTIS et al. 2003; CUNNINGHAM et al., 2002).
Badaro et al., (1986) demonstraram que somente 15% dos indivduos infectados na rea endmica
adoecem, isto , desenvolvem o padro de resposta Th2 . Os fatores que determinam o padro
deste tipo de resposta no esto totalmente esclarecidos.
O vrus de GBV-C cuja patogenicidade no homem desconhecida replica-se em
linfcitos. Estudos in vitro demonstraram que o GBV-C inibe a replicao do HIV. Por outro
lado, existem evidencias de que a co-infeco GBV-C /HIV estaria associada a um menor risco de
morte entre os indivduos HIV positivos estando, portanto, relacionado modulao para uma
resposta imune do tipo Th1 (WILLIAMS et al. 2004; TILLMANN et al. 2004). O propsito deste
estudo foi avaliar se a co-infeco GBV-C/ leishmania induziria esse mesmo padro de resposta
imune. A literatura com co-infeco de GBV-C e leishmania muito escassa dificultando assim o
estudo comparativo de como o GBV-C atuaria em pacientes co-infectados com leishmania frente
a uma resposta imune do tipo Th1.
Natal/RN uma importante rea endmica de LV, tendo casos notificados no ano de
2004. A prevalncia de GBV-C numa populao de indivduos supostamente saudveis (doadores
de sangue n=82) em Natal /RN foi de 19.5%, sendo 87.5% do sexo masculino e 12.5% do sexo
feminino, ndice maior do que o observado em outras localidades. Na populao estudada
residente em reas endmicas para LV (n=322), a prevalncia foi de 9,3%, sendo 53% do sexo
masculino e 47% do sexo feminino. Se fizermos uma anlise comparativa dos valores obtidos dos
doadores de sangue com os pacientes de reas endmicas para LV pode-se constatar que, devido
56
ao nmero de pacientes das reas endmicas ser maior que o dos doadores, a quantidade de
indivduos do sexo feminino aumentou significativamente.
Dentre os fentipos estudados dos indivduos residentes em reas endmicas
(Natal/RN) para LV foram obtidos os seguintes resultados dos indivduos positivos para o GBV-C
: DTH (-) 10.0%, DTH (+) 57.0%,LV 33.0%. Como seria esperado foi obtida uma maior
prevalncia no fentipo DTH+ de indivduos infectados com o GBV-C. Pode-se ento sugerir que
pacientes co-infectados com GBV-C / Leishmania poderiam apresentar uma homologia na
resposta imune com os indivduos co-infectados GBV-C/HIV. Dos 322 pacientes das reas
endmicas para LV, 30 foram positivos para GBV-C e destes 30 pacientes, um clone foi
submetido ao sequenciamento e em seguida a um Gen Bank, onde encontramos uma homologia
de 98% com 100 tipos de seqncias do vrus GBV-C regio 5 UTR.,
Um subgrupo de pacientes (n=4) que no ano de 1996 foi submetido a uma anlise de
vrus GBV-C e obtiveram RT-PCR positivos para este vrus, foi submetido uma nova coleta no
ano de 2004, realizando-se dosagens bioqumicas dentre elas: TGO, TGP, YGT, F. alcalina,
bilirrubinas e dosagens imunolgicas, observou-se que os valores das dosagens bioqumicas no
sofreram alteraes significativas levando-se a crer que o GBV-C no induz necrose no
hepatcito. Xiang et al. (2001), em estudos recentes relatou-se a importncia da co-infeco do
vrus GBV-C com o vrus do HIV, onde ambos competem pela ligao ao receptor CCR5 do
linfcito TCD4+, logo se o GBV-C ocuparia este sitio de ligao. Segundo os autores, o HIV no
se ligaria ao receptor e conseqentemente, ocorreria uma proteo ao individuo co-infectado
desenvolvendo um perfil Th1.(WILLIAMS et al. , 2004)
Nas dosagens imunolgicas, os marcadores sorolgicos feitos foram: HCV, HBSAg,
Anti-HBS, HVAG, HVAM, dos quais apenas o marcador HVAG foi identificado positivo nos
quatro indivduos analisados. Conclu-se que os pacientes entraram em contato com o vrus da
hepatite A ou tiveram a doena. Com base nos dados obtidos neste estudo, sugere-se que a co-
57
infeco do vrus GBV-C, em pacientes das reas endmicas para Leishmaniose visceral, pode
modular a resposta do perfil Th2 para um perfil Th1, potencialmente contribuindo para proteo
contra o desenvolvimento de doena ativa.
58
6.0. CONCLUSES.
A prevalncia do vrus GBV-C em uma populao saudvel (doadores de sangue
n=82) foi de 19,5 %. Dentre os indivduos GBV-C positivos, apenas 12,5 % eram do sexo
feminino e 87,5 % do sexo masculino;
A infeco pelo vrus da hepatite G na populao estudada exposta infeco por
Leishmania chagasi (n=322) teve uma prevalncia de 9,3 %, sendo destes 53% do sexo masculino
e 47% do sexo feminino;
Na avaliao da funo heptica, num subgrupo de pacientes (n=4), obtiveram-se
valores normais nas dosagens bioqumicas AST, ALT, YGT, LDH, Fosfatase alcalina e
bilirrubinas
A avaliao da funo heptica revelou que em um subgrupo de pacientes (n=4),
todos foram positivos para HVAG e negativos para HVAM, HCV, HBSAg, Anti-HBSAg;
Na populao de indivduos expostos a L.chagasi (n=322),obteve-se dos indivduos
positivos, para GBV-C(n=30) uma maior freqncia do fentipo DTH+ se compararmos com o
fentipo LV, onde o vrus da hepatite G possivelmente atuaria nos receptores de clulas T
(TCD4+), ocupando o sitio de ligao destas clulas e impedido a ligao das Leishmanias.
59
7.0. REFERNCIAS
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Centro de BiocinciasDepartamento de BioqumicaLaboratrio de Imunogentica
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Ttulo do Projeto: Co-infeco pelo vrus da hepatite G em pacientes infectados por L.chagasi em fase aguda.
Este termo de consentimento pode conter palavras ou expresses que so usadasfreqentemente no meio mdico-cientfico. Caso algum termo no esteja claro para voc, porfavor, informe, de forma que ns possamos esclarecer o significado a voc da melhor maneirapossvel. importante que voc compreenda o que estamos propondo realizar com este estudo,porque ns precisaremos da sua colaborao ou de algum membro da sua famlia paradesenvolvermos esta pesquisa. Se voc for o pai ou a me ou o guardio legal de um menor queesteja sendo convidado a participar deste estudo, o termo voc se aplica a este menor. Oresponsvel legal, por este menor, ser solicitado a ler e dar permisso, por escrito, para que omenor participe deste estudo.
NMERO DE PARTICIPANTES NESTE ESTUDOAproximadamente 100 pessoas participaro deste estudo. Esta populao residente no Rio
Grande do Norte e ser estudada na Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
OBJETIVOEste estudo envolve pesquisa, tendo como objetivo determinar prevalncia de GBV-C/HGVna populao geral. Precisarmos, para isso, obter 10 ml de sangue para extrao de soro e, apartir deste, RNA. Ns estamos convidando voc para participar deste estudo, pois tem sidoobservada, em outros Estados, uma alta prevalncia de GBV-C/HGV em doadores saudveis.
PESQUISA GENTICA
Esta pesquisa se prope a identificar, atravs da amplificao de uma regio especifica doRNA do vrus (5NTR). Para isto, ser necessrio extrair seu soro, que isolaremos do sangue.DNA a substncia que ns herdamos dos nossos pais e transmitimos para os nossos filhos,est relacionado com a nossa herana. Ns nos propomos a estudar os genes envolvidos comcncer para tentar compreender porque as pessoas adoecem. Os genes a serem estudados soaqueles ligados defesa do nosso corpo (sistema imune) e / ou aqueles envolvidos comsulfatao de glicoconjugados, substncias que podem ser encontradas nos nosso corpo.
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PROCEDIMENTOSProcedimento a ser realizado para aqueles que concordarem em participar do projeto:1. Coleta de sangue; (20 ml) para extrao de soro e RNA.
RISCOSOs riscos relativos coleta de sangue incluem sangramentos ou manchas arroxeadas,
infeco e desmaio. Estas complicaes so raras. Ns tomaremos todas as precaues para queesses riscos sejam mnimos. Ns assumimos o compromisso que as amostras de DNA coletadassero usadas para os objetivos aqui propostos. No entanto, ns pedimos permisso para guardar oDNA no utilizado, em nosso laboratrio, no Departamento de Bioqumica da UniversidadeFederal do Rio Grande do Norte. O