COLORAÇÃO DE GRAM E DE ZIEHL-NEELSEN

Texto 1. A Coloracao de Gram e as Variacoes na sua Execucao

RESUMO

A coloracao de Gram e um importante teste realizado nos laboratorios de

microbiologia, sendo um recurso auxiliar no diagnostico de doencas bacterianas. A

partir de um determinado perfil tintorial as bacterias coram-se de roxo ou de rosa e

consequentemente sao classificadas como Gram-positivas ou Gram-negativas,

respectivamente.

A coloracao de Gram envolve uma serie de procedimentos antes de chegar a

etapa final de leitura da lamina preparada: envolve a confeccao do esfregaco, sua

fixacao e passa pela coloracao pro- priamente. Nesta, o corante Cristal Violeta

adsorve-se nas celulas, forma um complexo com o iodo (Lugol) e apos a etapa

diferencial, com alcool-acetona, as celulas sao contra-coradas com Fucsina de

Gram. Neste estudo avaliou-se a influencia de variacoes na referida coloracao

considerando os tempos de exposicao aos corantes Cristal Violeta e a Fucsina de

Gram e o emprego ou nao de lavagens com agua entre as etapas.

Os resultados obtidos mostraram que as diferencas nos procedimentos

aplicados em cada tecnica testada nao alteraram o resultado quando comparados a

laminas padrao.

INTRODUÇÃO

Em geral, sao necessarias coloracoes biologicas para a visualizacao de

bacterias de modo adequado e demonstracao dos detalhes finos das suas

estruturas.

O advento da coloracao representa, em grande parte, o fundamento dos

principais avancos produzidos em microbiologia clínica e em outros campos da

microscopia diagnostica durante os últimos 100 anos.

A maioria das coloracoes utilizadas em bacteriologia tem por finalidade o

diagnostico presuntivo rapido do processo infeccioso e tambem a previa avaliacao

da qualidade da amostra.

A coloracao de Gram e o metodo bacterioscopico mais importante e mais

utilizado atualmente na bacteriologia e sua finalidade e a classificacao de

microrganismos com base em suas características tintoriais, tamanho, forma e

arranjo celular.

As bacterias sao classificadas basicamente em dois grandes grupos: Gram-

positivas e Gram-negativas. No que diz respeito as características tintoriais, as

bacterias Gram-positivas coram-se de roxo e as bacterias Gram-negativas coram-se

de rosa.

A deteccao de microrganismos na amostra e de suma importancia, uma vez

que pode indicar uma terapia antimicrobiana direcionada a um determinado grupo de

patogenos e, tambem, a necessidade da realizacao de cultura com finalidade

diagnostica e/ou epidemiologica.

A tecnica de coloracao de Gram geralmente respeita um protocolo de acoes

que a padroniza. Contudo, ha variantes nesse procedimento relacionadas aos

tempos de execucao da coloracao e a utilizacao de lavagem com agua em dadas

etapas que podem ou nao interferir na visualizacao das estruturas coradas. Nesse

sentido, este trabalho se propos a verificar se estas pequenas variacoes de tempo e

lavagens a partir de protocolos específicos refletem em alguma alteracao na

interpretacao dos resultados da coloracao de Gram.

FREITAS, Valdonir da Rosa; PICOLI, Simone Ulrich. A coloracao de Gram e as

variacoes na sua execucao. Newslab, v. 82, p. 124-128, 2007.

Texto 2. Técnica de Coloracao de GRAM

INTRODUÇÃO

O metodo tintorial predominante utilizado em bacteriologia e o metodo de

Gram. A bacterioscopia, apos coloracao pelo metodo de Gram com diagnostico

presuntivo, de triagem, ou ate mesmo confirmatorio em alguns casos, constitui peca

importante e fundamental na erradicacao e no controle das Doencas Sexualmente

Transmissíveis (DST). Essa tecnica e simples, rapida e tem capacidade de

resolucao, permitindo o correto diagnostico em cerca de 80% dos pacientes em

carater de pronto atendimento em nível local.

Os custos com investimento e manutencao sao consideravelmente baixos

diante da eficacia alcancada com os resultados imediatos dos testes. Essa tecnica

requer instalacao simples, necessitando apenas de uma sala pequena com

disponibilidade de agua e gas, onde devera ser instalado um balcao com pia e um

bico de Busen, eventualmente substituído por uma lamparina ou espiriteira.

Sao ainda necessarios: microscopio com objetiva de imersao e bateria para a

coloracao de Gram. Os corantes devem ser preparados pelo proprio laboratorio ou

por um laboratorio habitado que assegure a qualidade do produto.

Finalmente, e mais importante, sao necessarios tecnicos de laboratorio

treinados, responsaveis e conscientes do valor do seu trabalho.

A coloracao de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor,

o medico dinamarques Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que

as bacterias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes.

Isso permitiu classifica-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram

chamadas de Gram- positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-

negativas.

Apos descricao do metodo, inúmeras propostas de modificacao foram feitas.

Neste manual, voce vai conhecer a tecnica, os corantes e os procedimentos para a

correta realizacao da coloracao de Gram, recomendados pelo Programa Nacional de

Doencas Sexualmente Transmissíveis e Aids do Ministerio da Saúde.

Como funciona a coloracao de Gram?

Desde o trabalho original de Hans Gram, varios pesquisadores tentaram, com

pouco sucesso, determinar o mecanismo envolvido no metodo de coloracao.

Conceitos diversos tem sido apresentados, tais como:

1. A existencia de um substrato Gram-positivo e específico;

2.As bacterias Gram-positivas e Gram-negativas possuiriam

diferentes afinidades com o corante primario cristal de violeta; e

3.A existencia de diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos

Gram-positivos e Gram-negativos.

Este último e o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da pare- de

celular, quanto as dimensoes dos espacos intersticiais, por exemplo, “diametro do

poro”, parecem ser determinantes do resultado final da coloracao de Gram.

Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares sao cobertas pela

violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adicao do lugol, tambem chamado

de mordente, ocorre a formacao do completo iodo-pararosanilina. Esta reacao tem a

propriedade de fixar o corante primario nas estruturas coradas. Algumas estruturas

perdem a cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como

alcool etílico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou nao perdem a

cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas.

As bacterias que tem a parede celular composta por mureína

(peptídeoglicano - peptídeo de acido n-acetil muramico), durante o proces- so de

descoloracao com alcool etílico, retem o corante. Ja as bacterias com parede celular

composta predominantemente por acidos graxos (lipopolissacarídeos e

lipoproteínas) perdem o complexo iodo-pararosanilina, assumindo a cor do corante

de fundo.

Brasilia: Ministerio da Saúde, Tecnica de Coloracao de Gram. Programa

Nacional de Doencas Sexualmente Transmissíveis e AIDS, 1997. 63 p.: iI. (Serie

TELELAB) 1. Gram I. Programa Nacional de Doencas Sexualmente Transmissíveis

e AIDS, (Brasil). II. Serie TELELAB. Disponível em:

http://www.newslab.com.br/ed_anteriores/82/art02/art02.pdf. Acesso em: 15 out

2014.

TEXTO 3. Coloracao de Gram e Ácido Resistente (Tortora)

A coloracao de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologis- ta dinamarques

Hans Christian Gram. Ela e um dos procedimentos de coloracao mais úteis, pois

classifica as bacterias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas.

Neste procedimento (Figura 3.12a),

1. Um esfregaco fixado pelo calor e recoberto com um corante basico púrpura,

geralmente o cristal violeta. Uma vez que a coloracao púrpura impregna todas

as celulas, ela e denominada coloracao primária.

2. Apos um curto período de tempo, o corante púrpura e lavado, e o esfregaco e

recoberto com iodo, um mordente. Quando o iodo e lavado, ambas as

bacterias gram-positivas e gram-negativas aparecem em cor violeta escuro ou

púrpura.

3. A seguir, a lamina e lavada com alcool ou uma solucao de alcool-acetona.

Essa solucao e um agente descolorante, que remove o púrpura das celulas

de algumas especies, mas nao de outras.

4. O alcool e lavado, e a lamina e entao corada com safranina, um corante

basico vermelho. O esfregaco e lavado novamente, seco com papel e

examinado microscopicamente.

O corante púrpura e o iodo se combinam no citoplasma de cada bacteria,

corando-a de violeta escuro ou púrpura. As bacte- rias que retem essa cor apos a

tentativa de descolori-las com alcool sao classificadas como gram-positivas; as

bacterias que perdem a cor violeta escuro ou púrpura apos a descoloracao sao

classificadas como gram-negativas (Figura 3.12b). Como as bacterias gram- -

negativas sao incolores apos a lavagem com alcool, elas nao sao mais visíveis. É

por isso que o corante basico safranina e aplica- do; ele cora a bacterias gram-

negativas de rosa.

Os corantes como a safranina, que possuem uma cor contrastante com a

coloracao primaria, sao denominados contracorantes. Como as bacterias gram-

positivas retem a cor púrpura original, nao sao afetadas pelo contracorante

safranina.

Os diferentes tipos de bacterias reagem de modo distinto a coloracao de

Gram, pois diferencas es- truturais em suas paredes celulares afetam a retencao ou

a liberacao de uma combinacao de cristal violeta e iodo, denominada comple- xo

cristal violeta-iodo (CV-I).

Entre outras diferencas, as bacterias gram-positivas possuem uma parede

celular de peptideoglicano mais espessa (dissacarídeos e aminoacidos) que as

bacterias gram- -negativas. Alem disso, as bacterias gram-negativas contem uma

camada de lipopolissacarídeo (lipídios e polissacarídeos) como parte de sua parede

celular (veja a Figura 4.13, pagina 86).

Quando aplicados a celulas gram-positivas e gram-negativas, o cristal vio-

leta e o iodo penetram facilmente nas celulas. Dentro das mesmas, o cristal violeta e

o iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo e maior que a molecula de

cristal violeta que penetrou na celula e, devido a seu tamanho, nao pode ser

removido da camada intacta de peptideoglicano das celulas gram-positivas pelo

alcool. Consequentemente, as celulas gram-positivas retem a cor do co- rante cristal

violeta.

Nas celulas gram-negativas, contudo, a lava- gem com alcool rompe a

camada externa de lipopolissacarídeo, e o complexo CV-I e removido atraves da

camada delgada de peptide- oglicano. Como resultado, as celulas gram-negativas

permanecem incolores ate serem contracoradas com a safranina, quando adqui-

rem a cor rosa.

Em resumo, as celulas gram-positivas retem o corante e permanecem com a

cor púrpura. As celulas gram-negativas nao retem o corante; elas ficam incolores ate

serem contracoradas com um corante vermelho.

O metodo de Gram e uma das mais importantes tecnicas de coloracao na

microbiologia medica. Porem, os resultados da co- loracao de Gram nao sao

universalmente aplicaveis, pois algumas celulas bacterianas coram-se fracamente

ou nao adquirem cor. A reacao de Gram e mais consistente quando utilizada em

bacterias jovens, em crescimento.

Figura 1. Procedimento para a realizacao da coloracao de Gram.

Figura 2. Micrografia de bactérias coradas pelo Gram. Os bastonetes e os

cocos (roxo) sao gram-positivos, e os vibrioes (rosa) sao gram-negativos.

Coloracao álcool-ácido resistente

Outra importante coloracao diferencial (que classifica as bacterias em grupos

distintos) e a coloracao álcool-ácido resistente, que se liga fortemente apenas a

bacterias que possuem material cereo em suas paredes celulares.

Os microbiologistas utilizam essa coloracao para identificar todas as bacterias

do genero Mycobacterium, incluindo os dois importantes patogenos Mycobacterium

tuberculosis, o agente causador da tuberculose, e Mycobacterium leprae, o agente

causador da lepra. Essa coloracao tambem e usada para identificar as linhagens

patogenicas do genero Nocardia. As bacterias dos generos Mycobacterium e

Nocardia sao alcool-acido resistentes.

No procedimento de coloracao alcool-acido resistente, o corante vermelho

carbolfucsina e aplicado a um esfregaco fixado, e a lamina e aquecida levemente

por varios minutos. (O calor aumenta a penetracao e a retencao do corante.) A

seguir, a lamina e resfriada e lavada com agua.

O esfregaco e tratado com alcool-acido, um descolorante, que remove o

corante vermelho das bacterias que nao sao alcool-acido resistentes. Os

microrganismos alcool-acido resistentes retem a cor vermelha, pois a carbol-fucsina

e mais solúvel nos lipídios da parede celular que no alcool-acido.

Em bacterias que nao sao alcool-acido resistentes, cujas paredes celulares

nao possuem os componentes lipídicos, a carbolfucsina e rapidamente removida

durante a desco- loracao, deixando as celulas incolores. O esfregaco e entao corado

com o contracorante azul de metileno. As celulas que nao sao alco- ol-acido

resistentes ficam azuis apos a aplicacao do contracorante.

Figura 3. Bactérias álcool-ácido resistentes (BAAR). As bactérias Mycobacterium

leprae que infectaram este tecido foram coradas de vermelho com uma coloracao

álcool-ácido. As células que nao sao álcool-ácido resistentes estao coradas com o

contracorante azul de metileno.

TORTORA, Gerard J; FUNKE, Berdell R; CASE, Christine L. Microbiologia. Porto

Alegre: Artmed, 2012. 934 p. Traducao: Aristobolo Mendes da Silva [et al.]; revisao

tecnica: Flavio Guimaraes da Fonseca.

TEXTO 4. Coloracao de Gram e Zhiel-Neelsen – Práticas de

Microbiologia

COLORAÇÃO DE GRAM

Foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista Hans Christian Gram e e a

coloracao diferencial mais utilizada em bacteriologia. Esta coloracao separa as

bacterias em dois grandes grupos: as Gram-positivas (Gram +) e as Gram-negativas

(Gram -). Este metodo de coloracao e o metodo de escolha para a identificacao de

bacterias, porem deve der utilizado em bacterias em fase de crescimento. A

observacao de material coletado corado pela tecnica de Gram nao so e importante

para acompanhar o isolamento de amostras, como tambem para determinar o tipo

de antibiotico que deve ser utilizado em diferentes infeccoes.

Neste tipo de coloracao sao utilizados 4 reagentes diferentes, como sera

descrito a seguir. O preparo das amostras e rapido e se inicia com a coloracao de

um esfregaco de celulas fixados a uma lamina histologica pelo calor, com o corante

cristal violeta que cora as celulas com cor púrpura. Este corante se impregna em

todas as celulas e esta primeira coloracao e denominada coloracao primária.

Logo apos, as celulas sao recobertas por uma solucao de iodo que age como

um mordente que e qualquer substancia que forma um complexo insolúvel quando

se liga ao corante primario.

A seguir, as laminas contendo o esfregaco de celulas sao lavadas com etanol

95% (agente descolorante), que descora seletivamente alguns tipos de celulas. O

alcool e entao removido por lavagem em agua e as celulas sao coradas por um

segundo corante, a safranina, um contracorante, sendo sua coloracao bem

diferente daquela dada pelo cristal violeta. As bacterias denominadas Gram +

adquirem cor púrpura (roxo), enquanto as Gram – apresentam coloracao cor-de-

rosa.

O princípio da tecnica esta baseado na diferenca de composicao da parede

de diferentes bacterias e na capacidade destas paredes em reterem os corantes

utilizados. Sabemos hoje que as bacterias Gram + possuem uma parede celular

mais espessa e diferente da parede das bacterias Gram -.

A princípio, os dois tipos de celulas se coram pelo cristal violeta associado ao

iodo. O complexo formado pelo cristal violeta e pelo iodo se liga a componentes

presentes na parede das bacterias Gram +, que possuem na sua composicao

magnesio e acidos ribonucleicos. Esta ligacao forma um complexo (Mg – RNA – CV

– I) de difícil remocao.

Durante a utilizacao do alcool e que a diferenca na composicao da parede

celular das bacterias sera de extrema importancia para definir os dois grupos de

bacterias. O alcool tera duas funcoes: dissolver lipídios e desidratar as celulas.

O corante associado a parede das bacterias Gram + e que possui alto peso

molecular nao consegue se difundir de volta para o meio externo durante a lavagem

com o alcool – a célula permanece corada na cor roxa.

No caso das Gram -, sabemos que a camada de parede e extremamente

mais delgada e que sobre a parede encontramos uma outra membrana a externa, de

natureza lipídica.

Ao utilizar o alcool, a membrana externa das Gram – e solubilizada e, como a

camada de parede celular e mais fina, nao possuindo a mesma composicao da

parede das bacterias Gram +, o complexo cristal violeta-iodo e capaz de se difundir,

deixando a celula descorada. Quando se aplica o contracorante safranina, as

células Gram + adquirem a cor rosada do novo corante. As solucoes adiante sao

utilizadas na coloracao de Gram.

COLORAÇÃO DE RESISTÊNCIA AO ÁLCOOL-ÁCIDO (MÉTODO DE ZIEHL-

NEELSEN)

Esta e a coloracao de escolha para a identificacao de bacterias do genero

Mycobacterium, como por exemplo, as especies Mycobacterium tuberculosis e

Mycobacterium leprae, bem como para identificar cepas patogenicas de bacterias do

genero Nocardia.

A parede de micobacterias possui uma espessa camada de lipídios (acido

micolico) que evita a penetracao de diversos corantes. Por outro lado, quando o

corante penetra alcancando o citoplasma da celula, ele nao pode ser removido com

facilidade, mesmo com o uso de agentes descolorantes (mistura alcool-acido).

A celula que permanece corada apos a mistura alcool-acido ter sido aplicada

e denominada álcool-ácido resistente, enquanto que aquelas que se descoram por

nao possuírem a mesma composicao de parede celular sao denominadas álcool-

ácido sensíveis.

Uma vez que as especies M. tuberculosis e M. leprae sao patogenicas para

humanos, esta coloracao e de alto valor diagnostico. Algumas modificacoes e

cuidados devem ser observados durante a confeccao de laminas com micobacterias.

No caso do esfregaco, notar que as micobacterias sao difíceis de serem

espalhadas na gota de agua sobre a lamina. Isto se deve a característica hidrofobica

de sua parede. O esfregaco deve ser seco ao ar por 15 a 30 minutos e fixados pelo

calor, passando-se a lamina sobre a chama de 3 a 5 vezes durante 3-4 segundos.

O esfregaco devera ser recoberto com o corante (carbolfucsina) e colocado

sobre uma placa aquecedora morna ou sobre um recipiente com agua quente.

Atencao: nao deixe o corante evaporar. Va colocando mais corante se

necessario. A alta temperatura facilita a penetracao do corante pela parede da

bacteria.

Apos lavar a lamina com agua, resfrie rapidamente na geladeira ou passe

jatos de agua gelada. O resfriamento deixa a camada de lipídios das bacterias alcool

– acidos resistentes mais consistentes, evitando que o corante saia do citoplasma.

A lamina e tratada com alcool-acido que age como um agente descolorante,

descorando um grupo de celulas. As celulas descoradas sao entao coradas em azul

pelo azul de metileno. Duas populacoes de cores diferentes surgem apos este tipo

de coloracao: células vermelhas (alcool-acido resistentes, como as bacterias do

genero Mycobacterium) e células azuis (alcool-acido sensíveis).

Da mesma maneira como acontece na coloracao de Gram, a composicao da

superfície das celulas e o fator preponderante na obtencao da coloracao. O corante

apos a lavagem com o agente descolorante apenas continua impregnado em

celulas.