COLORAÇÃO DE GRAM E DE ZIEHL

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COLORAÇÃO DE GRAM E DE ZIEHL

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COLORAO DE GRAM E DE ZIEHL-NEELSENTexto 1. A Coloracao de Gram e as Variacoes na sua Execucao

RESUMOA coloracao de Gram e um importante teste realizado nos laboratorios de microbiologia, sendo um recurso auxiliar no diagnostico de doencas bacterianas. A partir de um determinado perfil tintorial as bacterias coram-se de roxo ou de rosa e consequentemente sao classificadas como Gram-positivas ou Gram-negativas, respectivamente. A coloracao de Gram envolve uma serie de procedimentos antes de chegar a etapa final de leitura da lamina preparada: envolve a confeccao do esfregaco, sua fixacao e passa pela coloracao pro- priamente. Nesta, o corante Cristal Violeta adsorve-se nas celulas, forma um complexo com o iodo (Lugol) e apos a etapa diferencial, com alcool-acetona, as celulas sao contra-coradas com Fucsina de Gram. Neste estudo avaliou-se a influencia de variacoes na referida coloracao considerando os tempos de exposicao aos corantes Cristal Violeta e a Fucsina de Gram e o emprego ou nao de lavagens com agua entre as etapas. Os resultados obtidos mostraram que as diferencas nos procedimentos aplicados em cada tecnica testada nao alteraram o resultado quando comparados a laminas padrao.INTRODUOEm geral, so necessrias coloraes biolgicas para a visualizao de bactrias de modo adequado e demonstrao dos detalhes finos das suas estruturas.

O advento da colorao representa, em grande parte, o fundamento dos principais avanos produzidos em microbiologia clnica e em outros campos da microscopia diagnstica durante os ltimos 100 anos.

A maioria das coloraes utilizadas em bacteriologia tem por finalidade o diagnstico presuntivo rpido do processo infeccioso e tambm a prvia avaliao da qualidade da amostra.

A colorao de Gram o mtodo bacterioscpico mais importante e mais utilizado atualmente na bacteriologia e sua finalidade a classificao de microrganismos com base em suas caractersticas tintoriais, tamanho, forma e arranjo celular.

As bactrias so classificadas basicamente em dois grandes grupos: Gram-positivas e Gram-negativas. No que diz respeito s caractersticas tintoriais, as bactrias Gram-positivas coram-se de roxo e as bactrias Gram-negativas coram-se de rosa.

A deteco de microrganismos na amostra de suma importncia, uma vez que pode indicar uma terapia antimicrobiana direcionada a um determinado grupo de patgenos e, tambm, a necessidade da realizao de cultura com finalidade diagnstica e/ou epidemiolgica.

A tcnica de colorao de Gram geralmente respeita um protocolo de aes que a padroniza. Contudo, ha variantes nesse procedimento relacionadas aos tempos de execucao da coloracao e a utilizacao de lavagem com agua em dadas etapas que podem ou nao interferir na visualizacao das estruturas coradas. Nesse sentido, este trabalho se propos a verificar se estas pequenas variacoes de tempo e lavagens a partir de protocolos especificos refletem em alguma alteracao na interpretacao dos resultados da coloracao de Gram.

FREITAS, Valdonir da Rosa; PICOLI, Simone Ulrich. A colorao de Gram e as variaes na sua execuo. Newslab, v. 82, p. 124-128, 2007.

Texto 2. Tcnica de Colorao de GRAM

INTRODUOO metodo tintorial predominante utilizado em bacteriologia e o metodo de Gram. A bacterioscopia, apos coloracao pelo metodo de Gram com diagnostico presuntivo, de triagem, ou ate mesmo confirmatorio em alguns casos, constitui peca importante e fundamental na erradicacao e no controle das Doencas Sexualmente Transmissiveis (DST). Essa tecnica e simples, rapida e tem capacidade de resolucao, permitindo o correto diagnostico em cerca de 80% dos pacientes em carater de pronto atendimento em nivel local. Os custos com investimento e manutencao sao consideravelmente baixos diante da eficacia alcancada com os resultados imediatos dos testes. Essa tecnica requer instalacao simples, necessitando apenas de uma sala pequena com disponibilidade de agua e gas, onde devera ser instalado um balcao com pia e um bico de Busen, eventualmente substituido por uma lamparina ou espiriteira. Sao ainda necessarios: microscopio com objetiva de imersao e bateria para a coloracao de Gram. Os corantes devem ser preparados pelo proprio laboratorio ou por um laboratorio habitado que assegure a qualidade do produto. Finalmente, e mais importante, sao necessarios tecnicos de laboratorio treinados, responsaveis e conscientes do valor do seu trabalho. A coloracao de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o medico dinamarques Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bacterias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classifica-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram- positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas. Apos descricao do metodo, inumeras propostas de modificacao foram feitas. Neste manual, voce vai conhecer a tecnica, os corantes e os procedimentos para a correta realizacao da coloracao de Gram, recomendados pelo Programa Nacional de Doencas Sexualmente Transmissiveis e Aids do Ministerio da Saude.

Como funciona a coloracao de Gram? Desde o trabalho original de Hans Gram, varios pesquisadores tentaram, com pouco sucesso, determinar o mecanismo envolvido no metodo de coloracao. Conceitos diversos tem sido apresentados, tais como: 1. A existencia de um substrato Gram-positivo e especifico;2.As bacterias Gram-positivas e Gram-negativas possuiriam diferentes afinidades com o corante primario cristal de violeta; e 3.A existencia de diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos. Este ultimo e o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da pare- de celular, quanto as dimensoes dos espacos intersticiais, por exemplo, diametro do poro, parecem ser determinantes do resultado final da coloracao de Gram. Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares sao cobertas pela violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adicao do lugol, tambem chamado de mordente, ocorre a formacao do completo iodo-pararosanilina. Esta reacao tem a propriedade de fixar o corante primario nas estruturas coradas. Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como alcool etilico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou nao perdem a cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas. As bacterias que tem a parede celular composta por mureina (peptideoglicano - peptideo de acido n-acetil muramico), durante o proces- so de descoloracao com alcool etilico, retem o corante. Ja as bacterias com parede celular composta predominantemente por acidos graxos (lipopolissacarideos e lipoproteinas) perdem o complexo iodo-pararosanilina, assumindo a cor do corante de fundo. Brasilia: Ministrio da Sade, Tcnica de Coloraao de Gram. Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e AIDS, 1997. 63 p.: iI. (Srie TELELAB) 1. Gram I. Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e AIDS, (Brasil). II. Srie TELELAB. Disponvel em: http://www.newslab.com.br/ed_anteriores/82/art02/art02.pdf. Acesso em: 15 out 2014.

TEXTO 3. Colorao de Gram e cido Resistente (Tortora)

A colorao de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologis- ta dinamarqus Hans Christian Gram. Ela um dos procedimentos de colorao mais teis, pois classifica as bactrias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas.Neste procedimento (Figura 3.12a),1. Um esfregao fixado pelo calor recoberto com um corante bsico prpura, geralmente o cristal violeta. Uma vez que a colorao prpura impregna todas as clulas, ela denominada colorao primria.2. Aps um curto perodo de tempo, o corante prpura lavado, e o esfregao recoberto com iodo, um mordente. Quando o iodo lavado, ambas as bactrias gram-positivas e gram-negativas aparecem em cor violeta escuro ou prpura.3. A seguir, a lmina lavada com lcool ou uma soluo de lcool-acetona. Essa soluo um agente descolorante, que remove o prpura das clulas de algumas espcies, mas no de outras.4. O lcool lavado, e a lmina ento corada com safranina, um corante bsico vermelho. O esfregao lavado novamente, seco com papel e examinado microscopicamente.O corante prpura e o iodo se combinam no citoplasma de cada bactria, corando-a de violeta escuro ou prpura. As bact- rias que retm essa cor aps a tentativa de descolori-las com lcool so classificadas como gram-positivas; as bactrias que perdem a cor violeta escuro ou prpura aps a descolorao so classificadas como gram-negativas (Figura 3.12b). Como as bactrias gram- -negativas so incolores aps a lavagem com lcool, elas no so mais visveis. por isso que o corante bsico safranina aplica- do; ele cora a bactrias gram-negativas de rosa. Os corantes como a safranina, que possuem uma cor contrastante com a colorao primria, so denominados contracorantes. Como as bactrias gram-positivas retm a cor prpura original, no so afetadas pelo contracorante safranina.Os diferentes tipos de bactrias reagem de modo distinto colorao de Gram, pois diferenas es- truturais em suas paredes celulares afetam a reteno ou a liberao de uma combinao de cristal violeta e iodo, denominada comple- xo cristal violeta-iodo (CV-I). Entre outras diferenas, as bactrias gram-positivas possuem uma parede celular de peptideoglicano mais espessa (dissacardeos e aminocidos) que as bactrias gram- -negativas. Alm disso, as bactrias gram-negativas contm uma camada de lipopolissacardeo (lipdios e polissacardeos) como parte de sua parede celular (veja a Figura 4.13, pgina 86). Quando aplicados a clulas gram-positivas e gram-negativas, o cristal vio- leta e o iodo penetram facilmente nas clulas. Dentro das mesmas, o cristal violeta e o iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo maior que a molcula de cristal violeta que penetrou na clula e, devido a seu tamanho, no pode ser removido da camada intacta de peptideoglicano das clulas gram-positivas pelo lco