Come studiamo le celluleCome studiamo le cellule

�� Osserviamo le cellule al microscopio per Osserviamo le cellule al microscopio per

ricavarne delle informazioni morfologichericavarne delle informazioni morfologiche

(e non solo)(e non solo)

Microscopi dirittiMicroscopi diritti

Microscopio rovesciatoMicroscopio rovesciato

•A luce trasmessa in campo chiaro

•A contrasto di fase o a contrasto

interferenziale

•A fluorescenza

Microscopia

Microscopia in campo chiaroMicroscopia in campo chiarocellule non colorate (IgrOv fissate in cellule non colorate (IgrOv fissate in

paraformaldeide)paraformaldeide)

HL60HL60

Microscopia in campo chiaroMicroscopia in campo chiarocellule SaOs colorate (cellule adese)cellule SaOs colorate (cellule adese)

Microscopia in campo chiaroMicroscopia in campo chiarocellule Jurkat coloratecellule Jurkat colorate

Contrasto di fase e contrasto Contrasto di fase e contrasto

interferenzialeinterferenziale

Rat-1 fibroblasti di ratto 20 X

Cos-7 fibroblasti di rene di scimmia trasfettati con SV40

Si basa sul fenomeno dell'Si basa sul fenomeno dell'interferenzainterferenza luminosa.luminosa.

Il preparato viene illuminato da un fascio Il preparato viene illuminato da un fascio

luminoso suddiviso a livello del condensatore in luminoso suddiviso a livello del condensatore in

due porzioni di fase differente e con diverso due porzioni di fase differente e con diverso

angolo di incidenza. angolo di incidenza.

Il cambiamento ulteriore di fase dovuto alla Il cambiamento ulteriore di fase dovuto alla

porzione di luce che attraversa il campione, porzione di luce che attraversa il campione,

andandosi a ricombinare con la luce non andandosi a ricombinare con la luce non rifrattarifratta

renderrenderàà visibili componenti trasparenti ma di visibili componenti trasparenti ma di

indice di rifrazione differente da quello del indice di rifrazione differente da quello del

mezzo. mezzo.

Microscopio a contrasto di faseMicroscopio a contrasto di fase

In campo biologico, la maggior parte dei In campo biologico, la maggior parte dei componenti cellulari è trasparente alla luce componenti cellulari è trasparente alla luce visibile, anche a causa dell'elevata presenza visibile, anche a causa dell'elevata presenza di acqua.di acqua.

Tuttavia le radiazioni luminose una volta Tuttavia le radiazioni luminose una volta oltrepassata una componente o un oltrepassata una componente o un organelloorganellocellulare, subisconocellulare, subiscono dei cambiamenti di fase dei cambiamenti di fase che dipendono sia dallo spessore, sia dal che dipendono sia dallo spessore, sia dal diverso indice di rifrazione della struttura diverso indice di rifrazione della struttura oltrepassataoltrepassata. .

�� Tramite la microscopia a contrasto di fase si Tramite la microscopia a contrasto di fase si evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni spesso comportano notevoli alterazioni strutturali ottenendo così dei dati molto più strutturali ottenendo così dei dati molto più reali di quella che è l'organizzazione reali di quella che è l'organizzazione cellulare. cellulare.

�� La tecnica in questione fu messa a punto dal La tecnica in questione fu messa a punto dal fisico olandese fisico olandese FrederikFrederik ZernikeZernike ((FritsFritsZernikeZernike) negli) negli anni cinquantaanni cinquanta e gli valse e gli valse ilil Premio NobelPremio Nobel per laper la fisicafisica nelnel 19531953..

Microscopia a fluorescenzaMicroscopia a fluorescenza

Cos-7 Cellule trasformate di rene di scimmia.

Immagine a falsi colori

DNA rosso mitocondri blu F-actina verde

Microscopia di fluorescenza Immagine a falsi coloriNetwork di microtubuli rosso F-actina verdeDNA blu

Cos-7 Cellule trasformatedi rene di scimmia.

Cos-7 Cellule trasformatedi rene di scimmia.

Microscopia di fluorescenza Immagine a falsi colorimitocondri giallo F-actina rossoDNA verde

Perche’Perche’ nella microscopia a nella microscopia a

fluorescenza si vedono fluorescenza si vedono cosi’cosi’ tanti tanti

dettagli?dettagli?

Ogni molecola fluorescente emetteOgni molecola fluorescente emette

luce, se opportunamente eccitata. E’ come se luce, se opportunamente eccitata. E’ come se

legassimo delle lampadine alle strutturelegassimo delle lampadine alle strutture

che vogliamo evidenziare che vogliamo evidenziare

CosCos--7 marcate per7 marcate per

evidenziare i mitocondrievidenziare i mitocondri

in fluorescenza in fluorescenza

SaosSaos marcate per evidenziare i mitocondrimarcate per evidenziare i mitocondri

in microscopia a campo chiaroin microscopia a campo chiaro

Limite di risoluzione del microscopioLimite di risoluzione del microscopio

�� Dipenda dalla lunghezza d’onda della “luce” Dipenda dalla lunghezza d’onda della “luce”

utilizzata per illuminare il preparatoutilizzata per illuminare il preparato

�� Il cosiddetto criterio di Il cosiddetto criterio di AbbeAbbe limita infatti la limita infatti la

risoluzione massima a circa 0.5 λ/(n sin θ) per risoluzione massima a circa 0.5 λ/(n sin θ) per

un sistema ottico avente apertura numerica n sin un sistema ottico avente apertura numerica n sin

θ, che impieghi luce di lunghezza d’onda λ. θ, che impieghi luce di lunghezza d’onda λ. Per Per

luce nello spettro visibile essa si attesta sui luce nello spettro visibile essa si attesta sui

0.2 ÷ 0.4 µm0.2 ÷ 0.4 µm..

Tipi di Coltura di Cellule “in vitro”Tipi di Coltura di Cellule “in vitro”

Coltura Primaria Coltura SecondariaColtura Primaria Coltura Secondaria

Coltura Primaria

●Coltura preparata direttamente da un tessuto:le cellule sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitrodopo le quali vanno incontro a senescenza (fenomeno che avviene indipendentemente dalla presenza di metaboliti appropriati per la crescita)Vantaggi : le cellule isolate riflettono con maggiore probabilità le attività biochimiche delle cellule in vivo

Svantaggi: vita limitata, ripetuti isolamenti per progetti a l ungo termine

Ciclo vitale di Cellule Primarie

●●Isolamento di ceppi clonaliIsolamento di ceppi clonali:: il programma genetico della senescenza è stato il programma genetico della senescenza è stato

annullato attraverso mutazioni spontanee o indotteannullato attraverso mutazioni spontanee o indotte

●● Derivazione: Derivazione: da colture primarie di tumori o da manipolazioni genetiche di da colture primarie di tumori o da manipolazioni genetiche di

colture primarie non tumorali colture primarie non tumorali

Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle ceLe cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule cancerosellule cancerose

VantaggiVantaggi: : cellule (clonali) più facili da coltivare, risposte riproducibilcellule (clonali) più facili da coltivare, risposte riproducibili con risultati i con risultati

meno variabili delle colture primariemeno variabili delle colture primarie

SvantaggiSvantaggi:: non riproducono esattamente l’ambiente fisiologico cellularenon riproducono esattamente l’ambiente fisiologico cellulare

Linea Cellulare Continua

Coltura PrimariaColtura Primaria

Coltura a breve termineColtura a breve termine Coltura a lungo termineColtura a lungo termine

< 10 < 10 duplicazioniduplicazioni 5050--60 60 duplicazioniduplicazioni

Coltura SecondariaColtura Secondaria

Linea Cellulare ContinuaLinea Cellulare Continua

>1>15050--200 duplicazioni200 duplicazioni

Linea Cellulare ContinuaLinea Cellulare Continua

�� Capacità di crescere indipendentemente Capacità di crescere indipendentemente

dall’organismo da cui è derivatadall’organismo da cui è derivata

�� Crescita ininterrotta per oltre un annoCrescita ininterrotta per oltre un anno

�� ImmortaleImmortale

Le prime Linee Cellulari ContinueLe prime Linee Cellulari Continue

1952, 1952, JohnsJohns HopkinsHopkins

UniversityUniversity 1963, University of 1963, University of

IbadanIbadan

HELA RAJI

Osserviamo le coltureOsserviamo le colture�� Le cellule devono essere coltivate in appositi Le cellule devono essere coltivate in appositi

recipienti.recipienti.

Le cellule devono essere coltivate Le cellule devono essere coltivate

in appositi terreniin appositi terreni

Diversi tipi di terreni adattiDiversi tipi di terreni adatti

alle diverse linee cellularialle diverse linee cellulari

Siero animale, di solitoSiero animale, di solito

Siero Fetale Bovino (FCS)Siero Fetale Bovino (FCS)

Altri supplementi: antibiotici, Altri supplementi: antibiotici, glutaminaglutamina

ecc.eccecc.ecc..

Medium di ColturaMedium di Coltura

●●I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i

componenti nutritivi necessari alla crescita delle cellulecomponenti nutritivi necessari alla crescita delle cellule

●●I piI piùù comuni terreni base di coltura:comuni terreni base di coltura:

--MEM:MEM: Minimum Minimum EssentialEssential MediumMedium

--DMEM:DMEM: DulbeccoDulbecco’’s modification of MEMs modification of MEM

--RPMI:RPMI: Roswell Park Memorial Roswell Park Memorial InstituteInstitute

Differiscono per la concentrazione in amminoacidi e sali e per lDifferiscono per la concentrazione in amminoacidi e sali e per la a

concentrazione di glucosioconcentrazione di glucosio

acquaacqua

Medium di ColturaSali inorganici

▪ Cloruro di calcio anidro▪ Solfato di magnesio anidro▪ Cloruro di potassio▪ Nitrato di potassio▪ Cloruro di sodio▪ Fosfato di sodio bibasico▪ Bicarbonato di sodio

Essenziali per la crescita e il mantenimento delle funzioni cellulari e agiscono anche come tampone per le fluttuazioni del pH dovute a variazioni ambientali o ai prodotti del catabolismo

Sali inorganiciSali inorganici

Nutrienti a basso peso molecolareNutrienti a basso peso molecolare

Medium di ColturaZuccheri

Rappresentano la principale fonte di energia o di carbonioper le biosintesi

Glucosio

Medium di ColturaVitamine

BiotinaPantotenatoAcido folicoInositoloNicotinamidePiridossinaRiboflavinaTiaminaVitamina B12

Agiscono come catalizzatori o come substratiper facilitare o controllare alcune funzionimetaboliche

Medium di ColturaAmminoacidi-isomeri L

AlaninaArgininaAsparaginaAcido asparticoCisteinaGlutaminaAcido glutamicoGlicinaIstidinaIsoleucina

LeucinaLisinaMetioninaFenilalaninaProlinaSerinaTreoninaTriptofanoTirosinaValina

Necessari per la sintesi delle proteine

Medium di ColturaMedium di Coltura

�� Il terreno base viene conservato a 4°C e, prima di Il terreno base viene conservato a 4°C e, prima di

essere utilizzato, viene essere utilizzato, viene complementatocomplementato con:con:

�� GlutamminaGlutammina ((aaaa essenziale molto labile)essenziale molto labile)

�� AntibioticiAntibiotici (penicillina/streptomicina)(penicillina/streptomicina)

�� Siero Siero (supplemento più comune delle colture (supplemento più comune delle colture

cellulari)cellulari)

SIEROSIERO�� Miscela complessa di proteine ed elementi Miscela complessa di proteine ed elementi

fondamentali per la crescita fondamentali per la crescita in vitroin vitro della maggior della maggior

parte delle celluleparte delle cellule

�� Fattori di crescita:Fattori di crescita: PDGF, EGF, IGFPDGF, EGF, IGF

�� Fattori di adesione:Fattori di adesione: fibronectinafibronectina, , vitronectinavitronectina

�� Altri elementi: Altri elementi: trasferrinatrasferrina, albumina, colesterolo, acidi , albumina, colesterolo, acidi

grassi e grassi e glucorticoidiglucorticoidi, elementi minerali , elementi minerali

Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino

(FBS)(FBS)

Allestimento e Allestimento e

propagazionepropagazione

1.1. Controllo della coltura al prelievo Controllo della coltura al prelievo dall’dall’incubatoreincubatore: : colorecolore e e torbidita’torbidita’..

1.1. Osservazione della fiasca al microscopio Osservazione della fiasca al microscopio rovesciato: valutazione della rovesciato: valutazione della densita’densita’ cellulare, cellulare, della presenza di cellule staccate o con della presenza di cellule staccate o con morfologie strane. morfologie strane.

SaosSaos 2 A DIVERSA CONFLUENZA2 A DIVERSA CONFLUENZA

HLHL--60 trattate con una sostanza che le differenzia in 60 trattate con una sostanza che le differenzia in

macrofagimacrofagi. A) HL. A) HL--60 non differenziate B) 60 non differenziate B)

differenziatedifferenziate

HL60 differenziate in cellule aderentiHL60 differenziate in cellule aderenti

ContaminazioniContaminazioni

�� BatteriBatteri

�� FunghiFunghi

�� LievitiLieviti

�� MicoplasmiMicoplasmi

Contamination

• Happens to even the best…

• Fungal – yeast

• Bacterial

• Mycoplasma - filterablebacteria which will passacross 0.2 µm filter. Bigproblem. It is treated withcephalosporin antibiotics.Can take over laboratories.

http://web.uct.ac.za/depts/biomed/Cellculture_05-1.ppt

HL60 infettate da HL60 infettate da micoplasmimicoplasmi

marcate con un colorante per il DNA marcate con un colorante per il DNA

Antibiotici?Antibiotici?

Da usare con discernimentoL’utilizzo continuo puo’ creare forme di

antibiotico resistenza

Molto usati cocktail di Penicillina e

streptomicina o gentamicina e

fungizone