Comment avoir accès aux phénotypes mutants sans faire de mutagénèse ?

utiliser l’interférence ARN

Histoire de l’interférence ARN

• 1990: PTGS (Post Transcriptional Gene Silencing) estdécouvert chez le Pétunia à partir d’observations sur la coloration des feuilles. Ce phénomène est appelé par Rich Jorgensen “co-suppression” Plant Cell 2: 279-289

• 1998: Andrew Fire démontre que l’ARN double brin estresponsable du PTGS chez le C. elegans Nature 391: 806-811

• Depuis 1998: l’ARN interférence devient un outil pour déterminer des phénotypes mutants chez différentsorganismes.

• Depuis 2000 :augmentation exponentielle du nombre de publications sur l’interférence ARN (1000 publications en 2004)

Définitions• Génétique inverse : aller du génotype au phénotype par ingéniérie génétique. Par exemple obtention de mutants KO par recombinaison homologue.

•PTGS = Post-transcriptional Gene Silencing : inhibition de l’expression d’un gène par introduction d’un ARN double brin.

• ARN interference: PTGS induit par l’introduction d’un ARN double brin (siRNA) dans un organisme ou des cellules en culture.

• RISC: RNA-induced silencing complexe, correspond à un ensemble de protéines et du siRNA.

DICER = endonucléase dimérique (famille des RNaseIII) qui coupe l’ARNiRISC = RNA Induced Silencing ComplexRdRP = ARN polymérase ARN dépendante (trouvée chez les végétaux)

L’interférence ARN

L’interférence ARN se déroule en deux étapes

étape 1

Initiation

étape 2

Destruction de la cible

Etape d’initiation

ATP

ATP

ADP + ppi

ADP + ppi

DICER coupe DICER coupe ll’’ARNARN en en fragment de 21 fragment de 21 ntnt = = siRNAsiRNA

RdRPRdRP : : uneune ARN polymARN polyméérase ARN rase ARN ddéépendantpendant peutpeut amplifier le amplifier le siRNAsiRNA

ARN double brin

Une kinase putative phosphoryle le siRNA

Le siRNA se fixe au complexe RISC; le siRNApasse en simple brin, le complexe siRNA/RISC est activé et fixe la cible ARNm. L’activitéendonucléase de RISC coupe la cible, l’activitéexonucléase coupe le reste de l’ARNm.

RISC = RNA induced silencingcomplex=hélicase;RecA;endonucléase;exonucléase

Coupure de la cible

siRNA = short interfering RNA• C’est la molécule essentielle pour l’interférence ARN

• 21-23 nucléotides ARN double brins

• Inhibition de l’expression de l’ARN m par induction de sa dégradation

Méthodes pour produire le siRNA

• Synthèse chimique

• Transcription In vitro• Digestion d’un grand ARN double brin par la RNaseIII (Dicer, Rnase III)

•Expression de l’ARN dans les cellules à partir d’un vecteur

Plasmide exprimant un ARNi

T7 promoter T7 promoter

Bam HI Sal Iluc insert

Not IBgl IIApa I

Kpn I

L4440luc

Amp resistance

Méthodes permettant de donner de l’ARNi àun organisme

Variables selon l’organisme:

•C.elegans – injection nourriture

• D. melanogaster – exposition des cellules dansle milieu de culture

• Cellule de mammifères - électroporation outransfection

Différentes méthodes pour faire des essais in vivo des siRNA

L’inhibition par les siRNA ça marche !

Northern Blot

Western Blot (anti-p53)

Suppression de l’expression de p53 par le vecteurpSUPER-p53

Stabilité de l’effet

Elimination de la protéine naturelle du prion par la méthode des siRNA

Western Blot

in situ

Chaque puits contient des siRNA (synthétique, plasmide …) qui visent à annuler différents gènes. Les siRNA servent à transfecter des cellules. Les cellules sont ensuite observées pour leur phénotype (rythme de division, létalité …)

Utilisation à haut débit des siRNA

Expérience actuelle d’utilisation des siRNA en masse pour étudier le développement précoce du C. elegans

Nonv = létaux+stérilesGrow = Croissance altéréeVpep = mouvements ou morphologie altérés

Analyse de l’inactivation par siRNA de 16757 ORFs de C.elegans