COMPARACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE GALACTOOLIGOSACÁRIDOS (GOS) A PARTIR DE LACTOSUERO EN POLVO Y LACTOSA USANDO Aspergillus orizae Y ENZIMA β-

GALACTOSIDASA LIBRE

COMPARISON OF GALACTOOLIGOSACCHARIDES (GOS) PRODUCTION FROM CHEESE WHEY POWDER AND LACTOSE BY Aspergillus oryzae FREE CELLS AND FREE β-

GALACTOSIDASE

Avella N.*, Solano C.*, Castro G.** *Estudiantes Programa de Ingeniería de Alimentos Universidad de La Salle, Bogotá, Colombia,

Carrera 4 # 10 – 70. **IQ MSc Docente Programa de Ingeniería de Alimentos Universidad de La Salle, Bogotá,

Colombia, gacastro@unisalle.edu.co.

RESUMEN El objetivo del trabajo fue evaluar la producción de galactooligosacáridos (GOS) a escala de laboratorio por medio fermentativo aplicando Aspergillus oryzae var. effussus y por reacción enzimática usando β-galactosidasa comercial, utilizando como sustrato, lactosa y lactosuero en polvo con una concentración inicial de 11% de lactosa en los dos casos. La concentración inicial del hongo en el medio fue de 2.9*10

7 esporas por mililitro, la duración de la fermentación

fue de 24 horas, para la β-galactosidasa la reacción duró 12 horas. La producción de GOS con la enzima fue de 43.91% con lactosa y 44.45% con suero, para el hongo la producción ascendió a 41.36% con lactosa y 43.27% con suero, estos resultados no presentan diferencias significativas de acuerdo al análisis estadístico. Las mayores producciones se alcanzaron a la hora 16 para la fermentación con el hongo y a la hora 10 para el proceso enzimático. Palabras clave: Galactooligosacaridos, β-galactosidasa, Aspergillus oryzae, lactosuero, lactosa.

SUMMARY

The objective was to evaluate the production of galactooligosaccharides (GOS) on laboratory scale by Aspergillus oryzae var. Effussus free cells and free β-galactosidase enzyme, the substrates were lactose and cheese whey poder, with an initial lactose concentration of 11% in both cases. The initial concentration of fungus in the medium was 2.9 * 10

7 spores per ml and

the fermentation time was 24 hours, for the enzymatic reaction the time was 12 hours. GOS production of the enzyme was 43.91% and 44.45% for lactose and cheese whey respectively, for the fungus 41.36% and 43.27% for lactose and cheese whey respectively, these results were not significantly different according the statistical analysis. The best yields were achieved at sixteen hour for fungus and at ten hour for enzyme. Keywords: Galactooligosaccharides, β-galactosidase, Aspergillus oryzae, cheese whey, lactose. INTRODUCCION

Los prebióticos son definidos como ingredientes alimenticios no digeribles que benefician la salud del hospedero estimulando selectivamente el crecimiento y/o actividad de un número limitado de bacterias intestinales que son beneficiosas (Huerta, 2005). Los galactooligosacáridos (GOS) se encuentran dentro de este grupo de sustancias, en donde estos azúcares se hallan de forma natural en la leche de mamíferos y en algunos productos procesados en los que se pueden obtener

mediante reacciones de transgalactosilación (Figueroa, 2004), usando la enzima β-galactosidasa.

La β-Galactosidasa, también conocida como lactasa, es una hidrolasa que ataca el grupo O-glucosilo de lactosa, su fuente son hongos como el Aspergillus niger y Aspergillus oryzae que a menudo se utilizan para la hidrólisis de la lactosa en el suero. La lactosa es el principal sustrato para la síntesis, este disacárido está presente en el suero de la leche en un alto porcentaje, además de que se puede adquirir con su concentración total en polvo luego de ser sometido a ciertos procesos

químico (Figueroa, 2005). Se conoce que los GOS son producidos de la lactosa hace más de 50 años y sin embargo el interés comercial de los mismos solo se da con el descubrimiento de la bifidogenia en donde este tipo de productos es clasificado como ingrediente alimenticio prebiótico de gran impacto industrial (Dey-chy, 1998).

En la actualidad y ya desde hace algunos años se ha notado el interés por los consumidores en tener mejores hábitos alimenticios, incluyendo en su dieta alimentos enriquecidos y funcionales que mejoren la digestión y que tengan efectos positivos sobre la flora bacteriana, además de aumentar el crecimiento de bacterias intestinales beneficiosas. Los microorganismos llamados probióticos mejoran estas funciones, pero necesitan a su vez fuentes nutritivas suficientes, estas sustancias son proporcionadas por los prebióticos, de forma tal que en conjunto son capaces de mejorar la salud en los seres humanos.

El objeto de este estudio, es producir prebióticos, galactooligosacáridos GOS, a escala de laboratorio utilizando la enzima β-galactosidasa comercial (libre) y el microorganismo A. oryzae, a partir de lo cual se determinan las condiciones del proceso de fermentación en cuanto a tiempo, sustrato

MATERIALES Y METODOS

Manejo del microorganismo y produccion de esporas La cepa de A. oryzae var. effussus usada durante el desarrollo de esta investigación, fue proporcionada por Departamento de agricultura de Estados Unidos (USDA servicio de investigación agrícola) y se encontraba liofilizada por lo que fue necesario llevar a cabo la activación de dicha cepa. Para la activación, en un ambiente estéril (Cámara de bioseguridad) se llevó a cabo la siembra de la cepa A. oryzae en cajas de petri con agar papa dextrosa (PDA) y agar sabouraud (medios precursores del crecimiento de hongos) por punción para ulteriormente incubar a 30 °C durante 7 días para activación y crecimiento de la cepa.

Metodologia de conteo de esporas La cuantificación o conteo de esporas se desarrolla por medio de la camara de Neubauer (SANCHEZ, 2009).

Características del medio para la reacción enzimática con β-galactosidasa comercial libre. Corresponden a un total del 89 % de tampón fosfato y 11 % p/v de lactosa en polvo o lactosuero en polvo y un mililitro de enzima β-galactosidasa (SANCHEZ, 2009).

Características del medio para fermentación con A. Oryzae. Corresponden a un total del 89 % de una solución constituida por (K2HPO4 0.84%, MgSO4•7H2O 0.102%, KCl 0.088%, FeSO4•7H2O 0.007%, NaNO3•4H2O 0.085%, extracto de levadura 2.0%, CaCO3 0.136%)) y 11% p/v de lactosa en polvo y suero en polvo y un mililitro de la solución de esporas a una concentración de 2.9*10

7

esporas por mililitro (SANCHEZ, 2009).

Características de la muestra para la reacción enzimática. Se ajusta pH a 6.5 incuba a 55 °C por 12 horas, tomando muestras por triplicado cada dos horas, las cuales son sometidas a inactivación de la enzima por acción de temperatura a 100 °C por 5 minutos, posteriormente se lleva a cabo centrifugación de las muestras a 1000 rpm durante 10 minutos y se almacena a congelación a -18 °C.

Características de la muestra para la fermentación. Se ajusta el pH a 5.5 e incubando a 30 °C y 200 rpm durante 24 horas en agitador orbital GENESIS

®,

tomando muestras por triplicado cada cuatro horas, las cuales son sometidas a inactivación de la enzima por acción de temperatura a 100 °C por 5 minutos. Posteriormente se lleva a cabo centrifugación de las muestras a 1000 rpm durante 10 minutos y se almacena a congelación a -18 °C.

Cuantificacion de GOS (DNS) Se hace por medio del método DNS para cuantificar azucares reductores presentes en las muestras, luego se aplica la siguiente ecuación:

Debido a que los galactooligosacáridos GOS son los azúcares no reductores de acuerdo a la ecuación anterior se puede decir que:

Análisis estadístico Todas las pruebas se hicieron por triplicado, se desarrolló un análisis estadístico descriptivo tanto para el comportamiento de producción de GOS en la fermentación de los dos sustratos lactosa y lactosuero en polvo con A. oryzae como para las reacciones enzimáticas de los mismos sustratos pero con la enzima β-galactosidasa, debido a que con este tipo de análisis no se pueden afirmar diferencias significativas. Posteriormente se desarrolla un modelo a dos filas de clasificación con interacción entre el grupo y el tiempo con anidamiento de individuos entre grupos, mediante los programas R y SAS.

RESULTADOS Y DISCUSION

La gráfica 1 muestra como desciende el porcentaje de azúcares reductores, debido al consumo para la producción de GOS, los cuales a ascienden a 4.83 y 4.89%, para lactosa y lactosuero respectivamente. A partir de la hora 8 con lactosa y 10 con lactosuero, la producción de GOS adicional es tan escasa que permite establecer estos como tiempos adecuados para el proceso en ambos casos.

Gráfica 1. Producción de GOS (%) y consumo de

azúcares (%) para el proceso con enzima -Galactosidasa libre. Los tiempos de 0 a 6 corresponden a las horas 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 del proceso.

En la gráfica 2 de aprecia un comportamiento similar al anterior, pero en este caso se evaluó el Aspergillus. oryzae

var. Effussus, como agente fermentativo, el tiempo en este caso fue el doble, 24 h, debido a lo sugerido en la literatura. Se podría establecer la hora 16 como el tiempo requerido para el proceso, debido a que a partir de esta no se genera producto adicional. Se logró una concentración de GOS de 4.55 4.76% con lactosa y lactosuero respectivamente.

Gráfica 2. Producción de GOS (%) y consumo de azúcares (%) para el proceso con Aspergillus oryzae libre. Los tiempos de 0 a 6 corresponden a las horas 0, 4, 8,12,16,20,y,24 del proceso.

Los porcentajes de GOS están reportados con referencia al total de la masa reaccionante, para compararlos con los obtenidos en otros trabajos, se deben convertir a porcentaje pero referente esta vez al total de azúcares iniciales en el proceso, que corresponden a 43.91% (Lactosa) 44.45% (Lactosuero) usando la enzima y 41.36% (Lactosa) y 43.27% (Lactosuero), con el hongo, estos resultados no presentan diferencias significativas, lo cual se confirmó por la aplicación del modelo estadístico mencionado. Al comparar con los resultados de los trabajos de Peña-Montenegro y Neri, con 37.01 y 26% de producción de GOS, respectivamente, permite afirmar que vale la pena seguir mejorando el proceso. La enzima permite llegar a un resultado muy similar que el logrado con el hongo, pero en la mitad de tiempo, lo cual hace energéticamente más viable esta opción.

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% A. R. Lactosa % GOS Lactosa

% A. R. LSuero % GOS LSuero

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% A. R. Lactosa % GOS Lactosa

% A. R. LSuero % GOS LSuero

CONCLUSIONES

Los resultados de este trabajo arrojan que no es necesario el desarrollo industrial y tecnológico que implica la extracción de lactosa para la producción de GOS ya que no se presentan diferencias significativas si el proceso es desarrollado a partir de lactosuero en polvo; la muestras que contienen lactosa y suero con β-galactosidasa produjeron un 4.82% y 4.89% respectivamente, además la velocidad de producción con el suero es mayor que la lactosa observando el comportamiento entre las horas 4 y 8, que son mayores que la lactosa variando de 0.07% a 3.32%, mientras que en la lactosa la producción en este tiempo es del 2.3%. En el tratamiento de lactosa en polvo y lactosuero en polvo con el microorganismo A. oryzae el punto máximo alcanzado esta alrededor de la hora 20 con un 4.8% y en cuanto al uso de la enzima β-galactosidasa y el microorganismo A. oryzae la mejor producción de prebióticos galactooligosacáridos GOS se da con la enzima a la hora 10 con un 4.87% contra un 4.54% producido por el hongo.

De acuerdo al análisis estadístico aplicado con un nivel de significancia de 5% para el tratamiento de lactosa en polvo y lactosuero en polvo en presencia del microorganismo A. oryzae y enzima β-galactosidasa se concluye que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los sustratos, también se observa que en el tratamiento de lactosa y lactosuero en polvo con enzima β-galactosidasa el punto máximo de producción de prebióticos ocurre en la hora 12 en donde la lactosa alcanza una producción de 4.40% y el suero un 5.62%.

Debido a que no se presentan diferencias significativas entre los tratamientos usados se puede aplicar cualquiera de estos para la producción de galactooligosacáridos, sin embargo basándose en razones de costos y tiempo de proceso, se recomienda usar el

medio que está compuesto por lactosuero en polvo como sustrato, usando enzima β-galactosidasa, con un tiempo total de 10 horas de reacción.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Dey-chyi, S. (1998). “Production of galactooligosaccharides by b-galactosidase immobilized on glutaraldehyde-treated chitosan beads”. Biotechnology Techniques 4. 273–276. Figueroa, I. (2004) “Estudio de agentes selectivos en el crecimiento de bacterias probioticas”. 3. Huerta, l. “Síntesis Enzimática de galactooligosacáridos a partir de residuos de la industria láctea: Desafíos tecnológicos y oportunidades”. Desarrollos tecnológicos 14. 2. Martínez, M. (2001) “Una técnica de cuantificación de azucares reductores”. TESE. Neri D., Balcão V., Dourado F., Oliveira J., Carvalho L., Teixeira J. (2009), Galactooligosaccharides production by b‐galactosidase immobilized onto magnetic polysiloxane–polyaniline particles, Reactive & Functional Polymers 69 246–251. Peña-Montenegro, T.D., Sánchez, O.F.(2010),Producción de galactooligosacáridos empleando células libres de Aspergillus oryzae UA1

Universidad de los Andes. Departamento de Ingeniería Química, Departamento de Ciencias Biológicas, Bogotá DC, Colombia. Sánchez, O. Sucrose Biotransformation to Fructooligosaccharides by Aspergillus sp. N74 Free Cells”.

Universidad de los Andes.

Departamento de Ingeniería Química, Departamento de Ciencias Biológicas, Colombia. 2009.